CN109789183A - 治疗性多靶向构建体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含任选地连接到有机支架的能够靶向至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的多种肽和毒素的构建体。还提供了这些构建体在治疗癌症中的用途。本发明还提供了结合某些细胞外肿瘤抗原的特定肽以及具有抗肿瘤活性的毒素。

Description

治疗性多靶向构建体及其用途
技术领域
本发明涉及包含任选地连接到有机支架的能够靶向至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的多种肽和至少一种毒素的构建体，并且还提供了这些构建体在治疗癌症中的用途。本发明还涉及结合某些细胞外肿瘤抗原的特定肽和具有抗肿瘤活性的毒素，以及这些肽和毒素的偶联物。
背景技术
靶向癌症疗法是被设计用于干扰参与癌细胞生长和存活的特定分子的药物或其他物质。与通常针对所有积极分裂的细胞起作用的常规化疗药物相反，靶向疗法的主要目的是更精确地并以潜在更少的副作用与癌细胞斗争。已被批准用于针对特定癌症的靶向癌症疗法包括阻止细胞生长信号传导、干扰肿瘤血管发生、促进癌细胞死亡、刺激免疫系统以破坏癌细胞和向癌细胞递送有毒药物的药剂。后者主要包括递送有毒分子的单克隆抗体。一旦抗体结合到它的靶细胞后，连接到所述抗体的有毒分子例如放射活性物质、毒性多肽或有毒化学品，被所述细胞摄取，最终杀死该细胞。所述毒素将不影响缺少所述抗体的靶的细胞。
出于大量原因，高效肿瘤靶向具有挑战性。首先，它需要鉴定对所述肿瘤细胞足够特异的药剂，以尽可能多地避免细胞的非特异性灭杀。此外，癌细胞在癌症类型之间和同一类型癌症内都倾向于是可变的：在特定肿瘤的细胞之间表面靶的表达模式可能变化。癌细胞也可能在肿瘤发展期间改变它们的细胞表面受体的表达，或变得对所述疗法耐药。耐药性可能以两种方式发生：所述靶本身通过突变而改变，使得所述靶向疗法不再与它良好地相互作用，和/或所述肿瘤发现了不依赖于所述靶的实现肿瘤生长的新途径。大多数抗癌药物攻击癌细胞上或癌细胞中的特定靶。抑制所述靶通常旨在阻断促进癌症的生理途径。所述靶中或它们的下游生理途径中的突变使得所述靶不与所述细胞的癌性本质相关。
DeNardo等，2003,Clin Cancer Res.9(10Pt 2):3854S-64S报道了偶联到肿瘤特异性或对照肽的支链聚乙二醇(PEG化)聚合物(Mr 40,000、Mr 70,000、Mr 100,000和Mr150,000)的合成，以评估分子量和肿瘤特异性两者对药代动力学和生物分布的影响。
Tsai等，2011,J Neurooncol.103(2):255–266描述了一种双特异性配体引导的毒素，其被设计用于同时靶向人类成胶质细胞瘤细胞上的表皮生长因子受体(EGFR)和肿瘤新血管系统上的尿激酶受体(uPAR)。所述构建体是一种单链多肽，由人类表皮生长因子(EGF)、尿激酶的片段和截短的假单胞菌外毒素(PE38)构成。
McGuire等，2014,Sci Rep.,4:4480报道了从噬菌体展示文库鉴定到的一系列用于非小细胞肺癌的肿瘤靶向肽的表征。所述肽作为单体和同四聚体合成。
US 7,947,289公开了包含修饰的细菌毒素的组合物和使用所述修饰的细菌毒素用于靶向特定细胞群体和用于治疗疾病的方法。
US 2004/0058865公开了合成的多聚体配体，其提供了提高的细胞和器官特异性靶向，还公开了它们的制备和使用方法。
US 2009/0130105公开了结合到IGF-1R的多个表位的组合物，例如单特异性结合分子或多特异性结合分子(例如双特异性分子)的组合。还公开了制造所述主题结合分子的方法和使用所述结合分子拮抗IGF-1R信号传导的方法。
WO 2007/093373公开了偶联到用于癌细胞的特异性靶向的功能单元的体内稳定的支链肽，特别是源自于神经降压肽(NT)和促黄体激素释放激素(LHRH)的序列的肽，其用于肿瘤诊断或疗法。
WO 2008/088422公开了一种包含OSK1肽类似物以及在某些实施方式中其可药用盐的物质的组合物。还公开了包含所述组合物和可药用载体的药物组合物、编码所述物质组合物的DNA、包含所述DNA的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。还公开了治疗自体免疫障碍和预防或减轻多发性硬化症的症状复发的方法。
对于具有提高的效力和降低的非特异性副作用的用于靶向癌症疗法的改进的组合物和方法，仍存在着未满足的需求。
发明内容
本发明涉及一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接地或通过载体共价结合。本发明是基于下述出人意料的观察，即包含结合癌细胞上的两个不同靶的两种肽和毒素的构建体，与仅具有这些肽中的一种肽的构建体相比，具有有利的并且在某些情况下协同的细胞毒性效应。
根据一个方面，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接共价结合或通过载体共价结合。
根据本发明的某些实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到选自人类表皮生长因子受体(EGFR)和人类程序性死亡-配体1(PD-L1)的细胞外肿瘤抗原。在某些实施方式中，所述至少两种肽中的另一者特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。
根据某些实施方式，所述构建体可以包含3至10种结合到不同细胞外肿瘤抗原的不同的肽。
在某些实施方式中，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接共价结合或通过载体共价结合，并且其中所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR。在一个实施方式中，肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(CHPGDKQEDPNCLQADK)或者是其类似物。
在其他实施方式中，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接共价结合或通过载体共价结合，并且其中所述肽中的至少一种特异性结合到PD-L1。在一个实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列(CEGLPADWAAAC)或者是其类似物。
在某些实施方式中，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接共价结合或通过载体共价结合，并且其中所述肽中的一种特异性结合到EGFR，所述肽中的一种特异性结合到PD-L1。根据一个实施方式，特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽或其类似物，并且特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽或其类似物。
根据任一上述实施方式，所述构建体包含所述肽中的至少一者或至少两者的多个拷贝。在某些实施方式中，所述构建体包含所述肽中的至少一种的2至50个拷贝。
根据任一上述实施方式，所述毒素是肽、多肽或蛋白质毒素。在某些实施方式中，所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素、由SEQ ID NO：5构成的BIM-BH3、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺(Conus californicus)毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。在一个实施方式中，所述结合到真核延伸因子2的毒素是包含选自SEQ ID NO：3(CSARWGPTMPWC)、SEQID NO：4(CRRGSRASGAHC)的氨基酸序列或其类似物的毒素。根据某些实施方式，所述构建体包含2至10种不同的毒素。根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：3的毒素和具有SEQ ID NO：4的毒素。
根据任一上述实施方式，所述构建体包含所述毒素中的至少一者或至少两者的多个拷贝。根据一个实施方式，所述构建体包含所述毒素中的至少一种的2至50个拷贝。根据另一个实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：3的毒素的2至50个拷贝和具有SEQ IDNO：4的毒素的2至50个拷贝。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其中所述肽中的一种特异性结合到EGFR，所述肽中的一种特异性结合到PD-L1，并且所述毒素选自特异性结合到真核延伸因子2的毒素和具有SEQ ID NO：5的毒素。根据一个这样的实施方式，所述构建体包含具有SEQID NO：1的肽或其类似物、具有SEQ ID NO：2的肽或其类似物和具有选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列的至少一种毒素。根据一个实施方式，所述构建体包含含有SEQ ID NO：1的肽或其类似物、含有SEQ ID NO：2的肽或其类似物、含有SEQ ID NO：3的毒素和含有SEQ IDNO：4的毒素。根据任一这样的实施方式，所述构建体包含所述肽和毒素中的每一种的多个拷贝。
根据任一上述实施方式，所述肽中的至少一种和/或至少一种毒素通过载体共价结合。根据一个实施方式，所述载体是有机支架。根据另一个实施方式，所述肽和毒素中的每一种被结合到载体，其中所述载体是有机支架。根据某些实施方式，所述支架是聚乙二醇(PEG)分子或改性的PEG分子。根据一个实施方式，所述PEG分子是支链分子。根据另一个实施方式，所述PEG分子包含用于结合本发明的肽和/或毒素的多个位点。根据一个实施方式，所述PEG分子包含8至56个可用于结合所述肽和毒素的位点。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素中每一者的多个拷贝，其中所述肽和毒素被结合到所述支架，并且其中所述肽中的至少一种特异性结合到选自EGFR或PD-L1的细胞外肿瘤抗原。根据某些实施方式，所述肽中的一种特异性结合到EGFR，所述肽中的一种特异性结合到PD-L1。根据一个实施方式，特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽或其类似物，并且特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽或其类似物。根据某些实施方式，所述毒素包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列或其类似物。根据一个实施方式，所述支架是PEG支架。根据一个实施方式，所述PEG分子包含8至56个可用于结合所述肽和毒素的位点。
根据一个实施方式，所述构建体包含下述每一者的多个拷贝：(i)具有SEQ ID NO：1的肽，(ii)具有SEQ ID NO：2的肽，(iii)具有SEQ ID NO：3的毒素和(iv)具有SEQ ID NO：4的毒素，其中所述肽和毒素中的每一种被结合到所述支架。根据一个实施方式，所述支架是PEG支架。根据另一个实施方式，所述构建体包含下述每一者的多个拷贝：(i)由SEQ ID NO：1构成的肽，(ii)由SEQ ID NO：2构成的肽，(iii)由SEQ ID NO：3构成的毒素和(iv)由SEQID NO：4构成的毒素。根据某些实施方式，所述具有SEQ ID NO：1或由其构成的肽、具有SEQID NO：2或由其构成的肽、具有SEQ ID NO：3或由其构成的毒素和具有SEQ ID NO：4或由其构成的毒素之间的化学计量摩尔比为1:1:3:3。
根据任一上述实施方式，所述肽或所述毒素中的至少一种通过连接物或间隔物连接到所述支架。
根据任一上述实施方式，所述构建体还包含提高渗透性的组成部分。
根据另一方面，本发明提供了一种包含本发明的构建体的组合物。根据一个实施方式，所述组合物是药物组合物。因此，在某些实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的构建体和可药用赋形剂。根据一个实施方式，所述药物组合物包含一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素中每一者的多个拷贝，其中所述肽和毒素被结合到所述支架，并且其中所述肽中的至少一种特异性结合到选自EGFR或PD-L1的细胞外肿瘤抗原。根据某些实施方式，所述肽中的一种特异性结合到EGFR，所述肽中的一种特异性结合到PD-L1。根据一个实施方式，特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽或其类似物，并且特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽或其类似物。根据某些实施方式，所述毒素包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列或其类似物。根据一个实施方式，所述支架是PEG支架。
根据一个实施方式，所述药物组合物包含一种构建体，其包含下述每一者的多个拷贝：(i)具有SEQ ID NO：1的肽，(ii)具有SEQ ID NO：2的肽，(iii)具有SEQ ID NO：3的毒素和(iv)具有SEQ ID NO：4的毒素，其中所述肽和毒素中的每一种被结合到所述支架。根据一个实施方式，所述支架是PEG支架。根据另一个实施方式，所述构建体包含下述每一者的多个拷贝：(i)由SEQ ID NO：1构成的肽，(ii)由SEQ ID NO：2构成的肽，(iii)由SEQ ID NO：3构成的毒素和(iv)由SEQ ID NO：4构成的毒素。根据某些实施方式，所述具有SEQ ID NO：1或由其构成的肽、具有SEQ ID NO：2或由其构成的肽、具有SEQ ID NO：3或由其构成的毒素和具有SEQ ID NO：4或由其构成的毒素之间的化学计量摩尔比为1:1:3:3。
根据一个实施方式，本发明的药物组合物被用于治疗癌症。
根据某些方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药本发明的药物组合物。根据一个实施方式，所述药物组合物包含本发明的构建体。根据一个实施方式，本发明提供了一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本发明的构建体。
根据一个方面，本发明提供了一种特异性结合到人类真核延伸因子2(eEF2)的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的氨基酸序列及其类似物。根据一个实施方式，所述肽或类似物是环状的。根据一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽或其类似物提高eEF2活性。根据另一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽或其类似物提高eEF2活性。根据一个实施方式，所述肽或类似物被用于诱导细胞死亡。
根据另一方面，本发明提供了一种肽，其包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或其类似物。根据一个实施方式，所述肽或类似物是人类表皮生长因子受体(EGFR)的拮抗剂。根据另一个实施方式，所述肽或类似物是环状的。根据一个实施方式，所述肽或类似物被用于靶向癌细胞。
根据另一个实施方式，本发明提供了一种肽，其包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或其类似物。根据一个实施方式，所述肽或类似物是人类程序性死亡-配体1(PD-L1)的拮抗剂。根据另一个实施方式，所述肽或类似物是环状的。根据一个实施方式，所述肽或类似物被用于靶向癌细胞。
根据某些方面，本发明提供了一种偶联物，其包含至少一种本发明的肽。根据一个实施方式，所述肽选自包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽和所述肽的类似物。
根据另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含本发明的肽或本发明的偶联物。根据一个实施方式，所述组合物是药物组合物。因此，在某些实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的肽或本发明的偶联物。根据一个实施方式，所述肽选自包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽和所述肽的类似物。根据另一个实施方式，所述偶联物是所述肽的偶联物。根据某些实施方式，所述药物组合物被用于治疗癌症。
根据一个方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本发明的肽或本发明的偶联物。根据一个实施方式，所述治疗癌症的方法包括给药包含所述肽或所述偶联物的药物组合物。根据一个实施方式，所述肽选自包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽和所述肽的类似物。根据另一个实施方式，所述偶联物是所述肽的偶联物。根据某些实施方式，所述方法包括给药包含所述肽或所述偶联物的本发明的药物组合物。
根据另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码本发明的肽或类似物的序列。根据一个实施方式，所述肽选自包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、包含SEQID NO：2或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽和包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述类似物是所述肽的类似物。
根据另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码一种多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1的至少一个拷贝；(ii)SEQ ID NO：2的至少一个拷贝；(iii)SEQ ID NO：3、4的至少一个拷贝，或其组合。
根据另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含本发明的多核苷酸。根据一个实施方式，所述多核苷酸被可操作连接到启动子。
根据某些方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的至少一种多核苷酸或至少一种核酸构建体。
根据另一方面，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的至少一种多核苷酸或至少一种核酸构建体。
附图说明
图1示出了装载有两种靶向分子例如E13.3和PL-L1-GR肽(实心圆圈和正方形)和毒素(空心圆圈)例如Tox1和/或Tox2的多臂PEG复合物的示意结构。
图2示出了ELISA实验的结果，证实了在两种不同温浴时间下几种肽(毒素)结合到eEF2或BSA：1.5min和30min(TB2-Tox1，GW-Tox2)。
图3示出了在体外转录/翻译系统中试验的几种肽(毒素)(TB2-Tox1，GW-Tox2，GR–non-eEF2-结合对照)的活性的结果。
图4-7示出了PEG-E13.3-毒素构建体对A431和MCF-7细胞的影响：
图4–对照(未处理)：图4A和4B：A431细胞分别在T＝0和48h时；图4C和4D：MCS-7细胞分别在T＝0和48h时。
图5示出了PEG-E13.3-BIM(图5A-C)构建体和PEG-E13.3-Tox1-Tox2(图5D-5F)在不同浓度下对A431细胞的影响：1μM(图5A和5D)，3μM(图5B和5E)和8μM(图5C和5F)。所述图片在处理后48小时获取。
图6示出了PEG-E13.3-BIM(图6A-C)构建体和PEG-E13.3-Tox1-Tox2(图6D-6F)在不同浓度下对MCF-7细胞的影响：1μM(图6A和6D)，3μM(图6B和6E)和8μM(图6C和6F)。所述图片在处理后48小时获取。
图7示出了用PEG-BIM的复合物(无E13.3)在不同浓度下处理A431细胞(图7A-7C)和MCF-7(图7D-7F)：1μM(图7A和6D)，3μM(图7B和7E)和8μM(图7C和7F)。所述图片在处理后48小时获取。
图8示出了用不同构建体：PEG-BIM(图8B-D)，PEG-E13.3-BIM(图8E-G)，PEG-PD-L1-GR-BIM(图8H-J)和PEG-PD-L1GR-E13.3-BIM(图8K-M)，在不同浓度下处理A431细胞的效果：10nM(图8B、8E、8H和8K)，100nM(图8C、8F、8I和8L)和1μM(图8D、8G、8J和8M)。图8A是对照。所述图片在处理后48小时获取。
图9示出了用3和10μM(分别为图9C和9D)PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2或10μM PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM处理A-549细胞的效果。图9A(T＝0)和9B(T＝48h)被用作对照。图9B-9D在处理后48小时获取。
图10示出了所选的肽的Coomassie Plus染色的电泳凝胶：道(从左至右)：1-E7.1；2-E10.2；3-E13.3；4-E14.1.1；5-E14.1.4；6-E23I3；7-E23I5；8-E15.1.3-T；9-A4.3.12-T；10-蛋白质标志物(Fermentas)。
图11示出了通过测量EGFR的自身磷酸化获得的所选肽的抑制分析的归一化的结果。
图12示出了在牛血清中温浴不同时间段的所选肽的稳定性的测量结果。
图13示出了在不同浓度下所选肽的抑制活性的评估结果(图13A是总图，图13B示出了单独的E13.3)。
图14示出了单独的或与8臂PEG复合的E13.3肽的体内稳定性。
图15示出了E13.3对两种癌细胞系的存活率的影响。
图16示出了在小鼠中E13.3-PEG复合物在肾脏、肝脏和肿瘤中的积累。
图17示出了在小鼠中，在IV注射荧光标记的E13.3-PEG复合物后1小时(左图)和24小时(右图)从肿瘤分离的癌细胞的照片。
图18示出了用1μM的下述构建体处理A-549细胞的效果：PEG-E13.3-BIM(18B)，PEG-(PD-L1-GR)-BIM(18C)和PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM(18D)，使用PBS作为对照(18A)。
具体实施方式
本发明涉及包含多种多靶向肽和至少一种毒素组成部分的治疗性构建体。具体来说，符合本发明的构建体包含多种肽，每种肽针对不同的细胞-靶。在符合本发明的构建体中包含的肽能够结合、阻断、抑制或活化在癌细胞的膜上表达的至少两种不同的抗原。根据一个方面，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接地或通过载体共价结合。
术语“肽”是指通过肽键、即在一个氨基酸的羧基与相邻氨基酸的氨基之间形成的共价键相连的氨基酸残基的短链。术语“肽”是指具有至多50个氨基酸的短序列。比50个氨基酸更长的氨基酸单体的链被称为“多肽”。这种多肽在具有超过50个氨基酸残基时，也可以被分类为蛋白质，更具体来说低或中分子量的蛋白质。
术语“肽”也涵盖术语“肽类似物”。术语“肽类似物”和“类似物”在本文中可互换使用，并且是指肽的与原始肽具有至少70％同一性的类似物，其中所述类似物保留了所述原始肽的活性。因此，术语“类似物”和“活性类似物”可以互换使用。术语“类似物”是指在亲本肽的氨基酸序列中含有替换、重排、缺失、添加和/或化学修饰的肽。术语“类似物”也指肽毒素的类似物，即毒素是肽。根据某些实施方式，所述肽类似物与所述原始肽具有至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性。根据一个实施方式，所述类似物与所述原始肽具有约70％至约95％、约80％至约90％或约85％至约95％的序列同一性。根据某些实施方式，本发明的类似物包含其中制造了1、2、3、4或5个替换的原始肽的序列。
所述氨基酸的替换可以是保守或非保守替换。所述非保守替换涵盖了一个氨基酸被任何其他氨基酸的替换。在一个特定实施方式中，所述氨基酸被非天然氨基酸替换。
当在本文中使用时，术语“氨基酸”是指包含胺和羧酸官能团两者的有机化合物，其可以是天然或非天然的氨基酸。二十二种天然氨基酸是天冬氨酸(Asp)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Glu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、半胱氨酸(Cys)、硒代半胱氨酸(Sec)和吡咯赖氨酸(Pyl)。非天然氨基酸的非限制性实例包括二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)、鸟氨酸(Orn)、氨基己二酸、β-丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、3-(氨基甲基)苯甲酸、p-乙炔基-苯丙氨酸、p-炔丙基-氧基-苯丙氨酸、m-乙炔基-苯丙氨酸、p-溴苯丙氨酸、p-碘苯丙氨酸、p-叠氮基苯丙氨酸、p-乙酰基苯丙氨酸、叠氮基正亮氨酸、6-乙炔基-色氨酸、5-乙炔基-色氨酸、3-(6-氯吲哚基)丙氨酸、3-(6-溴吲哚基)丙氨酸、3-(5-溴吲哚基)丙氨酸、叠氮基高丙氨酸、p-氯苯丙氨酸、α-氨基辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、N-乙酰基半乳糖胺-α-苏氨酸和N-乙酰基半乳糖胺-α-丝氨酸。根据一个实施方式，所述替换是用非天然氨基酸的替换。
根据某些实施方式，术语“类似物”也涵盖术语“保守类似物”。
本领域技术人员已知的氨基酸的保守替换在本发明的范围之内。保守氨基酸替换包括将一种氨基酸用具有相同类型的官能团或侧链例如脂族、芳香族、带正电、带负电的侧链的另一种氨基酸代替。本领域技术人员将会认识到，当改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸替换时，所述替换是“保守修饰的类似物”。提供功能上相似的氨基酸的保守替换表在本领域中是公知的。保守替换的一个典型实例在下文中提供。
下面的6个组各自含有彼此是保守替换的氨基酸：(1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。在其他实施方式中，所述保守替换涵盖了用化学上相似的非天然氨基酸替换。
因此，在某些实施方式中，所述类似物是所述肽的保守类似物。根据某些实施方式，本发明的保守类似物包含其中制造了1、2、3、4或5个保守替换的原始肽的序列。根据另一个实施方式，所述类似物由其中制造了1、2、或3个保守替换的原始肽的氨基酸序列构成。因此，所述类似物由具有1、2或3个保守替换的原始肽的氨基酸序列构成。
术语“肽”还涵盖了术语“肽片段”。术语“片段”是指原始肽或其类似物的片段，其中所述片段保留了所述原始肽或类似物的活性。因此，术语“片段”和“活性片段”可以互换使用。根据某些实施方式，所述片段由原始序列或其类似物的至少6个、至少8个、至少9个或至少10个连续氨基酸构成。根据一个实施方式，所述片段由原始序列或其类似物的6至11个、7至10个或8至9个连续氨基酸构成。
本发明的肽、类似物和片段可以通过本领域中已知的任何方法来生产，包括重组(对于由遗传编码的氨基酸构成的肽来说)和合成方法。合成方法包括纯固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典的溶液合成。固相肽合成程序对于本领域技术人员来说是公知的。生产肽的合成方法包括但不限于FMOC固相肽合成，其被描述在例如Fields G.B.,NobleR.,Int.J.Pept.Protein Res.,35:161-214,1990中。用于在PEG上合成肽的方法描述在例如DeNardo等，同上中。
在某些实施方式中，将合成的肽通过制备型高效液相色谱进行纯化，并通过本领域技术人员已知的方法通过氨基酸测序来确认所述肽序列。
在某些实施方式中，使用本领域中公知的重组蛋白技术来生产本发明的肽和肽多聚体(由遗传编码的氨基酸构成)。
当在本文中使用时，术语“毒素”是指对哺乳动物细胞例如人类细胞有毒、有害或毒性(细胞毒性)的肽或多肽物质。符合本发明的毒素可能源自于活生物体例如微生物、植物或高等生物，或者它可能使用任何已知的技术合成地制备、生产或设计，如WO 2007/010525中所描述。所述毒素通常与细胞的生物大分子例如酶和受体相互作用，以介导它的效应。所述术语涵盖了毒素的生物活性亚基或片段。根据某些实施方式，所述毒素是由至多50个氨基酸构成的肽毒素。根据某些实施方式，所述是肽的毒素可以是环状肽。为清晰起见。所述是环肽的毒素被称为“环毒素”或“环状毒素”。在本发明的构建体中，毒素组成部分将它的至少一些性质提供给所述构建体，并且所述构建体介导对靶细胞的有毒或有害效应。肽毒素的非限制性实例包括蓝细菌毒素例如微囊藻毒素和节球藻毒素、ProTx-I和ProTx-II毒素、蛇毒来源的去整合素例如Viperistatin或其片段以及Hm-1和Hm-2毒素。
术语“载体”是指共价结合或能够结合到所述至少两种不同的肽和/或毒素的任何分子。涵盖了几种可能的结合排布方式。根据一个实施方式，一种肽和一种毒素通过载体结合，并且第二种肽直接结合到所述第一种肽或所述毒素。根据另一个实施方式，两种肽通过载体结合，并且所述毒素结合到所述肽之一。根据另一个实施方式，所有的肽和毒素都共价结合到载体。
根据任一上述实施方式，所述肽和/或毒素通过连接物结合。术语“连接物”和“间隔物”在本文中可互换使用，并且是指共价结合并因此连接两个分子的任何分子。所述连接物的非限制性实例是氨基酸、肽或可用于在两个被连接的分子之间产生距离的任何其他有机物质。
当在本文中使用时，术语“靶”和“细胞靶”是指在癌细胞上存在的分子，其可能是癌细胞的标志物并可能参与癌细胞的生长、增殖、存活和转移的发生。靶的具体实例包括细胞表面蛋白，其在结合到它们的配对物例如配体后，引发促进肿瘤生长和发育的级联反应。符合本发明的靶任选地在癌细胞上高表达，并且不存在或以明显更低的水平存在于正常的非癌细胞上。因此，术语“靶”涵盖了术语“细胞外肿瘤抗原”。术语“肿瘤抗原”或“细胞外肿瘤抗原”在本文中可互换使用，并且包括肿瘤相关抗原(TAA)和肿瘤特异性抗原(TSA)两者。肿瘤相关抗原意味着在肿瘤细胞表面上以比在正常细胞上观察到的更高的量表达的抗原，或在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原。肿瘤特异性抗原是肿瘤细胞独有的并且不在正常细胞上表达的抗原。术语肿瘤抗原包括已被鉴定和尚未被鉴定的TAA或TSA，并包括所述肿瘤抗原的片段、表位以及任何和所有的修饰。
当在本文中使用时，术语“细胞靶向的”当指称作为本发明的构建体的一部分的组成部分、特别是肽时，表明所述肽提供细胞、组织或器官特异性靶向。具体来说，细胞靶向肽特异性识别并结合癌细胞上的细胞靶。凭借它的结合，所述细胞靶向肽将整个构建体导向癌性组织，以便于癌细胞的灭杀/抑制。癌细胞的灭杀/抑制通过通过所述构建体中存在的毒素来实施，但在某些实施方式中，它可能直接通过所述细胞靶向肽的结合来实施。
在一个实施方式中，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接地或通过载体共价连接。根据某些实施方式，所述构建体包含至少3种不同的所述肽。根据其他实施方式，所述构建体包含至少4种不同的所述肽。根据某些实施方式，所述构建体包含结合到两种或更多种不同的细胞外肿瘤抗原的两种或更多种不同的肽。根据一个实施方式，所述构建体包含结合到三种或更多种不同的细胞外肿瘤抗原的三种或更多种不同的肽。根据另一个实施方式，所述构建体包含结合到四种或更多种不同的细胞外肿瘤抗原的四种或更多种不同的肽。
所述细胞外肿瘤抗原的非限制性实例是EGFR、PD-L1、HER2、雄激素受体、苯二氮卓受体、钙黏蛋白、CXCR4、CTLA-4、CD2、CD19、内皮素受体、ERBB4、FGFR、叶酸受体、HER4、HGFR、粘蛋白1、OGFR、PD-1、PD-L2、PDGFR和VEGFR，因此根据一个实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到一种这样的细胞外肿瘤抗原。
根据某些实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到选自表皮生长因子受体(EGFR)或程序性死亡-配体1(PD-L1)的细胞外肿瘤抗原。术语“PD-L1”和“人类PD-L1”在本文中可互换使用。术语“EGFR”和“人类EGFR”在本文中可互换使用。
根据其他实施方式，所述至少两种肽中的另一者特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。
根据另一个实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR或PD-L1，并且所述至少两种肽中的另一者特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。
根据任一上述实施方式，所述肽由5至30个氨基酸构成。根据其他实施方式，每种肽由6至25个氨基酸构成。根据另一个实施方式，每种肽由7至20个氨基酸构成。根据某些实施方式，每种肽由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸构成。每种可能性代表了本发明的独立实施方式。
根据任一上述实施方式，本发明的肽是环状肽。术语“环状肽”和“环肽”在本文中可互换使用，并且是指在两个不相邻氨基酸之间具有分子内键的肽。所述环化可以通过共价或非共价键来实现。分子内键包括但不限于骨架与骨架、侧链与骨架和侧链与侧链的键。根据某些实施方式，所述环化在所述肽、类似物或片段的半胱氨酸之间发生。根据其他实施方式，所述环化在N-端和C-端氨基酸之间发生。
根据任一上述实施方式，所述构建体包含结合到两种或更多种不同的细胞外肿瘤抗原的两种或更多种肽。根据某些实施方式，所述构建体包含结合到2至10种不同的细胞外肿瘤抗原的2至10种不同的肽。根据其他实施方式，所述构建体包含3至8种、3至10种或4至6种不同的肽。根据一个实施方式，所述构建体包含结合到2种不同的细胞外肿瘤抗原的2种不同的肽。根据另一个实施方式，所述构建体包含结合到3种不同的细胞外肿瘤抗原的3种不同的肽。根据另一个实施方式，所述构建体包含结合到4种不同的细胞外肿瘤抗原的4种不同的肽。根据某些实施方式，所述构建体包含分别结合到5、6、7或8种不同的细胞外肿瘤抗原的5、6、7或8种不同的肽。根据某些实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR或PD-L1。
根据一个实施方式，所述细胞外肿瘤拮抗剂是人类EGFR。因此，根据一个实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR。根据某些实施方式，所述肽是具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(CHPGDKQEDPNCLQADK)的肽。根据其他实施方式，所述肽是由SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列构成的肽。根据某些这样的实施方式，所述包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽是环状的。
根据另一个实施方式，所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽的类似物。在另一个实施方式中，所述肽是SEQ ID NO：1的保守类似物。根据某些实施方式，所述肽是与SEQ ID NO：1具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的类似物。根据其他实施方式，所述类似物是与SEQ ID NO：1具有70％至95％、75％至90％或80％至85％的序列同一性的肽。根据某些实施方式，所述SEQ ID NO：1的类似物是具有1、2、3、4或5个保守替换的SEQ ID NO：1的保守类似物。
根据另一个实施方式，所述肽是SEQ ID NO：1或其类似物的片段。根据某些实施方式，所述片段由SEQ ID NO：1或其类似物的至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个或至少16个连续氨基酸构成。根据一个实施方式，所述片段由SEQ ID NO：1或其类似物的5至16个、6至14个、7至13个、8至12个、8至12个或9至11个连续氨基酸构成。在另一个实施方式中，所述肽片段由SEQ ID NO：1的6至16个、8至14个或10至12个连续氨基酸构成。
根据本发明的任一方面和实施方式，术语“包含在SEQ ID NO：X中所示的氨基酸序列的肽”、“包含SEQ ID NO：X的肽”和“具有SEQ ID NO：X的肽”在本文中可互换使用。术语“由SEQ ID NO：X中所示的氨基酸序列构成的肽”、“由SEQ ID NO：X构成的肽”和“SEQ IDNO：X的肽”在本文中可互换使用。
根据一个实施方式，所述细胞外肿瘤拮抗剂是人类PD-L1。因此根据一个实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到PD-L1。根据某些实施方式，所述肽是具有SEQ IDNO：2中所示的氨基酸序列(CEGLPADWAAAC)的肽。根据某些实施方式，所述肽是由SEQ IDNO：2构成的肽。根据某些这样的实施方式，所述包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽是环状的。
根据另一个实施方式，所述肽是SEQ ID NO：2的类似物。在另一个实施方式中，所述肽是SEQ ID NO：2的保守变体。根据某些实施方式，所述类似物是与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的肽。根据其他实施方式，所述类似物是与SEQ ID NO：2具有70％至95％、75％至90％或80％至85％同一性的肽。根据某些实施方式，所述类似物是具有1、2、3、4或5个保守替换的SEQ ID NO：2的保守类似物。
根据另一个实施方式，所述肽是SEQ ID NO：2或其类似物的片段。根据某些实施方式，所述片段由SEQ ID NO：2或其类似物的至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10或11个连续氨基酸构成。根据一个实施方式，所述片段由SEQ ID NO：1或其类似物的5至16个、6至14个、7至13个、8至12个、8至12个或9至11个连续氨基酸构成。在另一个实施方式中，所述肽片段由SEQ ID NO：1的6至16个、8至14个或10至12个连续氨基酸构成。
根据任一上述实施方式，所述包含SEQ ID NO：1或2或由其构成的肽、其类似物或片段是环状肽、类似物或片段。
根据某些实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR，并且所述肽中的至少一种特异性结合到PD-L1。根据某些实施方式，本发明的构建体具有协同的细胞毒性。当在本文中使用时，术语“协同的细胞毒性”是指其中包含两种或更多种肿瘤抗原靶向肽的细胞毒性高于两种或更多种构建体的细胞毒性，此时每种这样的构建体分别只包含所述靶向肽之一。因此，包含PD-L1和EGFR靶向肽的构建体的细胞毒性高于各自包含PD-L1或EGFR靶向肽的两种构建体的细胞毒性(考虑到所述构建体的浓度)。根据某些实施方式，所述构建体包含特异性结合到EGFR的一种肽和特异性结合到PD-L1的另一种肽。根据一个实施方式，所述结合到EGFR的肽是具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段。根据另一个实施方式，特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段。根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段和具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段。根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：1的肽和具有SEQ ID NO：2的肽。根据某些实施方式，所述构建体包含SEQ ID NO：1的肽和SEQ ID NO：2的肽。根据某些这样的实施方式，所述包含SEQ ID NO：1或2或由其构成的肽、其类似物或片段是环状肽、类似物或片段。根据某些实施方式，本发明的构建体具有协同的细胞毒性。
根据任一上述实施方式，本发明的构建体包含至少一种所述不同的肽的多个拷贝。
根据其他实施方式，本发明的构建体包含至少两种所述不同的肽中的每一者的多个拷贝。根据另一个实施方式，所述构建体包含每所述肽中的一种的多个拷贝。
术语“不同的肽”是指结合到不同结合位点并且不结合到同一个肽的两个拷贝的肽。
根据某些实施方式，所述构建体包含肽的2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25或10至20个拷贝。根据一个实施方式，所述构建体包含肽的2至50个拷贝。根据另一个实施方式，所述构建体包含肽的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。根据其他实施方式，所述构建体包含所述两种不同的肽中每一者的2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25或10至20个拷贝。根据一个实施方式，所述构建体包含所述两种不同的肽中每一者的2至50个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述两种不同的肽中每一者的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。在某些实施方式中，所述构建体包含所述3、4、或5种不同的肽中每一者的7至56或14至28个拷贝。
根据某些实施方式，所述构建体包含特异性结合到EGFR的肽的多个拷贝和/或特异性结合到PD-L1的肽的多个拷贝。根据某些其他实施方式，所述构建体包含具有SEQ IDNO：1的肽、其类似物或片段的多个拷贝和具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段的多个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段和/或所述具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段的2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25或10至20个拷贝。根据一个实施方式，所述构建体包含所述具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段和/或所述具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段的2至50个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述具有SEQ ID NO：1的肽的7至56、14至48、21至42、28至35或7至21个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述具有SEQ ID NO：2的肽的7至56、14至48、21至42、28至35或7至21个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述具有SEQ ID NO：1和2的肽中每一者的7至56、14至48、21至42、28至35或7至21个拷贝。根据任一上述实施方式，所述包含SEQ ID NO：1或2或由其构成的肽、类似物或片段是环状肽、类似物或片段。
根据任一上述实施方式，所述毒素选自肽毒素、多肽毒素或肽毒素。
根据某些实施方式，所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素或该毒素的类似物、BIM-BH3毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。根据某些实施方式，所述BIM-BH3毒素由氨基酸序列MRPEIWIAQELRRIGDEFNA(SEQ ID NO：5)构成。
根据某些实施方式，所述结合到真核延伸因子2的毒素是具有选自CSARWGPTMPWC(如SEQ ID NO：3中所示)或CRRGSRASGAHC(如SEQ ID NO：4中所示)的氨基酸序列的毒素或其类似物。
根据另一个实施方式，所述毒素选自具有SEQ ID NO：3的毒素、具有SEQ ID NO：4的毒素、SEQ ID NO：5的毒素(BIM-BH3毒素)、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。
根据某些实施方式，所述毒素是含有SEQ ID NO：3的毒素。根据其他实施方式，所述毒素是含有SEQ ID NO：4的毒素。根据另一个实施方式，所述毒素由SEQ ID NO：3构成。根据另一个实施方式，所述毒素由SEQ ID NO：4构成。根据一个实施方式，所述毒素由SEQ IDNO：5构成。根据某些实施方式，所述毒素是包含SEQ ID NO：3或4的毒素的类似物。根据某些实施方式，所述毒素是由SEQ ID NO：3或4构成的毒素的类似物。根据某些这样的实施方式，所述毒素或其类似物是环状毒素或类似物。
根据某些实施方式，所述含有SEQ ID NO：3的毒素的类似物与SEQ ID NO：3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。根据其他实施方式，所述类似物是与SEQ ID NO：3具有70％至95％、75％至90％或80％至85％的序列同一性的肽。根据某些实施方式，所述类似物是具有1、2、3、4或5个保守替换的SEQ ID NO：3的保守类似物。
根据某些实施方式，所述含有SEQ ID NO：4的毒素的类似物与SEQ ID NO：4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性。根据其他实施方式，所述类似物是与SEQ ID NO：4具有70％至95％、75％至90％或80％至85％的序列同一性的肽。根据某些实施方式，所述类似物是具有1、2、3、4或5个保守替换的SEQ ID NO：4的保守类似物。
根据某些这样的实施方式，所述结合到eEF2的毒素、特别是所述包含SEQ ID NO：3或由其构成的毒素或其类似物或片段具有环状结构，即是环毒素。
根据某些实施方式，所述构建体包含2至10种不同的毒素。根据一个实施方式，所述构建体包含2种不同的毒素。根据另一个实施方式，所述构建体包含3种不同的毒素。根据另一个实施方式，所述构建体包含4、5、6、7、8、9或10种不同的毒素。
根据某些实施方式，所述构建体包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的毒素和具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的毒素。
根据某些实施方式，本发明的构建体包含所述毒素中的至少一种的多个拷贝。根据其他实施方式，所述构建体包含至少两种毒素的多个拷贝。
根据某些实施方式，所述构建体包含至少一种具有SEQ ID NO：3或4的毒素的多个拷贝。根据其他实施方式，所述构建体包含至少一种具有SEQ ID NO：3或4的毒素的多个拷贝。
根据某些实施方式，所述构建体包含毒素的2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25或10至20个拷贝。根据一个实施方式，所述构建体包含毒素的2至50个拷贝。根据另一个实施方式，所述构建体包含毒素的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。根据其他实施方式，所述构建体包含两种不同的毒素中每一者的2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25或10至20个拷贝。根据一个实施方式，所述构建体包含两种不同的毒素中每一者的2至50个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体两种不同的毒素中每一者的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。在某些实施方式中，所述构建体包含3、4或5种不同的毒素中每一者的7至56或14至28个拷贝。
根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：3的毒素、其类似物或片段和/或具有SEQ ID NO：4的毒素、其类似物或片段的2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25、2至50或10至20个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述具有SEQID NO：3的毒素的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述具有SEQ ID NO：4的毒素的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含所述具有SEQ ID NO：3和4的毒素中每一者的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。
根据一个实施方式，所述具有氨基酸SEQ ID NO：3的毒素与具有氨基酸SEQ IDNO：4的毒素的摩尔比为约0.1:1至约10:1。根据某些实施方式，所述比例为约0.2:1至8:1、约0.4:1至6:1、约0.5:1至5:1、约0.6:1至4:1、约0.8:1至2:1或约1:1。根据一个实施方式，所述具有氨基酸SEQ ID NO：3的毒素与具有氨基酸SEQ ID NO：4的毒素的摩尔比为1:1。
根据某些实施方式，本发明提供了一种本发明的构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽中的一种特异性结合到EGFR，所述肽中的一种特异性结合到PD-L1，并且所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素、具有SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列的BIM-BH3毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素、蓝藻毒素及其任何组合。根据某些实施方式，所述毒素是结合到真核延伸因子2的毒素。根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其中所述肽中的一种特异性结合到EGFR，所述肽中的一种特异性结合到PD-L1，并且所述毒素结合到真核延伸因子2或SEQ ID NO：5的毒素。根据某些实施方式，特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段，特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段，并且所述毒素选自具有SEQ ID NO：3或4的毒素。根据某些实施方式，所述构建体包含(i)一种肽、(ii)两种肽、(iii)一种毒素和/或(iv)两种毒素的多个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含下述物质的多个拷贝：(i)具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段，(ii)具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段，和(iii)选自具有SEQ IDNO：3或4的毒素的毒素，或其组合。根据其他实施方式，所述构建体包含下述物质的多个拷贝：(i)SEQ ID NO：1的肽，(ii)SEQ ID NO：2的肽，(iii)SEQ ID NO：3或4的毒素，或其组合。根据其他实施方式，所述构建体包含下述每一者的多个拷贝：(i)SEQ ID NO：1的肽，(ii)SEQ ID NO：2的肽，(iii)SEQ ID NO：3的毒素，和(iv)SEQ ID NO：4的毒素。根据某些实施方式，本发明的构建体具有协同的细胞毒性。根据某些这样的实施方式，所述肽、其类似物或片段和/或所述毒素、其类似物或片段分别是是环状肽、其类似物或片段和/或环状毒素、其类似物或片段。
根据任一上述实施方式，本发明的肽彼此共价结合。根据一个实施方式，所述肽和毒素直接结合，即不需要载体。根据其他实施方式，本发明的肽通过载体共价结合。根据一个实施方式，所述载体是有机支架，因此所述肽通过支架共价结合。
根据某些实施方式，所述支架是肽类支架。根据其他实施方式，所述肽类支架将所述肽彼此相连在所述支架中的单一位置上，或连接到支架上的不同位置。每种可能性代表了本发明的独立实施方式。根据某些实施方式，所述支架包含至少一个赖氨酸(Lys)残基。根据其他实施方式，所述支架包含至少三个Lys残基。根据其他实施方式，所述至少三个Lys残基通过酰胺键连接在一起，以形成支链多聚体支架。根据某些实施方式，至少一个酰胺键在Lys残基的ε胺与另一个Lys残基的羧基之间形成。
根据特定实施方式，所述构建体包含符合下面呈现的图式之一的分子：
其中X表示所述肽和/或毒素的选自羧酸、酰胺或醇基团的C-端和任选的连接物或间隔物，并且肽表示符合本发明的肽，例如具有7-20个氨基酸，能够结合到细胞靶的肽。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些特定实施方式，所述肽和/或毒素中的至少一种以多个拷贝存在。根据某些实施方式，所述多个拷贝相连，由此形成多靶向肽多聚体。根据某些实施方式，所述肽和/或毒素的拷贝通过连接物相连。根据其他实施方式，所述肽和/或毒素的拷贝直接相连。根据其他实施方式，所述多聚体包含直接和通过连接物两种方式相连的拷贝。
根据某些实施方式，所述构建体包含一种肽多聚体，其包含以交替的顺序聚合物结构B(X1X2X3…Xm)nB或以嵌段共聚物结构B(X1)nZ(X2)nZ(X3)nZ…(Xm)n排列的多个细胞靶向肽，其中B是任选的1-10个氨基酸残基的序列；n在每种情况下独立地是2-50的整数；m是3-50的整数；X1、X2…Xm各自是由5-30个氨基酸残基构成的相同或不同的肽；Z在每种情况下是键或1-4个氨基酸残基的间隔物。根据特定实施方式，n在每种情况下独立地是2-10的整数；m是3-10的整数；X1、X2…Xm各自是由7-20个氨基酸残基构成的相同或不同的肽；Z在每种情况下是键或1-4个氨基酸残基的间隔物。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述肽多聚体包含2-8种不同或相同的肽。根据特定实施方式，所述肽多聚体包含单个肽序列的4-10个拷贝。根据另一个实施方式，所述肽多聚体由2-10、3-9、4-8或10-100种不同或相同的肽构成。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
根据其他实施方式，所述支架包含聚乙二醇(PEG)分子或改性的PEG分子或由其形成。根据某些实施方式，所述支架包含支链PEG分子。根据某些实施方式，所述支链分子包含至少两个可用于结合本发明的肽的位点。根据其他实施方式，所述支架包含2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25或10至20或2至50个可用于结合肽的位点。根据一个实施方式，所述构建体包含7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个可用于结合肽的位点。根据某些实施方式，所述支架包含8或56个可用于结合肽的位点。根据其他实施方式，所述支架包含42或49至56个可用于结合肽的位点。
根据某些实施方式，所述PEG分子是支链分子，包含至少两个分开的与肽的连接。根据某些实施方式，所述PEG具有8个结合位点。根据其他实施方式，所述PEG被结合到另外的PEG分子。根据某些实施方式，多个PEG分子被结合以提供多臂PEG分子。根据某些实施方式，8个8臂PEG分子被结合到一个中心8臂PEG分子，以提供一种具有56个能够结合本发明的肽或毒素的位点的PEG分子。根据某些实施方式，所述肽通过在NH2-PEG分子的氨基之间形成的酰胺键连接到所述PEG支架。根据其他实施方式，至少一种肽通过Lys残基连接到PEG支架。
根据某些实施方式，所述肽通过Lys残基连接到PEG支架。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其中结合到PEG支架的所述肽中的至少一种特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。根据某些实施方式，结合到PEG支架的所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR或PD-L1。根据某些实施方式，特异性结合到EGFR的所述肽和特异性结合到PD-L1的所述肽两者被结合到所述支架。根据一个实施方式，结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段。根据另一个实施方式，特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段。根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段和具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段，两者都结合到所述支架。根据某些实施方式，所述构建体包含结合到所述支架的具有SEQ ID NO：1的肽和具有SEQ ID NO：2的肽。根据某些实施方式，所述构建体包含结合到所述支架的SEQ ID NO：1的肽和SEQ ID NO：2的肽。根据某些这样的实施方式，所述包含SEQID NO：1或2或由其构成的肽、其类似物或片段是环状肽、类似物或片段。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其中所述支架结合到所述肽中的至少一种的多个拷贝。根据某些实施方式，所述支架结合到所述至少两种肽中每一者的多个拷贝。根据某些实施方式，结合到PEG支架的所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR或PD-L1。根据某些实施方式，所述支架结合到特异性结合到EGFR的肽的多个拷贝。根据其他实施方式，所述支架结合到特异性结合到PD-L1的肽的多个拷贝。根据另一个实施方式，所述支架结合到特异性结合到EGFR的肽的多个拷贝和特异性结合到PD-L1的肽的多个拷贝。根据一个实施方式，所述结合到EGFR的肽是具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段。根据另一个实施方式，特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段。根据一个实施方式，所述支架结合到所述具有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝和所述具有SEQID NO：2的肽的多个拷贝。根据某些这样的实施方式，所述包含SEQ ID NO：1或2或由其构成的肽、其类似物或片段是环状肽、类似物或片段。
根据某些实施方式，所述支架包含糖类组成部分。
根据其他实施方式，所述毒素被结合到载体。所述载体可以如上文中所描述。因此，根据一个实施方式，所述载体是支架。根据某些实施方式，所述载体是肽类支架。
根据其他实施方式，所述支架是PEG支架，即由PEG形成。根据某些实施方式，所述支架包含支链PEG分子。根据某些实施方式，所述支链分子包含至少一个可用于结合毒素的位点。
根据其他实施方式，所述支架包含2至100、3至90、4至60、5至50、6至40、7至35、8至30、9至25或10至20或2至50个可用于结合毒素的位点。根据一个实施方式，所述构建体包含7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个可用于结合毒素的位点。根据某些实施方式，所述支架包含8或56或42或49至56个可用于结合毒素的位点。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其中所述PEG支架结合到至少一种毒素的多个拷贝。根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其中所述支架结合到至少两种毒素的多个拷贝。根据某些实施方式，所述毒素选自具有SEQ ID NO：3的毒素、具有SEQID NO：4的毒素、具有SEQ ID NO：5的毒素(BIM-BH3毒素)、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素、蓝藻毒素及其任何组合。根据某些实施方式，所述毒素是SEQ IDNO：3或4的毒素。
根据一个实施方式，所述PEG支架结合到具有SEQ ID NO：3的毒素、其类似物或片段的多个拷贝。根据一个实施方式，所述PEG支架结合到具有SEQ ID NO：4的毒素、其类似物或片段的多个拷贝。根据一个实施方式，所述PEG支架结合到具有SEQ ID NO：5的毒素的多个拷贝。根据一个实施方式，所述PEG支架结合到SEQ ID NO：3或4的毒素的多个拷贝。
根据一个实施方式，所述PEG支架结合到每一种所述毒素的多个拷贝。根据一个实施方式，所述PEG支架结合到具有SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝和具有SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝。根据一个实施方式，所述PEG支架结合到SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝和SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝。
根据某些这样的实施方式，所述包含SEQ ID NO：1或2或由其构成的肽、其类似物或片段是环状肽、其类似物或片段。此外，所述包含SEQ ID NO：3或4或由其构成的肽、其类似物或片段是环状的，即环状毒素。
根据某些实施方式，本发明提供了一种包含PEG支架的构建体，所述PEG支架结合有结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中至少一种肽特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中每种所述肽和毒素被结合到PEG支架，并且其中至少一种肽特异性结合到选自EGFR和PD-L1的细胞外肿瘤抗原。根据一个实施方式，所述肽中的一种特异性结合到EGFR，并且所述至少两种肽中的另一者特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。根据另一个实施方式，所述肽中的一种特异性结合到PD-L1，并且所述至少两种肽中的另一者特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。根据其他实施方式，所述肽中的一种特异性结合到EGFR，并且所述至少两种肽中的另一者特异性结合到PD-L1。根据某些实施方式，特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段。根据某些实施方式，特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段。根据某些这样的实施方式，所述肽是环肽。根据某些实施方式，所述毒素选自具有SEQ ID NO：3的毒素、具有SEQ ID NO：4的毒素、具有SEQ ID NO：5的毒素(BIM-BH3毒素)、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。根据某些实施方式，所述毒素选自SEQID NO：3的毒素、SEQ ID NO：4的毒素和SEQ ID NO：5的毒素。根据某些实施方式，所述支架被结合到2、3或4种不同的毒素。根据某些实施方式，所述PEG支架被结合到所述肽中的至少一种的多个拷贝。根据其他实施方式，所述PEG支架被结合到所述至少两种肽中每一者的多个拷贝。根据其他实施方式，所述PEG支架被结合到毒素的多个拷贝。根据某些实施方式，所述PEG支架被结合到两种或更多种毒素中每一者的多个拷贝。根据一个实施方式，所述支架被结合到具有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝。根据另一个实施方式，所述支架被结合到具有SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝。根据另一个实施方式，所述支架被结合到具有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝和具有SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝。根据一个实施方式，所述支架被结合到具有SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝。根据另一个实施方式，所述支架被结合到具有SEQID NO：4的毒素的多个拷贝。根据另一个实施方式，所述PEG支架被结合到具有SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝和具有SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝。根据另一个实施方式，所述PEG支架被结合到所述SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝和所述SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝。根据一个实施方式，所述具有氨基酸SEQ ID NO：3或5的毒素与所述具有氨基酸SEQ ID NO：4的毒素的摩尔比为约0.1:1至约10:1或1:1。根据某些实施方式，本发明的构建体具有协同的细胞毒性。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其包含具有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝、具有SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝、具有SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝和具有SEQID NO：4的毒素的多个拷贝，其中所述肽和毒素的每个拷贝被结合到PEG支架。根据某些实施方式，本发明提供了一种包含PEG支架的构建体，所述PEG支架结合有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝、SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝、SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝和SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝。根据一个实施方式，所述具有氨基酸SEQ ID NO：3的毒素与所述具有氨基酸SEQ ID NO：4的毒素的摩尔比为约0.1:1至约10:1或1:1。根据某些实施方式，所述具有SEQ ID NO：1的肽、SEQ ID NO：2的肽、具有SEQ ID NO：3的毒素和具有SEQ ID NO：3的毒素之间的化学计量摩尔比为1:1:3:3。根据其他实施方式，所述具有SEQ ID NO：1的肽、SEQ IDNO：2的肽、具有SEQ ID NO：3的毒素和具有SEQ ID NO：4的毒素之间的化学计量摩尔比选自1:2:3:2、1:2:2:3、2:1:3:2、2:1:2:3和2:2:2:2。在上述实施方式中，所述包含SEQ ID NO：1或2或由其构成的肽是环肽，并且所述包含SEQ ID NO：3或4或由其构成的毒素是环毒素。根据某些实施方式，本发明的构建体具有协同的细胞毒性。
根据任一上述实施方式，所述肽和/或毒素直接地或通过间隔物结合。根据其他实施方式，所述肽和/或毒素通过间隔物结合到所述载体例如支架。根据某些特定实施方式，所述间隔物包含至少一个氨基酸残基。
根据任一上述实施方式，所述构建体还包含提高渗透性的组成部分。所述提高渗透性的组成部分可以被直接结合到肽和/或毒素，或者可以任选地通过间隔物结合到所述支架。术语“提高渗透性的组成部分”是指主动或被动促进或提高化合物通过身体屏障或进入细胞的渗透性的本领域中已知的任何组成部分。提高渗透性的组成部分的非限制性实例包括：疏水组成部分例如脂肪酸、甾类和大体积芳香族或脂族化合物；可能具有细胞膜受体或载体的组成部分，例如甾类、维生素和糖、天然和非天然氨基酸和转运肽，纳米粒子和脂质体。术语“渗透性”是指药剂或物质通过屏障、膜或皮肤层穿透、弥漫或扩散的能力。
根据另一方面，本发明提供了一种包含本发明的构建体的组合物。根据一个实施方式，所述组合物是药物组合物。因此，在某些实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的构建体和可药用赋形剂。前述方面的所有定义、术语和实施方式明确地被这个方面涵盖。
当在本文中使用时，术语“药物组合物”是指包含任选地用一种或多种可药用赋形剂配制的本文中所公开的本发明的构建体的组合物。
所述药物组合物的配方可以根据应用来调整。具体来说，所述药物组合物可以使用本领域中已知的方法来配制，以便在给药到哺乳动物后提供活性成分的快速、连续或延迟的释放。例如，所述配方可以是选自硬膏剂、颗粒剂、洗剂、擦剂、柠檬水、芳香水剂、粉剂、糖浆、眼用软膏、液体和溶液、气溶胶、提取物、酏剂、软膏、流浸膏剂、乳液、悬液、汤剂、输注液、眼用溶液、片剂、栓剂、注射剂、醑剂、胶囊、霜剂、锭剂、酊剂、贴片、丸剂和软质或硬质明胶胶囊的任一者。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”或“可药用赋形剂”是指与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、防腐剂、抗氧化剂、包衣剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、助流剂、pH调节剂、缓冲剂、增强剂、润湿剂、助溶剂、表面活性剂、抗氧化剂等。适合的赋形剂的非限制性实例是例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。其他适合的载体对于本领域技术人员来说是公知的。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。所述组合物可能含有提供增补、附加或增强的治疗功能的其他活性化合物。
根据某些实施方式，可以将本发明的构建体悬浮在无菌盐水溶液中，用于治疗用途。大量适合的药物递送系统是已知的，并包括例如可植入药物释放系统、水凝胶、羟甲基纤维素、微胶囊、脂质体、微乳液、微球等。可以通过使用聚合物来复合或吸附符合本发明的分子，来制备受控释放制剂。例如，生物相容的聚合物包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。符合本发明的分子从这种基质释放的速率取决于所述分子的分子量、基质中所述分子的量和被分散的粒子的尺寸。
本发明的药物组合物可以通过任何已知的方法给药。术语物质、化合物或药剂向对象的“给药”可以使用本领域技术人员已知的各种不同方法之一来进行。例如，化合物或药剂可以静脉内、动脉内、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、眼、舌下、口(通过摄食)、鼻内(通过吸入)、脊柱内、脑内和透皮(通过例如经皮肤导管吸收)给药。化合物或药剂也可以通过可更换或生物可降解的聚合物装置或其他装置例如贴片和泵或配方适合地引入，它们提供所述化合物或药剂的延长、缓慢或受控释放。给药也可以进行例如一次、多次和/或在一段或更多段延长的时间段内进行。在某些实施方式中，所述给药既包括直接给药，包括自我给药，也包括间接给药，包括开出药物的行动。例如，当在本文中使用时，指示患者自我给药所述药物或由他人给药所述药物和/或为患者提供药物处方的医师，正在向所述患者给药所述药物。
根据某些实施方式，所述药物组合物通过侵入性给药方式例如肌肉内、静脉内、动脉内、关节内或肠胃外方式给药。
对于暴露于普通技术人员来说，显然符合本发明的分子的治疗有效量取决于尤其是给药日程表、给药的分子的单位剂量、所述分子是否与其他治疗剂组合给药、所述患者的免疫状态和健康、给药的分子的治疗活性和治疗医师的判断。当在本文中使用时，“治疗有效量”是指在一段时间内缓解与待治疗障碍相关的一种或多种症状所需的分子的量。
尽管本发明的分子的适合剂量随着给药途径、分子的类型(多肽、多核苷酸、有机分子等)、患者的年龄、体重、性别或状况而变，但它最终应该由医师确定。在获得有效量中各种不同的考虑因素描述在例如下述文献中：Goodman和Gilman，《治疗剂的药理基础》(ThePharmacological Bases of Therapeutics)，第8版，Pergamon Press，1990；和《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第17版，Mack Publishing Co.，Easton,Pa.,1990。
在一个特定实施方式中，本发明的药物组合物包含一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接地或通过载体共价结合。根据某些实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到选自EGFR和PD-L1的细胞外肿瘤抗原。根据另一个实施方式，所述至少两种肽中的另一者特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。根据某些实施方式，所述构建体包含2至10种不同的肽。根据某些实施方式，所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR，并且所述肽中的至少一种特异性结合到PD-L1。根据一个实施方式，所述结合到EGFR的肽是具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段。根据另一个实施方式，特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段。根据另一个实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：1或由其构成的肽和具有SEQ ID NO：2或由其构成的肽。根据某些实施方式，所述药物组合物包含一种构建体，其包含一种或两种所述肽的多个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ IDNO：1和2的肽中每一者的7至56、14至48、21至42、28至35或7至21个拷贝。根据某些实施方式，所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素或该毒素的类似物、BIM-BH3毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。根据某些实施方式，所述BIM-BH3毒素由SEQ ID NO：5构成。根据某些实施方式，所述结合到真核延伸因子2的毒素是具有选自SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列的毒素或其类似物。根据某些实施方式，所述构建体包含2至10种不同的毒素。根据某些实施方式，所述构建体包含一种或两种毒素的7至56、14至48、21至42、28至35或7至21个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：3或4的毒素中每一者的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。根据某些实施方式，所述构建体包含具有SEQ ID NO：3和4的毒素中每一者的7至56、14至48、21至42、28至35、7至21个拷贝。根据一个实施方式，所述具有氨基酸SEQ ID NO：3的毒素与所述具有氨基酸SEQID NO：4的毒素的摩尔比为约0.1:1至约10:1或约1:1。根据某些实施方式，所述肽是环肽，并且所述毒素是环状毒素。
根据某些实施方式，本发明的药物组合物包含一种构建体，其包含PEG支架、结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中至少一种肽特异性结合到选自EGFR和PD-L1的细胞外肿瘤抗原，并且所述肽和毒素中的每一种被结合到所述支架。根据其他实施方式，所述肽中的一种特异性结合到EGFR，并且所述至少两种肽中的另一者特异性结合到PD-L1。根据某些实施方式，特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽、其类似物或片段。根据某些实施方式，特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽、其类似物或片段。根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其包含PEG支架、具有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝、具有SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝和具有SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝，其中每所述肽中的一种的每个拷贝和所述毒素的每个拷贝被结合到所述支架。根据一个实施方式，所述构建体包含PEG支架、具有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝、具有SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝和具有SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝，其中每所述肽中的一种的每个拷贝和所述毒素的每个拷贝被结合到所述支架。
根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其包含结合有具有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝、具有SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝、具有SEQ ID NO：3的毒素的多个拷贝和具有SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝的PEG支架。根据某些实施方式，本发明提供了一种构建体，其包含结合有SEQ ID NO：1的肽的多个拷贝、SEQ ID NO：2的肽的多个拷贝、SEQ IDNO：3的毒素的多个拷贝和SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝的PEG支架。根据一个实施方式，所述具有氨基酸SEQ ID NO：3的毒素与所述具有氨基酸SEQ ID NO：4的毒素的摩尔比为约0.1:1至约10:1或1:1。根据某些实施方式，所述具有SEQ ID NO：1的肽、SEQ ID NO：2的肽、具有SEQ ID NO：3的毒素和具有SEQ ID NO：3的毒素之间的化学计量摩尔比为1:1:3:3。根据其他实施方式，所述具有SEQ ID NO：1的肽、SEQ ID NO：2的肽、具有SEQ ID NO：3的毒素和具有SEQ ID NO：4的毒素之间的化学计量摩尔比选自1:2:3:2、1:2:2:3、2:1:3:2、2:1:2:3和2:2:2:2。在上述实施方式中，所述包含SEQ ID NO：1或2或由其构成的肽是环肽，并且所述包含SEQ ID NO：3或4或由其构成的毒素是环毒素。根据某些实施方式，本发明的构建体具有协同的细胞毒性，因此这些药物组合物在被给药时提供深厚的治疗效果。
根据任一上述实施方式，所述药物组合物包含符合本发明并符合上述实施方式的多个构建体。
根据另一个实施方式，本发明提供了符合本发明的药物组合物，其用于治疗细胞增殖性疾病或障碍。根据某些实施方式，所述细胞增殖性疾病或障碍是癌症。因此，根据一个实施方式，本发明的药物组合物被用于治疗癌症。
术语病症或患者的“治疗”是指采取步骤以获得有益或所需的结果，包括临床结果。有益或所需的临床结果包括但不限于改善或消除、实质性抑制、减缓或逆转疾病、病症或障碍的进展，实质性改善或缓解病症的临床或美学症状，实质性阻止疾病、病症或障碍的临床或美学症状的出现，和针对有害或恼人的症状提供保护。治疗也是指实现下述一个或多个目标：(a)减轻所述障碍的严重性；(b)限制待治疗的障碍特征性的症状的发生；(c)限制待治疗的障碍特征性的症状的恶化；(d)在以前患有所述障碍的患者中限制所述障碍的复发；和/或(e)在以前无所述障碍的症状的患者中限制症状的复发。
根据某些实施方式，治疗癌症包括阻止或治疗肿瘤转移。根据某些实施方式，所述转移被减少。根据其他实施方式，所述转移被阻止。
根据某些实施方式，治疗癌症包括增加患有癌症的对象的存活时间长度，包括向所述需要的对象给药包含上面定义的构建体的组合物，由此所述构建体的给药增加了存活时间长度。
根据某些实施方式，治疗癌症包括提高患有癌症的对象的无病存活期的进展。
根据某些实施方式，治疗癌症包括增加患有癌症的对象的相应时间长度。根据其他实施方式，治疗癌症包括阻止肿瘤复发。
可以通过符合本发明的治疗补救的癌症包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴系恶性肿瘤。这些癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种不同类型的头颈癌以及B-细胞淋巴瘤(包括低等级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中等级/滤泡性NHL、中等级弥散性NHL、高等级成免疫细胞性NHL、高等级成淋巴细胞性NHL、高等级小无裂细胞NHL、巨块病NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关的淋巴瘤和Waldenstrom's巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞性白血病和移植后淋巴增殖性障碍(PTLD)以及伴有母斑细胞病、水肿(例如与脑肿瘤相关的水肿)和Meigs综合征的异常血管增殖。
根据某些实施方式，所述癌症选自乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波斯肉瘤、类癌瘤、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。可以通过本发明的治疗补救的癌性病症包括转移的癌症。
根据其他实施方式，所述癌症是实体癌。
符合本发明的药物组合物可以作为独立的治疗或与使用任何其他药剂的治疗相组合给药。根据特定实施方式，符合本发明的构建体作为与至少一种抗癌药剂相组合的治疗方案的一部分给药到需要的对象。符合本发明的药物组合物可以与所述抗癌药剂相组合或分开地给药。
符合本发明的药物组合物可以与抗肿瘤组合物一起给药。
根据特定实施方式，所述抗肿瘤组合物包含至少一种化学治疗剂。
术语“抗肿瘤组合物”是指在治疗癌症中有用的组合物，其包含能够抑制或阻止肿瘤的生长或功能或转移和/或引起肿瘤细胞破坏的至少一种活性治疗剂。在抗肿瘤组合物中适合于治疗癌症的治疗剂包括但不限于化学治疗剂、放射活性同位素、毒素、细胞因子例如干扰素和靶向与肿瘤细胞相关的细胞因子、细胞因子受体或抗原的拮抗剂。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂例如噻替派和CYTOXANRTM环磷酰胺，烷基磺酸酯例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡，氮丙啶类例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替派和乌瑞替派，乙烯亚胺和甲基密胺类包括六甲密胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺和三甲密胺，多聚乙酰类(特别是布拉他辛和布拉他辛酮)，喜树碱(包括合成类似物拓朴替康)，苔藓抑素，卡利他汀，CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)，念珠藻环肽(具体来说念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)，尾海兔素，倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)，软珊瑚醇，水鬼蕉碱，匍枝珊瑚醇，海绵抑制素，氮芥类例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、甲二氯二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥，亚硝基脲类例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀，抗生素类力图烯二炔抗生素(例如卡奇霉素、尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见例如Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))，达内霉素包括达内霉素A，双膦酸盐例如氯屈膦酸盐，埃斯培拉霉素，以及新制癌菌素发色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、争光霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧基-L-正亮氨酸、ADRIAMYCINRTM多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、奎那霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星，抗代谢药例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)，叶酸类似物例如迪诺特宁、氨甲蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特，嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤，嘧啶类似物例如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷，雄激素例如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷、睾内酯，抗肾上腺药例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦，叶酸补充剂例如亚叶酸，醋葡醛内酯，醛磷酰胺糖苷，氨基乙酰丙酸，恩尿嘧啶，安吖啶，贝斯布西，比生群，依达曲沙，地磷酰胺，秋水仙胺，地吖醌，依洛尼塞，依利醋铵，埃博霉素，乙环氧啶，硝酸镓，羟基脲，蘑菇多糖，氯尼达明，类美登素例如美登素和安丝菌素，米托胍腙，米托蒽醌，莫哌达醇，二胺硝吖啶，喷司他汀，蛋氨氮芥，吡柔比星，洛索蒽醌，鬼臼酸，2-乙酰肼，丙卡巴肼，PSKRTM多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)，雷佐生，根霉素，西佐喃，锗螺胺，替奴佐酸，三亚胺醌，2,2',2-三氯三乙胺，单端孢霉烯(特别是T-2毒素、粘液霉素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)，乌拉坦，长春地辛，达卡巴嗪，甘露氮芥，二溴甘露醇，二溴卫矛醇，哌泊溴烷，加西托星，阿糖胞苷(“Ara-C”)，环磷酰胺，噻替派，类紫杉醇例如TAXOLRTM紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、无氢化蓖麻油的ABRAXANETM、紫杉醇的白蛋白工程改造的纳米粒子配方(American PharmaceuticalPartners,Schaumberg,Ill.)和TAXOTERERTM多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)，苯丁酸氮芥，GEMZARRTM吉西他滨，6-硫鸟嘌呤，巯基嘌呤，氨甲蝶呤，铂类似物例如顺铂和卡铂，长春碱，铂，依托泊苷(VP-16)，异环磷酰胺，米托蒽醌，长春新碱，NAVELBINERTM长春瑞滨，诺消灵，替尼泊苷，依达曲沙，柔红霉素，氨基喋呤，希罗达，伊班膦酸盐，伊立替康(例如CPT-11)，拓扑异构酶抑制剂RFS 2000，二氟甲基鸟氨酸(DMFO))，类视黄素例如视黄酸，卡培他滨，以及上述任一者的可药用盐、酸或衍生物。
在这个定义中还包括用于调控或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素药剂，例如抗雌激素抗体和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫西芬(包括NOLVADEXRTM他莫西芬)、雷洛昔芬、曲洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬、LY117018、奥那司酮和FARESTON托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，其调控肾上腺中的雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、MEGASERTM乙酸甲地孕酮、AROMASINRTM依西美坦、福美斯坦、法屈唑、RIVISORRTM伏罗唑、FEMARARTM来曲唑和ARIMIDEXRTM阿那曲唑；和抗雄激素抗体例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(一种1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号传导路径中的基因表达的那些反义寡核苷酸，例如PKC-α、Raf和H-Ras；核酶例如VEGF表达抑制剂(例如ANGIOZYMERTM核酶)和HER2表达抑制剂；疫苗，例如基因疗法基于DNA的疫苗，例如ALLOVECTINRTM疫苗、LEUVECTINRTM疫苗和VAXIDRTM疫苗；PROLEUKINRTM rIL-2；LURTOTECANRTM拓扑异构酶1抑制剂；ABARELIXRTM。rmRH；和上述任一者的可药用盐、酸或衍生物。
根据另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药本发明的药物组合物。根据一个实施方式，本发明提供了一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗有效量的本发明的构建体。根据某些实施方式，所述药物组合物作为治疗方案的一部分与至少一种抗癌药剂一起给药。术语“治疗有效量”是药物、化合物、构建体等在给药到对象时具有所需治疗效果的量。完全的治疗效果通过一剂的给药不必定出现，并且可能只在给药一系列药剂后出现。
根据另一方面，本发明提供了一种肽，其特异性结合到人类真核延伸因子2(eEF2)、其类似物或片段。根据一个实施方式，本发明提供了一种肽，其特异性结合到人类eEF2。根据某些实施方式，所述肽是毒素。根据某些实施方式，所述肽由5至30个氨基酸构成。根据其他实施方式，每种肽由6至25个氨基酸构成。根据另一个实施方式，每种肽由7至20个氨基酸构成。根据某些实施方式，每种肽由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸构成。每种可能性代表了本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述结合到人类eEF2的肽是具有SEQ ID NO：3的肽。根据某些实施方式，本发明提供了SEQ ID NO：3的类似物。根据另一个实施方式，本发明提供了所述肽或类似物的片段。根据一个实施方式，所述肽是具有SEQ ID NO：3的肽。根据另一个实施方式，所述肽是SEQ ID NO：3的肽。根据某些实施方式，所述肽是环状肽。
根据某些实施方式，所述类似物与SEQ ID NO：3具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性。根据某些实施方式，所述类似物与SEQ ID NO：3具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。根据其他实施方式，所述类似物与SEQ ID NO：3具有约70％至95％、75％至90％或80％至85％的序列同一性。根据某些实施方式，所述类似物是SEQ ID NO：3的保守类似物。根据某些实施方式，所述SEQ ID NO：3的保守类似物在SEQ ID NO：3中具有1、2、3、4或5个保守替换。根据某些实施方式，所述类似物是环肽。
根据一个实施方式，所述片段由SEQ ID NO：3或其类似物的6至11、7至10或8至9个连续氨基酸构成。
根据某些实施方式，所述包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽提高人类eEF2的活性。根据一个实施方式，所述肽是eEF2的激动剂。根据另一个实施方式，所述SEQ ID NO：3的类似物或所述肽或类似物的片段提高eEF2的活性。
根据一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、其类似物或所述肽或所述类似物的片段是毒素。在一个实施方式中，所述肽被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。根据某些实施方式，所述细胞是癌细胞。根据一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：3的肽被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。根据另一个实施方式，所述由SEQ ID NO：3构成的肽被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。根据另一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽的类似物被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。
术语“诱导细胞死亡”和“促进细胞死亡”在本文中可互换使用，并意味着本发明(即所述肽、类似物或片段)可以直接诱导细胞的细胞死亡，其中细胞死亡包括凋亡和坏死。所述细胞死亡可能由本发明的化合物与所述细胞表面上表达的分子或与位于所述细胞内的分子例如位于胞浆中、结合到细胞膜的内侧、位于细胞器中或存在于细胞器的膜上、不论是所述膜的内侧还是外侧部分上的分子的相互作用引起。
当在本文中使用时，术语“细胞死亡”涵盖了细胞的破坏和损伤或损害。术语“细胞死亡”涵盖细胞消融。
根据某些实施方式，所述结合到人类eEF2的肽是具有SEQ ID NO：4的肽。根据某些实施方式，本发明提供了SEQ ID NO：4的类似物。根据另一个实施方式，本发明提供了所述肽或类似物的片段。根据一个实施方式，所述肽是具有SEQ ID NO：4的肽。根据另一个实施方式，所述肽是SEQ ID NO：4的肽。根据某些实施方式，所述肽是环状肽。
根据某些实施方式，所述类似物与SEQ ID NO：4具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性。根据某些实施方式，所述类似物是SEQ ID NO：4的保守类似物。根据其他实施方式，所述类似物与SEQ ID NO：4具有70％至95％、75％至90％或80％至85％的同一性。根据某些实施方式，所述类似物是SEQ ID NO：4的保守类似物。根据某些实施方式，所述SEQ ID NO：4的保守类似物在SEQ ID NO：4中具有1、2、3、4或5个保守替换。根据某些实施方式，所述类似物是环状肽。
根据一个实施方式，所述片段由SEQ ID NO：4或其类似物的6至11、7至10或8至9个连续氨基酸构成。
根据某些实施方式，所述包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽提高人类eEF2的活性。根据一个实施方式，所述肽是eEF2的激动剂。根据另一个实施方式，所述SEQ ID NO：4的类似物或所述肽或类似物的片段提高eEF2的活性。
根据一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽、其类似物或所述肽或所述类似物的片段是毒素。在一个实施方式中，所述肽被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。根据某些实施方式，所述细胞是癌细胞。根据一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：4的肽被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。根据另一个实施方式，所述由SEQ ID NO：4构成的肽被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。根据另一个实施方式，所述包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽的类似物被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。
根据另一方面，本发明提供了特异性结合到人类eEF2的肽的偶联物。
根据一个实施方式，本发明提供了选自具有SEQ ID NO：3或由其构成的肽的肽、其类似物或其片段的偶联物。根据一个实施方式，本发明提供了具有SEQ ID NO：3或由其构成的环肽的偶联物。
根据一个实施方式，本发明提供了选自具有SEQ ID NO：4或由其构成的肽的肽、其类似物或其片段的偶联物。根据一个实施方式，本发明提供了具有SEQ ID NO：4或由其构成的环肽的偶联物。
术语“偶联物”是指从两种或更多种分子联结在一起或结合而形成的任何物质。具体来说，术语偶联物涵盖了由上述任一实施方式的两种或更多种肽的结合形成的化合物或包含所述肽结合到另一种分子的化合物。根据某些实施方式，本发明的肽、类似物或片段与提高所述肽的抗原性、溶解性、稳定性或渗透性的载体蛋白或组成部分偶联。包含符合本发明的至少一种肽的融合蛋白也在这一范围之内。
因此，根据某些实施方式，所述偶联物包含共价结合的包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、其类似物或片段的至少两个拷贝。
根据另一个实施方式，所述偶联物包含至少一种包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、其类似物或片段和另一种分子。根据某些实施方式，所述分子可以是任何分子。根据一个实施方式，所述分子选自活性药剂、细胞外肿瘤抗原靶向分子、载体、毒素、提高渗透性的组成部分和抗癌药剂。
根据某些实施方式，所述偶联物包含共价结合的包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽、其类似物或片段的至少两个拷贝。
根据另一个实施方式，所述偶联物包含至少一种包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽、其类似物或片段和另一种分子。根据某些实施方式，所述分子可以是任何分子。根据一个实施方式，所述分子选自活性药剂、细胞外肿瘤抗原靶向分子、载体、毒素、提高渗透性的组成部分和抗癌药剂。
所述细胞外肿瘤抗原靶向分子、载体、毒素、抗癌药剂如根据本发明所定义。术语“活性药剂”是指具有生物学活性、药理效果和/或治疗用途的药剂。
根据一个实施方式，所述细胞外肿瘤抗原选自EGFR、PD-L1、HER2、雄激素受体、苯二氮卓受体、钙黏蛋白、CXCR4、CTLA-4、CD2、CD19、内皮素受体、ERBB4、FGFR、叶酸受体、HER4、HGFR、粘蛋白1、OGFR、PD-1、PD-L2、PDGFR和VEGFR。
根据另一个实施方式，所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素、具有SEQ IDNO：5中所示的氨基酸序列的BIM-BH3毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。
根据另一个实施方式，所述载体可以是支架载体例如PEG载体或肽类载体。
根据某些实施方式，所述本发明的偶联物被用于在靶细胞中诱导细胞死亡。
根据另一方面，本发明提供了包含在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的肽。根据一个实施方式，本发明提供了所述具有SEQ ID NO：1的肽的类似物。根据另一个实施方式，本发明提供了所述肽或所述类似物的片段。根据一个实施方式，所述肽由SEQ ID NO：1构成。
根据某些实施方式，所述肽由5至30个氨基酸构成。根据其他实施方式，每种肽由6至25个氨基酸构成。根据另一个实施方式，每种肽由7至20个氨基酸构成。根据某些实施方式，每种肽由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸构成。每种可能性代表了本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述具有SEQ ID NO：1或由其构成的肽、其类似物或片段特异性结合到人类表皮生长因子受体(EGFR)。根据一个实施方式，所述肽、类似物或片段是EGFR的拮抗剂。根据某些实施方式，所述肽是环肽。
根据某些实施方式，所述SEQ ID NO：1的类似物与SEQ ID NO：1具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性。根据其他实施方式，所述类似物与SEQ ID NO：1具有70％至95％、75％至90％或80％至85％的序列同一性。根据某些实施方式，所述类似物是SEQ IDNO：1的保守类似物。根据某些实施方式，所述SEQ ID NO：1的保守类似物具有1、2、3、4或5个保守替换。根据某些实施方式，所述类似物是环肽。
根据一个实施方式，所述片段由SEQ ID NO：1或其类似物的6至11、7至10或8至9个连续氨基酸构成。
根据某些实施方式，所述包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、其类似物或片段是癌细胞靶向肽。因此，在一个实施方式中，所述包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、其类似物或片段被用于癌细胞靶向。
根据一个实施方式，本发明提供了选自具有SEQ ID NO：1或由其构成的肽的肽、其类似物或其片段的偶联物。根据一个实施方式，本发明提供了具有SEQ ID NO：1或由其构成的环肽的偶联物。
根据某些实施方式，所述偶联物包含共价结合的包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、其类似物或片段的至少两个拷贝。根据另一个实施方式，所述偶联物包含至少一种包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、其类似物或片段和另一种分子。根据某些实施方式，所述分子可以是任何分子。根据一个实施方式，所述分子选自活性药剂、细胞外肿瘤抗原靶向分子、载体、提高渗透性的组成部分、毒素、抗癌药剂及其组合。
术语细胞外肿瘤抗原靶向分子、载体、毒素、抗癌药剂如本发明中所定义。
根据一个实施方式，所述细胞外肿瘤抗原选自EGFR、PD-L1、HER2、雄激素受体、苯二氮卓受体、钙黏蛋白、CXCR4、CTLA-4、CD2、CD19、内皮素受体、ERBB4、FGFR、叶酸受体、HER4、HGFR、粘蛋白1、OGFR、PD-1、PD-L2、PDGFR和VEGFR。
根据另一个实施方式，所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素、SEQ ID NO：5的BIM-BH3毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。
根据另一个实施方式，所述载体可以是支架载体例如PEG载体或肽类载体。
根据另一方面，本发明提供了一种肽，其包含在SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。根据一个实施方式，本发明提供了所述具有SEQ ID NO：2的肽的类似物。根据另一个实施方式，本发明提供了所述肽或所述类似物的片段。根据一个实施方式，所述肽由SEQ IDNO：2构成。
根据某些实施方式，所述肽由5至30个氨基酸构成。根据其他实施方式，每种肽由6至25个氨基酸构成。根据另一个实施方式，每种肽由7至20个氨基酸构成。根据某些实施方式，每种肽由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸构成。每种可能性代表了本发明的独立实施方式。
根据某些实施方式，所述具有SEQ ID NO：2或由其构成的肽、其类似物或片段特异性结合到人类程序性死亡-配体1(PD-L1)。
根据任一上述实施方式，所述肽、类似物或片段是PD-L1的拮抗剂。
根据某些实施方式，所述肽是环肽。
根据某些实施方式，所述SEQ ID NO：2的类似物与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性。根据其他实施方式，所述类似物与SEQ ID NO：2具有70％至95％、75％至90％或80％至85％的同一性。根据某些实施方式，所述类似物是SEQ ID NO：2的保守类似物。根据某些实施方式，所述SEQ ID NO：2的保守类似物具有1、2、3、4或5个保守替换。根据某些实施方式，所述类似物是环肽。
根据一个实施方式，所述片段由SEQ ID NO：2或其类似物的6至11、7至10或8至9个连续氨基酸构成。
根据某些实施方式，所述包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、其类似物或片段是癌细胞靶向肽。因此，在一个实施方式中，所述包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、其类似物或片段被用于癌细胞靶向。
根据一个实施方式，本发明提供了选自具有SEQ ID NO：2或由其构成的肽的肽、其类似物或其片段的偶联物。根据一个实施方式，本发明提供了具有SEQ ID NO：2或由其构成的环肽的偶联物。
因此，根据某些实施方式，所述偶联物包含共价结合的包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、其类似物或片段的至少两个拷贝。根据另一个实施方式，所述偶联物包含至少一种包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、其类似物或片段和另一种分子。根据某些实施方式，所述分子可以是任何分子。根据一个实施方式，所述分子选自活性药剂、细胞外肿瘤抗原靶向分子、载体、毒素、抗癌药剂、提高渗透性的组成部分及其组合。
所述细胞外肿瘤抗原靶向分子、载体、毒素、抗癌药剂如本发明中所定义。
根据一个实施方式，所述细胞外肿瘤抗原选自EGFR、PD-L1、HER2、雄激素受体、苯二氮卓受体、钙黏蛋白、CXCR4、CTLA-4、CD2、CD19、内皮素受体、ERBB4、FGFR、叶酸受体、HER4、HGFR、粘蛋白1、OGFR、PD-1、PD-L2、PDGFR和VEGFR。
根据另一个实施方式，所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素、具有SEQ IDNO：5中所示的氨基酸序列的BIM-BH3毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺毒素、蛇毒毒素、蓝藻毒素及其任何组合。
根据另一个实施方式，所述载体可以是支架载体例如PEG载体或肽类载体。
根据另一方面，本发明提供了包含本发明的肽或本发明的偶联物的组合物。根据一个实施方式，所述组合物是药物组合物。因此，在某些实施方式中，本发明提供了包含本发明的肽或本发明的偶联物的药物组合物。
根据一个实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：1或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含SEQ ID NO：1的类似物或所述肽或所述类似物的片段。根据某些实施方式，所述药物组合物包含多种所述肽、类似物或片段。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：1或由其构成的肽、其类似物或片段的一种或多种偶联物。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：2或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含SEQ ID NO：2的类似物或所述肽或所述类似物的片段。根据某些实施方式，所述药物组合物包含多种所述肽、类似物或片段。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：2或由其构成的肽、其类似物或片段的一种或多种偶联物。
根据某些实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：3或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含SEQ ID NO：3的类似物或所述肽或所述类似物的片段。根据某些实施方式，所述药物组合物包含多种所述肽、类似物或片段。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：3或由其构成的肽、其类似物或片段的一种或多种偶联物。
根据另一个实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：4或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含SEQ ID NO：4的类似物或所述肽或所述类似物的片段。根据某些实施方式，所述药物组合物包含多种所述肽、类似物或片段。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含符合任一上述实施方式的包含SEQ IDNO：4或由其构成的肽、其类似物或片段的一种或多种偶联物。
本发明的其他方面的涉及所述肽和偶联物的所有定义和实施方式也被这个方面所涵盖。
根据某些实施方式，所述药物组合物被用于治疗细胞增殖性疾病或障碍。根据某些实施方式，细胞增殖性疾病或障碍是癌症。根据一个实施方式，所述药物组合物包含选自如本发明的任一实施方式中所定义的肽的肽、其类似物或其片段，所述肽包含选自SEQ IDNO：1、2、3和4的氨基酸序列或由其构成。因此，在某些实施方式中，本发明提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽。根据另一个实施方式，本发明提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽。根据另一个实施方式，本发明提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有包含SEQ IDNO：3或由其构成的肽。根据某些实施方式，本发明提供了一种用于治疗癌症的药物组合物，其含有包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述药物组合物包含如本发明的任一实施方式中所定义的所述肽的一种或多种偶联物。
根据另一方面，本发明提供了一种在需要的对象中治疗增殖性疾病或障碍的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本发明的肽或偶联物。根据一个实施方式，所述方法包括给药包含本发明的肽或偶联物的药物组合物。根据一个实施方式，所述肽选自包含SEQID NO：1或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽、其类似物和所述肽的片段。根据一个实施方式，所述偶联物是所述肽的偶联物。根据一个实施方式，所述肽、类似物或片段是环状的。
根据另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码肽的序列，所述肽选自包含选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列或由其构成的肽。根据某些实施方式，所述多核苷酸包含编码如本发明的任一实施方式中所定义的肽的类似物或其片段的序列，所述肽选自包含选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列或由其构成的肽。
根据某些实施方式，所述多核苷酸包含编码所述包含SEQ ID NO：1或由其构成的肽、其类似物或其片段的序列。根据一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述具有SEQ IDNO：1的肽的序列。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述SEQ ID NO：1的肽的序列。
根据某些实施方式，所述多核苷酸包含编码所述包含SEQ ID NO：2或由其构成的肽、其类似物或其片段的序列。根据一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述具有SEQ IDNO：2的肽的序列。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述SEQ ID NO：2的肽的序列。
根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述包含SEQ ID NO：3或由其构成的肽、其类似物或其片段的序列。根据一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述具有SEQID NO：3的肽的序列。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述SEQ ID NO：3的肽的序列。
根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述包含SEQ ID NO：4或由其构成的肽、其类似物或其片段的序列。根据一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述具有SEQID NO：4的肽的序列。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码所述SEQ ID NO：4的肽的序列。
根据一个实施方式，本发明提供了一种多核苷酸，其包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2和(iii)SEQ ID NO：3的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQID NO：2和(iii)SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2、(iii)SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的至少一个拷贝。
根据另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含符合任一上述实施方式的多核苷酸。根据一个实施方式，所述多核苷酸被可操作连接到启动子。根据一个实施方式，所述核酸构建体包含一种多核苷酸，其包含编码如本发明的任一实施方式中所定义的肽、其类似物或其片段的序列，所述肽选自包含选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述核酸构建体包含一种多核苷酸，其包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2和(iii)SEQ ID NO：3的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ IDNO：1、(ii)SEQ ID NO：2和(iii)SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2、(iii)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。
当在本文中使用时，术语“核酸构建体”是指人工构建的核酸区段。它可以是分离的或被整合在另一个核酸分子中。
当在本文中使用时，术语“可操作连接”、“可操作编码”和“可操作关联”在本文中可互换使用，并且是指启动子与核酸序列之间的功能性联系，其中所述启动子启动对应于所述DNA序列的RNA的转录。
术语“启动子”是启动下游核酸的转录的调控序列。术语“启动子”是指较大DNA序列内的DNA序列，其定义了RNA聚合酶可以结合并启动转录的位点。启动子可以包括任选的远端增强子或阻遏元件。所述启动子可以是同源的，即天然存在的指导所需核酸的表达的，或者是异源的，即天然存在的指导源自于所需核酸之外的基因的核酸的表达的。启动子可以是组成型或诱导型的。组成型启动子是在大多数环境和发育条件下有活性的启动子。诱导型启动子是在环境或发育调控下有活性的启动子，例如对木糖可利用性做出响应上调。
根据另一方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的多核苷酸序列或核酸构建体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸包含编码如本发明的任一实施方式中所定义的肽、其类似物或其片段的序列，所述肽选自包含选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列或由其构成的肽。根据另一个实施方式，所述载体包含多核苷酸，其包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2和(iii)SEQ ID NO：3的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2和(iii)SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ IDNO：1、(ii)SEQ ID NO：2、(iii)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。
术语“载体”和“表达载体”在本文中可互换使用，并且是指任何非病毒载体例如质粒、粘粒、人工染色体(细菌或酵母)或病毒载体例如病毒、反转录病毒、细菌噬菌体或噬菌体，采取双链或单链直链或环状形式的二元载体，或能够转化宿主细胞并任选地能够在宿主细胞中复制的核酸序列。所述载体可以含有适用于被转化的细胞的鉴定的任选标志物，例如四环素抗体或氨苄青霉素抗性。根据一个实施方式，所述载体是质粒。根据另一个实施方式，所述载体是噬菌体或细菌噬菌体。
术语“质粒”是指能够将外来DNA片段插入到细胞并任选地能够在给定细胞中自主复制的环状、任选地双链的DNA。质粒通常除了应该被表达的序列之外还含有其他序列，如用于它们的特异性选择的标志物基因和在某些情况下用于它们在靶细胞中的游离型复制的序列。在某些实施方式中，所述质粒被设计用于在细菌中扩增和表达。质粒可以通过标准的分子生物学技术进行工程化。
根据另一方面，本发明提供了一种包含本发明的多核苷酸、本发明的核酸构建体的细胞，所述多核苷酸包含编码如本发明的任一实施方式中所定义的肽、其类似物或其片段的序列，所述肽选自包含选自SEQ ID NO：1、2、3和4的氨基酸序列或由其构成的肽。根据另一个实施方式，本发明提供了一种包含多核苷酸的细胞，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2和(iii)SEQ ID NO：3的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ IDNO：1、(ii)SEQ ID NO：2和(iii)SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。根据另一个实施方式，所述多核苷酸包含编码多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1、(ii)SEQ ID NO：2、(iii)SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。
当在本说明书中使用时，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”意味着“至少部分由……构成”。当解释本说明书中包括术语“包含”的每个陈述时，以所述术语开始的一个或多个特点之外的特点也可能存在。相关的术语例如“包含”以同样的方式解释。术语“具有”和“包含”也可以涵盖“由……构成”和“基本上由……构成”的意义，并且可以用这些术语替换。术语“由……构成”排除了没有具体描绘或列出的任何组分、步骤或程序。术语“基本上由……构成”意味着所述组合物或组分可能包括另外的成分，但仅在所述另外的成分不实质性改变所宣称的组合物或方法的基本和新颖特征的前提下。
当在本文中使用时，术语“约”在指称可测量的值例如量、时距等时，意味着涵盖距所指定的值+/-10％或+/-5％、+/-1％或甚至+/-0.1％的变动。
下面的实施例旨在说明如何制造和使用本发明的化合物和方法，并且绝不应该被解释为限制。尽管现在将与特定实施方式相结合来描述本发明，但显然许多修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，打算涵盖落于权利要求书的精神和广阔范围之内的所有这些修改和改变。
实施例
实施例1.构建体的文库
包含支链PEG、毒素肽和两种靶结合肽的构建体的文库。每种构建体包含具有8个连接臂的支链PEG，每个臂具有NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)末端，肽的氨基组成部分与其相连。每个支架连接有8个肽：肽毒素的6个拷贝和两种靶结合肽中每一者的1个拷贝。
在所述文库的不同构建体中包括肽毒素和靶结合肽的不同组合(参见表1)。
表1.构建体的实例
一种示例性排列方式如下：所述毒素是1-节球藻素，2-ProTx-I，3–Viperistatin片段，并且所述结合肽针对下述靶：A-雄激素受体，B-ERBB4，和C-CXCR4。
另一种示例性排列方式是毒素1–SEQ ID NO：3的环毒素，毒素2–SEQ ID NO：4的环毒素，毒素3–SEQ ID NO：3和4的环毒素的组合；所述肽是肽A–环状肽SEQ ID NO：1，肽B–环状肽SEQ ID NO：3，肽C针对结合雄激素受体、B-ERBB4或C-CXCR4。
所述构建体使用本领域中已知的方法包括Fmoc-固相肽合成来合成，使用HPLC进行纯化，并使用本领域中公知的测定法和动物模型在体外和体内测试特异性活性例如抗增殖活性。
实施例2.环毒素Tox1和Tox2的制备
使用在WO 2007/010525中描述的技术，产生并试验了结合到人类真核延伸因子2(eEF2)的环肽(被称为毒素或环毒素Tox1和Tox2)。被称为Tox1(由SEQ ID NO：3构成)和Tox2(由SEQ ID NO：4构成)的环状肽的序列提供在表2中。
表2.两种毒性肽。
实施例3.Tox1和Tox2与eEF2的结合
使用eEF2或BSA作为配体，通过ELISA试验了Tox 1和Tox2与eEF2的结合。
实验部分
将0.25μg靶蛋白eEF2(人类；酵母来源的)或BSA(阴性对照)在50μl PBS中施加到maxisorp板(NUNC)的几个孔并在4℃温浴过夜。除去溶液，并向每个孔增补280μl阻断溶液(BSA 2mg/ml)。将所述板在25℃温浴1hr。
向1.5ml管添加100μl阻断溶液+109pfu(噬斑形成单位)的M13噬菌体，所述噬菌体表达下述肽：eEF2结合性：RB，LBRl，TB2(Tox1)，YO2，GW(Tox2)，DRB，PY，BW。将所述板在25℃温浴1hr。舍弃溶液，并将所述孔用280μl清洗缓冲液(Tween 20 0.05％)清洗7次。
向每个孔增补50μl 1:5000稀释的HRP/抗M13单克隆抗体偶联物(GEHealthcare)。将所述板在25℃温浴1hr。舍弃溶液，并将所述孔用280μl清洗缓冲液(Tween20 0.05％)清洗7次。向每个孔增补50μlTMB(T0440；Sigma)。
在1.5min和30min的温浴时间后，使用扫描仪对所述板照相。从图2可以看到，Tox1(在图中被称为TB2)具有最强的效应。
实施例4.Tox1和Tox2活化eEF2
使用HeLa裂解液系统一步人类偶联IVT试剂盒-DNA(ThermoFisher Scientific)，在体外转录/翻译系统中测试了Tox1和Tox2的效应。试验了下述肽：GW(Tox1)，DRB RB，TB2(Tox2)和BW。此外，也试验了非eEF2结合性对照肽GR。
将IVT试剂盒的组分混合，并取出一部分充当阴性对照。向剩余的混合物增补pCFE-GFP DNA。这种DNA在转录和翻译时给出绿色荧光蛋白GFP。荧光的程度提供了蛋白质合成程度的度量。
将所述混合物分成9ml的等分试样。向每个等分试样增补1ml一种浓度的特定肽。向阳性对照增补对照1ml PBS。将反应混合物在30℃温浴4hr。
向每个反应混合物添加40ml PBS。将所述混合物转移到96孔黑色ELISA板，并在ex/em 482/512nm下测量荧光。
从结果(参见图3)可以看出，在5μM的浓度下大多数肽给出比阳性对照(不含肽；橙色点)更高的荧光，并且超过所述非eEF2结合性对照肽。这意味着它们提高蛋白质合成，其中TB2和GW提供最高的效应。
实施例5.载有2种靶向肽和2种毒素的多臂PEG复合物的制备
设计并合成了共价偶联有两种不同的癌症靶向组成部分和两种不同的毒素组成部分的支链PEG分子的构建体(所述支架的示意图示出在图1中)。包含在这个构建体实施例中的靶向组成部分是环状肽E13.3(由SEQ ID NO：1构成)和PD-L1-GR(由SEQ ID NO：2构成)，并且所述毒素组成部分是环状肽Tox1(由SEQ ID NO：3构成)和Tox2(由SEQ ID NO：4构成)。
制备方法包括两个步骤。在第一个步骤中，生产含有8个臂的支链PEG，其中7个臂偶联有靶向/毒素组成部分(受保护的肽)，1个臂具有被FMOC保护的赖氨酸残基(Fmoc-Lys)。在第二个步骤中，将8个在步骤1中生产的肽/毒素-PEG分子偶联到另一个8臂支链PEG分子，以获得偶联有56个毒素/靶向组成部分的多支链PEG的构建体，其中42个组成部分是毒素肽(21个Tox1和21个Tox2)，并且14个是靶向肽(EGRF靶向肽E13.3的7个拷贝和PD-L1靶向肽PD-L1-GR的7个拷贝)。
更详细来说：
步骤1–偶联有一种类型的靶向或毒素组成部分的支链PEG的制备
将2.4μmole靶向肽或7.3μmole毒素肽溶解在DMSO中。
除了E13.3之外的所有肽只具有一个伯胺，而E13.3具有3个，其中一个用dde保护，并且N-端用乙酸残基阻断。
5.9将mg Fmoc-Lys-OH(Novabiochem(Merck)，目录号852023；MW＝368.43)溶解在150μl HCl 0.1M中，然后添加650μl DMSO以达到20mM的浓度。
将33.4mg 8臂星状PEG-NHS(Mw 10KDa，Creative Biotechnologies)溶解在167μl二噁烷中，以达到20mM的浓度。
将每种所述靶向肽溶液与17μl Fmoc-Lys-OH溶液和17μl PEG溶液混合。
将每种所述毒素肽溶液与52μl Fmoc-Lys-OH溶液和52μl PEG溶液混合。向每种混合物增补TEA(三甲胺)至5％。将每种溶液在室温下在Rotamix上以30rpm温浴15.5小时，以获得偶联有特定靶向/毒素组成部分的7个分子并且一个臂含有伯胺(Fmoc保护在这个过程中被除去，在每个PEG分子上给出一个游离伯胺)的8臂PEG的透明溶液。
所述支链PEG-肽分子被称为PEG-E13.3、PEG-PD-L1-GR、PEG-Tox 1和PEG-Tox 2。
步骤2–偶联有56个靶向/毒素组成部分的多支链PEG构建体的构建
将所述支链PEG-肽溶液PEG-E13.3、PEG-PD-L1-GR、PEG-Tox1和PEG-Tox2与20mMPEG-NHS溶液混合在一起，PEG-NHS:PEG-E13.3:PEG-PD-L1-GR:PEG-Tox1:PEG-Tox2的化学计量摩尔比为1:1:1:3:3，并在室温下在Rotamix上以30rpm温浴2小时，然后缓慢添加80％肼至终浓度为5％。肼被用于从E13.3组成部分除去dde保护基团。将所述混合物在室温下在Rotamix上以30rpm温浴2小时。得到的构建体是偶联有56个靶向/毒素组成部分的多支链PEG：E13.3肽的7个拷贝，PD-L1-GR肽的7个拷贝，Tox1的21个拷贝和Tox 2的21个拷贝。在反应结束时，添加PBS并轻柔混合。
步骤3–超滤
使用Vivaspin 20浓缩仪(30K MWCO PES)，通过两次添加20ml PBS将所述样品超滤至被称为PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2的装载后的多臂PEG的浓度为～206μM，并将缓冲液替换为PBS。
以类似的方式生产带有可替选毒素或肽(例如BIM)的其他多支链PEG。这种多臂PEG的实例是PEG-E13.3-PD-L1-GR-BIM，其中毒素Tox 1和Tox 2被BIM替换。
实施例6.包含E13.3、Tox1和Tox2的构建体的毒性
产生了结合到具有序列SEQ ID NO：1(CHPGDKQEDPNCLQADK)的E13.3靶向肽和选自BIMBH3(也被称为BIM并具有序列SEQ ID NO：5MRPEIWIAQELRRIGDEFNA)或Tox1和Tox2的组合的毒素的多臂PEG支架的构建体。所述支架如实施例5中所述来制备，并被相应地称为PEG-E13.3-Tox1-Tox2和PEG-13.3-BIM。
细胞培养和接种：
将A431细胞(人类鳞状细胞癌，在每个细胞上表达约100,000个EGFR的拷贝)和MCF-7细胞(乳腺癌细胞，在每个细胞上表达约3,000个EGFR on each细胞的拷贝)融化并培养，以获得指数生长的培养物。收集细胞，计数，并分别以7,000个细胞/孔和5,000个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板中。
将所述板在下述条件下温浴直至第二天：37±1℃，加湿和5±0.5％CO2/空气，以使细胞能够附着到孔。
处理：
使用Alamar Blue活力测定法测试A549细胞的细胞活力。在接种后第二天，将生长培养基更换为200μl测定法培养基，其含有2％FBS和不同浓度下的构建体试验品(1、3和8μM)或介质对照(PBS；浓度-0)。将板在37±1℃、加湿5±0.5％CO2/空气下温浴。温浴48小时后，在显微镜上获取细胞处理的图像(参见图4-7)。
从这些实验可以得到几个结论。首先，当在图上可以看到典型的细胞聚集，特征为当添加包含PEG-E13.3和任一种毒素的构建体时A431和MCF-7消失(图5-6)。此外，所述现象是剂量依赖性的。然而，当所述构建体缺少E13.3肽时(图7)，提高毒素的浓度不显著提高死细胞的比例，并且实际上与对照没有差异。这个结果清楚地表明E13.3将所述构建体靶向所述细胞。
其次，死细胞的比例随着毒素(对于BIM和Tox1与Tox2的组合两者来说)浓度的提高而提高，指示了剂量依赖性效应。此外，将为BIM和Tox1与Tox2的组合获得的图像进行比较，可以看到所述组合更加强力，引起更严重的细胞死亡。正如预期的，表达更少EGFR的MCF-7细胞的敏感性比A431细胞更低。
总结上述所有结果，显然包含毒素例如Tox1、Tox2或其组合和靶向肽的构建体有效地靶向并治疗癌症，其中所述靶向肽中的至少一者是E13.3。
实施例7.在A431细胞上所试验的构建体的毒性
在与实施例5和6相似的条件下，制备了PEG-PD-L1-GR-BIM、PEG-E13.3-BIM和PEG-E13.3-PD-L1-GR-BIM构建体，并使用A431细胞和Alamar Blue活力测定法测试细胞毒性，所述构建体的浓度在10nM至1μM之间变化。在48小时的温浴后，在显微镜上获取细胞处理的图像。
结果呈现在图8中。可以看到构建体PEG-PD-L1-GR-BIM和PEG-E13.3-BIM在1μM浓度下杀死A431细胞的能力有限。另一方面，E13.3和PD-L1-GR靶向肽的组合提供了超过60％的细胞杀死。事实上，包含两种靶向肽的构建体的细胞毒性效应高于包含这两种肽之一的两种构建体的累加效应。这清楚地表明包含两种靶向肽和Tox1与Tox2的组合的构建体具有协同细胞毒性。
实施例8.PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2和PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM构建体对A549细胞系的生长和生存力的影响
材料和方法
试验品PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2和PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM如实施例5中所述来制备并以10μM的浓度使用。磷酸盐缓冲盐水(PBS)被用作对照。
将A-549细胞(人类肺肿瘤细胞)融化并培养，以获得指数生长的培养物。收集细胞，计数，并以下述密度接种在96孔组织培养板中：A-549：5,000个细胞/孔。
将所述板在37±1℃、加湿、5±0.5％CO2/空气下温浴至第二天，以使细胞附着到所述孔。
处理
在接种后第二天，将生长培养基更换为在测定法培养基(2％FBS)中制备的试验品溶液。将试验品溶液以200μl/孔的体积小心地施加(在孔的侧壁上，不直接在细胞上)，以获得如下的终浓度：PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2：3或10μM，PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM-10μM。
将所述板在37±1℃、加湿、5±0.5％CO2/空气下温浴。
在48小时的温浴后，在显微镜上获取细胞处理的代表性图像。结果呈现在图9上。
结果
正如可以从图9清楚地看到的，PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2在3和10μM两种浓度下有效地杀死A549细胞。有趣的是，PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2在3μM浓度下远比10μM包含公知的BIM毒素的PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM构建体更加高效。
实施例9.PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2在小鼠中的急性IV毒性
PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2如实施例5中所述来制备，并按照表3中描述的方案，使用4ml/kg的剂量静脉内注射到3只7周龄雌性Hsd:ICR(CD-)小鼠。
表3.给药日程表
对体重和个体的临床征兆进行20天的观察。在体重或试验的临床征兆中都没有看到显著的异常。将所述动物在第20天安乐死并进行个体的肉眼尸检。在检查期间没有检测到异常。这个实施例的结果清楚地表明PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2构建体在体内非常安全。
实施例10.在体内评估PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-Tox1-Tox2的抗肿瘤效应
材料和方法：
动物：允许分成三组(1个对照组和2个试验品组)的18只6-7周龄的无胸腺雌性裸小鼠适应环境至少5天。在适应后，将A431肿瘤细胞皮下注射到每只小鼠的右胁区域，注射日被称为第0日。
监测下述参数：体重(每周两次)，肿瘤尺寸(用数字卡尺测量)，并将肿瘤体积计算为宽度2×长度/2。
当肿瘤达到100-150mm3的尺寸时，在第一周内对小鼠进行3次试验品的IV注射。对动物继续观察3周。
在观察期后，将小鼠安乐死，将肿瘤切下，测量并在4％甲醛溶液中固定，用于进一步分析。
实施例11：EGF受体的拮抗剂：筛选，纯化
筛选
使用在WO 2007/010525中描述的技术，产生并试验了结合到人类表皮生长因子受体(EGFR)的一系列新的肽(环肽)。在鉴定到几种潜在肽后，进行另外几轮优化。被称为E13.3并具有序列CHPGDKQEDPNCLQADK(SEQ ID NO：1)的一种所述肽，在其结合位点处显示出对受体的高亲和性。
表达和纯化
将包含用于表达鉴定到的肽E7.1、E10.2、E10.3、E13.3、E15.1.3-T、E14.1.1、E14.1.4、E23I3、E23I5和A4.3.12-T的质粒的细菌，从在5ml含有氨苄青霉素的2YT培养基中2.5μl包含相关肽质粒的细胞开始，在38℃和350rpm下生长过夜。将2ml每种起始培养物在37℃下在50ml 2YT中生长；在OD 1.5-2.5时用0.43mM IPTG诱导表达3小时，然后将所述细胞离心并保持在-20℃下。
将所述细胞在DNases I和B-Per(细菌蛋白提取试剂)存在下用溶菌酶裂解，并使用Ni-NTA珠子通过亲和层析以分批方式纯化所述肽。简短来说，将所述肽在20mM咪唑存在下装载在Ni-NTA珠子上，用PBS清洗并用250mM咪唑洗脱。使用PALL Life Sceince的Nanosep离心机装置3K gray进行缓冲液更换。所述肽的量通过CoomassiePlus蛋白质测定法来测试(参见图10)。
实施例12.所述肽对EGFR的影响
通过ELISA试验评估了在人类表皮样癌细胞系A431中几种肽对人类EGFR的磷酸化水平的影响。简单来说，使用0.25％胰蛋白酶/EDTA溶液将指数生长的A431细胞培养物从培养瓶分离，将200μl细胞悬液以2×105个细胞/ml的密度转移到96孔板并生长约3天。在培养基更换后，添加50μl EGF稀释液和EGF+肽(分别为50ng/ml和0.2mg/ml)。将所述板在37℃下温浴7.5min。除去含有EGF的培养基，通过150ul固定溶液将所述细胞固定，并在室温下温浴20min，然后将板用triton清洗溶液清洗两次。通过与作为第一抗体的phospho-EGFR(Tyr1045)抗体和作为第二抗体的抗兔IgG抗体温浴，来评估磷酸化的水平。不同肽抑制EGFR的自体磷酸化的能力呈现在图2上。EGFR自体磷酸化的归一化的抑制百分数呈现在图11和表4中。所述归一化的抑制百分数被计算为使用相同的EGF浓度，试验品的荧光信号除以不含试验品的对照的荧光信号。
表4.EGFR自体磷酸化的归一化的抑制百分数
克隆 A4.3.12 E23I5 E23I3 E14.1.4 E14.1.1 E15.1.3 E13.3 E10.2 E7.1
抑制％ 23 35 66 72 80 61 99.4 68 30
正如可以从图11和表4清楚地看到的，在所述肽中E13.3具有较高的抑制活性，计算的IC50为2μM。
实施例13.E13.3在牛血清中的稳定性
所选肽在牛血清中的稳定性，通过在将所述肽与牛血清温浴后测量所述肽的抑制活性来评估。所述抑制活性如实施例12中所述来测量。所述肽的抑制活性在将所述肽与牛血清在37℃下温浴不同时间段后来评估。样品中的EGF浓度为50ng/ml。结果呈现在图12中。可以清楚地看到，所有肽在牛血清中都具有相近的稳定性，t0.5为约1.5小时。
实施例14.所述肽的抑制效能是剂量依赖性的
以与实施例12中相似的方式，通过ELISA评估不同浓度的所选肽的效能。结果呈现在图13中。所有肽的IC50为约0.5-1μM。
实施例15.结合到8臂PEG的E13.3的制备
将9.8mg E13.3(fmoc)Lys溶解在水中至终浓度为20mg/ml。将11.3mg 8臂PEG琥珀酰亚胺基羧甲基酯MW 73,000(JENKEM TECHNOLOGY USA INC)和565μl二噁烷在37℃下加热至完全溶解。将E13.3和PEG溶液在50μl TEA存在下混合，并在室温下温浴过夜。向所述得到的溶液添加50μl哌啶，并在室温下温浴0.5小时。向所述溶液添加1ml乙酸乙酯以获得悬液，然后将其离心并除去上层相。将这些使用乙酸乙酯清洗的步骤重复4-5次。最后，将上层相完全除去，并将剩余的沉淀物溶解在200μl PBS中。使用Vivaspin 20ml浓缩器将所述缓冲液进一步用PBS交换，以消除任何痕量的乙酸乙酯。
实施例16.E13.3在小鼠中的稳定性
单独的或结合到8臂PEG的荧光标记的肽E13.3的体内稳定性，通过将所述化合物注射到小鼠的尾静脉来评估。在不同的时间间隔时分析所述动物的血液中所述肽(荧光)的存在。从图14中呈现的结果可以清楚地看到，游离肽的t0.5(约几分钟)比结合到PEG的肽(t0.5为约3.5小时)短得多。
实施例17.E13.3对不同癌细胞系的存活力的影响
使用几种癌细胞系(A549–人类肺癌细胞系和FaDu–人类咽癌细胞系)评估了E13.3的抗癌活性。将所述细胞培养物在存在或不存在E13.3(不同浓度下)的情况下温浴，并使用alamarBlue试剂测试存活力。结果呈现在图15上。可以看到，结合到PEG的E13.3在所有试验的浓度下可以成功地降低癌细胞的存活率。
实施例18.荧光PEG-E13.3在癌症肿瘤中的积累
将E13.3-PEG用荧光素标记并IV注射到带有皮下NCI-H1650肿瘤(肺癌)的异种移植小鼠。在特定时间点，在麻醉后收集肾脏、肝脏和肿瘤并测量荧光。结果呈现在图16和17中。
正如可以从图16看到的，在肾脏和肝脏中存在荧光的快速增加，随后具有典型的消除曲线。与此相反，荧光在癌细胞中积累，表明E13.3有效地结合、进入并积累在所述癌细胞中。图17上显示的结果进一步支持大多数所述癌细胞与E13.3-PEG相互作用并内化所述荧光肽。
实施例19：PD-L1结合蛋白
筛选
使用在WO 2007/010525中描述的方法，产生并试验了结合到人类PD-L1的一系列新的肽(环肽)。在鉴定到几种潜在肽后，进行了另外几轮优化。被称为PD-L1-GR并具有序列CysGluGlyLeuProAlaAspTrpAlaAlaAlaCys(SEQ ID NO：2)的一种所述肽在其结合位点处对受体显示出高亲和力。
实施例20.结合到多臂PEG的PD-L1-GR肽的构建体的制备
如实施例5中所述，制备了多臂PEG构建体，其包含(i)PD-L1-GR环状肽和BIM-BH3(被称为PEG-(PD-L1-GR)-BIM)，(ii)E13.3靶向肽(SEQ ID NO：1)和BIM-BH3毒素(被称为PEG-E13.3-BIM)，和(iii)E13.3、PD-L1-GR和BIM-BH3毒素(被称为PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM)。
所述构建体以1μM的浓度在细胞增殖测定法中用作试验品。PBS被用作对照。对于所述测定法来说，将A549细胞(人类肺癌细胞系)融化并培养，以获得指数生长。收集所述细胞，计数，并以7,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板中。将所述板在37±1℃、加湿、5±0.5％CO2/空气下温浴至第二天，以使细胞附着到所述孔。在第二天，将生长培养基更换为在测定法培养基(2％FBS)中制备的试验品溶液。试验品溶液以200μl/孔的体积小心地施加，以获得1μM的试验品终浓度。在48小时的温浴后，在显微镜上获取细胞处理的代表性图像，其呈现在图18中。
从图18可以看到，包含PEG-E13.3-(PD-L1-GR)-BIM的构建体是在1μM浓度下抑制细胞增殖的唯一构建体。这表明所述包含E13.3和PD-L1-GR肽的组合的复合物具有比只包含所述肽中的一种的构建体的合并的细胞毒性明显更高的细胞毒性。
尽管在上文中已利用优选实施方式对本发明进行了描述，但它可以被修改而不背离在权利要求书中所定义的本发明的精神和本质。
序列表
<110> AEBI有限公司
<120> 治疗性多靶向构建体及其用途
<130> AEBI/002 PCT
<150> 62/401192
<151> 2016-09-29
<150> 62/401195
<151> 2016-09-29
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide
<400> 1
Cys His Pro Gly Asp Lys Gln Glu Asp Pro Asn Cys Leu Gln Ala Asp
1 5 10 15
Lys
<210> 2
<211> 12
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<220>
<223> peptide
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<212> PRT
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<400> 3
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1 5 10
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<223> peptide
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1 5 10 15
Glu Phe Asn Ala
20

Claims (72)

1.一种构建体，其包含结合到至少两种不同的细胞外肿瘤抗原的至少两种不同的肽和至少一种毒素，其中所述肽和毒素直接共价结合或通过载体共价结合。
2.权利要求1的构建体，其中所述肽中的至少一种特异性结合到选自人类表皮生长因子受体(EGFR)和人类程序性死亡-配体1(PD-L1)的细胞外肿瘤抗原。
3.权利要求2的构建体，其中所述至少两种肽中的另一者特异性结合到选自下述的细胞外肿瘤抗原：EGFR，PD-L1，HER2，雄激素受体，苯二氮卓受体，钙黏蛋白，CXCR4，CTLA-4，CD2，CD19，内皮素受体，ERBB4，FGFR，叶酸受体，HER4，HGFR，粘蛋白1，OGFR，PD-1，PD-L2，PDGFR和VEGFR。
4.权利要求1至3任一项的构建体，其中每一个所述肽由5至30个或10至25个氨基酸残基构成。
5.权利要求1至4任一项的构建体，其中所述构建体包含3至10种不同的肽。
6.权利要求1至5任一项的构建体，其中所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR。
7.权利要求6的构建体，其中所述肽包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或其类似物。
8.权利要求7的构建体，其中所述类似物与SEQ ID NO：1具有至少70％的同一性。
9.权利要求1至5任一项的构建体，其中所述肽中的至少一种特异性结合到PD-L1。
10.权利要求9的构建体，其中所述肽包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或其类似物。
11.权利要求10的构建体，其中所述类似物与SEQ ID NO：2具有至少70％的同一性。
12.权利要求1至5任一项的构建体，其中所述肽中的一种特异性结合到EGFR并且所述肽中的一种特异性结合到PD-L1。
13.权利要求12的构建体，其中特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽或其类似物，并且特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽或其类似物。
14.权利要求1至13任一项的构建体，其中所述构建体包含所述肽中的至少一种的多个拷贝。
15.权利要求14的构建体，其中所述构建体包含所述肽中的至少一种的2至50个拷贝。
16.权利要求1至15任一项的构建体，其中所述毒素是肽、多肽或蛋白质毒素。
17.权利要求16的构建体，其中所述毒素选自特异性结合到真核延伸因子2的毒素、SEQID NO：5的BIM-BH3、白喉毒素、假单胞菌外毒素、炭疽毒素、肉毒毒素、蓖麻毒素、PAP、皂草毒蛋白、白树毒素、地肤子皂苷、ProTx-I、ProTx-II、加州芋螺(Conus californicus)毒素、蛇毒毒素和蓝藻毒素。
18.权利要求17的构建体，其中结合到真核延伸因子2的毒素是包含选自SEQ ID NO：3、4或其类似物的氨基酸序列的毒素。
19.权利要求17或18的构建体，其中所述毒素包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列。
20.权利要求16至19任一项的构建体，其中所述构建体包含2至10种不同的毒素。
21.权利要求20的构建体，其中所述构建体包含具有SEQ ID NO：3的毒素和具有SEQ IDNO：4的毒素。
22.权利要求16至21任一项的构建体，其中所述构建体包含所述毒素中的至少一种的多个拷贝。
23.权利要求22的构建体，其中所述构建体包含所述毒素中的至少一种的2至50个拷贝。
24.权利要求23的构建体，其中所述构建体包含具有SEQ ID NO：3的毒素的2至50个拷贝和具有SEQ ID NO：4的毒素的2至50个拷贝。
25.权利要求1的构建体，其中所述肽中的一种特异性结合到EGFR并且所述肽中的一种特异性结合到PD-L1，并且所述毒素选自结合到真核延伸因子2的毒素和具有SEQ ID NO：5的毒素。
26.权利要求25的构建体，其包含具有SEQ ID NO：1的肽或其类似物、具有SEQ ID NO：2的肽或其类似物和具有选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列的至少一种毒素。
27.权利要求26的构建体，其包含含有SEQ ID NO：1的肽或其类似物、含有SEQ ID NO：2的肽或其类似物、含有SEQ ID NO：3的毒素和含有SEQ ID NO：4的毒素。
28.权利要求25至27任一项的构建体，其包含所述肽和毒素中的每一种的多个拷贝。
29.权利要求1至28任一项的构建体，其中所述肽中的至少一种和/或至少一种毒素通过载体共价结合，其中所述载体是有机支架。
30.权利要求1至29任一项的构建体，其中所述肽和毒素中的每一种被结合到载体，并且其中所述载体是有机支架。
31.权利要求29或30的构建体，其中所述有机支架包含聚乙二醇(PEG)分子或改性的PEG分子。
32.权利要求31的构建体，其中所述PEG分子包含8至56个可用于结合所述肽和毒素的位点。
33.权利要求29至32任一项的构建体，其中所述肽中的每一种的多个拷贝和至少一种毒素的多个拷贝被结合到所述载体，并且其中所述肽中的至少一种特异性结合到EGFR或PD-L1。
34.权利要求33的构建体，其中所述肽中的一种特异性结合到EGFR，并且所述肽中的一种特异性结合到PD-L1。
35.权利要求34的构建体，其中特异性结合到EGFR的所述肽是具有SEQ ID NO：1的肽或其类似物，并且特异性结合到PD-L1的所述肽是具有SEQ ID NO：2的肽或其类似物。
36.权利要求34或35的构建体，其中所述毒素包含选自SEQ ID NO：3、4和5的氨基酸序列或其类似物。
37.权利要求33的构建体，其中所述构建体包含(i)具有SEQ ID NO：1的肽、(ii)具有SEQ ID NO：2的肽、(iii)具有SEQ ID NO：3的毒素和(iv)具有SEQ ID NO：4的毒素的多个拷贝，其中所述肽和毒素中的每一种被结合到所述支架。
38.权利要求33的构建体，其中所述构建体包含(i)由SEQ ID NO：1构成的肽、(ii)由SEQ ID NO：2构成的肽、(iii)由SEQ ID NO：3构成的毒素和(iv)由SEQ ID NO：4构成的毒素的多个拷贝，其中所述肽和毒素中的每一种被结合到所述支架。
39.权利要求37或38的构建体，其中具有SEQ ID NO：1或由其构成的肽、具有SEQ IDNO：2或由其构成的肽、具有SEQ ID NO：3或由其构成的毒素和具有SEQ ID NO：4或由其构成的毒素之间的化学计量摩尔比为1:1:3:3。
40.权利要求1至39任一项的构建体，其中所述肽或所述毒素中的至少一种通过连接物或间隔物连接到所述支架。
41.权利要求1至40任一项的构建体，其还包含提高渗透性的组成部分。
42.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至41任一项所述的构建体和可药用赋形剂。
43.权利要求42的药物组合物，其用于治疗癌症。
44.一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药根据权利要求42所述的药物组合物。
45.权利要求44的方法，其中所述药物组合物作为治疗方案的一部分与至少一种抗癌药剂相组合给药。
46.一种特异性结合到人类真核延伸因子2(eEF2)的肽，其中所述肽包含选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其类似物。
47.权利要求46的肽，其中所述类似物与所述肽具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性。
48.权利要求46或47的肽，其中所述肽或其类似物是环状的。
49.权利要求46至48任一项的肽，其中所述肽提高eEF2活性。
50.权利要求46至49任一项的肽，其用于诱导细胞死亡。
51.权利要求50的肽，其中所述细胞是癌细胞。
52.权利要求46至50任一项的肽，其中所述肽由选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的氨基酸序列构成。
53.一种肽，其包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列或其类似物。
54.权利要求53的肽，其中所述肽是人类表皮生长因子受体(EGFR)的拮抗剂。
55.权利要求53或54的肽，其中所述类似物与SEQ ID NO：1具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性。
56.权利要求53至55任一项的肽，其中所述肽或其类似物是环状的。
57.权利要求53至56任一项的肽，其中所述肽由SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列构成。
58.一种肽，其包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列或其类似物。
59.权利要求58的肽，其中所述肽或其类似物是人类程序性死亡-配体1(PD-L1)的拮抗剂。
60.权利要求58或59的肽，其中所述类似物与SEQ ID NO：2具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性。
61.权利要求58至60任一项的肽，其中所述肽是环状的。
62.权利要求58至61任一项的肽，其中所述肽由SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列构成。
63.权利要求58至62任一项的肽，其用于靶向到癌细胞。
64.一种偶联物，其包含至少一种权利要求46至63任一项的肽。
65.一种药物组合物，其包含权利要求46至63任一项的肽或权利要求64的偶联物，以及可药用载体。
66.权利要求65的药物组合物，其中所述组合物包含多种所述肽或所述偶联物。
67.权利要求65或66的药物组合物，其用于治疗癌症。
68.一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括给药治疗有效量的权利要求46至63任一项的肽或权利要求64的偶联物。
69.一种分离的多核苷酸，其包含编码根据权利要求46至63任一项所述的肽或其类似物的序列。
70.一种分离的多核苷酸，其包含编码一种多肽的序列，所述多肽包含(i)SEQ ID NO：1的至少一个拷贝；(ii)SEQ ID NO：2的至少一个拷贝；(iii)SEQ ID NO：3的至少一个拷贝，和/或SEQ ID NO：4的至少一个拷贝。
71.一种核酸构建体，其包含可操作连接到启动子的权利要求69或70的多核苷酸。
72.一种载体，其包含至少一种根据权利要求70所述的多核苷酸。
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