ES2874668T3 - Conjugados anticuerpo-fármaco dirigidos a uPARAP - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido contra uPARAP que comprende: a) un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP), b) un agente activo, donde el agente activo se selecciona de entre un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo y un marcador detectable, y c) un enlazador que une a) con b).

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados anticuerpo-fármaco dirigidos a uPARAP
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a conjugados moleculares dirigidos al receptor uPARAP, en particular conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) dirigidos contra uPARAP y su uso en la administración de agentes activos a células y tejidos que expresan uPARAP. La divulgación se refiere además al uso de dichos CAF en el tratamiento de enfermedades que involucran células que expresan uPARAP, tales como ciertos cánceres.
Antecedentes
La proteína asociada al receptor activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPARAP - Urokinase-type Plasminogen Activator Receptor Associated Protein), también conocida como CD280, Endo180 y receptor de manosa C tipo 2, es un miembro de la familia de receptores de manosa de macrófagos de glucoproteínas transmembrana endocíticas. uPARAP es una proteína de membrana involucrada en el recambio de la matriz durante la remodelación tisular, particularmente la captación y degradación intracelular de colágeno.
El receptor uPARAP está regulado positivamente en las células tumorales de cánceres específicos, incluidos los sarcomas y el glioblastoma en etapa tardía. Además, el receptor se regula positivamente con mayor frecuencia en las células estromales que rodean a los tumores sólidos y alguna bibliografía sugiere una alta expresión de uPARAP en la metástasis ósea del cáncer de próstata (Caley y col., 2012, J. Pathol 5: 775-783). En individuos adultos sanos, el receptor muestra un patrón de expresión restringido (Melander y col., 2015, Int J Oncol 47: 1177-1188).
Los conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) son una nueva clase de fármaco biofarmacéutico muy potente diseñado como terapia dirigida, en particular para el tratamiento del cáncer. Los CAF son moléculas complejas compuestas por un anticuerpo (un mAb completo o un fragmento de anticuerpo) unido, mediante un enlazador químico estable que puede poseer enlaces lábiles, a un fármaco biológicamente activo o un compuesto citotóxico. Al combinar las capacidades de direccionamiento únicas de los anticuerpos con la capacidad de matar células de los fármacos citotóxicos, los conjugados fármaco-anticuerpo permiten una discriminación sensible entre tejido sano y enfermo, basándose en la expresión del antígeno del anticuerpo. Esto significa que, a diferencia de los agentes quimioterapéuticos tradicionales, los conjugados anticuerpo-fármaco se dirigen y atacan activamente a las células cancerosas, de modo que las células sanas con poca o ninguna expresión de antígeno se ven menos afectadas. Hasta la fecha, tres CAF han recibido aprobación de mercado y varios CAF se encuentran actualmente en ensayos clínicos.
WO 2010/111198 describe conjugados que comprenden un anticuerpo anti-uPARAP y sugiere el uso de tales conjugados en la administración de agentes terapéuticos a células que expresan uPARAP.
WO 2013/098813 describe conjugados que comprenden un anticuerpo anti-uPARAP, un enlazador y un agente activo y sugiere el uso de tales conjugados para su uso en el tratamiento del cáncer, como el glioblastoma.
L. Engelholm y col., Journal of Pathology, 2016, vol. 238, no. 1, p. 120-133 enseña el uso de anticuerpos de uPARAP ejemplificados en un modelo de ratón para el tratamiento del sarcoma. Sugiere además una combinación del anticuerpo ejemplificado y bifosfonato. y/o agentes antitumorales para el tratamiento del sarcoma
H.J. Jürgensen y col., Journal of Biological Chemistry, 2014, vol. 289, no. 11, p. 7935-7947 describe anticuerpos dirigidos hacia uPARAP.
Actualmente existen procedimientos de tratamiento para la mayoría de los tipos de cáncer. Sin embargo, en la mayoría de los casos con una eficacia insatisfactoria o con efectos secundarios perjudiciales debido a la falta de especificidad del tratamiento. Por tanto, existe la necesidad de tratamientos más eficaces con mayor especificidad.
Resumen
La presente divulgación proporciona conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) basados en anticuerpos anti-uPARAP capaces de unirse a la región N-terminal del receptor de uPARAP. Los CAF como se describen en esta invención son capaces de dirigirse específicamente a células y tejidos que expresan uPARAP, y tienen una excelente eficacia in vitro e in vivo sin efectos secundarios registrados. La invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier materia que no esté comprendida en el alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo.
La presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido contra uPARAP que comprende: a. un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP),
b. un agente activo, donde el agente activo se selecciona de entre un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo y un marcador detectable, y
c. un enlazador que enlaza a) con b).
En un aspecto más, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido contra uPARAP que comprende:
a. un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP),
b. un agente activo, donde el agente activo se selecciona de entre un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo y un marcador detectable, y
c. un enlazador que enlaza a) con b)
para uso como medicamento.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido contra uPARAP que comprende:
a. un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP),
b. un agente activo, donde el agente activo se selecciona de entre un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo y un marcador detectable, y
c. un enlazador que enlaza a) con b)
y un tampón, diluyente, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto más, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido contra uPARAP que comprende:
a. un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP),
b. un agente activo, donde el agente activo se selecciona de entre un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo y un marcador detectable, y
c. un enlazador que enlaza a) con b)
o una composición farmacéutica que comprende dicho conjugado anticuerpo-fármaco, para su uso en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por células que expresan uPARAP, tal como donde la enfermedad caracterizada por células que expresan uPARAP se selecciona de entre cáncer, una enfermedad de degradación ósea tal como osteoporosis, fibrosis y enfermedades o trastornos asociados a macrófagos tales como aterosclerosis o inflamación crónica.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit que comprende un conjugado anticuerpo-fármaco dirigido contra uPARAP que comprende:
a. un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP),
b. un agente activo, donde el agente activo se selecciona de entre un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo y un marcador detectable, y
c. un enlazador que enlaza a) con b)
o una composición farmacéutica que comprende dicho conjugado anticuerpo-fármaco, que opcionalmente comprende además medios para administrar el conjugado anticuerpo-fármaco a un sujeto y/o instrucciones de uso.
Descripción de los Dibujos
Figura 1.Representación esquemática de los cuatro miembros de la familia de proteínas de la familia del receptor de Manosa, incluyendo uPARAP. Todas las proteínas tienen la misma composición de dominio general con un péptido señal N-terminal seguido de un dominio rico en cisteína, un dominio de fibronectina tipo II (dominio FN-II), 8-10 dominios similares a lectina de tipo C (CTLD), una región de extensión transmembrana y una pequeña cola citoplasmática (Adaptado de Melander y col., 2015 Int J Oncology 47: 1177-1188).
Figura 2. Ilustración esquemática de un CAF dirigido a uPARAP, en forma de anticuerpo dirigido, conjugado con una construcción enlazador-toxina maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenzoiloxicarbonil-monometil auristatina E (MC-VC-PAB-MMAE). El anticuerpo dirigido es específico contra el receptor uPARAP, que se encuentra altamente expresado en ciertos tipos de cáncer. La construcción enlazador-toxina se une mediante química de maleimida a tioles de cisteínas libres o puentes disulfuro intercatenarios reducidos. (N=1-10 toxinas por anticuerpo). La región enlazadora valina-citrulina con la unión péptido/amida a la entidad espaciadora es un sustrato para las proteasas lisosomales como la catepsina B, pero es suficientemente estable en el entorno extracelular para asegurar la liberación del fármaco conjugado sólo cuando lo absorben las células que expresan el antígeno diana. El fármaco conjugado es un inhibidor de tubulina muy potente en forma de monometil auristatina E (MMAE). Como conjunto (mAb-vc-MMAE), esta construcción de CAF asegura la entrega específica del componente del fármaco solo a las células que expresan el antígeno uPARAP, así como la liberación intracelular del fármaco conjugado en estas células.
Figura 3: Captación celular de mAb 2h9, marcado con un fluoróforo (AlexaFluor 647, AF647) utilizando un procedimiento similar al procedimiento de conjugación descrito en la leyenda de la figura 2 (reducción parcial seguida de reacción con un reactivo AlexaFluor 647 derivatizado con maleimida), en líneas celulares positivas para uPARAP, medidas por citometría de flujo. IFM: Intensidad de Fluorescencia Media Relación de especificidad: Relación de 2h9-AF647 / Señales aTNP-AF647, siendo aTNP un mAb de control no diana. Estos números demuestran una captación específica de 2h9-AF647 y confirman que las células positivas para uPARAP captan mAb 2h9 siguiendo dicho procedimiento de conjugación.
Figura 4: A.Reducción de SDS-PAGE de un anticuerpo diana (2h9), un CAF de mAb-vc-MMAE con una Proporción de Fármaco a Anticuerpo (PFA) moderada de ~4-5, y un CAF de mAb-vc-MMAE con una PFA de —8-10. Se ve que los mAb conjugados muestran una movilidad reducida en el gel, y que las especies de CAF moderadamente conjugadas se conjugan preferiblemente a través de las cadenas pesadas de mAb, mientras que el CAF con una PFA más alta se conjuga a través de las cadenas pesada y ligera. B. Reducción de SDS-PAGe que muestra que la incubación de cAf con catepsina B recombinante activada (+rh catepsina B) revierte la movilidad del gel de CAF a la del anticuerpo dirigido no modificado y, por lo tanto, la región enlazadora es de hecho escindible por proteasas lisosomales como la catepsina B. C. El análisis ELISA muestra la afinidad retenida del mAb 2h9 hacia uPARAP después de la etapa de reducción del procedimiento de conjugación así como en forma de CAF. En conjunto, estos datos muestran que CAF 2h9-vc-MMAE se comporta como se esperaba, en relación con la movilidad del gel y la afinidad hacia el receptor diana después de la conjugación.
Figura 5: Ensayos de viabilidad celular in vitro, basados en la exposición a los CAF en una serie de diluciones. La serie de diluciones comienza en 10 pg/mL CAF (componente mAb). seguido de una serie de diluciones de 4 veces de los CAF. Las células se incubaron durante 72 horas, antes de analizarlas mediante un ensayo de viabilidad colorimétrica. Aquí, el ensayo muestra una reducción específica en la viabilidad general después de la incubación con CAF 2h9-vc-MMAE dirigido a uPARAP, en comparación con un CAF no dirigido (aTNP-vc-MMAE), en cuatro líneas celulares que expresan el receptor diana (U937, Células THP-1, HT1080 y KNS42), mientras que una línea celular negativa para receptor (CHO-K1) no se ve afectada. Esto demuestra una reducción específica del receptor en la viabilidad de las líneas celulares positivas para uPARAP, después de la incubación con cAf 2h9-vc-MMAE.
Figura 6: Análisis de distribución del ciclo celular de cuatro líneas celulares positivas para uPARAP (U937, THP-1, HT1080 o KNS42) después de una incubación de 3 días en presencia de 1pg/mL de CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP o CAF de control aTNP-vc-MMAE, o toxina MMAE libre 50 nM. Dado que MMAE es un inhibidor de la tubulina, el efecto de un fármaco puede conducir a un aumento en la fracción de células en la fase Sub-G1 (que finalmente conduce a la apoptosis) o en la fase G2-M (inhibición de la segregación genómica después de la replicación del ADN). Un guión indica un recuento de células demasiado bajo para registrarlo, debido a la muerte y desintegración celular generalizadas. Se ve que las cuatro líneas celulares muestran una sensibilidad específica hacia CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP (y MMAE libre), evidente por el cambio en la distribución del ciclo celular hacia las fases Sub-G1 y G2/M en estas muestras.
Figura 7: Ensayo de competencia, que muestra que las células U937 se incuban durante 3 días en presencia de 1pg/mL de CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP, en presencia simultánea de diferentes concentraciones de anticuerpo dirigido no conjugado (2h9), otro anticuerpo dirigido a uPARAP (5f4) o el anticuerpo de control no dirigido (aTNP). Se ve que solo un excedente molar (1+ pg/mL mAb competitivo) del anticuerpo dirigido no conjugado 2h9 puede competir por el efecto del CAF, rescatando así las células de la muerte celular mediada por CAF. Por lo tanto, se muestra que la interacción entre uPARAP y el anticuerpo dirigido 2h9 es crucial para el efecto citotóxico observado.
Figura 8: Se ha demostrado que la preincubación de células U937 en presencia de un inhibidor de proteasas lisosomales de amplio espectro (E64D) conduce a la anulación completa del efecto citotóxico del CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP. Por lo tanto, se muestra que la liberación lisosomal del fármaco conjugado es crucial para obtener un efecto citotóxico.
Figura 9: Ensayo in vivo de la eficacia de CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP para combatir un tumor de xenoinjerto subcutáneo positivo para uPARAP, establecido por inyección de la línea celular U937 en ratones CB17 SCID. Los ratones se tratan mediante inyección subcutánea (s.c.) cerca del tumor con CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP (N=10), control CAF aTNP-vc-MMAE (N=9), mAb no conjugado 2h9 (N=5), o una solución salina (PBS, N=5). Todos los tratamientos se realizan en dosis de 3 mg/kg/inyección de componente mAb, como 4 dosis en total, administradas cada 4 días. El día 0 marca el día de la primera inyección, iniciada una vez que el tumor ha alcanzado un tamaño palpable de 50-100 mm3, y el gráfico muestra el tamaño medio del tumor en cada grupo de tratamiento. Se ve que el tratamiento con CAF 2h9-vc-MMAE da como resultado una disminución drástica del crecimiento tumoral, mientras que todos los demás grupos de tratamiento alcanzan un punto de sacrificio dentro de los 10-12 días posteriores al inicio del tratamiento. Esto demuestra que el CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP es eficaz para inhibir el crecimiento de un tumor positivo para uPARAP preestablecido in vivo.Además, los datos del grupo tratado con 2h9-vc-MMAE representan una tasa de curación permanente del 50% (véase la también la figura 10).
Figura 10: Una mirada más detallada al crecimiento tumoral del grupo tratado con 2h9-vc-MMAE descrito en la figura 9, muestra que este grupo incluía ratones que sufrían de un tratamiento incompleto y recidiva del tumor, así como ratones que perdieron la carga tumoral por completo y no mostraron recidiva del tumor. De los 10 ratones tratados con 2h9-vc-MMAE, 5 mostraron una recidiva casi inmediata del crecimiento tumoral después del tratamiento, alcanzando rápidamente un punto de sacrificio, mientras que los 5 ratones restantes perdieron todos los signos del tumor y permanecieron libres de crecimiento tumoral durante un período de 90 días, lo que proporciona una tasa de curación permanente general del 50% para los ratones tratados con 2h9-vc-MMAE después de la administración s.c.
Figura 11: Ensayo in vivo de la eficacia de CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP para combatir un tumor de xenoinjerto subcutáneo positivo para uPARAP, establecido por inyección de la línea celular U937 en ratones CB17 SCID. Los ratones se tratan mediante inyección intravenosa (iv) a través de las venas de la cola, con CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP (N=10), CAF aTNP-vc-MMAE de control (N=10), mAb no conjugado 2h9 (N=5), o una solución salina (PBS, N=5). Todos los tratamientos se realizaron en dosis de 5 mg/kg/inyección de componente mAb, como 3 dosis en total, administradas cada 4 días. El día 0 marca el día de la primera inyección, iniciada una vez que el tumor ha alcanzado un tamaño palpable de 50-100 mm3, y el gráfico muestra el tamaño medio del tumor en cada grupo de tratamiento. En estas condiciones, el tratamiento con CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP da como resultado una abrogación completa de la carga tumoral en los 10 ratones, lo que da una tasa de curación permanente general del 100% de los ratones después de la administración intravenosa de este CAF, lo que demuestra aún más la eficacia del CAF 2h9-vc-MMAE en la lucha contra tumores sólidos positivos para uPARAP.
Figura 12: Ensayos de viabilidad celular in vitro que muestran una reducción específica en la viabilidad general después de la incubación con CAF 2h9-vc-MMAE dirigido por uPARAP o CAF 5f4-vc-MMAE dirigido por uPARAP, en comparación con un CAF no dirigido (aTNP-vc-MMAE ), en la línea celular U937. Los datos indican que los CAF basados en 5f4 tienen una eficacia comparable a los CAF basados en el anticuerpo 2h9.
Figura 13: Tinción inmunohistoquímica de diferentes sarcomas (liposarcoma, mixofibrosarcoma, dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) y leiomiosarcoma (LMS). El procedimiento de tinción muestra la expresión tisular de uPARAP como un color marrón rojizo oscuro. La expresión de uPARAP es evidente en secciones de tejido de cáncer maligno (tumor), mientras que las secciones de tejido no canceroso están desprovistas de uPARAP, lo que demuestra el aumento de los niveles de expresión de uPARAP que se encuentran en los sarcomas. Barras de escala = 20 pm.
Figura 14: Se pueden utilizar diferentes anticuerpos dirigidos contra la parte N-terminal de uPARAP para la administración eficaz de fármacos en un formato de CAF. Los CAF con la composición mAb-vc-MMAE se prepararon como se describe en la leyenda de la Figura 2, usando tres anticuerpos diferentes dirigidos contra epítopos dentro de los tres dominios N-terminales de uPARAP (mAb 2h9, mAb 5f4 y mAb 9b7). A modo de comparación, se preparó un CAF de la misma manera pero usando un anticuerpo anti-uPARAP dirigido contra un epítopo fuera de los tres dominios N-terminales (mAb 11c9).A continuación, se realizaron ensayos de viabilidad celular in vitro con células U937 como se describe en la leyenda de la Figura 5, utilizando todos estos CAF. Todos los CAF conducen a una reducción específica en la viabilidad celular general, pero la sensibilidad celular a 2h9-vc-MMAE, 5f4-vc-MMAE y 9b7-vc-MMAE es mayor que la sensibilidad a 11c9-vc-MMAE.
Figura 15: Se pueden usar diferentes toxinas en un formato de CAF dirigidas a la parte N-terminal de uPARAP. Los CAF con mAb 2h9 como componente de anticuerpo se prepararon como se describe en la leyenda de la Figura 2, pero utilizando los siguientes conjuntos enlazador-citotoxina en lugar de VC-PAB-MMAE: VC-PAB-MMAF (siendo MMAF monometil auristatina F, una variante carboxílica de MMAE) y PEG4-va-PBD (con PEG4 refiriéndose a un espaciador de polietilenglicol, siendo va valina-alanina y PBD refiriéndose a una pirrolobenzodiazepina dimérica). Los CAF resultantes (denominados 2h9-vc-MMAF y 2h9-va-PBD respectivamente) se utilizaron para ensayos de viabilidad celular in vitro con células U937, realizados como se describe en la leyenda de la Figura 5. Las células U937 mostraron una sensibilidad muy fuerte a 2h9 -vc-MMAF y una sensibilidad más moderada a 2h9-va-PBD.
Figura 16: Se preparó un CAF con mAb 2h9 como componente de anticuerpo como se describe en la leyenda de la Figura 2, pero utilizando el siguiente conjunto enlazador-citotoxina en lugar de VC-PAB-MMAE: PEG4-vc-Duocarmycin SA (con PEG4 refiriéndose a un espaciador de polietilenglicol y vc es valina-citrulina). El CAF resultante (denominado 2h9-vc-DuocSA) se usó para ensayos de viabilidad celular in vitro con células U937, realizados como se describe en la leyenda de la Figura 5. Las células U937 mostraron una sensibilidad baja, pero medible, a 2h9-vc-DuocSA.
Figura 17: Los CAF con mAbs 2h9 o aTNP como componente de anticuerpo se prepararon como se describe en la leyenda de la Figura 2, usando los siguientes conjuntos enlazador-citotoxina: VC-PAB-MMAE o VC-PAB-MMAF. Los cAf resultantes (denominados 2h9-vc-MMAE, 2h9-vc-MMAF, aTNP-vc-MMAE y aTNP-vc-MMAF) se utilizaron para ensayos de viabilidad celular in vitro utilizando células de explantes de glioblastoma humano y se realizaron como se describe en la leyenda a la Figura 5. Estas células de explante de glioblastoma mostraron un alto grado de sensibilidad específica hacia los CAF dirigidos por uPARAP, basándose tanto en la toxina MMAE como en la MMAF.
Figura 18: Se produjo un producto de mAb 2h9 recombinante, denominado "2h9 clonado", en células CHO transfectadas con un vector de expresión que incluye las secuencias de ADN que codifican la cadena ligera y pesada de mAb 2h9 ([SEQ ID NO: 1] y [SEQ ID NO: 5], respectivamente). La reactividad de este producto se analizó en transferencia Western y se comparó con mAb 2h9 producido por cultivo de células de hibridoma ("2h9 original"). Para la transferencia Western, se analizó un lisado celular detergente preparado a partir de células de osteosarcoma humano MG63 positivas para uPARAP, usando concentraciones idénticas de "2h9 clonado" y "2h9 original" como anticuerpos primarios. Los dos productos de anticuerpos muestran una reacción idéntica y ambos reaccionan específicamente con la proteína uPARAP. No se observa reacción en ausencia de anticuerpo primario (control negativo).
Secuencias
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Las Regiones Determinantes de Complementariedad (RDC) se predijeron según el esquema de definición de Kabat y col. como se especifica en las referencias Kabat y col. (1983), Kabat y col. (1991) y Wu y Kabat (2008) utilizando un programa computarizado de numeración de Kabat publicado por Dunbar y Deane (2016). Las regiones de unión a antígeno (RUA) según el algoritmo Paratome también se predijeron como se especifica en las referencias Kunik y col. (2012a y b). Las RUA representan RDC alternativas de los anticuerpos descritos en esta invención.
Las regiones completas involucradas en el reconocimiento y la unión de antígenos pueden desviarse ligeramente de las RDC y RUA especificadas y todos los datos de secuencia incluidos en las regiones variables o fragmentos Fab especificados aquí se tratan como posibles contribuyentes a la unión de antígenos. Se pueden utilizar procedimientos o algoritmos diferentes de los empleados aquí para la identificación de potenciales regiones de unión/reconocimiento. Por lo tanto, además de las RDC predichas como se presentan en esta invención, esta divulgación cubre cualquier secuencia de aminoácidos que se predice que representan RDC o RUA en mAbs 2h9, 5f4 y 9b7 en función de las respectivas regiones Fab y regiones variables (SEQ ID NO: 9, 10, 11, 15, 20 y 25, respectivamente), utilizando dichos procedimientos o algoritmos. Ejemplos de procedimientos y algoritmos adicionales para la predicción de RDC incluyen el sistema IMGT (LeFranc y col., (2003))
Debido a la posición de las regiones del cebador durante la secuenciación de las cadenas ligeras y pesadas de Fab 9B7, se espera cierta ambigüedad en la región N-terminal de estas secuencias. Por tanto, los primeros 7 aminoácidos de SEQ ID NO: 19 pueden no ser exactos. Lo mismo ocurre con los aminoácidos 1-8 de SEQ ID NO: 24. Las SEQ ID NO: 20 y 25 corresponden a las SEQ ID NO: 19 y 24 respectivamente sin los aminoácidos N-terminales ambiguos.
Descripción detallada
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.
El conjugado anticuerpo-fármaco dirigido a uPARAP de la presente divulgación comprende
a) un anticuerpo capaz de unirse al dominio rico en cisteína (CysR), el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) y/o al dominio 1 similar a lectina de tipo C (CTLD 1) de uPARAP,
b) un agente activo, y
c) opcionalmente un enlazador que enlaza a) con b).
En un aspecto particular de la presente divulgación, el conjugado anticuerpo-fármaco dirigido a uPARAP de la presente divulgación comprende
a. Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que es capaz de unirse a:
i. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 o 37 (dominios CysR-FN-II-CTLD-1 de uPARAP), ii. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 o 39 (dominios CysR-FN-II de uPARAP),
iii. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 o 41 (dominios FN-II-CTLD-1 de uPARAP),
iv. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 o 31 (el dominio rico en cisteína (CysR) de uPARAP) v. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP), y/o
vi. la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 o 35 (el dominio 1 semejante a lectina de tipo C (CTLD 1) de uPARAP),
b. un agente activo, y, opcionalmente
c. un enlazador que enlaza a) con b).
Anticuerpo dirigido contra uPARAP
El anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación se internaliza tras la unión a uPARAP en la superficie celular, permitiendo así las acciones intracelulares del agente activo del complejo CAF. Se conoce de, por ejemplo, WO 2010/111198, que no todos los anticuerpos capaces de unirse a uPARAP se internalizan a la misma velocidad o en la misma cantidad. De hecho, algunos anticuerpos anti-uPARAP no se internalizan en absoluto y, por lo tanto, no son adecuados para su uso en CAF.
El receptor uPARAP consta de un dominio rico en cisteína N-terminal (CysR), un dominio de fibronectina tipo II (FN-II) y ocho dominios semejantes a lectina de tipo C (CTLD 1-8), cf. figura 1. Secuencias cortas de aminoácidos conectan los dominios individuales. Los datos presentados en esta invención sugieren que los anticuerpos anti-uPARAP que se dirigen a los tres dominios más N-terminales de uPARAP son muy eficaces para su uso en CAF.
Por lo tanto, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación se une preferiblemente a la región N-terminal de uPARAP, más preferiblemente a un epítopo ubicado en los tres dominios más N-terminales de uPARAP, que es el dominio rico en cisteína, el dominio de fibronectina tipo II y/o el dominio 1 similar a lectina de tipo C, incluidas las secuencias enlazadoras que conectan estos dominios de uPARAP.
Por tanto, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es capaz de unirse a un péptido que comprende o consiste en el dominio rico en cisteína (CysR) (SEQ ID NO: 30 o 31), el dominio de fibronectina tipo II (FN-II). (SEQ ID NO: 32 o 33) y/o el dominio 1 similar a lectina de tipo C (CTLD 1) (SEQ ID NO: 34 o 35) de uPARAP.
El dominio rico en cisteína, el dominio de fibronectina de tipo II y el dominio 1 similar a lectina de tipo C, incluidas las secuencias enlazadoras que conectan estos dominios como enumerados por NCBI, corresponden a aa 46-361 de uPARAP humano de longitud completa. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, el epítopo del anticuerpo anti-uPARAP se localiza en el aa 46-361 de SEQ ID NO: 29 (uPARAP humano de longitud completa). En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación se une a un epítopo ubicado en el aa 31-365 de SEQ ID NO: 29, más preferiblemente en el aa 46-361 de SEQ ID NO: 29, correspondiente a SEQ ID NO: 36 en esta invención. SMART predice CYSR-FN-II-CTLD1, incluidas las secuencias enlazadoras que conectan estos dominios a aa 41-360 de SEQ ID NO: 29. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, el epítopo para el anticuerpo anti-uPARAP se localiza en los aa 41-360 de SEQ ID NO: 29, correspondiente a SEQ ID NO: 37 en esta invención.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación se une al dominio CysR y/o el dominio CtLd-1.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación se une al dominio CysR, que según el NCBI predice que consta de aa 46-161 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a SEQ ID NO: 30 en esta invención, y por SMART para consistir en aa 41-161 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a SEQ ID NO: 31 en esta invención. Es decir, en una realización de la presente divulgación, se une a un epítopo ubicado en los aa 46-161 o 41-161 de SEQ ID NO: 29.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación se une al dominio FN- II, que según el NCBI predice que consta de aa 181-228 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a SEQ ID NO: 32 en esta invención, y por SMART para consistir en aa 180-228 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a SEQ ID NO: 33 en esta invención. Es decir, en una realización de la presente divulgación, se une a un epítopo ubicado en los aa 181-228 o 180-228 de SEQ ID NO: 29.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación se une al dominio CTLD-1, que según el NCBI predice que consta de aa 247-361 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a SEQ ID NO: 34 en esta invención, y por SMART para consistir en aa 235-360 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a SEQ ID NO: 35 en esta invención. Es decir, en una realización de la presente divulgación, se une a un epítopo ubicado en los aa 247-361 o 235-360 de SEQ ID NO: 29.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es capaz de unirse a un péptido que comprende o consiste en el dominio CysR y FN-II, incluidas las secuencias enlazadoras que conectan estos dominios, lo cual es predicho por NCBI. para consistir en aa 46-228 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a la SEQ ID NO: 38, y por SMART para consistir en aa 41-228 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a la SEQ ID NO: 39 en esta invención. Es decir, en una realización de la presente divulgación, se une a un epítopo ubicado en los aa 46-228 o 41-228 de SEQ ID NO: 29.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es capaz de unirse a un péptido que comprende o consiste en el dominio FN-II y CTLD-1, incluidas las secuencias enlazadoras que conectan estos dominios, lo cual es predicho por NCBI. para consistir en aa 181-361 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a la sEq ID NO: 40 en esta invención, y por SMART para consistir en aa 180-360 de uPARAP humano de longitud completa, correspondiente a la SEQ ID NO: 41 en esta invención. Es decir, en una realización de la presente divulgación, se une a un epítopo ubicado en los aa 180-361 o 181-360 de SEQ ID NO: 29. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es el anticuerpo IgG1k monoclonal de ratón del clon 2.h.9: F12 disponible comercialmente de Merck Millipore (http://www.merckm¡ll¡pore.com/DK/en/product/Ant¡-UPAR-Assoc¡ated-Prote¡n-Ant¡body%2C-clone-2.h.9%3AF12,MM NF-MAB2613?cid=BI-XX-BRC-P-GOOG-ANTI-B302-1075) o un fragmento funcional o variante del mismo, tal como una versión quimérica o humanizada del mismo. Clon de anticuerpo monoclonal IgG1k de ratón 2.h.9:F12 se hace referencia en esta invención como el anticuerpo "2h9" o "mAb 2h9". El anticuerpo 2h9 reacciona tanto con uPARAP humano como de ratón y, por lo tanto, es muy adecuado para estudios clínicos y preclínicos.
Estudios previos indican que el epítopo del anticuerpo 2h9 está ubicado en los tres dominios más N-terminales de uPARAP, particularmente en el dominio CysR o el dominio CTLD-1. Una proteína recombinante soluble que consta de los tres dominios n-terminales de uPARAP (CysR, FN-II y CTLD-1) se une a 2h9 inmovilizado en una configuración BIAcore, lo que limita la ubicación de la unión del mAb 2h9 a estos tres dominios n-terminales (Jürgensen y col., 2011, JBC 286(37):32736-48). Además, el intercambio del dominio FN-II de uPARAP con el dominio Fn-II de otros miembros de la misma familia de receptores no tiene ningún efecto sobre la unión del mAb 2h9, lo que sugiere que el dominio FN-II probablemente no contiene el epítopo del mAb 2h9 (Jürgensen y col., 2014, JBC 289(11):7935-47). Esto limita efectivamente la unión del mAb 2h9 al dominio CysR o al dominio CTLD-1.
Las RDC predichas de la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina del mAb 2h9 corresponden a las SEQ ID NO: 2-4 y las RDC predichas de la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina del mAb 2h9 corresponden a las SEQ ID NO: 6-8.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es un anticuerpo correspondiente al anticuerpo 2h9 o un fragmento funcional o variante del mismo seleccionado de entre el grupo que consiste en:
a. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 9 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% identidad de secuencia de la misma, y/o
ii. una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o 10 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% identidad de secuencia de la misma,
b. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de a), c. una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a), o una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de b),
d. una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a), o una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de b),
e. un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7 y 8, o
ii. las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 3 y 4, y/o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs 6, 7 y 8,
f. un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nos: 42, 43, 44, 45, 46 y 47, o
ii. las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, 43 y 44, y/o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO 45, 46 y 47.
Para preservar el reconocimiento de antígenos de los anticuerpos descritos en esta invención, la variación de secuencia no suele estar en las RDC o RUA. Por tanto, en una realización preferida de la presente divulgación, cualquier variación de secuencia se ubica fuera de las RDC o RUA. Todos los anticuerpos variantes y los fragmentos de unión a antígeno descritos en esta invención conservan la capacidad de unirse a uPARAP.
Por ejemplo, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender
a. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 9 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RDC1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 2,
ii. una RDC2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 3,
iii. una RDC3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 4, y
a. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o 10 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RDC1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 6,
ii. una RDC2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 7,
iii. una RDC3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 8,
donde cualquier variación de secuencia está fuera de las RDC.
Alternativamente, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender
a. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 9 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RUA1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 42,
ii. una RUA2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 43,
iii. una RUA3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 44, y
a. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o 10 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RUA1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 45,
ii. una RUA2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 46,
iii. una RUA3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 47,
donde cualquier variación de secuencia está fuera de las RUA.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es el anticuerpo monoclonal de ratón 5f4 o un fragmento funcional o variante del mismo. El anticuerpo 5f4 es IgGlK.
Los estudios han demostrado que el epítopo de 5f4 está ubicado en el dominio FN-II de uPARAP En Jurgensen y col., 2014 se muestra que el anticuerpo 5f4 es capaz de unirse a uPARAP de tipo natural y a miembros artificiales de la familia de receptores de manosa, donde el dominio FN-II de tipo natural se ha cambiado por el de uPARAP. 5f4 no es capaz de unirse a los otros miembros de las proteínas de la familia de receptores de manosa en su forma natural, o con uPARAP donde el dominio FN-II de tipo natural se ha cambiado con dominios equivalentes de los otros miembros de la familia de receptores de manosa (Jürgensen y col., 2014, JBC 289(11 ):7935-47).
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es un anticuerpo correspondiente al anticuerpo 5f4 o un fragmento funcional o variante del mismo seleccionado de entre el grupo que consiste en
a. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% identidad de secuencia de la misma, y/o
i. una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% identidad de secuencia de la misma,
b. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de a), c. una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a), o una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de b),
d. una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a), o una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de b),
e. un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17 y 18, o
ii. las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, 13 y 14, y/o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID
NO 16, 17 y 18.
f. un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51, 52 y 53, o
ii. las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 48, 49 y 50, y/o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID
NO 51, 52 y 53.
Para permitir alguna variación de secuencia fuera de las RDC, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender
a. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 11 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RDC1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 12,
ii. una RDC2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 13,
iii. una RDC3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 14, y
b. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 15 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RDC1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 16,
ii. una RDC2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 17,
iii. una RDC3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 18,
donde cualquier variación de secuencia está fuera de las RDC.
Alternativamente, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender
a. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 11 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RUA1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 48,
ii. una RUA2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 49,
iii. una RUA3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 49, y
b. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RUA1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 51,
ii. una RUA2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 52,
iii. una RUA3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 53,
donde cualquier variación de secuencia está fuera de las RUA.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es el anticuerpo monoclonal de ratón 9b7(mAb 9b7) o un fragmento funcional o variante del mismo. Estudios anteriores indican que el epítopo del anticuerpo 9b7 se encuentra en los tres dominios más N-terminales de uPARAP. Cuando una proteína recombinante soluble que consta de los tres dominios N-terminales de uPARAP (CysR, FN-II y CTLD-1) se inmoviliza en una configuración BIAcore, mAb 9b7 se une a esta construcción.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP se selecciona de entre el grupo que consiste en
a. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% identidad de secuencia de la misma, y/o
ii. una región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o 25 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% identidad de secuencia de la misma,
b. un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo que el anticuerpo de a), c. una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a), o una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de b),
d. una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a), o una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de b),
e. un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende:
i. una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, 22, 23, 26, 27 y 28, o
ii. las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, 22 y 23, y/o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO 26, 27 y 28.
f. un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una o más de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58 y 59, o
ii. las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55 y 56, y/o las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, 58 y 59.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender a. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RDC1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 21,
ii. una RDC2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 22,
iii. una RDC3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 23, y
b. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o 25 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RDC1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 26,
ii. una RDC2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 27,
iii. una RDC3 que tiene una secuencia de aa según SEQ ID NO: 28, en la que cualquier variación de secuencia está fuera de las RDC.
Alternativamente, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender
a. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RUA1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 54,
ii. una RUA2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 55,
iii. una RUA3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 56, y
b. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o 25 o una secuencia que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia de la misma, tal como al menos un 80% de identidad de secuencia de la misma, por ejemplo, al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y comprende además
i. una RUA1 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 57,
ii. una RUA2 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 58,
iii. una RUA3 que tiene una secuencia aa según SEQ ID NO: 59,
donde cualquier variación de secuencia está fuera de las RUA.
Por "anticuerpo" incluimos moléculas de anticuerpos sustancialmente intactas, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de anticuerpos de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras y fragmentos de unión a antígenos y derivados de los mismos.
Por "fragmento de unión a antígeno" nos referimos a un fragmento funcional de un anticuerpo que es capaz de unirse a uPARAP.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP según la presente divulgación se selecciona de entre un anticuerpo de ratón, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión a antígeno humanizado, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un anticuerpo monocatenario (SCA) como un scFv, la porción variable de las cadenas pesadas y/o cadenas ligeras de los mismos, o un minianticuerpo Fab, donde estos fragmentos o anticuerpos modificados pueden derivarse de anticuerpos de ratón, quiméricos, humanos o humanizados.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP es un anticuerpo monoclonal humanizado o completamente humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación es un anticuerpo recombinante.
El anticuerpo anti-uPARAP de la presente divulgación puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluidas IgG, IgM, IgD, IgE, IgA y cualquier subclase de las mismas. Las subclases de IgG también son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen IgGI, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal IgG. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es IgG1k. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-uPARAP es un fragmento de unión a antígeno. Las ventajas de usar fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos completos, son múltiples El tamaño más pequeño de los fragmentos puede conducir a propiedades farmacológicas mejoradas, como una mejor penetración en los tejidos. Además, los fragmentos de unión a antígenos pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli u otras células hospedadoras no mamíferas, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de dichos fragmentos. Fab es el fragmento que contiene un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo que puede producirse por digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína, u otros medios específicos de proteólisis para dar una cadena ligera y una porción de una cadena pesada.
F(ab')2 es el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo completo con la enzima pepsina u otros medios específicos de proteólisis para producir un fragmento de unión al antígeno bivalente sin reducción posterior; F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab unidos por dos enlaces disulfuro.
Fv es un fragmento modificado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, expresada como dos cadenas.
El anticuerpo monocatenario (SCA) es una molécula modificada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria fusionada genéticamente, que incluye un scFv.
Los procedimientos para generar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse mediante cualquiera de varios procedimientos que emplean la inducción de la producción in vivo de moléculas de anticuerpos, el cribado de bibliotecas de inmunoglobulinas o la generación de moléculas de anticuerpos monoclonales mediante líneas celulares en cultivo. Estos incluyen la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma del virus de Epstein-Barr (EBV). Asimismo, se pueden obtener fragmentos de anticuerpos usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos según la presente divulgación se pueden preparar mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo con varias enzimas o mediante expresión en E. coli o células de mamíferos (p.ej., cultivo de células de ovario de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteínas) del ADN que codifica el fragmento Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante procedimientos convencionales.
Los expertos en la materia apreciarán que para la terapia o el diagnóstico en humanos, se usan preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos modificados genéticamente o fragmentos de anticuerpos que tienen preferiblemente porciones mínimas derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen anticuerpos en los que las regiones determinantes complementarias (RDC) de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) se reemplazan por residuos de una región determinante complementaria de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo que tiene la funcionalidad deseada. En algunos aspectos, los residuos de la estructura Fv del anticuerpo humano se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la RDC importada de secuencias de estructuras. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones determinantes de complementariedad corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas, o sustancialmente todas, de las regiones de estructura corresponden a las de una secuencia de consenso humana relevante. Los anticuerpos humanizados de manera óptima también incluyen al menos una porción de una región constante de anticuerpo, tal como una región Fc, típicamente derivada de un anticuerpo humano.
Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, el anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos denominados frecuentemente como residuos importados, que se toman típicamente de un dominio variable importado. La humanización se puede realizar esencialmente como se describe sustituyendo las RDC humanas con las correspondientes RDC no humanas. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos donde algunos residuos de RDC y posiblemente algunos residuos de estructura se sustituyen con residuos de sitios análogos en anticuerpos no humanos.
Los anticuerpos humanos se pueden producir mediante varias técnicas conocidas en la técnica, lo que incluye bibliotecas de expresión en fagos.
Una vez que se obtienen los anticuerpos adecuados, se pueden analizar para determinar la especificidad del antígeno, por ejemplo mediante ELISA.
Agente activo
El CAF anti-uPARAP de la presente divulgación comprende un agente activo, es decir, un fármaco, que puede administrarse intracelularmente a células que expresan uPARAP en su superficie. El agente activo puede ser, por ejemplo, un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo o un marcador detectable. En una realización preferida de la presente divulgación, el agente activo es un agente terapéutico.
En una realización de la presente divulgación, el agente activo es un agente quimioterapéutico. Las clases de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, antraciclinas, antimetabolitos, agentes anti-microtúbulos/antimitóticos, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de quinasa, antibióticos peptídicos, antineoplásicos a base de platino, inhibidores de topoisomerasa y antibióticos citotóxicos.
En una realización preferida de la presente invención, el agente activo es un agente citotóxico que permite la destrucción eficaz de las células que expresan uPARAP.
En una realización de la presente divulgación, el agente activo es un agente antimitótico, tal como monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), un taxano (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel), un alcaloide de la vinca (por ejemplo, Vinblastina, Vincristina, Vindesina o Vinorelbina), Colchicina o Podofilotoxina.
En una realización de la presente divulgación, el agente citotóxico es monometil auristatina E (MMAE). Debido a su alta toxicidad, MMAE, que inhibe la división celular al bloquear la polimerización de la tubulina, no se puede utilizar como fármaco quimioterapéutico de agente único. Sin embargo, se ha demostrado que la combinación de MMAE unida a un anticuerpo monoclonal anti-CD30 (Brentuximab Vedotin, nombre comercial Adcetris™) es estable en el líquido extracelular, se puede escindir con catepsina y es segura para la terapia.
En una realización de la presente divulgación, el agente citotóxico es monometil auristatina F (MMAF). MMAF es un agente anti-microtúbulo/anti-mitótico y una variante carboxilo de MMAE.
En una realización de la presente divulgación, el agente citotóxico es un agente de reticulación de ADN, tal como pirrolobenzodiazepina o un derivado dimérico de pirrolobenzodiazepina.
En una realización de la presente divulgación, el agente citotóxico es un agente alquilante de ADN, tal como Duocarmycin SA.
Ejemplos de agentes alquilantes adicionales incluyen tiotepa y ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonatos tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); delta-9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluido el análogo sintético topotecan (HYcAm TIN®), c Pt -II (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatin; una sarcodictyin; espongistatina; mostazas nitrogenadas como clorambucilo, clornafazina, cloofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos enediyne (p. ej., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma II y caliqueamicina omega II; dinemicina, incluida dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromoproteína relacionada, enediyne, cromóforos de antiobióticos, amineromicina, actinomicina) bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluido ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina, inyección de liposoma de doxorrubicina HCl (DOXIL®) y desoxi-doxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, nocina, mitcidomicina, nocinomicina, miticomicina potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato, gemcitabina (GEMzAr®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), una epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacárido PSK®; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulación de nanopartículas modificadas por ingeniería de albúmina de paclitaxel (ABRAXANE.TM), y doxetaxel (TAXOTERE®); cloranbucil; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; un análogo de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina (VELBAN®); platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatino; leucovovin; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); un retinoide como el ácido retinoico; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores, como CHOP, una abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN®) combinado con 5- FU y leucovovin.
Los agentes antihormonales actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de las hormonas que pueden promover el crecimiento del cáncer y, a menudo, se administran como tratamiento sistémico o para todo el cuerpo. Pueden ser hormonas en sí mismas. Los ejemplos incluyen antiestrógenos y moduladores selectivos del receptor de estrógeno (SERM), incluidos, por ejemplo, tamoxifeno (incluido NOLVADEx ® tamoxifeno), raloxifeno (EVISTA®), droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LYI 17018, onapristona y toremifeno (FARESTON®); antiprogesteronas; reguladores descendentes de los receptores de estrógeno (ERD); agentes que funcionan para suprimir o desactivar los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRH) como acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros antiandrógenos como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de la aromatasa como, por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®), exemestano (AROMASIN®), formestanie, fadrozol, vorozol (RIVISOR®), letrozol (FEMARA®) y anastrozol ( ARIMIDEX®). Además, bifosfonatos como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrónico /zoledronato (ZOMEtA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (Ar Ed IA®), tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®); así como troxacitabina (un análogo de citosina nucleósido 1,3-dioxolano); siRNA, ribozima y oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante; vacunas como la vacuna THERATOPE® y las vacunas de terapia génica, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN® y la vacuna vAx ID®; inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por ejemplo, ABARELIX®); ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina quinasa dual de ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016); inhibidores de COX-2 tales como celecoxib (CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil) -3-(trifluorometil) - IH-pirazol-1-il) bencenosulfonamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
En una realización de la presente divulgación, el agente activo es un nucleótido, tal como un oligonucleótido, por ejemplo, un siRNA o un miARN.
Puede haber una o más unidades de fármaco por molécula de anticuerpo. La relación entre el número de moléculas de fármaco por anticuerpo se denomina Proporción de Fármaco a Anticuerpo (PFA). En una realización de la presente divulgación, la PFA está entre 1 y 10, es decir, habrá entre 1 y 10 unidades de fármaco por molécula de anticuerpo. En una realización de la presente divulgación, la PFA está entre 2 y 8, por ejemplo entre 3 y 6, como 4 o 5.
Enlazador
Un vínculo estable entre el anticuerpo y el agente activo es un aspecto importante de la tecnología de CAF. Los enlazadores pueden, por ejemplo, basarse en motivos químicos que incluyen disulfuros, hidrazonas o péptidos (escindibles) o tioéteres (no escindibles) y controlan la distribución y liberación del agente citotóxico a la célula diana. Se ha demostrado que los tipos de enlazadores escindibles y no escindibles son seguros en ensayos clínicos y preclínicos. Por ejemplo, Brentuximab Vedotin incluye un enlazador escindible sensible a enzimas que administra el potente y altamente tóxico agente antimicrotúbulo monometil auristatina E (MMAE), un agente antineoplásico sintético, a las células.
Trastuzumab Emtansine, otro CAF aprobado, es una combinación del inhibidor de la formación de microtúbulos mertansine (DM-1), un derivado de Maytansine, y el anticuerpo Trastuzumab (Herceptin™, Genentech/Roche), unido por un enlazador estable, no escindible.
El tipo de enlazador, escindible o no escindible, confiere propiedades específicas al fármaco administrado. Por ejemplo, los enlazadores escindibles pueden, por ejemplo, escindirse mediante enzimas en la célula diana, lo que conduce a una liberación intracelular eficaz del agente activo, por ejemplo, un agente citotóxico. Por el contrario, un CAF que contiene un enlazador no escindible no tiene ningún mecanismo para la liberación del fármaco y debe depender de mecanismos tales como la degradación del anticuerpo dirigido a la liberación del fármaco. Además, como apreciarán los expertos en la técnica, la composición de enlazador puede influir en factores críticos como la solubilidad y las propiedades farmacocinéticas del CAF en su conjunto.
Para ambos tipos de enlazadores, la liberación del fármaco es crucial para obtener un efecto celular. Los fármacos que pueden difundirse libremente a través de las membranas celulares pueden escapar de la célula diana y, en un proceso llamado "muerte de transeuntes", también atacan a las células vecinas, como las células cancerosas en las proximidades de la célula diana que expresa uPARAP.
En una realización preferida de la presente divulgación, el CAF que se dirige a uPARAP como se describe en esta invención comprende un enlazador que une el anticuerpo anti-uPARAP y el agente activo. El enlazador puede ser escindible o no escindible. En una realización de la presente divulgación, el enlazador es un enlazador escindible que permite la liberación intracelular del agente activo dentro de las células que expresan uPARAP.
Los grupos escindibles incluyen un enlace disulfuro, un enlace amida, un enlace amida sustituido en forma de un enlace peptídico, un enlace tioamida, un enlace éster, un enlace tioéster, un enlace diol vecinal o un hemiacetal. Estos, u otros enlaces escindibles, pueden incluir enlaces escindibles enzimáticamente, como enlaces peptídicos (escindidos por peptidasas), enlaces fosfato (escindidos por fosfatasas), enlaces de ácido nucleico (escindidos por endonucleasas) y enlaces de azúcar (escindidos por glicosidasas).
El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador polipeptídico, un enlazador peptídico o un enlazador de ácido nucleico.
En realizaciones particulares de la presente divulgación, el enlazador es un enlazador peptídico. La elección de la secuencia de péptidos es fundamental para el éxito del conjugado. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el enlazador es estable frente a las proteasas del suero, aunque es escindido por enzimas lisosomales en la célula diana. En un ejemplo, el enlazador es un péptido seleccionado de entre protamina, un fragmento de protamina, (Arg)9, biotina-avidina, biotinstreptavidina y péptido de antenapedia. Otros enlazadores no nucleotídicos incluyen cadenas de alquilo o arilo de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 átomos. En otra realización de la presente divulgación, el enlazador es un enlazador nucleotídico.
En una realización de la presente divulgación, el enlazador es un enlazador que contiene péptido escindible con enzima, tal como un enlazador que contiene péptido escindible con catepsina. La catepsina puede ser uno de varios tipos de catepsina, perteneciendo a un grupo de proteasas lisosomales.
En una realización de la presente divulgación, el enlazador comprende o consiste en un dipéptido, tal como valinacitrulina (VC) o valina-alanina (VA), que puede estar conectado adicionalmente a través de un enlace amida a otros elementos estructurales. Los enlazadores a base de valina-citrulina, en los que la función carboxilo de citrulina se modifica a una amida sustituida, pueden escindirse mediante catepsinas lisosomales, mientras que los enlazadores a base de valina-alanina, en los que la función carboxilo de alanina se modifica a una amida sustituida, pueden ser escindidos por otras proteasas lisosomales, incluidas otras catepsinas,.
En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación comprende además un espaciador. El espaciador puede, por ejemplo, conectar el enlazador y el agente activo. En una realización de la presente divulgación, el espaciador es ácido paraaminobenzoico (PAB).
En una realización de la presente divulgación, el espaciador es o incluye un espaciador de polietilenglicol, tal como un espaciador de PEG4.
En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación comprende además una entidad de unión. La entidad de unión puede, por ejemplo, conectar el anticuerpo y el enlazador escindible, donde la entidad de unión es el producto de reacción entre una cadena lateral de aminoácidos del anticuerpo y un grupo de unión reactivo en el precursor del enlazador. En una realización de la presente divulgación, este grupo de unión reactivo comprende o consiste en maleimida y ácido caproico (MC), donde la maleimida reacciona preferiblemente con tioles de cisteína durante el acoplamiento. En otras realizaciones de la presente divulgación, el grupo de unión comprende o consiste en N-hidroxisuccinimida, azidas o alquinos.
En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación comprende un anticuerpo antiuPARAP como se describe en esta invención y el complejo enlazador-fármaco Vedotin. Vedotin es un complejo enlazador-fármaco que comprende el agente citotóxico MmAE, un espaciador (ácido paraaminobenzoico), un enlazador escindible con catepsina (dipéptido de valina-citrulina) y un grupo de unión que consta de ácido caproico y maleimida. Vedotin es MC-VC-PAB-MMAE. Brentuximab Vedotin (nombre comercial Adcetris™) es un ejemplo de CAF aprobado por la FDA que comprende Vedotin.
En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación comprende un anticuerpo antiuPARAP como se describe en esta invención y una unidad enlazadora-espaciadora-toxina que es VC-PAB-MMAF. En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación comprende un anticuerpo antiuPARAP como se describe en esta invención y el conjunto enlazador- espaciador-toxina siendo PEG4-VA-PBD. En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación comprende un anticuerpo antiuPARAP como se describe en esta invención y un conjunto enlazador-espaciadora-toxina que es PEG4-VC-DuocarmicinaSA.
En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación comprende un complejo enlazadorfármaco como se describe en US 2006/074008.
La construcción enlazador-fármaco puede, por ejemplo, unirse al anticuerpo anti-uPARAP mediante química de maleimida a tioles de puentes disulfuro intercatenarios o intracatenarios reducidos.
Uso Terapéutico
Los CAF dirigidos contra uPARAP como se describen en esta invención son útiles para el suministro de agentes activos, tales como agentes terapéuticos o citotóxicos a células que expresan uPARAP y, por tanto, para el tratamiento de una gama de enfermedades y trastornos caracterizados por la expresión de uPARAP, en particular la sobreexpresión de uPARAP.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un CAF anti-uPARAP, como se describe en esta invención, junto con un tampón, diluyente, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar de una manera conocida en la técnica que sea suficientemente estable al almacenamiento y adecuada para la administración a seres humanos. y/o animales. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden liofilizarse, por ejemplo, mediante secado por congelación, secado por pulverización, enfriamiento por pulverización o mediante el uso de la formación de partículas a partir de la formación de partículas supercríticas.
Por "farmacéuticamente aceptable" nos referimos a un material no tóxico que no disminuye la eficacia del CAF antiuPARAP. Dichos tampones, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).
El término "tampón" significa una solución acuosa que contiene una mezcla ácido-base con el propósito de estabilizar el pH. Los tampones farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica.
El término "diluyente" pretende significar una solución acuosa o no acuosa con el fin de diluir el péptido en la preparación farmacéutica.
El término "adyuvante" pretende significar cualquier compuesto agregado a la formulación para aumentar el efecto biológico del péptido. El adyuvante puede ser uno o más de sales de plata, cinc o cobre con diferentes aniones, por ejemplo, de modo no taxativo, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato y acetatos de diferente composición de acilo. El adyuvante también puede ser polímeros catiónicos como éteres de celulosa catiónicos, ésteres de celulosa catiónicos, ácido hialurónico desacetilado, quitosano, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos como poli (vinil imidazol) y polipéptidos catiónicos como polihistidina, polilisina, poliarginina y péptidos. que contienen estos aminoácidos. El excipiente puede ser uno o más de carbohidratos, polímeros, lípidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, que se agregan a la composición, por ejemplo, para facilitar la liofilización. Ejemplos de polímeros son almidón, éteres de celulosa, celulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenanos, ácido hialurónico y derivados del mismo, ácido poliacrílico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros de polietilenóxido/óxido de polipropileno, polivinilalcohol/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis, y polivinilpirrolidona, todos de diferente peso molecular, que se agregan a la composición, por ejemplo, para el control de la viscosidad, para lograr bioadhesión, o para proteger el lípido de degradación química y proteolítica. Ejemplos de lípidos son ácidos grasos, fosfolípidos, monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos, ceramidas, esfingolípidos y glucolípidos, todos de diferentes longitud de cadena de acilo y saturación, lecitina de huevo, lecitina de soya, huevo hidrogenado y lecitina de soya, que se agregan a la composición por motivos similares a aquellos para los polímeros. Ejemplos de minerales son talco, óxido de magnesio, óxido de cinc y óxido de titanio, que se agregan a la composición para obtener beneficios tales como la reducción de acumulación de líquido o propiedades de pigmentos ventajosas. Los CAF de la presente divulgación se pueden formular en cualquier tipo de composición farmacéutica conocida en la técnica por ser adecuada para la administración de los mismos.
Los CAF de la presente divulgación o las composiciones farmacéuticas que comprenden los CAF se pueden administrar mediante cualquier ruta adecuada conocida por los expertos en la técnica. Por tanto, las posibles rutas de administración incluyen parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, vaginal y rectal. Además, es posible la administración desde implantes.
En una realización preferida de la presente divulgación, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intracerebroventricular, intraarticular, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea, o pueden administrarse por técnicas de infusión. Tales composiciones se usan mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer la solución isotónica con sangre. Las soluciones acuosas se deberían tamponar de forma adecuada (preferentemente a un pH de 3 a 9), de ser necesario. La preparación de las formulaciones parenterales adecuadas en condiciones estériles se logra fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar conocidas por los expertos en la técnica.
Formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea sustancialmente isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y se pueden almacenar en un estado liofilizado (deshidratado por congelación) que solo requiere la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes del uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.
En una realización de la presente divulgación, los CAF de la presente divulgación se administran por vía intravenosa. En una realización de la presente divulgación, los CAF de la presente divulgación se administran subcutáneamente. En una realización de la presente divulgación, los CAF de la presente divulgación se administran por vía intracraneal o intracerebral.
Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una cantidad farmacéuticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva", o "cantidad efectiva" o "terapéuticamente efectiva", como se usa en esta invención, se refiere a la cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección y un régimen de administración dados. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir un efecto terapéutico deseado en asociación con el aditivo y diluyente requeridos, es decir. un portador o vehículo de administración. Además, se pretende que signifique una cantidad suficiente para reducir, y más preferiblemente impedir, un déficit clínicamente significativo en la actividad, función y respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para provocar una mejora en una condición clínicamente significativa en un huésped. Los expertos en la técnica apreciarán que la cantidad de un compuesto puede variar dependiendo de su actividad específica. Las cantidades de dosificación adecuadas pueden contener una cantidad predeterminada de composición activa calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido. El trabajador médico o veterinario habitualmente experto puede determinar una cantidad terapéuticamente efectiva basándose en las características del paciente, tales como edad, peso, sexo, estado, complicaciones, otras enfermedades, etc., como es bien conocido en la técnica. La administración de la dosis farmacéuticamente efectiva se puede realizar tanto mediante administración única en forma de una unidad de dosis individual, como también varias unidades de dosis más pequeñas, como también mediante administraciones múltiples de dosis subdivididas a intervalos específicos. Alternativamente, la dosis se puede proporcionar como una infusión continua durante un período prolongado.
Los expertos en la materia apreciarán que los CAF que se dirigen a uPARAP descritos en esta invención pueden administrarse solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, los CAF que se dirigen a uPARAP descritos en esta invención pueden administrarse en combinación con una gama de agentes anticancerígenos, tales como antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas y otros antibióticos citotóxicos, alquiloides de la vinca, agentes anti-microtúbulo/anti-mitóticos, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de quinasas, antibióticos peptídicos, antineoplásicos a base de platino, etopósido, taxanos, inhibidores de topoisomerasa, inmunosupresores antiproliferativos, corticosteroides, hormonas sexuales y antagonistas de hormonas, antibióticos citotóxicos y otros agentes terapéuticos.
En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación se administra junto con reactivos adicionales y/o terapéuticos que pueden aumentar la eficacia funcional del CAF, como fármacos establecidos o nuevos que aumentan la permeabilidad de la membrana lisosomal, facilitando así la entrada molecular desde el interior del lisosoma al citoplasma, o fármacos que aumentan la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona un kit que comprende un CAF dirigido a uPARAP como se describe en esta invención o una composición farmacéutica que lo comprende. Opcionalmente, el kit puede comprender además medios para administrar el CAF a un sujeto e instrucciones de uso. En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para la administración de un agente activo a una célula que expresa uPARAP en un sujeto que comprende administrar al sujeto un CAF dirigido por uPARAP o una composición que comprende un CAF dirigido por uPARAP como descrito en esta invención, de manera que el agente activo se administre a dicha célula.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere al CAF dirigido por uPARAP o una composición que comprende dicho CAF dirigido por uPARAP como se describe en esta invención, para su uso en la administración de un agente activo a una célula que expresa uPARAP en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un CAF dirigido por uPARAP o una composición que comprende un CAF dirigido por uPARAP como se describe en esta invención, de manera que el agente activo se administra a dicha célula.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por células que expresan uPARAP en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un CAF dirigido por uPARAP o una composición que comprende un CAF dirigido por uPARAP como se describe en esta invención a dicho sujeto.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere al CAF dirigido a uPARAP o una composición que comprende dicho CAF dirigido a uPARAP como se describe en esta invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por células que expresan uPARAP.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para inhibir el crecimiento de una célula que expresa uPARAP in vivo o in vitro que comprende administrar un CAF dirigido a uPARAP o una composición que comprende un CAF dirigido a uPARAP como se describe en esta invención Esta inhibición del crecimiento puede incluir muerte celular o puede incluir inhibición del crecimiento sin muerte celular.
En una realización particularmente preferida de la presente divulgación, la célula que expresa uPARAP es una célula tumoral y/o una célula asociada a un tumor y la presente divulgación se refiere a un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el CAF dirigido por uPARAP o una composición que comprende un CAF dirigido por uPARAP como se describe en esta invención a dicho sujeto.
Las células asociadas a tumores incluyen fibroblastos activados, miofibroblastos, neovasculatura y células infiltrantes del linaje macrófago-monocitos u otros tipos de células leucocíticas, así como células del tejido estromal que rodea el tumor.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para inhibir la progresión tumoral en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un CAF dirigido por uPARAP o una composición que comprende un CAF dirigido por uPARAP como se describe en esta invención a dicho sujeto. . Esta inhibición de la progresión tumoral puede incluir la erradicación completa o incompleta de los tumores, o puede incluir la detención del crecimiento sin muerte celular.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para inhibir, reducir o eliminar la capacidad metastásica de un tumor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un ADC dirigido por uPARAP o una composición que comprende un ADC dirigido por uPARAP como descrito en esta invención a dicho sujeto.
En una realización de la presente divulgación, las células tumorales expresan o sobreexpresan uPARAP.
En una realización de la presente divulgación, las células asociadas al tumor expresan o sobreexpresan uPARAP. En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona un procedimiento para inducir la muerte celular y/o inhibición del crecimiento y/o proliferación de células que expresan uPARAP, que comprende la etapa de administrar al individuo una cantidad efectiva de un CAF que se dirige a uPARAP como se describe en esta invención, o una composición farmacéutica que comprende un CAF que se dirige a uPARAP como se describe en esta invención.
El tratamiento induce preferiblemente la muerte celular y/o inhibe el crecimiento y/o proliferación de las células que expresan uPARAP, tales como células tumorales o células asociadas a tumores.
En una realización de la presente divulgación, el tratamiento es de alivio.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tratamiento es curativo.
En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación proporciona un CAF dirigido a uPARAP como se describe en esta invención para la preparación de un medicamento para inducir la muerte celular y/o inhibir el crecimiento y/o proliferación de células que expresan uPARAP, tales como células tumorales o células asociadas a tumores.
La expresión y el papel de uPARAP en el cáncer ha sido investigada por varios grupos de investigación; cf. revisión de Melander y col. (Melander y col., 2015, Int J Oncol 47: 1177-1188) y artículo de Engelholm y col (Engelholm y col., 2016, J. Pathol. 238, 120-133).
En una realización de la presente divulgación, el cáncer es un tumor sólido, donde las células tumorales y/o las células asociadas a tumores expresan uPARAP.
En una realización de la presente divulgación, el cáncer es un tumor sólido, donde las células tumorales expresan uPARAP.
Los ejemplos de cánceres caracterizados por la sobreexpresión de uPARAP incluyen sarcoma, incluido el osteosarcoma (Engelholm y col., 2016, J Pathol 238(1): 120-33) así como otros sarcomas, glioblastoma (Huijbers y col., 2010, PLoS One 5(3):e9808), cáncer de próstata y metástasis óseas del cáncer de próstata (Kogianni y col., 2009, Eur J Cancer 45(4): 685-93), cáncer de mama y, en particular, cáncer de mama "similar a basal" (Wienke y col., 2007, Cancer Res 1;67(21): 10230-40), y cáncer de cabeza y cuello (Sulek y col., 2007, J Histochem Cytochem 55(4): 347-53).
En una realización de la presente divulgación, el cáncer es sarcoma, tal como osteosarcoma, liposarcoma, mixofibrosarcoma, dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) y/o leiomiosarcoma (LMS).
En una realización de la presente divulgación, el cáncer es glioblastoma.
En una realización de la presente divulgación, el cáncer es un tumor sólido, donde las células asociadas al tumor expresan uPARAP. Cuando uPARAP es expresado por células asociadas a tumores, se cree que el efecto terapéutico está mediado por el llamado efecto "transeunte" y/o vía reducción y/o eliminación de la estimulación del crecimiento y diseminación tumoral mediada por células estromales.
Ejemplos de cánceres caracterizados por sobreexpresión de uPARAP en las células asociadas a tumores incluyen cáncer de mama (Schnack y col., 2002, Int J Cancer 10;98(5): 656-64), cáncer de cabeza y cuello (Sulek y col., 2007, J Histochem Cytochem 55(4): 347-53) y muchos otros tumores malignos sólidos.
En una realización de la presente divulgación, el cáncer no es un tumor sólido. Por ejemplo, el CAF de la presente divulgación puede, por ejemplo, usarse para el tratamiento de leucemia que expresa uPARAP, por ejemplo, del linaje macrófago-monocito.
En otras realizaciones de la presente divulgación, la enfermedad o trastorno caracterizado por células que expresan uPARAP no es cáncer.
uPARAP participa en el crecimiento óseo y la homeostasis (Madsen y col., 2013, PLoS One 5;8(8): e71261). Por tanto, en una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación puede usarse para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por degradación ósea, donde la degradación ósea está mediada por células no malignas, como la osteoporosis.
Debido a su papel en la acumulación de colágeno, también se ha demostrado un papel de uPARAP en la fibrosis (Madsen y col., 2012, J Pathol 227(1):94-105). Por tanto, en una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación puede usarse para el tratamiento de la fibrosis, por ejemplo, de riñón, pulmón e hígado.
En una realización de la presente divulgación, el CAF de la presente divulgación puede usarse para el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con macrófagos, que incluyen aterosclerosis e inflamación crónica.
Bibliografía
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Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K. and Foeller, C. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 5a Edición. NIH Publicación No. 91-3242.
Wu, T.T., Kabat, E. A. (2008) Pillars article: an analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med. 132, 211-250. J. Immunology 180, 7057-7096.
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Kunik V, Peters B, Ofran Y. (2012b) Structural consensus among antibodies defines the antigen binding site. PLoS Comput Biol. 8(2):e1002388.
Ejemplo 1: Eficacia in vitro e in vivo de los CAF dirigidos contra la región N-terminal de uPARAP Materiales y procedimientos
Preparación y evaluación de CAF mAb-vc-MMAE
Se generaron y produjeron anticuerpos monoclonales (mAb) contra uPARAP o contra trinitrofenol (TNP) usando la técnica de hibridoma después de la inmunización de ratones, según procedimientos establecidos conocidos en la técnica. En el caso de los mAb contra uPARAP, los ratones hospedadores para la inmunización tenían un gen deficiente con respecto a uPARAP, lo que condujo a anticuerpos reactivos tanto con el antígeno humano como con el murino Los CAF se prepararon mediante un procedimiento de conjugación comúnmente empleado, descrito previamente en la técnica (Doronina y col. 2003 Nature biotechnology 21(7):778-84; Francisco y col., 2003. Blood 102(4):1458-65; Hamblett y col., 2004. Clinical cancer research 10(20):7063-70).
Los anticuerpos se sometieron a una reducción suave mediante una incubación de 10 minutos a 37°C en presencia de DTT 10 mM en un tampón de borato de sodio 50 mM, NaCl 50 mM, pH 8,0 a 5 mg/mL de concentración, seguido de la eliminación de DTT mediante intercambio de tampón usando filtros centrífugos NMWL de 30 kDa a PBS fresco pH 7,4 con EDTA 1 mM, a continuación ajustado a 2 mg/mL de concentración Esto fue seguido por la conjugación inmediata con un excedente molar de 5 a 10 veces de maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenzoiloxicarbonilmonometil auristatina E (MC-VC-PAB-MMAE, es decir, Vedotin), disuelto en DMSO sin agua hasta un contenido final de DMSO del 10% v/v durante la conjugación durante 2 horas a 37°C. Los CAF mAb-vc-MMAE resultantes se purificaron mediante filtración en gel en columnas de desalación PD-10. La Proporción de Fármaco a Anticuerpo (PFA) promedio de los CAF resultantes se determinó en función de la proporción de absorbancia de las muestras de conjugado purificado a A=248nm y A=280nm. Los mAbs no modificados muestran una relación A248nm/A280 nm de 0,43, y la Amax a A=248nm de MMAE da lugar a una mayor relación A248nm/A280 nm para los CAF mAb-vc-MMAE, que se ha demostrado que refleja la PFA de los CAF resultantes (Hamblett y col., 2004. Clinical cancer research 10(20):7063-70; Sanderson y col., 2005. Clinical Cancer Research 11:843-852).
Líneas celulares
Las células U937, THP-1 y HT1080 se obtuvieron todas de ATCC. Las células KNS42 fueron amablemente proporcionadas por Lara Perryman, Centro de Investigación e Innovación Biotecnológica (BRIC) de la Universidad de Copenhague. Las células CHO-K1 se obtuvieron de Invitrogen. Todas las células se mantuvieron en un medio apropiado suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% penicilina/estreptomicina, a 37°C, 5% en incubadora de atmósfera de CO2.
Análisis SDS-PAGE de especies conjugadas
La reducción de SDS-PAGE se realizó ejecutando un gel NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE al 4-12%, cargando 5 |jg de proteína total por carril, reducido hirviendo durante 3 minutos en tampón de muestra en presencia de DTT 40 mM. Los geles se tiñeron usando una tinción estándar de azul de Coomassie al 0,1%. Para el ensayo de escisión del enlazador de catepsina B, las muestras se trataron con catepsina B humana recombinante (rh) según las instrucciones del fabricante, utilizando 100 ng de catepsina B activada en 20 jg de CAF (componente mAb), en un tampón MES 25 mM, pH 5,0, e incubación a 37°C durante la noche.
Análisis ELISA de la unión de mAb a uPARAP
Una placa ELISA de 96 pocillos se revistió con 25ng/pocillo de una proteína uPARAP truncada soluble que contiene los primeros 3 dominios N-terminales de uPARAP humano, con epítopo intacto para mAb 2h9. Los mAb no tratados (2h9 o aTNP), los mismos mAb sometidos al procedimiento de reducción de conjugación (ver más arriba), o los CAF 2h9-vc-MMAE o aTNP-vc-MMAE, se emplearon a continuación como anticuerpo primario, seguido de un anticuerpo secundario Ig anti-ratón de conejo conjugado con HRP. Finalmente, se añadió una solución de sustrato que contenía diclorhidrato de o-fenilendiamina y la reacción de color se detuvo añadiendo H2SO41 M. Las placas se leyeron a 492 nm usando un lector de placas.
Citotoxicidad in vitro de CAF - Ensayo de viabilidad celular
Células de la prueba se sembraron a baja densidad (20-25% de confluencia, en general 5-10x103 células por pocillo) en una placa de 96 pocillos en 90|j L de medio, y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se prepararon conjugados mAb-vc-MMAE basados en mAb 2h9, mAb 5f4 o mAb de control no dirigido aTNP como una dilución en serie (1:4) en PBS y se añadieron en volúmenes de 10 jL a cada pocillo, con una concentración final máxima de CAF de componente mAb de 10jg/mL. Las células se incubaron durante 72 horas, antes de añadir 20 j l de ensayo de proliferación celular CellTiter 96 AQueous One Solution (MTS, Promega), y se incubaron durante un tiempo apropiado para la formación de color (normalmente 1 hora). A continuación, se leyeron las placas a 490 nm, con sustracción de fondo a 630 nm, utilizando un lector de placas.
Citotoxicidad in vitro de CAF - Análisis del ciclo celular
El análisis del ciclo celular se realizó usando un sistema Nucleocounter NC-3000 (ChemoMetec Dinamarca), usando el protocolo estándar del fabricante para analizar la distribución del ciclo celular de una población de células, basado en el contenido de ADN de cada célula. El porcentaje de células en fases Sub-G1, G1, S o G2/M del ciclo celular se estableció a partir del análisis de histograma utilizando el software NucleoView NC-3000.
Competición del receptor e inhibición de proteasa lisosomal
Para el ensayo de competición del receptor, el ensayo de agotamiento del receptor y el ensayo de inhibición de proteasas lisosomales, se sembraron células U937 como para un ensayo de viabilidad celular (ver más arriba). Para el ensayo de competición del receptor, una concentración constante de 2h9-vc-MMAE del componente mAb de 1 jg/mL se mantuvo en todos los pocillos y el mAb de competición sin modificar se añadió simultáneamente en una serie de diluciones. (1:2) comenzando con una concentración de 8jg/mL mAb competitivo. A continuación, las células se sometieron a un ensayo de viabilidad celular de citotoxicidad de 72 horas (véase más arriba). Para el ensayo de inhibición de proteasas lisosomales, las células U937 se preincubaron con 20 jM de inhibidor de proteasa E64D durante 2 horas, antes de iniciar un ensayo de viabilidad celular de citotoxicidad de 72 horas (ver más arriba).
Experimentos en animales
Todos los experimentos con animales se realizaron bajo la aprobación legal de la Administración Danesa de Veterinaria y Alimentos. Todos los reactivos y líneas celulares utilizados para experimentos con animales dieron negativo para la presencia de virus murinos, bacterias, micoplasmas y hongos. Los animales recibieron atención estándar y fueron sacrificados ante cualquiera de los siguientes signos: pérdida de más del 10% del peso corporal, malestar o enfermedad visible, ingesta o defecación comprometida de alimentos o agua, signos de inflamación grave en las proximidades de los tumores, o crecimiento tumoral que excediera un volumen de 1000 mm3 o comprometiera la libre circulación de los animales. El crecimiento tumoral se midió usando calibradores electrónicos y los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula Volumen=(LxW2)/2, siendo L la dimensión más larga del tumor y W el ancho en la dimensión perpendicular.
Tratamiento de un modelo de tumor de xenoinjerto U937 subcutáneo positivo para uPARAP en ratones mediante inyección s.c.
Para el establecimiento del tumor, a los ratones se les afeitó en el flanco, y recibieron una inyección subcutánea de 1x106 células U937, y a continuación se vigilaron estrechamente con el fin de observar el desarrollo de tumores sólidos. Tras la formación de tumores palpables con un volumen de 50-100 mm3, los ratones comenzaron el tratamiento en uno de los cuatro grupos de tratamiento: 2h9-vc-MMAE (N=10), aTNP-vc-MMAE (N=9), mAb sin modificar 2h9 (N=5) o control de vehículos PBS (N=5). Todos los tratamientos se administraron como un total de 4 dosis subcutáneas de 3 mg/kg de componente mAb en el área del tumor, a intervalos de 4 días. Las inyecciones se realizaron bajo anestesia breve con isoflurano para evitar riesgos para el operario. Durante el tratamiento, los tumores se evaluaron cada dos días, hasta llegar a un punto de sacrificio. Los ratones que perdieron por completo cualquier carga tumoral se revisaron dos veces por semana durante un período de 3 meses después de finalizar el tratamiento.
Tratamiento de un modelo de tumor de xenoinjerto U937 subcutáneo positivo para uPARAP en ratones mediante inyección s.c.
Para el establecimiento del tumor, a los ratones se les afeitó en el flanco, y recibieron una inyección subcutánea de 1x106 células U937, y a continuación se vigilaron estrechamente con el fin de observar el desarrollo de tumores sólidos. Tras la formación de tumores palpables con un volumen de 50-100mm3, los ratones comenzaron el tratamiento en uno de los cuatro grupos de tratamiento: 2h9-vc-MMAE (N = 10), aTNP-vc-MMAE (N = 10), mAb 2h9 sin modificar (N = 5) o control de vehículo PBS (N = 5). Todos los tratamientos se administraron como un total de 3 dosis intravenosas de 5 mg/kg de componente mAb en las venas de la cola de los ratones, a intervalos de 4 días. Durante el tratamiento, los tumores se evaluaron cada dos días, hasta llegar a un punto de sacrificio. Los ratones que perdieron por completo cualquier carga tumoral se revisaron dos veces por semana durante un período de 3 meses después de finalizar el tratamiento.
Estadísticas
Todas las muestras se realizaron por triplicado. Barras de error: Desviaciones estándar.
Resultados y conclusiones
El receptor de colágeno uPARAP está regulado positivamente en las células tumorales de cánceres específicos, incluidos los sarcomas y el glioblastoma en etapa tardía. Además, el receptor se regula positivamente con mayor frecuencia en las células estromales que rodean a los tumores sólidos. En individuos adultos sanos, el receptor muestra una expresión restringida, lo que lo convierte en una diana potencial para la terapia con CAF.
Para este propósito, seleccionamos un anticuerpo monoclonal, 2h9, obtenido después de la inmunización de un ratón deficiente en el gen de uPARAP, y preparamos un CAF dirigido a uPARAP (2h9-vc-MMAE) usando un procedimiento de conjugación bien establecido Se demostró que el anticuerpo de direccionamiento 2h9 tolera bien el procedimiento de conjugación, con una pérdida de afinidad insignificante. Se demostró que el CAF resultante es altamente específico para matar o inducir la detención del crecimiento en células positivas para uPARAP in vitro, siendo las células U937 la línea celular más sensible probada. uPARAP es un receptor de reciclaje constitutivo, que dirige su carga al compartimento lisosómico. Encontramos que la eficacia de CAF en células altamente sensibles, como las células U937, dependía completamente de la escisión del enlazador, ya que la citotoxicidad dependiente de uPARAP se abrogaba después de la inhibición de catepsinas lisosomales con E64D. Por lo tanto, sugerimos que la capacidad lisosomal de escisión del enlazador contribuye a las diferencias en la sensibilidad de CAF entre diferentes tipos de células, en colaboración con las diferencias generales en la sensibilidad hacia la citotoxina conjugada.
Para los estudios in vivo, utilizamos un modelo de tumor de xenoinjerto subcutáneo de crecimiento rápido con células U937 en ratones CB17 SCID Usando este modelo, se encontró que CAF 2h9-vc-MMAE era altamente eficiente para erradicar tumores sólidos U937 in vivo.Después del tratamiento mediante administración subcutánea local, 5 ratones permanecieron libres de tumor 90 días después de finalizar el régimen de tratamiento, lo que constituye una tasa de curación del 50%. Más importante aún, después del tratamiento por administración intravenosa, observamos un efecto potente que resultó en una tasa de curación del 100%. En particular, esta erradicación de tumores se obtuvo sin ningún efecto adverso evidente tras la inspección regular de los ratones tratados. Es importante destacar que el anticuerpo 2h9 es reactivo contra uPARAP tanto humano como murino, una reactividad cruzada habilitada por el uso de un ratón deficiente en uPARAP para la inmunización cuando se genera el anticuerpo. Por lo tanto, en este modelo de xenoinjerto, además de los efectos antitumorales beneficiosos, se revelaría cualquier efecto secundario perjudicial potencial en el huésped, pero no se observaron signos de efectos perjudiciales.
El epítopo para el anticuerpo 2h9 está ubicado dentro de los primeros tres dominios N-terminales de uPARAP, más particularmente en el dominio CysR o CTLD-1Los estudios in vitro presentados en esta invención indican que otro CAF que comprende un anticuerpo anti-UPARAP dirigido a los primeros tres dominios N-terminales de uPARAP, a saber, 5f4, es tan eficiente como los CAF que comprenden el anticuerpo 2h9. El epítopo del anticuerpo 5f4 está en el dominio FN-II de uPARAP. Por tanto, planteamos la hipótesis de que los CAF que comprenden anticuerpos antiuPARAP dirigidos contra epítopos dentro de los primeros tres dominios N-terminales de uPARAP son particularmente eficaces como CAF.
En conclusión, los datos presentados aquí apoyan firmemente la noción del receptor de colágeno uPARAP como una diana versátil en la terapia del cáncer de CAF basada en el patrón de expresión y la función molecular Además, estos datos muestran que los CAF que comprenden anticuerpos dirigidos contra los primeros tres dominios N-terminales de uPARAP, tales como CAF 2h9-vc-MMAE, son altamente eficientes para el direccionamiento de células que expresan uPARAP in vitro e in vivo.
Ejemplo 2: Eficacia in vitro de CAF basados en MMAE
Además de los CAF del Ejemplo 1, se generaron los siguientes CAF de MMAE: 9b7-vc-MMAE y 11c9-vc-MMAE. mAb 2h9, mAb 5f4 y mAb 9b7 están dirigidos contra epítopos dentro de los tres dominios N-terminales de uPARAP, mientras que mAb 11c9 es un anticuerpo anti-uPARAP dirigido contra un epítopo fuera de los tres dominios N-terminales de uPARAP.
Se realizaron ensayos de viabilidad celular in vitro con células U937 como se describe en el Ejemplo 1, usando todos estos CAF. Todos los CAF conducen a una reducción específica en la viabilidad celular general, pero la sensibilidad celular a 2h9-vc-MMAE, 5f4-vc-MMAE y 9b7-vc-MMAE es significativamente mayor que la sensibilidad a 11c9-vc-MMAE (Figura 14).
Por tanto, los inventores concluyen que los CAF que comprenden anticuerpos anti-uPARAP capaces de unirse a epítopos dentro de los tres dominios más N-terminales de uPARAP son CAF muy eficaces.
Ejemplo 3: Eficacia in vitro de CAF que comprenden diferentes enlazadores, espaciadores y toxinas
Se pueden usar diferentes toxinas en un formato de CAF dirigidas a la parte N-terminal de uPARAP. Los CAF con mAb 2h9 como componente de anticuerpo se prepararon como se describió anteriormente pero usando los siguientes conjuntos de enlazador-citotoxina en lugar de VC-PAB-MMAE:
- VC-PAB-MMAF (siendo MMAF monometil auristatina F, una variante carboxilo de MMAE)
- PEG4-va-PBD (donde PEG4 se refiere a un espaciador de polietilenglicol, va es valina-alanina y PBD se refiere a una pirrolobenzodiazepina dimérica)
- PEG4-vc-Duocarmicin SA (donde PEG4 se refiere a un espaciador de polietilenglicol y vc es valina-citrulina) Los CAF resultantes (denominados 2h9-vc-MMAF, 2h9-va-PBD y 2h9-vc-DuocSA, respectivamente) se usaron para ensayos de viabilidad celular in vitro con células U937, realizados como se describió anteriormente. Las células U937 mostraron una sensibilidad muy fuerte a 2h9-vc-MMAF, una sensibilidad más moderada a 2h9-va-PBD y una sensibilidad baja pero medible a 2h9-vc-DuocSA. Se muestran los resultados en las Figuras 15 y 16.
Ejemplo 4: Eficacia in vitro de los CAF en células de explante de glioblastoma humano
Los CAF 2h9-vc-MMAE y 2h9-vc-MMAF se ensayaron mediante ensayos de viabilidad celular in vitro, realizados como se describe en el Ejemplo 1, para determinar su capacidad para destruir específicamente células de explante de glioblastoma humano. Las células de explante de glioblastoma se describen, por ejemplo, en Staberg y col., 2017, Cell Oncol. 40: 21-32. Estas células mostraron una sensibilidad muy fuerte y específica hacia CAF 2h9-vc-MMAE, así como CAF 2h9-vc-MMAF, demostrando así una alta eficacia de estos CAF en la lucha contra las células de glioblastoma humano. Los resultados se presentan en la Figura 17.
Ejemplo 5: Anticuerpo recombinante
El producto proteico codificado por un ADN sintético, que comprende [SEQ ID NO: 1] (cadena ligera del anticuerpo monoclonal 2h9 contra uPARAP) y [SEQ ID NO: 5] (cadena pesada del mismo anticuerpo), se expresó en células CHO. El producto de anticuerpo recombinante resultante se purificó y se demostró mediante transferencia Western que reconoce específicamente uPARAP de la misma manera que el anticuerpo monoclonal 2h9 producido por cultivo de células de hibridoma (Figura 18).

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido contra uPARAP que comprende:
a) un anticuerpo que se une a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 (el dominio de fibronectina tipo II (FN-II) de uPARAP),
b) un agente activo, donde el agente activo se selecciona de entre un agente terapéutico, un agente citotóxico, un radioisótopo y un marcador detectable, y
c) un enlazador que une a) con b).
2. El conjugado anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, donde el anticuerpo se selecciona de entre el grupo que consiste en:
a) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y
ii. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de la misma,
donde cualquier variación de secuencia está fuera de las regiones determinantes de complementariedad, b) una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a),
c) una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a),
d) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 13, 14 y
ii. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 16, 17 y 18.
e) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nos: 48, 49, 50 y
ii. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 51, 52 y 53.
f) una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de d) o e).
3. La composición para su uso según la reivindicación 1, donde el compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en:
a) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 o 20 o una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia de la misma, y
ii. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o 25 o una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia de la misma,
donde cualquier variación de secuencia está fuera de las regiones determinantes de complementariedad, b) una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a),
c) una versión quimérica del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de a),
d) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21, 22, 23 y
ii. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26, 27 y 28.
e) un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende
i. una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 54, 55, 56 y
ii. una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 57, 58 y 59.
f) una versión humanizada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de d) o e).
4. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo se selecciona de entre un anticuerpo de ratón, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un fragmento de unión a antígeno humanizado, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un Fv, un anticuerpo monocatenario (SCA) como un scFv, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de los mismos y un minianticuerpo Fab.
5. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
6. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el agente activo es un agente quimioterapéutico, tal como un agente quimioterapéutico seleccionado de entre el grupo que consiste en agentes alquilantes, antraciclinas, antimetabolitos, agentes anti-microtúbulo/anti-mitóticos, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de quinasa, antibióticos peptídicos, antineoplásicos a base de platino, inhibidores de topoisomerasa y antibióticos citotóxicos.
7. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el agente activo es un agente antimitótico, tal como se selecciona de entre el grupo que consiste en monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), un taxano (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel), un alcaloide de la vinca (por ejemplo, Vinblastina, Vincristina, Vindesina o Vinorelbina), Colchicina o Podofilotoxina.
8. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el agente activo es un agente de reticulación de ADN, tal como un agente de reticulación de ADN seleccionado de pirrolobenzodiazepina o un derivado de pirrolobenzodiazepina dimérico.
9. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el agente activo es un agente alquilante, tal como Duocarmycin SA.
10. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso como medicamento.
11. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y un tampón, diluyente, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. El conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica según la reivindicación 11 para su uso en un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por células que expresan uPARAP, tal como donde la enfermedad caracterizada por células que expresan uPARAP se selecciona de entre cáncer, una enfermedad de degradación ósea tal como osteoporosis, fibrosis y enfermedades o trastornos asociados a macrófagos tales como aterosclerosis o inflamación crónica.
13. El conjugado anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, donde la enfermedad es cáncer.
14. El conjugado anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, donde el cáncer es sarcoma, como osteosarcoma, liposarcoma, mixofibrosarcoma, dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP). y/o leiomiosarcoma (LMS).
15. El conjugado anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, donde el cáncer es glioblastoma.
16. El conjugado anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, donde el cáncer es cáncer de próstata o metástasis óseas del cáncer de próstata.
17. El conjugado anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, donde el cáncer es cáncer de mama.
18. El conjugado anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, donde el cáncer es cáncer de la cabeza o cuello.
19. El conjugado anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, donde el cáncer es leucemia.
20. Un kit que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o la composición farmacéutica según la reivindicación 11, que opcionalmente comprende además medios para administrar el conjugado anticuerpo-fármaco a un sujeto. y/o instrucciones de uso.
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