CN115397513A - 改进的抗衰老化合物及其用途 - Google Patents

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CN115397513A CN202180015708.2A CN202180015708A CN115397513A CN 115397513 A CN115397513 A CN 115397513A CN 202180015708 A CN202180015708 A CN 202180015708A CN 115397513 A CN115397513 A CN 115397513A
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Abstract

本发明涉及改进的化合物，其用于治疗能从移除衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中得到益处的疾病或病症，例如癌症。本发明还涉及用于治疗罹患、或疑似罹患能从移除衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中得到益处的疾病或病症的个体的方法。

Description

改进的抗衰老化合物及其用途
技术领域
本发明涉及改进的化合物，其可用于治疗能从移除衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中得到益处的疾病或病症，例如癌症。本发明还涉及治疗罹患或疑似罹患能从移除衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中得到益处的疾病或病症的个体的方法。
背景技术
细胞凋亡(程序性细胞死亡)能够杀伤受损细胞。经历凋亡最后阶段的将死细胞呈现出吞噬分子，使得这些细胞被具有合适受体的细胞，例如巨噬细胞，吞噬。
衰老细胞被认为会破坏组织功能，且它们的遗传清除可以延缓衰老特征。衰老细胞从细胞周期中永久撤出，且通常发展出持久的促炎性表型，称为衰老相关分泌表型或SASP。SASP影响细胞微环境，这在生命的早期或在伤口愈合的急性期可能是有益的。然而，不像被永久消除的凋亡细胞，衰老细胞可能在较长时间内大面积存在，并随着年纪增长而积聚。因为它们较低但慢性的SASP，持久存在的衰老细胞被认为会加速衰老以及年龄相关疾病的发生。
已经显示出，衰老细胞随着年龄积聚，并积聚在年龄相关病理位置上。此外，衰老细胞可以获得使得它们重新进入增殖状态的突变。因而良性的衰老病灶保持变为恶性的能力。确实，衰老已经跟很多的(年龄相关)病理相关联，反过来，衰老细胞的遗传意义上的清除可以延缓衰老特征。
确实，最近已经示出，在加速衰老的小鼠模型中，衰老细胞在遗传意义上的清除可以显著地改善健康状况，并降低衰老参数。这些小鼠显示出减少的衰老迹象，如由脊柱后凸(过度骨骼曲度)、肌肉力量、脂肪堆积和白内障所测得的。这提供了进一步的证据，即细胞衰老和SASP与年龄相关表型以及癌症有因果联系(Baker et al.，2011.Nature479(7372)：232-6)。该概念-验证的证据在遗传学意义上获得，具有较差的治疗实用性。
研究较为一致地揭示出，FOXO(叉头框O)转录因子为衰老和长寿的重要决定因子。FOXO蛋白表示从秀丽隐杆线虫到哺乳动物均保守的转录因子亚家族，其作用为胰岛素和胰岛素类生长因子通路下游的关键寿命调节因子。无脊椎动物基因组有1个FOXO基因，而哺乳动物有4个FOXO基因：FOXO1、FOXO3、FOXO4、和FOXO6。在哺乳动物中，该亚家族参与大范围的关键细胞进程，调节压力耐受、代谢、细胞周期停滞、和细胞凋亡。它们在寿命决定中的作用是复杂的，且有待于全面了解。
Bourgeois和Madl(Regulation ofcellular senescence via the FOXO4-p53axis.FEBS Lett.2018Jun；592(12)：2083-2097)公开了，在过去十年中，FOXO和p53已经被识别为衰老的关键调节因子，而它们的失调与多种疾病，包括癌症，相关。然而，很多基础分子机制仍未知，包括FOXO和p53对衰老的调控。在FOXO和p53之间似乎共享一些活性，包括它们在细胞衰老调节中的中心地位。他们聚焦于FOXO与p53之间关联的最新进展，且特别关注FOXO4-p53轴，以及FOXO4/p53在细胞衰老中的作用。讨论了可能的将靶向FOXO4-p53相互作用以调节细胞衰老作为年龄相关疾病和病态的治疗中的药物靶点的策略。
WO2013/152038涉及抑制Jun激酶和/或FOXO4的作用剂在个体中治疗癌症和/或移除衰老细胞的用途。在一些实施方式中，作用剂是小分子，例如SP600125。在一些实施方式中，作用剂是小分子例如AS601245。在一些实施方式中，作用剂是所公开的肽。
WO2013/152041涉及抑制FOXO4功能的作用剂、及其在个体中治疗癌症和/或移除衰老细胞的用途。在一些实施方式中，抑制FOXO4的作用剂是抑制细胞中FOXO4功能的肽，其中该肽包含与所公开的FOXO4片段具有至少80％同一性的氨基酸序列。
WO2016/118014涉及包含氨基酸序列LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRP(SEQID NO：5)的肽、以及在年龄相关病症治疗中使用该肽的方法，其中该氨基酸序列中的氨基酸为D-氨基酸残基。该肽展现出在衰老细胞、或相对于对照细胞具有增加FOXO4表达且表达Ser15磷酸化p53(pSer15-p53)的细胞中诱导细胞凋亡的活性。
WO2018/129007涉及靶向衰老细胞的条件性活性蛋白、以及生成该条件性活性蛋白的方法。
由以上可以清晰得出，在领域内仍需要在衰老细胞中有选择性地引起细胞凋亡的化合物，因为细胞衰老与退行性(功能丧失)疾病以及癌症(功能获得)相关。当前没有可以选择性地在体内诱导衰老细胞凋亡的合适的治疗上可行的化合物。
发明内容
因而，本发明的目的是提供新的改进化合物，其治疗性地靶向衰老细胞，并且可以有效地用于治疗细胞衰老相关的疾病。
在其第一个方面，本发明通过提供一种化合物、和其药学上可接受的盐来解决该问题，该化合物选自：
i)包含与氨基酸序列X3X2X4X5X7X5X4X4X6X18X8X3QNX9X8X10X10X11X12S*X13X14X11X11(SEQID NO：1)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选高于95％同一性的氨基酸序列的肽，
其中，
S*可以是S、或不存在；
X2不存在，或选自K、E、R、和H；
X3不存在，或选自A、J、和S；
X4选自I、Z、和L，其中Z为环己基-丙氨酸；
X5选自A、G、S、E、和D；
X6选自E和D；
X7选自J、G、Q、A、S、和P；
X8选自B、W、Y、和F，其中B是2-甲基-色氨酸；
X9不存在，或选自A和G；
X10不存在，或选自A和N；
X11选自R和K；
X12不存在，或选自R；
X13不存在，或选自G和S；
X14不存在，或选自A和C；以及
X18选自A和E；
规定没有J，或者存在2个J且形成订书针状物；
ii)根据i)的包含非天然氨基酸、和/或D-氨基酸的肽，优选根据i)的包含至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的D-氨基酸，或由至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的D-氨基酸构成的肽，以及
iii)根据i)或ii)的反-倒位肽，即，当与原本蛋白序列相比时，氨基酸序列翻转并以D-而非L-异构体放置的肽，且
其中该化合物在衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中引发细胞凋亡。
优选的是根据本申请的化合物，其中该肽包含与氨基酸序列X1X17K*X2X16X3X3X2X4X5X7X5X4X4X6AX8X3QNX9X8X10X10X11X12S*X13X14X11X11X15(SEQ ID NO：2)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同一性的氨基酸序列，其中Z、B、J、S*、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、和X18如上所定义；
K*可以是K、或不存在；
X1不存在或表示氨基酸序列LTL；
X15不存在或选自A和C；
X16选自A和P；以及
X17不存在或R和S；且
其中该化合物在衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中引发细胞凋亡。
更优选地，根据本发明的化合物包含氨基酸基序X3QNX9X8(例如，从SEQ ID NO：2的18位开始)，其选自SQNAW(SEQ ID NO：43)、SQNGW(SEQ ID NO：44)、和SQN-W(SEQ ID NO：45)，其中“-”表示不存在的氨基酸。甚至更优选地，根据本发明的化合物包含氨基酸基序X2X4X5X7X5(例如，从SEQ ID NO：2的8位开始)，其选自KIAAA(SEQ ID NO：46)、KIEAA(SEQ IDNO：47)、KIAAE(SEQ ID NO：48)、和KIEAE(SEQ ID NO：49)。
更优选地，根据本发明的化合物包含氨基酸基序X4X5X7X5X4X4X6AX8X3QNX9X8(SEQ IDNO：3，从SEQ ID NO：2的9位开始)，其选自通式IX5X7X5ILX6AYX3QNX9W(SEQ ID NO：4)，
其中，
X3不存在或选自A、J、和S；
X5选自A、G、S、E、和D；
X6选自E和D；
X7选自J、G、Q、A、S、和P；以及
X9不存在或选自A和G。
优选地，根据本申请的化合物由D-氨基酸构成。氨基酸的命名根据标准的单字母编码。
最优选地，根据本申请的化合物是包含选自以下的氨基酸序列的肽、及其药学上可接受的盐：
LTLRKEASSEIAQSILDAYSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：7)、
LTLRKKASSKIAQSILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：8)、
LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRP(SEQ ID NO：9)、
RKKASSKIAQSILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：10)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：11)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNAWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：12)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：13)、
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：14)、
RKKASSKIAAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：15)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：16)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：17)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：18)、
AKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：19)、
AKIEAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：20)、
LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：21)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNGWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：22)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNAWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRA(SEQ ID NO：23)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：24)、
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：25)、
RKKASSKIAAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：26)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：27)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：28)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：29)、
AKIAAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：30)、
AKIEAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：31)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：53)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：54)、
AKIEAAILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：55)、
AKIEAEILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：56)、
AKIEAAILDEFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：57)、
RKKASJKIAJAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：58)、
RKKASSKIAAAZLDAFSQNAWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRA(SEQ ID NO：59)、
AKIEAAILDAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：60)、
AKIEAEILEAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：61)、
AKIEAAZLDAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：62)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：63)、
RKKASSKIEAEZLDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：64)、
RKKASSKIEAEIZDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：65)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：67)、和
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：68)，
其中J、B和Z如上所定义，以及肽，特别是包含选自与SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中任一至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，以及由根据SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中任一的氨基酸构成的肽。这些肽特别是D-肽。
在其第二个方面，本发明涉及一种用于识别与p53结合、或优选地与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的改进化合物的方法，包括以下步骤，a)提供本文中根据本申请的至少一种化合物；b)适当地改造a)的化合物；c)确定b)的至少一种化合物与p53或其片段的结合、该至少一种化合物的稳定性、以及在该至少一种化合物的存在下FOXO4或其片段与p53或其片段的结合(相比于在不存在该化合物时FOXO4或其片段与p53或其片段的结合)中的至少一种，以及d)基于步骤c)的确定，识别出相比于步骤a)提供的化合物为改进的与p53结合、或优选与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物。
优选的是根据本发明的方法，其中该至少一种化合物的结合，特异于p53或其片段。优选的方法还包括测试所识别化合物的引发细胞凋亡和/或杀伤衰老细胞、瘢痕细胞、和/或肿瘤细胞的活性的步骤，优选包括半胱天冬酶活性的确定。
在其第三个方面，本发明涉及一种用于筛选与p53结合、且优选地与p53结合且抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物的筛选工具，包含分离的表达FOXO4的细胞、和/或表达其p53结合片段的细胞(其中该细胞任选地表达p53)，和/或表达其FOXO4结合片段的细胞。
优选的是根据本发明的筛选工具，其中该FOXO4的片段是根据序列PRKGGSRRNAWGNQSYAELISQAIESAPEKRLTLAQIYEWMVRTVPYFKDKGDSNSSAGWKNSIRHNLSLHSKFIKVHNEATGKSSWWMLN(完整叉头结构域)(SEQ ID NO：32)或PRKGGSRRNAWGNQSYAELISQAIESAPEKRLTL(SEQ IDNO：33)的肽，其中该p53的片段是根据序列AMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGP(SEQ ID NO：34)的肽。
在其第四个方面，本发明涉及一种用于制备在受试者中治疗或预防衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞的药物组合物的方法，包括将根据本发明的化合物配制到合适的药物组合物中或实施本发明方法、以及将所识别的化合物配制到合适的药物组合物中的步骤。根据本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，例如，但不限于，稳定剂、膨胀剂、缓冲剂、载体、稀释剂、溶剂、增溶剂、和粘合剂。本领域技术人员了解，合适赋形剂的选择取决于给药途径和剂型、以及活性成分和其他因素。根据本发明的药物组合物优选适用于肠道外给药。
在其第五个方面，本发明涉及由本发明方法获得的用于在受试者中治疗或预防衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞的药物组合物。
在其第六个方面，本发明涉及根据本发明的至少一种化合物、或根据本发明的药物组合物在医学中的用途。优选的是根据本发明用途的至少一种化合物或药物组合物，其中要预防和/或治疗的疾病或病症选自由衰老细胞、瘢痕细胞造成的症状、年龄相关疾病、肾病、骨关节炎、COPD、骨骼肌疾病、认识功能损伤、和癌症。
在其第七个方面，本发明涉及一种用于在有需要受试者中治疗或预防由衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞造成的疾病或病症、年龄相关疾病、肾病、骨关节炎、COPD、骨骼肌疾病、认识功能损伤、或癌症的方法，包括向该受试者施用有效量的至少一种本发明化合物、或根据本发明的药物组合物。
其他方面和有益之处可以由阅读以下描述和非限制性例子而方便地得到。
具体实施方式
在本发明所实施实验的背景下，当前发明人令人惊讶地发现，当在仔细地进一步分析FOXO4与p53的相互作用后向化合物引入变化时，仍可实现相当实质性的功能改进
因而，本发明的主要方面涉及改进的化合物、及其药学上可接受的盐，该化合物选自
i)包含与氨基酸序列X3X2X4X5X7X5X4X4X6X18X8X3QNX9X8X10X10X11X12S*X13X14X11X11(SEQID NO：1)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选高于95％同一性的氨基酸序列的肽，
其中，
S*可以是S、或不存在；
X2不存在，或选自K、E、R、和H；
X3不存在，或选自A、J、和S；
X4选自I、Z、和L，其中Z为环己基-丙氨酸；
X5选自A、G、S、E、和D；
X6选自E和D；
X7选自J、G、Q、A、S、和P；
X8选自B、W、Y、和F，其中B是2-甲基-色氨酸；
X9不存在，或选自A和G；
X10不存在，或选自A和N；
X11选自R和K；
X12不存在，或选自R；
X13不存在，或选自G和S；
X14不存在，或选自A和C；以及
X18选自A和E；
规定没有J，或者存在2个J且形成订书针状物；
ii)根据i)的包含非天然氨基酸、和/或D-氨基酸的肽，优选根据i)的包含至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的D-氨基酸，或由至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的D-氨基酸构成的肽，以及
iii)根据i)或ii)的反-倒位肽，即，当与原本蛋白序列相比时，氨基酸序列翻转并以D-而非L-异构体放置的肽，且
其中该化合物在衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中引发细胞凋亡。优选地，该化合物由D-氨基酸构成。
优选的是与p53结合、或更优选与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物，其可以用领域内现有的检测、和/或本文所公开的检测而检测到。这些检测包括NMR，其中可确定该肽与TP53(的片段)结合的能力；拉下检测，其中(生物素化版本的)肽与(链霉亲和素)珠结合，将其倒入含有TP53的细胞裂解液中，并研究与该肽结合的TP53部分；以及FRET/HTRF检测，其中评测肽的干扰TP53(的片段)与FOXO4之间相互作用的能力。
FOXO1/3/6与FOXO4之间的进化差异表明，仍可改造一些氨基酸来创建出显示所需抑制活性的改进化合物。
FOXO4在进化上与FOXO1/3和6、以及低等物种中的FOXO直系同源物的不同之处，在于一些独特的残基。当前发明人从未觉得FOXO1或FOXO3是焦点，而且也没有FOXO1和3对衰老细胞存活重要的证据。因而，分析了这些氨基酸是否至少部分地解释了FOXO4-肽在消除衰老细胞中的效力。这在基于与FOXO4相似结构域的D-反-倒位肽中得到证实，而基于FOXO1或FOXO3的序列没有在消除衰老细胞中显示出选择性。
对FOXO4-FH片段和TP53-TAD2结构域的分析显示出，TP53中的负电荷、以及疏水Tyr介导了与FOXO4的结合。因而，认为突变为正电氨基酸，像Glu->Lys和Tyr->Phe，对相互作用的强度是有益的。NMR还示出，N端氨基酸LTL对于相互作用是非必要的。最后，NMR示出，TP53中带负电的氨基酸负责在SQ基序(位点)周边与FOXO4相互作用。可以改造NG氨基酸位点来改进分子的稳定性。所有这些改造呈现出一个新的策略，其中这些中的任一或其组合引出用于本发明的改进分子的合理设计。
还发现，在本发明背景下的活性肽，当与现有技术中已存在的提议相比，可以相当短，而仍然保留很强的活性。但是，更长的更有活性的肽也是可能的，因而，根据本发明的优选化合物是包含与氨基酸序列X1X17K*X2X16X3X3X2X4X5X7X5X4X4X6AX8X3QNX9X8X10X10X11X12S*X13X14X11X11X15(SEQ ID NO：2)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同一性的氨基酸序列，其中Z、B、J、S*、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、和X18如上所定义；
K*可以是K、或不存在；
X1不存在或表示氨基酸序列LTL；
X15不存在或选自A和C；
X16选自A和P；以及
X17不存在或R和S；且
其中该化合物在衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中引发细胞凋亡。
还发现，根据本发明的特别有活性的肽包含某些氨基酸基序，优选的是选自SQNAW(SEQ ID NO：43)、SQNGW(SEQ ID NO：44)、和SQN-W(SEQ ID NO：45)的氨基酸基序X3QNX9X8(例如，从SEQ ID NO：2的18位开始)，其中“-”表示不存在的氨基酸。
令人惊讶地发现，在X9是丙氨酸(A)的情况下，肽在溶液中显示出改善的稳定性，如在肽SEQ ID NO：12和23的情况下所示例的(参见实施例)。因而，优选该变换，以向根据本发明的化合物提供额外的稳定性。
甚至更优选地，根据本发明的化合物包含选自KIAAA(SEQ ID NO：46)、KIEAA(SEQID NO：47)、KIAAE(SEQ ID NO：48)、和KIEAE(SEQ ID NO：49)的氨基酸基序X2X4X5X7X5(例如，从SEQ ID NO：2的8位开始)。
更优选地，根据本发明的化合物包含氨基酸基序X4X5X7X5X4X4X6AX8X3QNX9X8(SEQ IDNO：3，从SEQ ID NO：2的9位开始)，其选自通式IX5X7X5ILX6AYX3QNX9W(SEQ ID NO：4)，
其中，
X3不存在或选自A、J、和S；
X5选自A、G、S、E、和D；
X6选自E和D；
X7选自J、G、Q、A、S、和P；以及
X9不存在或选自A和G。
在本发明的背景下，发现氨基酸基序LTLRKEASSE(SEQ ID NO：35)对于肽的基本功能改善是非必需的，且可以减少到单个Ala，由Ala、“中性”或带正电氨基酸替换。相反，可选自如上通式IX5X7X5ILX6AFX3QNX9W(SEQ ID NO：4)的“核心基序”X4X5X7X5X4X4X6AX8X3QNX9X8(SEQ ID NO：3，从SEQ ID NO：2的9位开始)是非常重要的。然而，在该基序中，氨基酸“SONG”(SEQ ID NO：50)似乎起到结构接头的作用，且作用于使得“W”收缩到疏水核中。一些残基可以删除，单个或双个“G”就足够，且当使用AANG(SEQ ID NO：51)或SQ-G或SQAG(SEQ ID NO：52)时，肽仍可作用。在末端的W仍是必要的，且难以用天然AA取代。在开端的“I”是必要的，需要是疏水氨基酸，优选I/L，但是也可以是非天然的。在IX5X7X5IL(SEQ ID NO：36，例如IAQSIL，SEQ ID NO：37)部分中，“I”之间的间隔需要2-3个残基。可以容忍一些改变，只要它们不破坏螺旋或疏水核。类似地，在末端的“IL”是必要的，且需要是疏水氨基酸，优选I/L，但也可以是非天然的。此外，在之后的“L”和“Y”之间的间隔优选为2个残基，但是可容忍单个氨基插入。再次地，容忍该改变，只要它们不破坏螺旋或疏水核。“Y”是必要的，需要是疏水氨基酸，优选F/Y，但也可以是非天然的。类似于上述的N端部分，基序ANRRSSCKRP(SEQ IDNO：38)对于肽的基本功能改进是非必要的，可以减少到至少3个带正电残基，尽管更少一些，该肽仍有活性。
更加优选地，根据本发明的化合物是包含选自以下的氨基酸序列的肽、及其药学上可接受的盐：
LTLRKEASSEIAQSILDAYSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：7)、
LTLRKKASSKIAQSILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：8)、
LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRP(SEQ ID NO：9)、
RKKASSKIAQSILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：10)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：11)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNAWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：12)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：13)、
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：14)、
RKKASSKIAAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：15)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：16)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：17)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：18)、
AKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：19)、
AKIEAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：20)、
LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：21)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNGWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：22)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNAWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRA(SEQ ID NO：23)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：24)、
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：25)、
RKKASSKIAAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：26)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：27)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：28)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：29)、
AKIAAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：30)、
AKIEAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：31)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：53)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：54)、
AKIEAAILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：55)、
AKIEAEILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：56)、
AKIEAAILDEFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：57)、
RKKASJKIAJAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：58)、
RKKASSKIAAAZLDAFSQNAWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRA(SEQ ID NO：59)、
AKIEAAILDAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：60)、
AKIEAEILEAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：61)、
AKIEAAZLDAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：62)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：63)、
RKKASSKIEAEZLDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：64)、
RKKASSKIEAEIZDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：65)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：67)、和
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：68)，
其中J、B和Z如上所定义，以及包含选自与SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中任一至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，和由根据SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中任一的氨基酸构成的肽，优选由SEQ ID NO：55、60、63、64或65中任一的氨基酸序列构成的肽。
在本发明的化合物中，根据氨基酸的单字母编码，X1不存在或表示氨基酸LTL，因为N端氨基酸LTL对于相互作用是非必需的。X2选自带正电的氨基酸，优选K、E、R、和H。X3选自小的非极性氨基酸，优选A和S，且可以使用本文定义的J形成订书针状物，X4选自疏水氨基酸，优选I和L、以及修饰的氨基酸Z，其中Z是环己基-丙氨酸。X5选自小的带正电或负电的氨基酸，优选A、G、S、E、和D。X6选自带负电的氨基酸，优选E和D。X7选自小的或极性的氨基酸，优选G、Q、A、S、和P，且可以使用本文定义的J形成订书针状物。X8选自芳香类氨基酸，优选W、Y、和F、以及B，其中B是2-Me-色氨酸。X9选自小的极性或非极性氨基酸，优选A和G。X10选自A和N以及电中性的极性氨基酸，优选Q。X11和X12选自带正电氨基酸，优选R和K。X13选自G和S，X14和/或X15选自A和C，X16选自A和P，X17选自R和S，X18选自A和E。优选地，化合物可以包含与此处指出的天然氨基酸具有相同或基本相同所需特性的非天然发生氨基酸，且在由本文式子表示的化合物的相关位置上。也可以引入修饰氨基酸，例如，接头氨基酸、订书针状物、半胱氨酸桥、糖基化位点、泛素化和/或聚乙二醇化位点，如果需要的话。
装订肽是一种短肽，通常为α-螺旋构型，受到合成支撑物(“订书针状物”)的约束。这个订书针状物通过两个氨基酸侧链之间的共价键形成，形成大环肽。因而，订书针状物通常是指两个之前独立基团的共价连接。在其他应用中，肽装订主要用于增强肽的药理性能。
本发明的肽可以是任何长度，只要化合物具有结合p53、和/或结合p53并抑制或基本抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的功能。优选的是具有100-19、更优选75-19、甚至更优选50-19个氨基酸长度的化合物。具体优选的是本发明的具有选自在SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中的一个中给定的长度的肽。
根据本发明的化合物优选为包含与SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中任一至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列的反-倒位肽。
本文使用的术语“肽”，优选地，是指合成性地合成的肽，优选拟肽物，更优选D-肽。术语“肽”包括肽类似物，其可以具有例如使得肽在体内更加稳定或者更加能够渗透入细胞的改造。这类改造包括，但不限于，N-端改造、C-端改造、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、以及骨架改造。用于制备拟肽化合物的方法为本领域熟知，并且记载在例如Quantitative Drug Design，C.A.Ramsden Gd.，Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon Press (1992)中。
进一步优选的改造涉及氨基酸本身，并包含非天然发生氨基酸(优选具有与天然氨基酸相同或基本相同的所需特征)的引入，优选在化合物的相同或基本相同位置。优选的实例为2-Me-色氨酸、或环己基-丙氨酸。其他改造可以包括修饰的氨基酸，例如，接头氨基酸、订书针状物、半胱氨酸桥、糖基化位点、泛素化和/或聚乙二醇化位点。装订可以通过引入两个用于交联肽内i和i+4或i和i+7残基的a-戊烯基-甘氨酸残基、或a，a’-戊烯基丙氨酸残基而完成。这些残基可以用于创建出全烃、包含烯烃、去甲基化的约束物或订书钉状物。优选的是Fmoc-L-2-(4′-戊烯基)丙氨酸、和关环复分解(RCM)(参见例如Kim YW，Kutchukian PS，Verdine GL.Introduction of all-hydrocarbon i，i+3staples intoal-pha-helices via ring-closing olefin metathesis.Org Lett.2010Jul 2；12(13)：3046-9.doi：10.1021/ol1010449)。可以用于交联或约束肽的其他策略包括经“点击”化学法引入的内酰胺桥、氢键替代、光控开关、硫醚、和三唑。
在一个优选实施方式中，根据本发明的化合物还包含赋予细胞渗透特性、细胞器靶向特性、核定位、线粒体定位、血脑屏障渗透、细胞膜定位、和/或肽酶切割的肽序列。细胞渗入序列是，例如HIV的TAT-序列(GRKKRRQRRRPP，SEQ ID NO：41)或ARKKRRQRRRPPP(SEQ IDNO：66)。其他合适的序列可从文献中得知，且可以取自例如Ramaker等人的文献(Ramakeret al.(2018)Cell penetrating peptides：a comparative transport analysis for474sequence motifs，Drug Delivery，25：1，928-937)。对于核定位，参见，例如Kim YH，HanME，Oh SO.The molecular mechanism for nuclear transport and itsapplication.Anat Cell Biol.2017；50(2)：77-85.doi：10.5115/acb.2017.50.2.77)。该肽序列可以优选地与所述肽的N-和/或C-端部分融合。
术语“D-异构体”，如本文所用的，是指至少部分氨基酸残基具有称为“D”(拉丁语dexter；右)的分子空间构型的氨基酸序列。本发明的化合物包含至少80％、更优选至少90％、更优选至少95％、最优选99％或100％(即，“全D”)的D-氨基酸。本发明的肽优选包含至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、或更多个D-氨基酸残基。同时，本发明的肽优选包含至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90、95、98、或99％、最优选100％的D-氨基酸残基。
本文所用的缩写“DRI”是指D-反-倒位异构体，其中将氨基酸序列反转并以D-而非L-异构体放置，具体参照人FOXO4蛋白的序列、或其肽片段。本领域技术人员将意识到，根据本发明的DRI肽可以包含L-氨基酸残基与D-氨基酸残基的组合，或者可以完全由D-氨基酸(全-D)残基构成，例如如上所公开的。
术语“％序列同一性”或“％同一性序列”在本文中定义为，在比对序列并任选地引入必要的空格以达到最大百分比序列同一性后，核酸序列中的核苷酸、或氨基酸序列中的氨基酸分别与目标核酸或氨基酸序列中的核苷酸、氨基酸相同的百分比。用于比对的方法和计算机程序为领域内所熟知。序列同一性在目标氨基酸序列的几乎全长上、优选全(完整)长度上计算。本领域技术人员理解，氨基酸序列中的连续氨基酸残基与另一氨基酸序列中的连续氨基酸残基进行比较。优选地，氨基酸残基的构型，例如D或L，与确定氨基酸序列同一性不相关。例如，在本发明的背景下，D-Ala(D-A)展现出与L-Ala(L-A)的序列同一性。
本领域技术人员还知道存在用于确定细胞和/或细胞培养物中细胞凋亡程度的体外标准检测，例如评测细胞质细胞色素C(细胞凋亡标记物)的水平和TUNEL(细胞凋亡标记物)的水平的检测。使用这些标准检测，本领域技术人员可以容易地评测并比较不同化合物对不同细胞类型或不同发育阶段细胞(例如衰老细胞vs.非衰老细胞)的凋亡诱导活性。其他标准的细胞凋亡检测是膜联蛋白V检测和切割半胱天冬酶-3的染色。为检测细胞活力，其基本是凋亡的对立面，可以使用MTT检测(用于评测细胞活力的比色检定)、ATP-检测试验、实时细胞密度(例如xCELLigence)检定或群落形成检定。关于要使用的检定的其他信息可以取自文献，例如Elmore S.Apoptosis：a review of pro-grammed cell death.ToxicolPathol.2007；35(4)：495-516。优选检测包括对升高的半胱天冬酶-3/7活性、线粒体细胞色素C的丧失、TUNEL阳性、胞外膜联蛋白V阳性、和/或细胞死亡标记物升高(例如细胞碘化丙啶包含)、和/或活力丧失(例如丧失钙黄绿素AM的并入、或MTS活力检测)的确定。
通常地和优选地，衰老细胞可以被识别为标记物LMNB1和/或HMGB1存在/染色减少、和p21Cip1和/或p16INK4a升高、和/或存在DNA-SCARS标记物yH2AX和/或53BP1和/或PML、和/或存在SASP标记物如IL1和/或IL6和/或MMP1的细胞。细胞不需要显示出TP53或其突变体的完全缺失。通常地且优选地，癌细胞可以被识别为p21Cip1升高、和/或存在DNA-SCARS标记物yH2AX和/或53BP1和/或PM、和/或存在SASP标记物如IL1和/或IL6和/或MMP1的细胞。细胞不需要显示出TP53或其突变体的完全缺失。通常地且优选地，瘢痕细胞可以被识别为具有升高水平的DNA-SCARS(较大团簇的53BP1和/或yH2AX、和/或PML/FOXO4核质体)的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种编码本发明肽的核酸(在生物学上具有可能性的程度)，任选地包含在载体(例如表达载体)中。核酸可以是DNA、RNA、cDNA、PNA或其组合。在其他方面中，本发明提供包含本发明核酸或载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何种类的合适的原核或真核细胞，例如选自癌细胞、衰老细胞、瘢痕细胞、人非胚胎干细胞、酵母细胞、细菌细胞、以及表达FOXO4和/或其p53结合片段的重组宿主细胞、和任选地表达p53和/或其FOXO4结合片段的重组宿主细胞。
如上所述，本发明涉及改进的抑制性化合物，其被设计出来，因为FOXO1/3/6和FOXO4之间的进化差异表明，一些氨基酸仍可以改造或修饰，以创建出改进的抑制性化合物。所有这些改造呈现为新的策略，其中这些中的任一或其组合最终引起用于本发明背景的改进分子的“合理设计”。本发明还包括进一步改善仅部分地进行过“定向进化”或“定向突变”的化合物的策略。
因而，本发明另一个重要的方面是用于识别出与p53结合、或优选地与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53之间相互作用的改进化合物的方法，包括以下步骤：a)提供根据本发明的至少一种化合物；b)适当地改造a)的化合物；c)确定b)的至少一种化合物与p53或其片段的结合、该至少一种化合物的稳定性、以及在该至少一种化合物的存在下FOXO4或其片段与p53或其片段的结合(相比于在不存在该化合物时FOXO4或其片段与p53或其片段的结合)中的至少一种，以及d)基于步骤c)的确定，识别出比步骤a)提供的化合物改进的与p53结合或优选地与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物。
优选的是根据本发明的方法，其中该至少一种化合物的结合，特异于、和/或被确定/检测为特异于p53或其片段。
另外优选的是根据本发明的方法，其还包括测试所识别化合物诱导细胞凋亡和/或杀伤衰老细胞、瘢痕细胞、或癌或肿瘤肿瘤的活性，优选包括半胱天冬酶活性的确定。
在“合理设计”用于本发明背景的改进分子的过程中，以及为进一步改善仅部分地进行过“定向进化”或“定向突变”的化合物，化合物可以进行连续多轮的上述方法。
在提供化合物(例如肽)后，例如在其恰当的化学合成后，化合物可以进行改造。总体而言，如何改造本发明化合物的很多方法为本领域技术人员所知，且记载在文献中。化合物的改造将通常落入几个类别中，例如a)氨基酸突变/改变成不同氨基酸，b)氨基酸的化学修饰，例如通过添加额外化学基团，c)氨基酸结构(例如L-变为D-型)或连接键(例如，引入反-倒位键)的改造，d)化合物长度的改变，以及e)向分子附着额外基团(包括标记基团、标签、接头或载体，例如螯合剂)。
FOXO1/3/6和FOXO4之间的进化差异表明，一些氨基酸仍可以改造，以创建出显示所需的结合以及-根本地-抑制活性的改进化合物。对于FOXO4-FH片段和TP53-TAD2结构域的分析显示出，TP53的负电荷、以及疏水Tyr，介导与FOXO4的结合。因而，本发明肽的氨基酸可以突变成正电氨基酸，对相互作用强度有益。实例为赖氨酸(K)、精氨酸(R)、和组氨酸(H)。NMR实验还示出，TP53中带负电的氨基酸负责在SQ基序(位点)周边与FOXO4相互作用。该位点可以变为磷酸化，以防止该情况发生，该位点可以突变为小的氨基酸，比如丙氨酸(A)、甘氨酸(G)或丝氨酸(S)。用于引入这些突变的方法为本领域技术人员已知，且包括在化学合成肽的过程中引入改造、或编码肽的核苷酸序列例如通过寡核苷酸类突变、包含PCR的突变等相应改变的遗传工程类方法。同时随机突变也是可行的。关于有希望的氨基酸改动的进一步指导，可以在以上对于X1-X12的定义的上下文中找到，这也方便地适用于剩余的X13-X18的定义。
此外，氨基酸也可以通过化学修饰而改变，例如通过在合成过程中或通过翻译后或合成后修饰而添加额外化学基团。改变氨基酸的方法为本领域熟知，且总结于例如Christopher D.Spicer&Benjamin G.Davis.Selective chemical protein modificationNature Communications volume 5，Article no.：4740(2014)；或Sakamoto S，HamachiI.Recent Progress in Chemical Modification ofProteins.Anal Sci.2019Jan 10；35(1)：5-27。
此外，可以实施氨基酸结构(例如L-到D-型)或氨基酸之间连接键(例如，在合成过程中引入反-倒位键)的改变。NMR还示出，3个N端氨基酸LTL对于相互作用是不必要的。因而，化合物的长度可以例如通过移除这3个氨基酸来改变。
最后，对于分子而言的额外化学和/或功能基团，例如，标记基团、标签、接头氨基酸、订书针状物、半胱氨酸桥、糖基化位点、泛素化和/或聚乙二醇化位点、接头或载体，例如螯合剂。同时，包括引入或添加使得可以制备得自FOXO4的DRI肽二聚体或多聚体的氨基酸(订书针状物)。此外，可以包括稳定化修饰(例如，所谓的封端)，以加强得自FOXO4的DRI肽的稳定性和/或消除衰老细胞的潜能。该FOXO4肽的稳定化还可以通过对肽经常断裂的位点(例如NG-位点)进行突变而实现。装订可以通过引入2个用于交联肽内的i和i+4或i和i+7残基的a-戊烯基-甘氨酸残基、或a，a’-戊烯基-甘氨酸残基而实现。这些残基用于创建出全烃、含烯烃、去甲基的约束物或订书针状物。其他可以用于交联或约束肽的策略包括经“点击”化学法引入的内酰胺桥、氢键替代、光控开关、硫醚、和三唑。
在下一步骤中，对改造的化合物测试所述至少一种化合物与p53或其片段的结合中的至少一个。如本文所讨论的，化合物结合p53或其结合片段(像TP53)的特性对于化合物的所有用途，治疗或诊断，都是必要的。在本发明的背景下，“改进的”结合包括两种情形，其中改造的化合物的结合与未改造(即，起始)化合物为相同程度，尽管该化合物已经被改造(例如通过二聚体化、或通过添加标记物或其他基团)。优选的是所修饰的呈现出与靶标，即p53或其结合片段，有更强结合的化合物。还优选的是，例如由于该修饰化合物改善的体外或体内稳定性而显示出与靶标，即p53或其结合片段，更长结合的化合物。另外优选的是显示出该修饰化合物减少的磷酸化的化合物。同时包括的是至少2种上述特性的组合。
检测化合物与靶标(即p53和/或其结合片段)的结合的试验为本领域技术人员所熟知，且优选包括质谱法、NMR检测、拉下检测等。
此外包括的是竞争性检测，即检测该改造化合物在至少一种化合物的存在下的特性，与不存在该化合物时FOXO4或其片段与p53或其片段的结合相比。
另外优选的是根据本发明的方法，其中该至少一种化合物的结合，特异于、和/或经确认/检测特异于p53或其片段。如上所述，化合物结合p53或其结合片段(例如TP53)的特性对于该化合物的所有用途，治疗的或诊断的，都是必要的。理想地，结合也特异于或至少基本上或本质上特异于意向靶标，即p53或其结合片段。这将减少或避免化合物在医疗用途中的不想要的副作用，以及减少或避免在诊断用途中的任何背景性或假阳性结果。
在方法的最后一步中，基于步骤c)的确定，识别出与步骤a)提供的化合物相比是改善的-在本发明的优选方面-与p53结合、或优选地与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物。尽管该功能被认为对本发明化合物经由消除衰老细胞的治疗功能是必要的，根据本发明的改进的诊断类分子可能不是强制地需要这样的特性/功能。
这些改进化合物的识别可以包括检测这些化合物，例如FOXO4肽，结合TP53并消除衰老细胞的功效，任选地，对于决定该特性的结构要求的识别；和/或检测这些化合物例如FOXO4肽消除衰老细胞的选择性，再次任选地，对于决定该特性的结构要求的识别。FOXO4与FOXO1/3和6、以及低等物种中FOXO直系同源物在进化上的不同在于一些独特的残基。当前发明人从未发觉FOXO1或FOXO3是焦点，而且也没有FOXO1和3对衰老细胞成活重要的证据。因而，分析了这些氨基酸是否至少部分地解释了FOXO4-肽在消除衰老细胞中的效力。这在基于与FOXO4相似结构域的D-反-倒位肽中得到证实，而基于FOXO1或FOXO3的序列在消除衰老细胞中没有显示出选择性。
还优选的是根据本发明的方法，其中该方法还包括测试所识别化合物引起细胞凋亡和/或杀伤衰老细胞、瘢痕细胞、癌或肿瘤细胞的活性，优选地包括半胱天冬酶活性的确定。已经在以上提及，本领域技术人员还知道存在着用于确定细胞培养物中细胞凋亡程度的体外标准检测，例如评测细胞质细胞色素C(细胞凋亡标记物)的水平和TUNEL(细胞凋亡标记物)的水平的检测。使用这些标准检测，本领域技术人员可以容易地评测并比较不同化合物对不同细胞类型或不同发育阶段细胞(例如衰老细胞vs.非衰老细胞)的凋亡诱导活性。其他标准的细胞凋亡检测是膜联蛋白V检测和切割半胱天冬酶-3的染色。优选检测包括对升高的半胱天冬酶-3/7活性、线粒体细胞色素C的丧失、TUNEL阳性、胞外膜联蛋白V阳性、和/或细胞死亡标记物升高(例如细胞碘化丙啶包含)、和/或活力丧失(例如丧失钙黄绿素AM的并入、或MTS活力检测)的确定。为检测细胞活力，其基本是凋亡的对立面，可以使用MTT检测(用于评测细胞活力的比色检定)、ATP-检测试验、实时细胞密度(例如xCELLigence)检定或群落形成检定。关于要使用的检定的其他信息可以取自文献，例如ElmoreS.Apoptosis：a review of programmed cell death.Toxicol Pathol.2007；35(4)：495-516。优选地，根据本发明的肽或改进肽，如果在衰老细胞培养物中杀伤、清除、或移除至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、或80％的细胞(或减少其细胞活力)，则被认为在衰老细胞中呈现出凋亡诱导活性。优选地，根据本发明的肽选择性地在衰老细胞、即不是非衰老细胞中呈现出细胞凋亡引导活性。根据本发明的肽偏爱于衰老细胞中的凋亡，更甚于非衰老细胞中的凋亡至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3、4、5或更高的系数。
根据本发明的肽优选是分离的。根据本发明的肽优选使用适当的肽合成来制备。
在根据本发明的方法的一个方面，FOXO4或其p53结合片段、p53或其FOXO4结合片段、和/或化合物(肽)是带标签的，例如具有荧光的、可检测的、稳定同位素、和/或质量标签。这些标签在文献中已知，包括FITC、Alexa、Dylight、FAM和其他。可检测的标签可以被抗体、链霉亲和素/亲和素识别，或者基于引起可检测产物的酶促反应而识别。质量标记可以通过附着同位素、或其他合适的质量标记物来实现。原则上，也可以使用任何可以用于实验和治疗/成像目的的标签。
此外优选的是根据本发明的方法，其中FOXO4或其片段、和/或p53或其片段在细胞中重组表达。用于重组表达肽以及分离和纯化该重组制备产物的方法为领域内熟知，且记载于各文献。通常而言，任何合适的细胞可以用于重组制备FOXO4或其片段、和/或p53或其片段，优选的是选自癌细胞、衰老细胞、人非胚胎干细胞、酵母细胞、细菌细胞、表达FOXO4和/或其p53结合片段的重组宿主细胞(其中该重组宿主细胞任选地表达p53或其FOXO4结合片段，即使用两个或多个构建体)的细胞。
本发明的另一个方面涉及一种用于筛选本发明的与p53结合、且优选与p53结合且抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物的筛选工具，包含分离的表达FOXO4的细胞、和/或表达其p53结合片段的细胞(其中该细胞任选地表达p53)、和/或表达FOXO4结合片段的细胞。
本发明的筛选工具是实施本发明方法的重要部分，且也可以用作验证化合物体内药物活性的第一个步骤。优选地，FOXO4或其片段、和/或p53或其片段在细胞中重组表达。用于重组表达肽以及分离和纯化该重组制备产物的方法为领域内熟知，且记载于各文献。通常而言，任何合适的细胞可以用于重组制备FOXO4或其片段、和/或p53或其片段，优选的是选自癌细胞、瘢痕细胞、衰老细胞、人非胚胎干细胞、酵母细胞、细菌细胞、表达FOXO4和/或其p53结合片段的重组宿主细胞(其中该重组宿主细胞任选地表达p53或其FOXO4结合片段，即使用两个或多个构建体)中的细胞。在根据本发明的工具的一个方面，FOXO4或其p53结合片段、p53或其FOXO4结合片段、和/或化合物(肽)带有标签，例如具有荧光的、可检测的、和/或质量标签。如上所述，这些标签在文献中已知，包括FITC、Alexa、Dylight、FAM和其他。可检测的标签可以被抗体、链霉亲和素/亲和素识别，或者基于引起可检测产物的酶促反应而识别。质量标记可以通过附着同位素、或其他合适的质量标记物来实现。
优选的是根据本发明的筛选工具，包含FOXO4的片段，如根据序列RKK PRKGGSRRNAWGNQSYAELISQAIESAPEKRLTLAQIYEWMVRTVPYFKDKGDSNSS AGWKNSIRHNLSLHSKFIKVHNEATGKSSWWMLN(SEQ ID NO：32)或PRKGGSRRNAWGNQSYAELISQAIESAPEKRLTL(SEQ IFD NO：33)的肽(优选全D-肽)、以及p53的片段，如根据序列AMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGP(SEQ ID NO：34)的肽。
本发明的另一个重要方面涉及本发明化合物在诊断中的用途，例如作为诊断化合物。明显地，识别/使用本发明的化合物，以结合p53或p53片段，优选地还抑制细胞中FOXO4与p53的相互作用。这些特性还用于诊断背景。更优选地，该至少一种化合物的结合，特异于、和/或被确定/检测为特异于p53或p53片段或其片段。这将减少或避免在诊断使用中的任何背景或假阳性结果。根据本发明的化合物(肽)优选带有标签，例如具有荧光的、可检测、稳定同位素、和/或质量标签。这些标签在文献中已知，包括FITC、Alexa、Dylight、FAM和其他。可检测的标签可以被抗体、链霉亲和素/亲和素识别，或者基于引起可检测产物的酶促反应而识别。质量标记可以通过附着同位素、或其他合适的质量标记物来实现。然而，诊断方法也可以在没有标签的情况下实施，且结合可以使用例如NMR直接地或间接地检测。
一个具体的诊断用途或方法可以是用于检测细胞中p53或其片段的表达的方法，包括使用本发明的化合物来检测p53或其片段，其中相比于不表达p53或其片段的对照细胞的结合增加，表明该细胞中p53或其片段的表达。由于本发明化合物的高特异性，化合物提供诊断用的改进分子。诊断还可以包括检测p53相关疾病或症状，例如由衰老细胞造成的癌症或其他病症，例如年龄相关疾病、肾病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)/非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肝纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)、骨关节炎、COPD、骨骼肌疾病、和认知功能降低。
在本发明的背景下，术语“约”表示包括给定量的+/-20％，优选+/-10％，除非另外指出。
优选地，根据本发明的方法可适用于自动化，优选以自动和/或高通量的形式实施。通常而言，这涉及芯片和各自机械装置如机械臂的使用。在识别和/或筛选改进化合物的情况下，特别优选自动化。同时，也可以在自动化中包括本发明筛选工具的使用。
本发明的另一个重要方面涉及一种用于制备在受试者中治疗或预防衰老细胞的药物组合物的方法，包括将根据本发明的化合物配制到合适的药物组合物中、或者实施本发明的用于识别优选地抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的改进化合物的方法，以及将所识别的化合物配制到合适的药物组合物中的步骤。本发明还涉及用于在受试者中治疗或预防衰老细胞的药物组合物，其由本发明方法获得。
本文所用的术语“药物组合物”是指在适于向哺乳动物(优选人)给药的条件下制备的组合物，例如其在GMP条件下制备。根据本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，例如，但不限于，稳定剂、膨胀剂、缓冲剂、载体、稀释剂、溶剂、增溶剂、和粘合剂。本领域技术人员了解，合适赋形剂的选择取决于给药途径和剂型、以及活性成分和其他因素。根据本发明的药物组合物优选适用于肠道外给药。
优选的是根据本发明的药物组合物，其包含化合物的混合物、和/或至少一种化合物与其他药学上的活性成分的混合物。本文所用的术语“药物上的活性成分”是指抑制或防止细胞活力和/或功能、和/或造成细胞破坏(细胞死亡)、和/或发挥抗肿瘤/抗增殖效果，例如直接或间接防止肿瘤细胞的发育、成熟或扩散，的化合物。术语还包括仅造成生长抑制效果而不仅仅是细胞毒性作用的作用剂。该术语还包括烷化剂例如铂类药物(例如，顺铂、卡铂、和奥沙利铂)，抗代谢剂例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨(Xeloda)、克拉屈滨、氯法拉宾、阿糖胞苷(Ara-C)、脱氧氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨(Gemzar)、羟基脲、和甲氨蝶呤，抗肿瘤抗生素，优选阿霉素，拓扑异构酶抑制剂，有丝分裂抑制剂，皮质类固醇，抗血管生成剂，酪氨酸激酶抑制剂、蛋白激酶A抑制剂，细胞因子家族成员，放射性同位素。作为本发明背景下的化疗剂，还包括紫杉醇，例如Paclitaxel或Doxetaxel。
在另一个方面，本发明提供根据本发明的至少一种肽、药物组合物、或核酸在医疗中的用途，或用作医药，或用在治疗症状或疾病或病症中。
本文所用的术语“由衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞造成的疾病或病症”是指哺乳动物(优选人)受试者中的任何疾病或病症，其中在哺乳动物(优选人)受试者中存在衰老细胞或存在细胞衰老与该受试者中的该疾病或病症相关。
认为正常的和病理的退行性衰老表型(功能丧失)和癌症(功能获得)与细胞衰老有因果关系。衰老的成纤维细胞与乳腺产奶减少相关，衰老的肺动脉平滑肌细胞与肺高压相关，衰老的皮肤细胞与真皮变薄以及减少的胶原蛋白含量相关，衰老的星状胶质细胞与阿尔海默茨症以及帕金森症相关，且衰老的软骨细胞与骨关节炎有关。
已证实与细胞衰老相关的症状和疾病还包括：动脉粥样硬化、肺气肿、糖尿病溃疡、肾病(参见，例如，Valentijn FA，et al.Cellular senescence in the aging anddiseased kidney.J Cell Commun Signal.2018Mar；12(1)：69-82)、脊柱后凸、骨质疏松、黄斑病变、COPD和胰岛素耐受、糖尿病、肥胖、核纤层蛋白病(例如早老症、疝气、肌少症、和恶病质)、关节炎、脊椎侧弯、和癌症。因此，衰老细胞在基因层面的清除显著地改善健康状况并降低衰老参数，如在加速衰老小鼠模型中显示出的(Baker et al.，2011.Nature479(7372)：232-6)。该概念-验证的证据在遗传学意义上获得，具有较差的治疗实用性。本发明提供新的改进的化合物、以及用于识别它们的方法，其在治疗上靶向衰老细胞，且可以用在与细胞衰老相关疾病的治疗中。
另一个方面涉及至少一种化合物或药物组合物在本发明预防或治疗中的用途，其中要预防和/或治疗的症状选自由衰老细胞造成的症状、年龄相关疾病、肾病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)/非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肝纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)、关节炎(如骨关节炎)、COPD、骨骼肌疾病、认知功能受损、动脉粥样硬化、肺气肿、糖尿病溃疡、脊柱后凸、骨质疏松、黄斑病变、COPD和胰岛素耐受、糖尿病、肥胖、核纤层蛋白病(例如早老症、疝气、肌少症、和恶病质)、脊椎侧弯、和癌症。
优选的是至少一种化合物或药物组合物在本发明的用途，其中疗法是与抗癌化疗剂或针对各疾病或病症的其他标准护理药物的联合疗法，或其中该疗法应用于经抗癌化疗剂或用于各疾病或病症的标准护理药物预处理过且在该处理中存活的衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞。
结果，另一方面涉及一种用于在有需要的受试者中治疗或预防由衰老细胞、瘢痕细胞造成的疾病或病症、年龄相关疾病、肾病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)/非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肝纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)、关节炎(如骨关节炎)、COPD、骨骼肌疾病、认知功能减退、动脉粥样硬化、肺气肿、糖尿病溃疡、脊柱后凸、骨质疏松、黄斑病变、COPD和胰岛素耐受、糖尿病、肥胖、核纤层蛋白病(例如早老症、疝气、肌少症、和恶病质)、脊椎侧弯、和癌症的方法，包括向该受试者施用有效量的本发明至少一种化合物、或本发明的药物组合物。
优选的是根据本发明的方法，其中该疗法是与抗癌化疗剂或针对各疾病或病症的其他标准护理药物的联合疗法，或其中该疗法应用于经抗癌化疗剂或用于各疾病或病症的标准护理药物预处理过且在该处理中存活的衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞。
“治疗”是指疾病症状的减少和/或缓和。有效的治疗实现例如衰老细胞的移除、肿瘤质量和癌细胞数量的缩减。治疗也可以避免(预防)和减少衰老细胞的数量、减少癌扩散、例如影响其转移和/或形成。治疗可以是初次治疗(在任何其他疾病治疗开始前)、或在第一轮治疗后的治疗(例如在手术后、或在复发后)。治疗也可以是联合治疗，涉及例如化疗、手术、和/或放疗。可以治疗罹患或疑似罹患可从移除衰老细胞中受益的疾病或病症的受试者，特别是人。
在本发明的背景下，令人惊讶地发现了，根据本发明的化合物可以具体有益地用于疗法耐受癌症，且最为有效，如在当前实施例和图表中所示例的。除有效外，还示出，当前发明的化合物不仅是增殖抑制的，而是确实对癌细胞有细胞毒性。肽在用破坏剂例如化-放疗预处理且在处理中存活下来的细胞中特别有效。因而，使用肽的治疗可以在细胞破坏第一疗法，例如化疗/放疗、饮食胁迫、外源性胁迫、氧化胁迫等之后进行，或者如上所述，作为联合疗法，即同时应用、或同时作用，而不是按序。这在使用例如小分子抑制剂例如BRAF抑制剂时较为有效。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含第一容器和第二容器，第一容器包含本发明的化合物，第二容器包含化疗剂。试剂盒可以适当地包含有关在哺乳动物(优选人)受试者中施用的说明书。优选人受试者罹患或疑似罹患由衰老细胞、瘢痕细胞造成的疾病或病症、年龄相关疾病、肾病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)/非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肝纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)、关节炎(如骨关节炎)、COPD、骨骼肌疾病、认知功能减退、动脉粥样硬化、肺气肿、糖尿病溃疡、脊柱后凸、骨质疏松、黄斑病变、COPD和胰岛素耐受、糖尿病、肥胖、核纤层蛋白病(例如早老症、疝气、肌少症、和恶病质)、脊椎侧弯、和癌症。尽管本发明的化合物和化疗剂可以配制在单一剂型例如药物组合物中，优选配制在多个剂型中，其中本发明的化合物在一个容器中，化疗剂在另一容器中。在用于本发明的试剂盒中，优选本发明的化合物和化疗剂一起施用。优选地，该肽在施用该化疗剂后施用。优选地，本发明的化合物作为佐剂施用，从而其能够清理、杀伤或减少已经因为化疗剂处理而变得衰老的细胞的活力。未曾预料到的是，本发明的化合物可以减少当前化疗剂的脱靶效应。优选根据本发明的试剂盒包含对于给药方案的说明书，获得本发明化合物和化疗剂的优化组合效果。
在本发明的另一方面，本发明还涉及诊断试剂盒，其包含用于实施本发明方法的材料，如本文所述的，在一个或分开的容器中，任选地与助剂和/或用于实施本发明方法的说明书一起。试剂盒可以包含本文的化合物和所识别的化合物。此外，可以包含染料、抗体、和其他用于上述检测试验的组分。试剂盒可以包含如上所述标记形式的本文化合物和/或所识别的化合物。
本发明还将在以下实施例中参照附图进行进一步描述，然而，本发明不限于此。出于本发明的目的，所有本文引用的文献均通过引用的方式全部并入。
附图说明
图1示出人FOXO4(智人)的序列，下划线为TP53相互作用结构域的序列。
图2示出示例性肽CL04009(SEQ ID NO：11)在与重组TP53-TAD2、以及分离自细胞的全长TP53的结合中较为强效，且优于参照化合物(FOXO4-DRI)。A)示出单独的15N标记TP53-TAD2(底部)、在CL04009(SEQ ID NO：11)存在下(顶部)、或参照化合物存在下(中间)的相对NMR化学位移扰动。已将由参照化合物引起的NMR化学位移扰动设为100％。B)示出在不存在任意肽、存在生物素化CL04009(SEQ ID NO：11)或生物素化参照肽(FOXO4-DRI)时，使用链霉亲和素珠对HEK293T细胞裂解液中内源TP53的拉下。
图3示出肽CL04009(SEQ ID NO：11)对于衰老的、而非健康对照的IMR90肺成纤维细胞较为强效且有选择性。该图示出，经改造而改善与TP53结合的CL04009(SEQ ID NO：11)在衰老的、而非健康对照的IMR肺成纤维细胞细胞中诱发经由半胱天冬酶-3/7激活的细胞凋亡方面具有较好的选择性。此外，在较低浓度也有效，表明其改善的功效。上图示出半胱天冬酶活性，下图为细胞活力。FOXO4-DRI用作对照。
图4示出CL04022(SEQ ID NO：12)比参照化合物FOXO4-DRI在结合TP53-TAD方面更为强效。示出在递增浓度的肽的存在下，FITC标记的TP53-TAD2(250nM)的荧光极性测量。
图5示出，基于肽中的丙氨酸替换，肽CL04022(SEQ ID NO：12)比CL04009(SEQ IDNO：11)在数天的较长时间段中更加稳定。两种肽均溶于H2O，并于室温保存。在指定时间点确定肽浓度。
图6示出肽CL04022(SEQ ID NO：12)在施用后24h开始诱发半胱天冬酶-3/7活化，典型细胞凋亡的过程。完全半胱天冬酶-3/7活化在60h后完成，上排为对照。
图7示出肽CL04009(SEQ ID NO：11)为改善TP53选择性结合做出的改变，也得到非常有效的且有选择性的在衰老(上方蓝线)、而非健康对照(下方黑线)IMR90细胞中引发凋亡的能力。下方的图示出肽CL04088(SEQ ID NO：13)比肽CL04022(SEQ ID NO：12)更优，且仍优于对照。
图8示出肽CL04009(SEQ ID NO：11)的改造(此处表示为CL05055)可以进一步改善消除不同来源衰老细胞的效力。RPE＝视网膜色素上皮细胞，CL03001与用作对照的FOXO4-DRI一样。
图9示出CL04022(SEQ ID NO：12)在诱发胶质母细胞瘤细胞的程序性细胞死亡方面优于FOXO4-DRI。A)CL04022(SEQ ID NO：12)在引发GBM8胶质母细胞瘤中半胱天冬酶-3/7活化(细胞凋亡)和b)LDH丧失(细胞死亡)方面比FOXO4-DRI更强效。C)示出CL04022(SEQ IDNO：12)在GBM8胶质母细胞瘤细胞中、而不在健康Wi38细胞中引发凋亡。相对于健康WI38细胞，CL04022(SEQ ID NO：12)对于引发GBM8胶质母细胞瘤凋亡也具有选择性。
图10示出CL04022(SEQ ID NO：12)对结肠癌有效。A)肽CL04022(SEQ ID NO：12)对两种微卫星不稳定(MSI)结肠癌3D类器官培养物有效。该肽对一种微卫星稳定(MSS)系无效。B)示出CL04022(SEQ ID NO：12)相比于健康对照样本，对得自患者的结直肠癌有选择性。CL04022(SEQ ID NO：12)对正常野生型结肠类器官显示出较低的效力(相比于上述A))。当类器官没有APC时，该肽有效。
图11示出CL04183(SEQ ID NO：55)和CL05114(SEQ ID NO：60)相对于FOXO4-DRI(CL03001)在溶液中有更好的稳定性。在表格中，CL02001代表肽CL03001的“L”型，CL02015表示肽CL04183(SEQ ID NO：55)的“L”型。
图12示出A)肽CL04022(SEQ ID NO：12)对在化疗(5’氟尿嘧啶或奥沙利铂)中存活的结肠癌3D类器官更加有效，B)示出CL04022(SEQ ID NO：12)引发细胞死亡，而不仅造成细胞周期停滞，这与标准护理5FU相反。
图13示出在暴露于CL04009(SEQ ID NO：11)后14天，3D结肠类器官不再有肿瘤赘生物。这表明CL04009(SEQ ID NO：11)对结肠类器官有细胞毒性，而不仅是细胞增殖抑制，如此处在结肠癌例子中所示的。
图14示出在一个实验中，相对于对照人RPE1细胞，肽CL04183(B)(SEQ ID NO：55)相对于原始的FOXO4-DRI(CL03001)(A)对衰老人RPE1细胞显示出更好的选择性和效力。
图15示出结肠类器官中结直肠癌相关突变，基于p53，对FOXO4类肽敏感。WT结肠和不同肿瘤进展(TPO)类器官用递增浓度的CL04124(SEQ ID NO：68)或CL04183(SEQ ID NO：55)处理。在5天后测量细胞活力。
图16示出CL04183(SEQ ID NO：55)在患者来源的结直肠癌类器官中有力地引起细胞凋亡。A)患者来源的结直肠癌类器官系CRC29用5’-氟尿嘧啶(5-FU)或CL04183(SEQ IDNO：55)处理。3天后，细胞用钙黄绿素-AM和碘化丙啶处理，分别对活的和死的细胞进行染色。类器官用EVOS成像系统成像。B)在用CL04183(SEQ ID NO：55)处理前，CRC29类器官与用于凋亡测试的钙黄绿素-AM以及半胱天冬酶-3/7红色染料共孵育。立即使用LSM880显微镜进行实时成像，每小时拍照。C)CRC29用递增浓度的CL04183(SEQ ID NO：55)处理。5天后测定细胞活力。
图17示出肽CL04009(SEQ ID NO：11)比参照化合物FOXO4-DRI/CL03001更能在衰老人乳腺上皮细胞中引发细胞凋亡。MCF10细胞用递增浓度的CL04009(SEQ ID NO：11)以及FOXO4-DR处理，在2天后进行半胱天冬酶检测，以确定凋亡诱发情况。
图18示出CL04183(SEQ ID NO：55)在天然衰老小鼠中减少灰色毛发。24月龄C57BL/6J小鼠在经i.v.注射接受3剂PBS或CL04183(SEQ ID NO：55)前拍照。第一次处理4周后，对小鼠再次拍照。
图19示出肽CL04183(SEQ ID NO：55)减少体内表达荧光素酶的结直肠癌细胞。A)将包含萤火虫荧光素酶的结直肠癌类器官系CRC29移植到免疫缺陷小鼠的盲肠中。移植两周后，确定生物发光水平，小鼠用3剂CL04183(SEQ ID NO：55)或PBS处理。所有动物在最后一剂2天后拍照，与基底值比较发光值。B)在处死前，对小鼠注射荧光素。对各器官成像，使用M3可视软件定量荧光素酶信号。
图20示出肽CL04183(SEQ ID NO：55)减少结直肠癌对肝和肺的转移。将结直肠癌类器官系CRC29移植到免疫缺陷小鼠的盲肠中。移植两周后，动物用3剂CL04183(SEQ IDNO：55)或PBS处理。A)对肺和肝进行人核仁染色，检测小鼠器官中的人癌细胞。B)肺中的转移癌细胞的量用CellProfiler软件进行定量。每只小鼠分析6个平铺扫描。所有计数与PBS处理组的平均值进行比较。每个染色切片的肝转移数量进行可视化计数。
图21示出CL04183(SEQ ID NO：55)在体内引起转移癌细胞的凋亡。对用PBS或CL04183(SEQ ID NO：55)处理的CRC29肺转移进行TUNEL检测，确定凋亡诱发。每组包括3只小鼠，使用FIJI对TUNEL阳性癌细胞的百分比进行定量。
图22示出三阴性乳癌系呈现出开放构型的p53，其与CL04183(SEQ ID NO：55)灵敏度相关。这表明，人乳癌细胞系用递增浓度的CL04183(SEQ ID NO：55)处理，在2天后进行MTS检测来确定细胞活力。用GraphPad Prism计算EC50值。
图23示出CL04183(SEQ ID NO：55)对于NRAS突变的和BRAF突变的黑色素瘤的效力。同时参见图14。
图24示出NMR肽结合数据。从用单独p53-TAD2(下圆形，红)、在添加参照肽FOXO4-DRI/CL03001(黑)或添加测试肽(上圆形，蓝)时获得的1H，15N HSQC NMR光谱中提取的p53-TAD2 T55的1H，15N交叉峰的放大图。A)肽SEQ ID NO：22、B)肽SEQ ID NO：23、C)肽SEQ IDNO：24、D)肽SEQ ID NO：25、E)肽SEQ ID NO：26、和F)肽SEQ ID NO：27。
图25示出NMR肽结合数据。从用单独p53-TAD2(下圆形，红)、在添加参照肽FOXO4-DRI/CL03001(黑)或添加测试肽(上圆形，蓝)时获得的1H，15N HSQC NMR光谱中提取的p53-TAD2 T55的1H，15N交叉峰的放大图。A)肽CL04022，SEQ ID NO：12，B)肽CL04121，SEQ ID NO：67，C)肽CL04183，SEQ ID NO：55，D)肽CL04180，SEQ ID NO：54，E)肽CL04230，SEQ ID NO：56，和F)肽CL04231，SEQ ID NO：57。
图26示出NMR肽结合数据。从用单独p53-TAD2(下圆形，红)、在添加参照肽FOXO4-DRI/CL03001(黑)或添加测试肽(上圆形，蓝)时获得的1H，15N HSQC NMR光谱中提取的p53-TAD2 T55的1H，15N交叉峰的放大图。A)肽CL04235，SEQ ID NO：61，B)肽CL05114，SEQ ID NO：60。
SEQ ID NOs：1-4、和7-31、和43-66示出本发明的肽、或其部分。
SEQ ID NOs：5、6和42示出对照肽，例如FOXO4-DRI/CL03001。
SEQ ID NOs：39和40分别示出人FOXO4和p53的氨基酸序列。
实施例
在本发明的背景下，术语FOXO4-DRI或CL03001，当与肽和/或对照肽相关时，是指具有D-氨基酸序列LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：6)或L-氨基酸序列PRKGGSRRNAWGNQSYAELISQAIESAPEKRLTL(SEQ ID NO：42)的肽。
细胞培养
人IMR90、WI38和RPE细胞在含有10％FCS和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Lonza)中于37℃、3.0％O2和5.0％CO2下生长。为诱发衰老，细胞用10Gy电离辐射(Gammacell 1000)进行照射，并静置最少10天，以变得衰老。
GBM8细胞在含有高葡萄糖、L-谷氨酰胺、无酚红，补充有1％(10mM)HEPES、1％青霉素/链霉素、2％B-27(50X)、5μg/ml肝素钠(源自猪小肠粘膜，I-A级)、20ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(rhFGF)、和20ng/ml重组人表皮生长因子(rhEGF)的Dulbecco改良Eagle培养基/营养素混合物F-12(DMEM F-12)中培养。这些细胞在包被有基质胶(20x稀释在DMEM F-12)的塑料器皿中，于人工孵育器中，37℃、5％CO2和3％O2孵育。
为实施活力和细胞凋亡检测，细胞拆分到96孔板中，并在2天后用肽处理。非衰老细胞和癌细胞以1500细胞/孔铺板，而衰老细胞以8000细胞/孔铺板。
类器官培养
类器官在人工孵育箱中37℃、5％CO2生长。所有的类器官在补充有1％Glutamax、1％青霉素/链霉素、1％(10mM)HEPES、10％Noggin条件性培养基、2％B-27(50X；Thermo/Life Technologies)、N-乙酰基半胱氨酸(Sigma-Aldrich，1.25mM)、A83-01(Tocris，500nM)、和SB203580(Invitrogen/Life Technologies，3μM)的改进DMEM/F12(Lonza)的基质胶(Corning)小滴中培养。为实施活力和细胞凋亡检测，使类器官在冰冷培养基中再混悬，之后于4℃在15ml管中离心。得到的团块于37℃经胰蛋白酶处理5分钟，得到单细胞，之后用改良的DMEM/F12培养基清洗两遍。这些细胞之后重悬于基质胶中，并以5μl小滴在96-孔板中铺板。15分钟后，将100μl新鲜培养基添加到孔中。铺板后2天，将肽和化疗处理加至类器官。
半胱天冬酶检测
对于半胱天冬酶检测，在处理2天后向培养基添加半胱天冬酶-Glo 3/7检测试剂(Promega)。板在铝箔中，于摇床上室温孵育1小时，之后用发光酶标仪测量。
MTS检测
处理6天后，细胞用10μl CellTiter
Figure BDA0003806232370000241
Aqueous One溶液细胞增殖检测(Promega)37℃孵育1小时，以实施MTS检测。之后，使用Spectramax M5e测量490nm吸光度。
类器官上的活/死细胞检测
在肽和/或化疗处理后3天的较大类器官、或在用检定前处理为单细胞且生长2周的类器官上进行活/死细胞检定。为实施检定，将钙黄绿素-AM(1∶1000)和碘化丙啶(PI；1∶100)加至类器官的培养基中以分别测定活的和死的细胞。在Zeiss细胞观察显微镜上对类器官进行成像，信号用FIJI进行定量。
实时成像
类器官和IMR90细胞在96孔细胞培养板中生长，向孔中加入488IncuCyte凋亡用半胱天冬酶3/7试剂(Sartorius)、或IncuCyte半胱天冬酶3/7红凋亡检测试剂(EssenBioscience)。在将板转移至包含热和CO2控制组件的Zeiss细胞观察显微镜前，加入肽。之后，开始实时成像，其中每2小时记录照片，持续60小时。使用Zen成像软件(Zeiss)处理照片。
或者，在LSM880共聚焦显微镜上进行实时成像。对于该实验，将类器官铺板在玻璃底细胞培养皿上，用测量细胞活力的钙黄绿素-AM(Sigma-Aldrich)、和IncuCyte半胱天冬酶3/7红色凋亡检测试剂(Essen Bioscience)孵育。在开始成像前添加肽。
小鼠
在得到荷兰动物伦理委员会的批准后，进行小鼠实验。对于这些实验，采用雄性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wj1/SzJ/J小鼠(Charles River)。将含有萤火虫荧光素酶的人CRC29结直肠癌类器官移植到盲肠中，在该位置形成原发肿瘤。在氯胺酮和右美托咪定麻醉下进行移植。此外，动物在手术前以及后一天接受卡洛芬30min。在移植后14天，小鼠用异氟烷进行镇静，并在BioSpace成像仪下进行成像。接下来，动物用PBS或5’-氟尿嘧啶(5-FU)经i.p.注射50mg/kg剂量处理。在5-FU处理1周后经i.v.注射施用第一剂CL04183(2.5mg/kg)，在2和4天后重复该处理。在移植后4周，小鼠再次成像，确定处理效果，之后处死。收获所有器官，并再次在BioSpace成像仪下进行成像，使用M3可视软件对荧光素酶信号进行定量。
免疫组化
在用TBS清洗前，肝和肺的石蜡切片在递减浓度的乙醇中再水化，并在10nM柠檬酸钠缓冲液(pH6)中煮沸20分钟，进行抗原修复。在切片冷却30分钟后，组织用0.2％TX-100的TBS液室温透化5分钟。接下来，切片用TBS清洗，并在含有2％w/v二抗-适当血清(例如，驴或山羊)和0.1％鱼胶的1％BSA液的封闭缓冲液中孵育1小时。之后切片用防水笔环绕，并用TBS/1％BSA稀释的一抗4℃孵育过夜。第二天，组织用TBS清洗3次，用封闭缓冲液(含有Hoechst 33342的核染色)稀释的荧光标记二抗孵育1小时。之后，将切片用TBS清洗2次，在苏丹黑溶液中孵育20min以减少背景，并在脱矿质水中清洗。切片之后用Vectashield贴片，用LSM880 Zeiss共聚焦显微镜进行成像。
细胞凋亡染色
在肺转移癌上进行TUNEL检测，以确定处理后的细胞凋亡诱发。再水化的切片用20μg/ml ProtK的PBS溶液处理15分钟，在0.1％Triton X-100的0.1％柠檬酸钠液中透化。接着，组织用含10％TUNEL酶的标记液(ROCHE)37℃标记1小时。在贴片用软集封片液(Vectashield)贴片前，用Hoechst 33342(ThermoFisher)对核进行标记。使用LSM880共聚焦显微镜(Zeiss)获取照片，使用FIJI分析TUNEL阳性细胞的百分比。
蛋白表达和纯化
人p53的1-312(p53-TADBD)、94-312(p53-DBD)、氨基酸1-94(p53-TAD)和氨基酸37-57(p53-TAD2)的片段的表达构建体通过合成相应优化的p53 cDNA构建体并经NcoI/BamHI限制性酶切位点插入到pETM11-ZZ-His6载体(Genscript)中而生成。对于人FOXO4的氨基酸86-208片段(FOXO4-FH)，当前发明人还生成pETM11-ZZ-His6载体中的优化cDNA表达构建体(Genscript)。当前发明人采用三种不同的化学感受态大肠杆菌菌株(大肠杆菌BL21(DE3)和大肠杆菌BL21-(DE3 Star)用于蛋白表达，大肠杆菌TOP10用于质粒DNA的扩增)。
使用公开的本领域已知的方法规程实施蛋白表达和纯化。
荧光偏振
制备116μl特定肽的溶液(1-100μM)。之后添加4μl FITC标记的p53肽(储备液浓度15μM，终浓度500nM)。将35μl转移到384孔板的各孔中。三个重复，进行测量。
在ClarioStar+酶标仪中，获取数据。每孔进行200闪的终点测量。使用482nm波长的激发滤片和530nm的发射滤片，对每次测量进行增益调节和焦距调节。记录荧光强度、平行荧光偏振、和垂直荧光偏振。
使用MARS版本(BMG)、微软Excel和GraphPad Prism版本8进行数据分析。
NMR化学位移扰动
制备含有500μl100μM p53-TAD2的5mm NMR管，记录1H，15N HSQC NMR光谱。之后，逐步加入递增量的肽，之后在每一步后测量另一1H，15N HSQC光谱。在配置有TXI600S3探针头的600Mhz Bruker Avance NOE NMR光谱仪中获得NMR光谱。用Topspin3.5和Topspin4.0(Bruker)进行数据获取和加工。使用ccpNMR进行数据分析、峰值提取和分配。
Figure BDA0003806232370000261
Figure BDA0003806232370000271
序列表
<110> 可丽尔生物技术私有有限责任公司
<120> 改进的抗衰老化合物及其用途
<130> C32322WO
<140> PCT/EP2021/054338
<141> 2021-02-22
<150> US62/979,819
<151> 2020-02-21
<160> 68
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是Ala或Ser或芴甲氧羰基-L-2-(4'-戊烯基)丙氨酸（订书针）
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是Lys、Glu、Arg、或His
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Ile、Leu、或环己基-丙氨酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> 其他特征
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是Gly、Gln、Ala、Ser、或Pro或芴甲氧羰基-L-2-(4'-戊烯基)丙氨酸（订书针）
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以是Ala、Gly、Ser、Glu或Asp
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<221> 其他特征
<222> (7)..(8)
<223> Xaa可以是Ile、Leu、或环己基-丙氨酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是Glu或Asp
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<221> 其他特征
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可以是Ala或Glu
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<221> 其他特征
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可以是Trp、Tyr、或Phe或2-甲基-色氨酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (12)..(12)
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<220>
<221> 其他特征
<222> (15)..(15)
<223> Xaa可以是Ala或Gly
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<223> Xaa可以是Arg或Lys
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Asn Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 智人
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<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 其他特征
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<220>
<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<220>
<221> 其他特征
<222> (10)..(10)
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<221> 其他特征
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> 其他特征
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<221> 其他特征
<222> (13)..(14)
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<220>
<221> 其他特征
<222> (15)..(15)
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala
1 5 10 15
Xaa Xaa Gln Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20 25 30
<210> 3
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (1)..(1)
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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<221> 其他特征
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Gln Asn Xaa Xaa
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
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<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> 其他特征
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以是Glu或Asp
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<221> 其他特征
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<223> Xaa可以是Ala或Ser
<220>
<221> 其他特征
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<223> Xaa可以是Ala或Gly
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Ile Xaa Xaa Xaa Ile Leu Xaa Ala Phe Xaa Gln Asn Xaa Trp
1 5 10
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Leu Thr Leu Arg Lys Glu Pro Ala Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu
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Glu Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Gly Gly Lys
20 25 30
Arg Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Leu Thr Leu Arg Lys Glu Pro Ala Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu
1 5 10 15
Glu Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Gly Gly Lys
20 25 30
Arg Pro Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
35 40 45
<210> 7
<211> 34
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Leu Thr Leu Arg Lys Glu Ala Ser Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu
1 5 10 15
Asp Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys
20 25 30
Arg Pro
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<212> PRT
<213> 智人
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Leu Thr Leu Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Gln Ser Ile Leu
1 5 10 15
Asp Ala Phe Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys
20 25 30
Arg Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Leu Thr Leu Arg Lys Glu Pro Ala Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu
1 5 10 15
Glu Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Gly Gly Lys
20 25 30
Arg Pro
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Gln Ser Ile Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys Arg Pro
20 25 30
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
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Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys Arg Pro
20 25 30
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Ala Trp Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys Arg Pro
20 25 30
<210> 13
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<212> PRT
<213> 智人
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Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
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Ser Gln Asn Trp Arg Arg Lys Arg
20
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<212> PRT
<213> 智人
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Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Glu Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Trp Arg Arg Lys Arg
20
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<212> PRT
<213> 智人
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Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe
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<213> 智人
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Arg Lys Lys Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln
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Asn Trp Arg Arg Lys Arg
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<213> 智人
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Arg Lys Lys Ser Lys Ile Glu Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln
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Asn Trp Arg Arg Lys Arg
20
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Ala Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln Asn Trp Arg
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Ala Lys Ile Glu Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln Asn Trp Arg
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Leu Thr Leu Arg Lys Glu Pro Ala Ser Glu Ile Ala Gln Ser Ile Leu
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Glu Ala Tyr Ser Gln Asn Gly Trp Ala Asn Arg Arg Ser Gly Gly Lys
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Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
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Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
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Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
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Ser Gln Asn Ala Trp Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys Arg Pro Pro
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Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Ala
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<213> 智人
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Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
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Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe
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Arg Lys Lys Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Pro Arg Lys Gly Gly Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Gln Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ala Ile Glu Ser Ala Pro Glu Lys Arg Leu
20 25 30
Thr Leu Ala Gln Ile Tyr Glu Trp Met Val Arg Thr Val Pro Tyr Phe
35 40 45
Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys Asn Ser Ile
50 55 60
Arg His Asn Leu Ser Leu His Ser Lys Phe Ile Lys Val His Asn Glu
65 70 75 80
Ala Thr Gly Lys Ser Ser Trp Trp Met Leu Asn
85 90
<210> 33
<211> 34
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Pro Arg Lys Gly Gly Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Gln Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ala Ile Glu Ser Ala Pro Glu Lys Arg Leu
20 25 30
Thr Leu
<210> 34
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gln Trp Phe
1 5 10 15
Thr Glu Asp Pro Gly Pro
20
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Leu Thr Leu Arg Lys Glu Ala Ser Ser Glu
1 5 10
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可以是Ala、Gly、Ser、Glu或Asp
<220>
<221> 其他特征
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是Gly、Gln、Ala、Ser、或Pro
<220>
<221> 其他特征
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是Ala、Gly、Ser、Glu或Asp
<400> 36
Ile Xaa Xaa Xaa Ile Leu
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Ile Ala Gln Ser Ile Leu
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys Arg Pro
1 5 10
<210> 39
<211> 505
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Met Asp Pro Gly Asn Glu Asn Ser Ala Thr Glu Ala Ala Ala Ile Ile
1 5 10 15
Asp Leu Asp Pro Asp Phe Glu Pro Gln Ser Arg Pro Arg Ser Cys Thr
20 25 30
Trp Pro Leu Pro Arg Pro Glu Ile Ala Asn Gln Pro Ser Glu Pro Pro
35 40 45
Glu Val Glu Pro Asp Leu Gly Glu Lys Val His Thr Glu Gly Arg Ser
50 55 60
Glu Pro Ile Leu Leu Pro Ser Arg Leu Pro Glu Pro Ala Gly Gly Pro
65 70 75 80
Gln Pro Gly Ile Leu Gly Ala Val Thr Gly Pro Arg Lys Gly Gly Ser
85 90 95
Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Gln Ser Tyr Ala Glu Leu Ile Ser Gln
100 105 110
Ala Ile Glu Ser Ala Pro Glu Lys Arg Leu Thr Leu Ala Gln Ile Tyr
115 120 125
Glu Trp Met Val Arg Thr Val Pro Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser
130 135 140
Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys Asn Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu
145 150 155 160
His Ser Lys Phe Ile Lys Val His Asn Glu Ala Thr Gly Lys Ser Ser
165 170 175
Trp Trp Met Leu Asn Pro Glu Gly Gly Lys Ser Gly Lys Ala Pro Arg
180 185 190
Arg Arg Ala Ala Ser Met Asp Ser Ser Ser Lys Leu Leu Arg Gly Arg
195 200 205
Ser Lys Ala Pro Lys Lys Lys Pro Ser Val Leu Pro Ala Pro Pro Glu
210 215 220
Gly Ala Thr Pro Thr Ser Pro Val Gly His Phe Ala Lys Trp Ser Gly
225 230 235 240
Ser Pro Cys Ser Arg Asn Arg Glu Glu Ala Asp Met Trp Thr Thr Phe
245 250 255
Arg Pro Arg Ser Ser Ser Asn Ala Ser Ser Val Ser Thr Arg Leu Ser
260 265 270
Pro Leu Arg Pro Glu Ser Glu Val Leu Ala Glu Glu Ile Pro Ala Ser
275 280 285
Val Ser Ser Tyr Ala Gly Gly Val Pro Pro Thr Leu Asn Glu Gly Leu
290 295 300
Glu Leu Leu Asp Gly Leu Asn Leu Thr Ser Ser His Ser Leu Leu Ser
305 310 315 320
Arg Ser Gly Leu Ser Gly Phe Ser Leu Gln His Pro Gly Val Thr Gly
325 330 335
Pro Leu His Thr Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Ser Pro Ala Glu Gly Pro
340 345 350
Leu Ser Ala Gly Glu Gly Cys Phe Ser Ser Ser Gln Ala Leu Glu Ala
355 360 365
Leu Leu Thr Ser Asp Thr Pro Pro Pro Pro Ala Asp Val Leu Met Thr
370 375 380
Gln Val Asp Pro Ile Leu Ser Gln Ala Pro Thr Leu Leu Leu Leu Gly
385 390 395 400
Gly Leu Pro Ser Ser Ser Lys Leu Ala Thr Gly Val Gly Leu Cys Pro
405 410 415
Lys Pro Leu Glu Ala Pro Gly Pro Ser Ser Leu Val Pro Thr Leu Ser
420 425 430
Met Ile Ala Pro Pro Pro Val Met Ala Ser Ala Pro Ile Pro Lys Ala
435 440 445
Leu Gly Thr Pro Val Leu Thr Pro Pro Thr Glu Ala Ala Ser Gln Asp
450 455 460
Arg Met Pro Gln Asp Leu Asp Leu Asp Met Tyr Met Glu Asn Leu Glu
465 470 475 480
Cys Asp Met Asp Asn Ile Ile Ser Asp Leu Met Asp Glu Gly Glu Gly
485 490 495
Leu Asp Phe Asn Phe Glu Pro Asp Pro
500 505
<210> 40
<211> 393
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1 5 10 15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
50 55 60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
115 120 125
Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
130 135 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys
165 170 175
Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln
180 185 190
His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp
195 200 205
Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
210 215 220
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
225 230 235 240
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
245 250 255
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
260 265 270
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
275 280 285
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
325 330 335
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
340 345 350
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His
355 360 365
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met
370 375 380
Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
385 390
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro
1 5 10
<210> 42
<211> 34
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Pro Arg Lys Gly Gly Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Gln Ser Tyr
1 5 10 15
Ala Glu Leu Ile Ser Gln Ala Ile Glu Ser Ala Pro Glu Lys Arg Leu
20 25 30
Thr Leu
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Ser Gln Asn Ala Trp
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Ser Gln AsN Gly Trp
1 5
<210> 45
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Ser Gln Asn Trp
1
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Lys Ile Ala Ala Ala
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Lys Ile Glu Ala Ala
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Lys Ile Ala Ala Glu
1 5
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Lys Ile Glu Ala Glu
1 5
<210> 50
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Ser Gln Asn Gly
1
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Ala Ala Asn Gly
1
<210> 52
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Ser Gln Ala Gly
1
<210> 53
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Glu Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Trp Arg Arg Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Gly
35
<210> 54
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Arg Lys Lys Ser Lys Ile Glu Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln
1 5 10 15
Asn Trp Arg Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25 30
<210> 55
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Ala Lys Ile Glu Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln Asn Trp Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25
<210> 56
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Ala Lys Ile Glu Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln Asn Trp Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25
<210> 57
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Ala Lys Ile Glu Ala Ala Ile Leu Asp Glu Phe Ser Gln Asn Trp Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25
<210> 58
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (6)..(6)
<223> 芴甲氧羰基-L-2-(4'-戊烯基)丙氨酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (10)..(10)
<223> 芴甲氧羰基-L-2-(4'-戊烯基)丙氨酸
<400> 58
Arg Lys Lys Ala Ser Xaa Lys Ile Ala Xaa Ala Ile Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Trp Arg Arg Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Gly
35
<210> 59
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (12)..(12)
<223> 环己基-丙氨酸
<400> 59
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Ala Ala Ala Xaa Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Ala Trp Ala Asn Arg Arg Ser Ser Cys Lys Arg Pro Pro
20 25 30
Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Ala
35 40
<210> 60
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (15)..(15)
<223> 2-甲基-色氨酸
<400> 60
Ala Lys Ile Glu Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln Asn Xaa Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25
<210> 61
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (15)..(15)
<223> 2-甲基-色氨酸
<400> 61
Ala Lys Ile Glu Ala Glu Ile Leu Glu Ala Phe Ser Gln Asn Xaa Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25
<210> 62
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (7)..(7)
<223> 环己基-丙氨酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (15)..(15)
<223> 2-甲基-色氨酸
<400> 62
Ala Lys Ile Glu Ala Ala Xaa Leu Asp Ala Phe Ser Gln Asn Xaa Arg
1 5 10 15
Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25
<210> 63
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (20)..(20)
<223> 2-甲基-色氨酸
<400> 63
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Glu Ala Glu Ile Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Xaa Arg Arg Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Gly
35
<210> 64
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (12)..(12)
<223> 环己基-丙氨酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (20)..(20)
<223> 2-甲基-色氨酸
<400> 64
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Glu Ala Glu Xaa Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Xaa Arg Arg Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Gly
35
<210> 65
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 其他特征
<222> (13)..(13)
<223> 环己基-丙氨酸
<220>
<221> 其他特征
<222> (20)..(20)
<223> 2-甲基-色氨酸
<400> 65
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Glu Ala Glu Ile Xaa Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Xaa Arg Arg Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Gly
35
<210> 66
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
Ala Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Pro
1 5 10
<210> 67
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 67
Arg Lys Lys Ser Lys Ile Ala Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe Ser Gln
1 5 10 15
Asn Trp Arg Lys Arg Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly
20 25 30
<210> 68
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
Arg Lys Lys Ala Ser Ser Lys Ile Glu Ala Ala Ile Leu Asp Ala Phe
1 5 10 15
Ser Gln Asn Trp Arg Arg Lys Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Gly
35

Claims (28)

1.一种化合物、及其药学上可接受的盐，该化合物选自：
i)包含与氨基酸序列X3X2X4X5X7X5X4X4X6X18X8X3QNX9X8X10X10X11X12S*X13X14X11X11(SEQ IDNO：1)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同一性的氨基酸序列的肽，
其中，
S*可以是S、或不存在；
X2不存在，或选自K、E、R、和H；
X3不存在，或选自A、J、和S；
X4选自I、Z、和L，其中Z为环己基-丙氨酸；
X5选自A、G、S、E、和D；
X6选自E和D；
X7选自J、G、Q、A、S、和P；
X8选自B、W、Y、和F，其中B是2-甲基-色氨酸；
X9不存在，或选自A和G；
X10不存在，或选自A和N；
X11选自R和K；
X12不存在，或选自R；
X13不存在，或选自G和S；
X14不存在，或选自A和C；以及
X18选自A和E；
规定没有J，或者存在2个J且形成订书针状物；
ii)根据i)的包含非天然氨基酸、和/或D-氨基酸的肽，优选根据i)的包含至少80％D-氨基酸或由至少80％D-氨基酸构成的肽，以及
iii)根据i)或ii)的反-倒位肽，且
其中该化合物引发衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中的凋亡。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中该肽包含与氨基酸序列X1X17K*X2X16X3X3X2X4X5X7X5X4X4X6AX8X3QNX9X8X10X10X11X12S*X13X14X11X11X15(SEQ ID NO：2)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同一性的氨基酸序列，其中Z、B、J、S*、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、和X18如权利要求1所述；
K*可以是K、或不存在；
X1不存在或表示氨基酸序列LTL；
X15不存在或选自A和C；
X16选自A和P；以及
X17不存在或R和S；且
其中该化合物引发衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞中的凋亡。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中氨基酸基序X3QNX9X8选自SQNAW(SEQ ID NO：43)、SQNGW(SEQ ID NO：44)、和SQN-W(SEQ ID NO：45)，其中“-”表示不存在氨基酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中氨基酸基序X2X4X5X7X5选自KIAAA(SEQID NO：46)、KIEAA(SEQ ID NO：47)、KIAAE(SEQ ID NO：48)、和KIEAE(SEQ ID NO：49)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中氨基酸基序X4X5X7X5X4X4X6AX8X3QNX9X8(SEQ ID NO：3)选自通式IX5X7X5ILX6AYX3QNX9W(SEO ID NO：4)，其中，
X3不存在或选自A、J、和S；
X5选自A、G、S、E、和D；
X6选自E和D；
X7选自J、G、Q、A、S、和P；以及
X9不存在或选自A和G。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中该化合物是包含选自以下的氨基酸序列、优选为D-氨基酸序列的肽：
LTLRKEASSEIAQSILDAYSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：7)、
LTLRKKASSKIAQSILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：8)、
LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRP(SEQ ID NO：9)、
RKKASSKIAQSILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：10)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNGWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：11)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNAWANRRSSCKRP(SEQ ID NO：12)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：13)、
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：14)、
RKKASSKIAAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：15)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：16)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：17)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：18)、
AKIAAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：19)、
AKIEAAILDAFSQNWRRKR(SEQ ID NO：20)、
LTLRKEPASEIAQSILEAYSQNGWANRRSGGKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：21)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNGWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：22)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNAWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRA(SEQ ID NO：23)、
RKKASSKIAAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：24)、
RKKASSKIEAAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：25)、
RKKASSKIAAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：26)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：27)、
RKKSKIAAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：28)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：29)、
AKIAAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：30)、
AKIEAAILDAFSQNWRRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：31)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：53)、
RKKSKIEAEILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：54)、
AKIEAAILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：55)、
AKIEAEILDAFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：56)、
AKIEAAILDEFSQNWRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：57)、RKKASJKIAJAILDAFSQNWRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：58)、RKKASSKIAAAZLDAFSQNAWANRRSSCKRPPPRRRQRRKKRA(SEQ ID NO：59)、
AKIEAAILDAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：60)、
AKIEAEILEAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：61)、
AKIEAAZLDAFSQNBRKRRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：62)、
RKKASSKIEAEILDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：63)、
RKKASSKIEAEZLDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：64)、
RKKASSKIEAEIZDAFSQNBRRKRPPRRRQRRKKRG(SEQ ID NO：65)、其中J、B和Z如上所定义，
与SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中任一至少80％、优选至少90％、更优选至少95％同一性的氨基酸序列，以及
由根据SEQ ID NO：1-4、和7-31、和53-65、以及67和68中任一的氨基酸构成的肽，优选由SEQ ID NO：55、60、63、64或65中任一的氨基酸构成的肽。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，还包含赋予细胞渗透特性、细胞器靶向特性、核定位、线粒体定位、血脑屏障渗透、细胞膜定位、和/或肽酶切割的序列，例如HIV的TAT-序列(GRKKRRQRRRPP，SEQ ID NO：41)或ARKKRRQRRRPPP(SEQ ID NO：66)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的化合物，包含非天然发生氨基酸、修饰氨基酸，优选非天然发生氨基酸与该化合物在该位置上的天然氨基酸具有相同或基本相同的所需特性，修饰氨基酸为例如接头氨基酸、订书针状物、半胱氨酸桥、糖基化位点、泛素化和/或聚乙二醇化位点。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的化合物，其中该化合物与p53结合，或优选与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53的相互作用。
10.一种用于识别与p53结合、或优选与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的改进化合物的方法，包括以下步骤：
a)提供权利要求1-9中任一项所述的至少一种化合物；
b)适当地改造a)的化合物；
c)确定b)的至少一种化合物与p53或其片段的结合、该至少一种化合物的稳定性、以及在该至少一种化合物的存在下与不存在该化合物时FOXO4或其片段与p53或其片段的结合相比较的FOXO4或其片段与p53或其片段的结合中的至少一种，以及
d)基于步骤c)的确定，识别出相对于步骤a)提供的化合物为改进的与p53结合或优选与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该至少一种化合物的结合特异于p53或其片段。
12.根据权利要求10或11所述的方法，还包括测试所识别的化合物的引发细胞凋亡和/或杀伤衰老细胞、瘢痕细胞、和/或肿瘤细胞的活性，优选包括对于半胱天冬酶-3/7活性升高、线粒体细胞色素C的丧失、TUNEL阳性、胞外膜联蛋白V阳性、和/或细胞死亡标记物升高、和/或活力丧失的确定，细胞死亡标记物升高为例如细胞碘化丙啶包含，活力丧失为例如钙黄绿素AM并入的丧失或MTS活力检测。
13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中FOXO4或其片段、和/或p53或其片段在细胞中重组表达。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中细胞选自癌细胞、瘢痕细胞、衰老细胞、瘢痕细胞、人非胚胎干细胞、酵母细胞、细菌细胞、表达FOXO4和/或其p53结合片段的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞任选地表达p53和/或其FOXO4结合片段。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，其中FOXO4或其p53结合片段、p53或其FOXO4结合片段、和/或该化合物可检测地标记，例如具有荧光、质量和/或稳定同位素标签。
16.一种用于筛选与p53结合、以及优选与p53结合并抑制细胞中FOXO4与p53相互作用的化合物的筛选工具，包含分离的表达FOXO4的细胞、和/或表达其p53结合片段的细胞，其中所述细胞任选地表达p53，和/或表达FOXO4结合片段的细胞。
17.根据权利要求16所述的筛选工具，其中FOXO4或其片段、和/或p53或其片段在细胞中重组表达。
18.根据权利要求16或17所述的筛选工具，其中该细胞选自癌细胞、衰老细胞、瘢痕细胞、人非胚胎干细胞、酵母细胞、细菌细胞、表达FOXO4和/或其p53结合片段的重组宿主细胞、其中该重组宿主细胞任选地表达p53和/或其FOXO4结合片段。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的筛选工具，其中FOXO4或其p53结合片段、p53或其FOXO4结合片段、和/或化合物可检测地标记，例如具有荧光和/或质量标签。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的筛选工具，其中FOXO4的片段是根据序列PRKGGSRRNAWGNQSYAELISQAIESAPEKRLTLAQIYEWMVRTVPYFKDKGDSNSSAGWKNSIRHNLSLHSKFIKVHNEATGKSSWWMLN(SEQ ID NO：32)或PRKGGSRRNAWGNQSYAELISQAIESAPEKRLTL(SEQ ID NO：33)的肽，其中p53的片段是根据序列AMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGP(SEQ ID NO：34)的肽。
21.一种用于制备在受试者中治疗或防止衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞的药物组合物的方法，包括将权利要求1-9中任一项所述的化合物配制到合适的药物组合物或实施权利要求10-15中任一项所述的方法，以及将所识别的化合物配制到合适的药物组合物中的步骤。
22.一种药物组合物，其由权利要求21所述的方法获得，用于在受试者中治疗或预防衰老细胞。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，包含化合物的混合物、和/或至少一种化合物与其他药学上的活性成分的混合物。
24.权利要求1-9中任一项所述的至少一种化合物、或权利要求22或23所述的药物组合物在医疗中的用途。
25.根据权利要求24所述的至少一种化合物或药物组合物的用途，其中待预防和/或治疗的疾病症状选自由衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞造成的疾病或病症，年龄相关疾病、肾病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)/非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肝纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)、骨关节炎、COPD、骨骼肌疾病、认知功能受损、和癌症。
26.根据权利要求24或25所述的至少一种化合物或药物组合物的用途，其中该疗法为与抗癌化疗剂或针对各疾病或病症的其他标准护理药物的联合疗法，或其中该疗法应用于经抗癌化疗剂或用于各疾病或病症的标准护理药物预处理过且在该处理中存活的衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞。
27.一种用于在有需要的受试者中治疗或预防由衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞造成的疾病或病症，年龄相关疾病、肾病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)/非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肝纤维化、特发性肺纤维化(IPF)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(ALS)、骨关节炎、COPD、骨骼肌疾病、认知功能受损、或癌症的方法，包括向该受试者施用有效量的权利要求1-9中任一项所述的至少一种化合物、或权利要求22或23所述的药物组合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中该疗法为与抗癌化疗剂或针对各疾病或病症的其他标准护理药物的联合疗法，或其中该疗法应用于经抗癌化疗剂或用于各疾病或病症的标准护理药物预处理过且在该处理中存活的衰老细胞、瘢痕细胞、和/或癌细胞。
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