WO2020213972A1 - 항암 활성이 증가된 자연살해세포 및 그의 면역 치료 용도 - Google Patents

항암 활성이 증가된 자연살해세포 및 그의 면역 치료 용도 Download PDF

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백영석
이인지
전성민
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Definitions

  • It relates to natural killer cells with increased anticancer activity and uses thereof for immunotherapy.
  • Natural killer cells also referred to as "NK cells" used in immune cell therapy are morphologically large granules in the cytoplasm and account for about 5-15% of lymphocytes in the blood.
  • the main functions of natural killer cells that have been discovered so far include the ability to kill tumor cells, cytotoxicity to virus-infected cells, and the ability to kill bacteria and fungi. Therefore, natural killer cells are expected to play an important role in anti-tumor, immunity and protective immunity against microorganisms.
  • Natural killer cells have surface receptors as immune receptors. Since dominant receptors such as BCR of B cells and T cell receptor (TCR) of T cells do not exist in natural killer cells, it is predicted that there is an activation mechanism that is distinct from other immune cells. In addition, natural killer cells are known to have the ability to non-specifically kill cancer. The killing ability of these natural killer cells is used in the treatment of solid cancer along with lymphokine activated killer cells (LAK) and tumor infiltration lymphocytes (TIL), or donor lymphocyte infusion. By performing the immunotherapy method (Tilden. AB et al., J. Immunol., 136) through the method, it can be applied as a new cell therapy method to prevent rejection that occurs during bone marrow transplantation or organ transplantation.
  • LAK lymphokine activated killer cells
  • TIL tumor infiltration lymphocytes
  • glioma is a tumor that accounts for 60% of primary brain tumors and is a malignant tumor with no special treatment other than radiation therapy.
  • glioblastoma which is classified as malignant, has a very high resistance to radiation and anticancer treatment compared to other cancers, and once diagnosed, the expected survival period is only 1 year.
  • Malignant glioblastoma accounts for 12-15% of all brain tumors, and is the most common tumor among single tumors in the brain.
  • One aspect is to provide natural killer cells with increased anticancer activity having receptor expression characteristics of a specific range of relative MFI values.
  • Another aspect is to provide a cell therapy or pharmaceutical composition containing the natural killer cells or a population thereof as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a method of treating cancer comprising administering an effective amount of the natural killer cells or a population thereof to an individual in need thereof.
  • One aspect provides a natural killer cell with increased anticancer activity having receptor expression characteristics of a specific range of relative MFI values.
  • NK cells are cytotoxic lymphocytes constituting a major component of the innate immune system, defined as large granular lymphocytes (LGL), and lymphatic progenitor cells ( Common lymphoid progenitor, CLP), constitutes a third cell differentiated from producing B and T lymphocytes.
  • LGL large granular lymphocytes
  • CLP Common lymphoid progenitor
  • the "natural killer cells” or “NK cells” include natural killer cells without additional modifications derived from any tissue source, and may include natural killer cells as well as mature natural killer cells.
  • the natural killer cells are activated in response to interferon or macrophage-derived cytokines, and the natural killer cells are labeled with "activating receptors" and "inhibitory receptors", two types of controlling cytotoxic activity of cells.
  • Natural killer cells are any source, for example, placental tissue, placental perfusate, umbilical cord blood, placental blood, peripheral blood, spleen, hematopoietic cells from liver, etc., such as hematopoietic stems or precursors, stem cells derived from placenta or umbilical cord, It can be produced from induced pluripotent stem cells, or cells differentiated therefrom.
  • the natural killer cells may be derived from, for example, peripheral blood mononuclear cells.
  • peripheral blood mononuclear cells refers to mononuclear cells isolated from peripheral blood of mammals, preferably humans, mainly immune cells such as B cells, T cells, natural killer cells, and They include granulocytes such as basophil, eosinophil, and neutrophil.
  • the PBMC may be prepared from peripheral blood collected from a living body by a conventional manufacturing method.
  • the PBMC can be separated from peripheral blood using a specific gravity centrifugation method using Ficoll.
  • natural killer cells can be obtained by removing red blood cells from a product of leukapheresis, which separates white blood cells from blood.
  • the natural killer cells of the present specification may have one or more characteristics selected from the following (a) to (e);
  • the value of the relative MFI of NKG2D compared to day 0 of culture of PBMC is 1.2 to 12 times, 2 to 12 times, 4 to 12 times, 2 to 10 times, 2 to 8 times, 4 to 8 times An increase of 3 times to 6 times or 3.5 to 4.5 times;
  • the relative MFI of NKp30 compared to day 0 of culture of PBMC was 1.5 to 15 times, 1.5 to 12 times, 2 to 12 times, 4 to 10 times, 2 to 10 times, 4 to 8 times A fold, 3 to 6 fold, or 4 to 6 fold increase;
  • the value of the relative MFI of NKp44 on the 14th day of culture compared to the 0th day of culture of PBMC is 12 to 22 times, 12 to 20 times, 14 to 22 times, 16 to 22 times, 16 to 20 times, An increase of 12 to 18 fold, 14 to 18 fold, or 16 to 18 fold;
  • the value of the relative MFI of ITGA1 compared to day 0 of the culture of PBMC was 1.8 to 25 times, 2 to 25 times, 4 to 22 times, 4 to 18 times, 6 to 16 times, 6 to 10 times A fold, or an increase of 6 to 8.5 fold;
  • the relative MFI of ITGA2 compared to day 0 of culture of PBMC was 1.4 to 6 times, 1.8 to 6 times, 1.8 to 5 times, 2 to 5.5 times, 2 to 5 times, 2 to 4 times Times, or 2.5 to 3.5 times.
  • the value of the relative MFI may be a value of the relative MFI of the 14th day of culture compared to the 0th day of culture of the PBMC.
  • MFI Mean Fluorescence Intensity
  • Relative MFI receptor MFI/isotype MFI
  • Relative MFI is a concept that is separate from the expression ratio, which measures the expression ratio of positive cells to isotypes.Even if the expression ratio is the same, the strength of each receptor function is different depending on the MFI value. It can be understood that the function has been increased.
  • the present specification provides a novel natural killer cell treated with a new material, for example, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, or PDGF-AB when culturing natural killer cells from PBMC.
  • the novel natural killer cells have different manufacturing methods from other known natural killer cells, and the relative MFI values of NKG2D, NKp30, NKp44, ITGA1, and ITGA2, which are factors related to anticancer activity and activation of natural killer cells, are PBMC culture. Cells increased from 1.2 times to 30 times as much as before.
  • CD16 with MFI values of 8 to 140, 10 to 140, 8 to 40, 15 to 30, 80 to 140, 100 to 140 or 110 to 130; LFA-1 with an MFI value of 20 to 160, 30 to 160, 30 to 150, 20 to 60, 25 to 50, or 120 to 160, 135 to 150; NKG2D with an MFI value of 2 to 30, 5 to 30, 5 to 25, 6 to 15, 12 to 30, or 14 to 25; NKp30 of an MFI value of 2 to 25, 5 to 25, 5 to 20, 2 to 14, 7 to 20 18, or 10 to 18; NKp44 at an MFI value of 10 to 40, 12 to 30, 12 to 25, 14 to 22, 12 to 18, or 18 to 22; ITGA1 with MFI values of 2 to 30, 4 to 25, 4 to 22, 2 to 16, 4 to 12, 10 to 25, or 14 to 25; ITGA2 with MFI values of 1 to 10, 1.5 to 10, 2 to 10, 1.6 to 4, 2 to 8, 4 to 8, or 4 to 6; CD2 with an MFI value of 20 to 180; CD27 with an MFI value of 0.1 to 1.5; CD
  • the natural killer cells may additionally have the following characteristics (f);
  • the natural killer cells may additionally have the following characteristics (g) or (h);
  • the relative mean fluorescence intensity (MFI) value of CD16 on the 14th day of culture compared to the 0th day of culture of PBMCs was 0.02 to 0.85 times, 0.04 to 0.8 times, 0.08 to 0.8 times, 0.1 to 0.6 times, 0.1 times A reduction of to 0.4 times or 0.12 to 0.3 times; or
  • the natural killer cells are NKG2D, NKp30, NKp44, CD16, LFA-1, ITGA1, ITGA2, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIRDS4, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CCR3, CCR5, CCAM6, PSA-N , Nestin, Tyrosine Hydroxylase, CD147, CD127, CD15, CD31, CD146, CD49c, CD107a, It may express any one receptor selected from NKG2A, CD45, CD140a, and CD11b.
  • Activation receptors of natural killer cells mainly remove target cells by recognizing ligands that increase in expression when the target cells are in an abnormal state, causing cytotoxic effects.
  • the PSA-NCAM is a marker for differentiation of neurons, and may be an indicator related to the formation of neurons in the nervous system during embryonic development, and Tyrosine Hydroxylase may be an enzyme necessary for the synthesis of neurotransmitter hormones, and CD147 is As a factor related to brain development, it may have an integrin-mediated adhesion function in the brain endothelium.
  • the S100B may improve blood vessel brain barrier permeability.
  • the CD15 may be a function related to chemotaxis, phagocytosis, and/or antibacterial activity, and CD31 is associated with CD38 to treat wounds or to be involved in angiogenesis and cell migration. Can be.
  • CD146 is a cell surface marker expressed in active T cells, mesenchymal stem cells, etc., and may be involved in extravasation of leukocytes, and CD49c is involved in the movement of nerves or is involved in cell-cell, cell-substrate It may be to serve as an attachment between.
  • NKG2D provides cytotoxic activity by detecting UL16 binding proteins (ULBPs) and MIC A/B, RAE1, H60, and MULT1, which are intracellular molecules that increase expression during DNA damage, cancer, and viral infection.
  • ULBPs UL16 binding proteins
  • NKp30 is a receptor that is activated by the binding of extracellular ligands including BAG6 and NCR3LG1, B7-H6, and stimulates cytotoxicity by binding to these ligands.
  • NKp44 recognizes glycoproteins and proteoglycans on the cell surface, nuclear proteins that can be exposed to the outside of cells, and molecules that are released into the extracellular space or migrate to extracellular vesicles. Recently, NKp44 has been reported to recognize soluble plasma proteins (eg, PDGF-DD) such as extracellular matrix (ECM)-derived glycoproteins or growth factors (Cell. 2018 January 25; 172(3): 534-548.e19., Front Immunol. 2019; 10: 719.).
  • soluble plasma proteins eg, PDGF-DD
  • ECM extracellular matrix
  • KIR2DS4 is associated with a number of diseases including cancer, pregnancy disorders and resistance to HIV, and the exact ligand has not been defined, but the peptides presented by HLA-C*05:01 (e.g., recombinant peptide: HLA-C Complex) to activate NK cells, and the activated NK cells produce TNF-alpha and IFN-gamma and degranulate. Therefore, KIR2DS4 can be a high peptide-specific activation receptor and plays a sufficient role in immune defense (J Immunol May 1, 2019, 202 (1 Supplement) 177.24;).
  • ITGA1 is a receptor for laminin and collagen and is involved in cell-cell adhesion. It recognizes some sequences of collagen and is involved in the negative regulation of EGF-stimulated cell growth.
  • ITGA2 is a receptor for laminin, collagen, collagen C-propeptide, fibronectin, and E-cadherin, and is responsible for adhesion to platelets and other cells, regulation of collagen, and construction of the synthesized extracellular matrix.
  • the natural killer cells are at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or about 99%, or 50 to 100 of the cell population.
  • %, 50-90%, 60-90%, 60-80%, or 60-70% is NKG2D, NKp30, NKp44, CD16, LFA-1, ITGA1, ITGA2, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIRDS4, CXCR1, CXCR2 , CXCR3, CCR3, CCR5, CCR6, PSA-NCAM, Nestin, Tyrosine Hydroxylase, CD147, CD127, CD15, CD31, CD146, CD49c, CD107a, It may express NKG2A, CD45, CD140a, or CD11b.
  • natural killer cells are at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or about 99%, or 50 to 100%, 50 to 90%, 60 to 90%, 60 to 80%, or 60 to 70% is KIR2DS1 + , KIR2DS2 + , KIR2DS3 + , KIR2DS4 + , CXCR1 + , CXCR2 + , CXCR3 + , CCR3 + , CCR5 + , CCR6 + , PSA-NCAM + , Nestin + (Nestin + ), CD127 + , CD15 + , CD31 + , CD146 + , CD49c + , CD107a + , NKG2A + , CD45 + , CD140a + , and CD11b + may represent any one of the characteristics selected from.
  • natural killer cells are at least 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% or about the cell population.
  • 99%, or 50-100%, 50-90%, 60-90%, or 60-80% of the CD87 - may be an indication of any one of the characteristics selected from the group consisting of -, CD10 -, and CD80.
  • the term "positive or +" may mean that the label is present in a larger amount or at a higher concentration when compared to other cells for which the label is a reference in relation to the cell label.
  • the label since a cell has a label inside or on the surface of the cell, if the label can be used to distinguish the cell from one or more other cell types, the cell will be positive for that label. It may also mean that the cell has the label in an amount sufficient to emit a signal at a value greater than the background value, for example a signal from a cell measuring device.
  • a cell can be detectably labeled with an NKp44 specific antibody, and if the signal from this antibody is detectably greater than a control (eg background value) then the cell is "NKp44 + ".
  • a control eg background value
  • the term "negative or -" means that even when an antibody specific for a specific cell surface label is used, the label cannot be detected compared to the background value.
  • CD87-If can be labeled detectably cells with antibodies specific for the cell-is "CD87".
  • the natural killer cell is a parent cell, for example, a hematopoietic cell, or a natural killer cell, compared with the cytotoxicity, or the natural killer cell's natural immunomodulatory ability is activated, or immunity as described above. It may mean a cell with increased expression of the receptor.
  • the natural killer cell is CD3-CD56+.
  • the activated natural killer cells are CD3-CD56+CD16+.
  • the activated natural killer cells are additionally CD94+CD117+.
  • the activated natural killer cell is additionally CD161-.
  • the activated natural killer cell is further NKG2D+.
  • the activated natural killer cell is additionally NKp46+. In another specific embodiment, the activated natural killer cell is additionally CD226+. In certain embodiments, more than 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% of said activated natural killer cells are CD56+ and CD16-. In other embodiments, at least 50%, 60%, 70%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88% or 90% of the activated natural killer cells are CD3- and CD56+. In other embodiments, at least 50%, 52%, 54%, 56%, 58% or 60% of the activated natural killer cells are NKG2D+.
  • 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% or 3% of said cells are NKB1+.
  • less than 30%, 20%, 10%, 8%, 6%, 4% or 2% of the activated natural killer cells are NKAT2+.
  • at least 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% of the CD3-, CD56+ activated natural killer cells , 75%, 80% or 85% is NKp46+.
  • At least 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 of the CD3-, CD56+ activated natural killer cells %, 75%, 80% or 85% is CD117+.
  • at least 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% or 50% of said CD3-, CD56+ activated natural killer cells are CD94+.
  • at least 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% or 50% of the CD3-, CD56+ activated natural killer cells are CD161-.
  • At least 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 of the CD3-, CD56+ activated natural killer cells %, 75%, 80%, 85% or 95% is CD226+.
  • at least 20%, 25%, 30%, 35% or 40% of said CD3-, CD56+ activated natural killer cells are CD7+.
  • at least 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% or 60% of the CD3-, CD56+ activated natural killer cells are CD5+.
  • the activated natural killer cells or the activated natural killer cells enriched population is one or more functionally related markers, such as CD94, CD161, DNAM-1, 2B4, NKp46, KIR, and It can be evaluated by detecting the NKG2 family of activating receptors (eg, NKG2D).
  • functionally related markers such as CD94, CD161, DNAM-1, 2B4, NKp46, KIR, and It can be evaluated by detecting the NKG2 family of activating receptors (eg, NKG2D).
  • the activated natural killer cells may be generated from the hematopoietic cells described above.
  • the activated natural killer cells can be obtained from proliferated hematopoietic cells, such as hematopoietic stem cells and/or hematopoietic progenitor cells.
  • the hematopoietic cells continue to proliferate and differentiate in the first medium without the use of feeder cells. Thereafter, the cells are cultured in a second medium in the presence of feeder cells. This separation (isolation), proliferation and differentiation can be carried out in a central facility, which provides a point of use, for example, proliferated hematopoietic cells for proliferation and differentiation in hospitals and the like.
  • the generation of activated natural killer cells includes proliferating a population of hematopoietic cells. During cell proliferation, a plurality of hematopoietic cells in the hematopoietic cell population differentiate into natural killer cells.
  • the term “natural killer progenitor cells”, or “NK progenitor cells”, or cell populations thereof, is, for example, expressed as the level of expression of one or more phenotypic markers, such as CD56, CD16, and KIR. As described above, it may refer to a cell or a population thereof, including cells of a natural killer cell lineage that have not yet developed into mature natural killer cells.
  • the natural killer progenitor cell population comprises cells with low CD16 and high CD56.
  • the natural killer progenitor cell population comprises about 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, or 50% of CD3-CD56+ cells.
  • the natural killer progenitor cell population contains 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, or 50% or less of CD3-CD56+ cells. Include. In another specific embodiment, the natural killer progenitor cell population is 0%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30 %-35%, 35%-40%, 40%-45%, or 45%-50% CD3-CD56+ cells.
  • the CD3-CD56+ cells in the natural killer progenitor cell population are additionally CD117+.
  • about 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% of the CD3-CD56+ cells in the population of natural killer progenitor cells are CD117+.
  • at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% of the CD3-CD56+ cells in the population of natural killer progenitor cells are CD117+. .
  • 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90 of the CD3-CD56+ cells in the natural killer progenitor cell population CD117+ is between %-95%, or 95%-99%.
  • the CD3-CD56+ cells in the natural killer progenitor cell population are further CD161+.
  • about 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, or 75% of the CD3-CD56+ cells in the population of natural killer progenitor cells are CD161+.
  • at least 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, or 75% of the CD3-CD56+ cells in the population of natural killer progenitor cells are CD161+.
  • 40%-45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 60%-65%, 65 of the CD3-CD56+ cells in the natural killer progenitor cell population CD161+ is between %-70%, or 70%-75%.
  • the CD3-CD56+ cells in the natural killer progenitor cell population are additionally NKp46+.
  • about 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 of the CD3-CD56+ cells in the natural killer progenitor cell population %, 80%, 85%, 90% or more are NKp46+.
  • about 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, or 55% of said CD3-CD56+ cells in said population of naturally killer progenitor cells are NKp46+.
  • up to 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, or 55% of said CD3-CD56+ cells in said population of natural killer progenitor cells are NKp46+.
  • the natural killer progenitor cell population is as described above for CD52+, CD16+, CD244+, CD94+, or CD94+.
  • the natural killer cells may be cultured or genetically engineered to express the aforementioned receptors or to increase their expression or activity.
  • the culture herein is as mentioned above from any source, for example, hematopoietic cells from placental tissue, placental perfusate, umbilical cord blood, placental blood, peripheral blood, spleen, liver, and the like, for example hematopoietic stems or precursors. It may mean that it is cultured to increase the expression or activity of the same receptor.
  • genetic engineering or “genetically engineered” refers to an act of introducing one or more genetic modifications to a cell or a cell made thereby.
  • increase in activity may refer to a detectable increase in the activity of a protein, or enzyme.
  • Increase in activity refers to a higher level of protein or enzyme activity compared to a given parental or wild-type cell or pre-culture (eg, PBMC) cell. Means.
  • the natural killer cells may be genetically modified or engineered.
  • the natural killer cells may be genetically modified to improve target specificity and/or homing specificity.
  • the natural killer cells may secrete Perforin, Granzyme, or Interferon.
  • the granzyme may be one or more selected from the group consisting of granzyme A, granzyme B, granzyme H, granzyme K, and granzyme M.
  • the interferon may be type 1 interferon (eg, interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ ), type 2 interferon (eg, interferon- ⁇ ), or type 3 interferon.
  • type 1 interferon eg, interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇ , interferon- ⁇
  • type 2 interferon eg, interferon- ⁇
  • type 3 interferon eg, interferon- ⁇
  • Another aspect provides a cell therapy or pharmaceutical composition comprising the immune cells or cell populations thereof as an active ingredient.
  • the cell therapy or pharmaceutical composition may be for the prevention or treatment of cancer or infectious diseases.
  • Another aspect provides the use of the natural killer cells or populations of cells for use in the manufacture of a medicament.
  • Another aspect provides a method of treating a disease comprising administering the natural killer cells or cell populations thereof to an individual.
  • disease may mean one pathological condition, particularly cancer, infectious disease, inflammatory disease, metabolic disease, autoimmune disorder, degenerative disease, apoptosis-related disease, and graft rejection.
  • treatment refers to, or includes alleviation, inhibition or prevention of one or more symptoms of a disease, disorder or condition
  • active ingredient or “pharmaceutically effective amount” refers to a disease, disorder or condition , Or any amount of the composition used in the practice of the invention provided herein sufficient to alleviate, inhibit or prevent progression of one or more symptoms thereof.
  • administering As used herein, the terms “administering,” “introducing” and “implanting” are used interchangeably and into a subject by a method or route that results in at least partial localization of a composition according to one embodiment to a desired site. It may mean the arrangement of the composition according to one embodiment. It can be administered by any suitable route that delivers at least a portion of the cells or cellular components of the composition according to one embodiment to a desired location in a living subject.
  • the survival period of cells after administration to an individual may be several hours if short, for example from 24 hours to several days to several years if long.
  • the administration may be administered in combination with an additional anticancer agent.
  • additional anticancer agents may include alkylating agents, antimetabolites, spindle inhibitors plant alkaloids, cell impaired/antitumor antibiotics, topoisomerase inhibitors, antibodies, photosensitizers and kinase inhibitors. have.
  • the anticancer agent may include compounds used in targeting therapy and conventional chemotherapy.
  • examples of the antibodies are alemtuzumab, apolyzumab, aselizumab, atlizumab, vafinuzumab, bevacizumab, vibatuzumab mertansine, cantuzumab mertansine, sedelizumab, sertolizumab pegol , Cidfucituzumab, Cidtuzumab, Daclizumab, Eculizumab, Epalizumab, Epratuzumab, Erlizumab, Felbizumab, Pontolizumab, Gemtuzumab Ozogamycin, Inotuzumab Ozogamycin , Ipilimumab, Labetuzumab, Lintuzumab, Matuzumab, Mepolizumab, Motabizumab, Motobizumab, Natalizumab, Nimotuzumab, Nolovizumab, Numabizumab, Ocrelizuma
  • isolated cell for example, “isolated natural killer cell”, etc. refers to a cell substantially separated from a tissue from which the cell originates, such as peripheral blood.
  • Neoplasms can be malignant or benign, cancers can be primary or metastatic;
  • the neoplasm or cancer can be early or late.
  • Non-limiting examples of neoplasms or cancers that can be treated include lung cancer, laryngeal cancer, stomach cancer, colon cancer, rectal cancer, liver cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, cervical cancer, prostate cancer, kidney cancer, skin cancer, bone cancer.
  • Muscle cancer fat cancer, fibroblast cancer, hematologic cancer, leukemia, lymphoma, multiple myeloma, and at least one selected from the group consisting of glioma.
  • the glioma may be astrocytic tumours, oligodendroglial tumours, mixed gliomas, or Ependymal tumours. More specifically, the astrocytoma may be a glioblastoma, an anticancer drug-resistant glioblastoma, or a recurrent glioblastoma.
  • the natural killer cells are cancers (eg, glioma, gliomas) secreting or expressing MICA (MHC class I polypeptide-related sequence A) or PDFG-DD (Platelet-derived growth factor-DD). Blastoma, etc.) may be more effective.
  • MICA MHC class I polypeptide-related sequence A
  • PDFG-DD Plateelet-derived growth factor-DD
  • the natural killer cells according to an embodiment may inhibit self-tolerance. Accordingly, the natural killer cells according to an embodiment may be those capable of inhibiting immune activity, vascular brain barrier penetration, cell migration promotion, or self tolerance.
  • the method of administering the pharmaceutical composition is not particularly limited, but may be administered parenterally or orally, such as intravenous, subcutaneous, intraperitoneal, inhalation or topical application, depending on the intended method.
  • the dosage range varies depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
  • the daily dosage refers to an amount of a therapeutic substance according to an aspect sufficient to treat a disease state alleviated by being administered to an individual in need of treatment.
  • the effective amount of a therapeutic substance depends on the particular compound, the disease state and its severity, the individual in need of treatment, which can be determined routinely by a person skilled in the art.
  • the dosage of the composition according to one aspect to the human body may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition, and degree of disease of the patient. Based on an adult patient weighing 70 kg, for example, about 1,000-10,000 cells/time, 1,000-100,000 cells/time, 1,000-1000,000 cells/time, 1,000-10,000,000, 1,000-100,000,000 cells/time, 1,000 to 1,000,000,000 cells/time, 1,000 to 10,000,000,000 cells/time, or 1,000 to 100,000,000,000 cells/time, may be dividedly administered once to several times a day at regular time intervals, or several times at regular time intervals.
  • the term'individual' refers to a subject in need of treatment of a disease, and more specifically refers to mammals such as human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle. .
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment may include a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and/or additive for example, sterile water, physiological saline, conventional buffers (phosphoric acid, citric acid, other organic acids, etc.), stabilizers, salts, antioxidants (ascorbic acid, etc.), surfactants, suspending agents, isotonic agents, or preservatives, etc. can do.
  • organic substances such as biopolymers, inorganic substances such as hydroxyapatite, specifically collagen matrix, polylactic acid polymer or copolymer, polyethylene glycol polymer or copolymer, and chemical derivatives thereof, etc. I can.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment is prepared in a dosage form suitable for injection, the immune cells, immune cells, or substances that increase the activity thereof are dissolved in or dissolved in a pharmaceutically acceptable carrier. It may be frozen.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment is a suspension agent, a solubility aid, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a surfactant, a diluent, an excipient, a pH adjuster, a painless agent, Buffering agents, reducing agents, antioxidants, and the like may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment is formulated in a unit dosage form by using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present invention belongs. It may be made of or may be prepared by placing it in a multi-volume container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of a powder, granule, tablet, or capsule.
  • the relative MFI of specific receptors which are significant for cancer including glioblastoma, is increased, and thus effective anticancer immunotherapy is possible.
  • 1 is a Dot plot showing the phenotypic analysis of natural killer cells by culture period (a: CD3CD56; b: CD3CD19, CD14SSC; c: CD3SSC, CD4CD8).
  • FIG. 2 is a graph showing the results of culture evaluation of 7 people in FIG. 1 and a graph showing the survival rate and the multiplication rate of natural killer cells (a: the ratio of CD3+CD56+, CD3-CD56+, CD3+CD56- cells; b: CD19+ cells Ratio; c: the ratio of CD14+ cells; d: the ratio of CD4+, CD8+ cells; e: the ratio of natural killer cells proliferation; f: the survival rate of cells)
  • 3 is a result of showing changes in the expression of immunoreceptors of natural killer cells and PBMCs before culturing according to an embodiment in a dot plot.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in the expression of immunoreceptors of natural killer cells and PBMC before culture according to an embodiment (a: NKG2D+, DNAM1+, CD69+, NKp30+; b: NKp44+, NKp46+, CD2+, CD16+; c : KIR2DL1+, KIR2DL3+, KIRDL1+, NKG2A+.)
  • FIG. 5 is a graph showing the expression of anticancer substances (granzyme B, perforin, and interferon-gamma) of natural killer cells and PBMCs before culturing according to an embodiment using a flow cytometer.
  • anticancer substances granzyme B, perforin, and interferon-gamma
  • FIG. 6 is a graph showing the expression of CD107a degranulation of natural killer cells and PBMCs before culturing according to an embodiment.
  • FIG. 7 is a dot plot showing the expression of the ligand for the glioblastoma cell line of natural killer cells according to an embodiment (a: T98G cells; b: U-87MG cells; c: A172 cells; d: U-373MG) cell).
  • FIG. 9 is a result showing the cell killing ability of natural killer cells according to E:T ratio for glioblastoma cell lines A172, U-87MG, U-373MG, and T98G according to an embodiment.
  • FIG. 10 is a graph confirming the cytotoxicity of these natural killer cells to cancer cell lines after blocking specific receptors in natural killer cells according to an embodiment.
  • FIG. 11 is a graph illustrating a decrease in tumor weight after administration of natural killer cells according to one embodiment to an ovarian cancer animal model (arrows indicate drug administration timing).
  • FIG. 12 is a graph showing a decrease in tumor weight after administration of natural killer cells according to an embodiment to a gastric cancer animal model (arrows indicate drug administration timing).
  • FIG. 13 is a graph illustrating a decrease in tumor weight after administration of natural killer cells according to an embodiment to a glioblastoma animal model.
  • Natural killer cells were cultured as follows to produce natural killer cells expressing a significant immune receptor against glioblastoma.
  • Blood was prepared by collecting blood from a vein of a normal person. At this time, a blood collection tube containing heparin was used as the blood collection container. Blood collected from the patient was carefully transferred to two tubes (#352070, BD or equivalent) containing Ficoll (#17-1440-02, GE Healthcare or equivalent), each of 30 ml each. The tube containing blood was centrifuged at 2,500 rpm for 10 minutes in a break off state, and then the plasma portion of the upper layer was transferred to a new tube. The transferred plasma was inactivated for 30 minutes in a heat block, and then centrifuged for 5 minutes at 4,000 rpm. The supernatant was transferred from the centrifuged tube to a new tube, labeled as plasma, and stored at 2-8°C.
  • RBC lysis buffer #158904, Qiagen
  • the cell suspension was centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, and Ca/Mg free DPBS was added to the tube from which the supernatant was removed, followed by centrifugation at 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and the remaining precipitated cells were suspended with 1 ml of Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) medium.
  • Example 1.1 All the cell suspensions obtained in Example 1.1 were centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed. Cells were suspended with Cryostor CS10 or ALyS505NK-EX+Albumin+DMSO mixed solution stored at 2 to 8°C, so that the number of cells was 1 to 100 ⁇ 10 6 cells/ml. Dispense 1 ml of the suspended cells into 2 ml cryogenic vial, and use CRF (controlled rate freezers) for 10-15 minutes at 0°C, 5-10 minutes at -12°C, and -42°C.
  • CRF controlled rate freezers
  • the second stage was frozen at 5°C/m in the range of ⁇ -90°C, and then frozen at 5°C/m in the range of -90 ⁇ -120°C after the second freezing stage.
  • the frozen cells were transferred to an LN 2 tank and stored (below -130°C).
  • the heat block was set at 37°C, and then a culture solution containing 10% plasma was added to a T flask.
  • the volume of the culture medium can be variously adjusted, for example, 4 ml, 6 ml, 8 ml, or 10 ml.
  • the frozen vial which had been frozen in Example 2.2, was placed in a heat block to melt the frozen PBMC. When the frozen PBMC was half dissolved, it was transferred to a T flask containing the culture solution. Then, it was placed in a 37°C 5% CO 2 incubator and incubated for one day.
  • a solution of 0.01 ml fibronectin (#FC-010, Millipore), and 0.121 ml gamma globulin (#020A1004, green cross) was added to a 15 ml tube, and then 9.859 ml of Ca/Mg free DPBS was added.
  • the prepared coating solution was put into a T75 flask (#156499, Nunc) using a pipette and reacted at 2-8° C. for 16 hours or longer. The remaining coating solution before cell culture was washed with Ca/Mg free DPBS and then removed.
  • Example 1 Take the cell suspension prepared in Example 1 and put it into the coated flask prepared in Example 2.1, and 1.5 ml of autologous plasma, IL-18 (#B003-2, R&D) 0.075 ml, PDGF-DD (1159-SB, R&D ) 0.075 ml, anti-NKp46 (#MAB1850, R&D) 0.03 ml, and Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 13.4625 ml were added and incubated in a CO 2 incubator for 2-3 days. Thereafter, 1.5 ml of autologous plasma and 13.5 ml of Alys505NK-EX were added to the flask, followed by incubation in a CO 2 incubator for 1-2 days.
  • a solution of 0.025 ml fibronectin (#FC-010, Millipore), and 0.303 ml gamma globulin (#020A1004, green cross) was added to a 50 ml tube, and then 24.647 ml of Ca/Mg free DPBS was added.
  • the prepared coating solution was put into a T175 flask (#159910, Nunc) using a pipette and reacted at 2-8° C. for 16 hours or longer. The remaining coating solution before cell culture was washed with Ca/Mg free DPBS and then removed.
  • Example 2.2 After the primary culture of Example 2.2, the T75 flask in which cells were cultured was taken out from the incubator, the cells were collected, and then transferred to a T175 flask (#159910, Nunc). Plasma 3 ml, anti-NKp46 (#MAB1850, R&D) 0.06 ml, and Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 27 ml were added to a T175 flask and incubated in a CO 2 incubator for 1-2 days.
  • Plasma 3 ml, anti-NKp46 (#MAB1850, R&D) 0.06 ml, and Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 27 ml were added to a T175 flask and incubated in a CO 2 incubator for 1-2 days.
  • the remaining plasma and anti-NKp46 solution 0.12 ml, IL-18 0.03 ml, PDGF-DD (1159-SB, R&D) 0.03 ml, Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 53.85 ml, and a new substance enhancing function
  • one or two or more of PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD (1159-SB, R&D), and PDGF-AB 50 ng/ml were added, and then 1 in a CO 2 incubator again. Incubated for ⁇ 2 days.
  • the cells and plasma of the T175 flask cultured in Example 2.4 were placed in a culture solution containing 2000 IU/ml IL-2, and cultured in a CO 2 incubator. After 2-3 days, a new equal volume of the culture solution (a culture solution containing 2000 IU/ml of IL-2) was mixed with the cell suspension in which the cells are being cultured, and then cultured in a CO 2 incubator.
  • IL-2 is added to the immune cell culture solution to which IL-2 is not added in a predetermined amount. May be.
  • the characteristics of the cells were analyzed on days 0, 6, 10, and 14 during the culture period from PBMC to natural killer cells before culture.
  • CD3, CD56, CD19, CD16, CD14, CD4, CD8 were identified as major markers to analyze the cell characteristics.
  • the proportion of CD3-CD56+ NK cells increased during the culture period, and NK cells accounted for 85.5% (4.92) as the main component on the 14th day after culture.
  • CD3+CD56- T cells decreased to 10% on the 14th day of culture, and CD3+CD56+ NKT cells were present at a constant rate of 5%.
  • Monocytes and B cells were not found to be 0%.
  • the proportion of CD8+ cells was higher than that of CD4+ cells among T cells after culture.
  • Figure 2 is a graph showing the results of the culture evaluation of 7 people in the figure of Figure 1. (a,b,c,d)
  • both of the 14th day culture maintained a high survival rate of 90% or more, and showed 1259 times the proliferation ability of natural killer cells.
  • Relative MFI refers to the value of the expression intensity of positive cells compared to the isotype, and is defined by Equation 1 below.
  • Relative MFI receptor MFI/isotype MFI
  • Relative MFI is a different concept from the expression ratio, which measures the expression ratio of positive cells compared to isotypes.Even if the expression ratio is the same, the strength of each receptor function is different according to the MFI value. It can be understood that the function has been increased.
  • a new natural killer cell with enhanced function was prepared by treatment with a new substance as in 2.5.
  • the characteristics of the new natural killer cell were defined by measuring the MFI values of specific receptors.
  • the cells before and after the culture were collected to prepare 1 ⁇ 10 7 cells, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed, and the FACS buffer (PBS containing 2% FBS) was used. It was diluted in 2 ml.
  • FACS buffer PBS containing 2% FBS
  • an antibody containing a fluorescent substance was put into a 5 ml FACS tube for each condition, and 100 ⁇ l of the diluted cell solution was dispensed and stained for 30 minutes in refrigerator. After staining, 500 ⁇ l of PBS was added, centrifuged at 3200 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed.
  • CD3 CD158b CD56 10 CD3 NKB1(KIR3DL1) CD56 11 CD3 NKG2A(CD159a) CD56 12 CD3 CD158a (KIR2DL1) CD56 13 CD3 CD2 CD56
  • FIG. 3 is a Dot Plot result comparing the expression of immunoreceptors of PBMCs before culture with natural killer cells according to one embodiment.
  • FIG. 4 is a change in expression of immunoreceptors of natural killer cells and PBMCs before culture according to an embodiment. Is the result of graphing.
  • the natural killer cells As shown in Figures 3 and 4, the natural killer cells according to one embodiment have increased expression of NKG2D, DMAN-1, CD69, CD2, NKp30, NKG2A, and NKp44, NKp46, CD16, KIR2DL1, KIR2DL2/3, And it was found that the expression of KIR3DL1 was almost unchanged compared to PMBC before culture.
  • the mRNA expression pattern of KIR2DS4 in activated natural killer cells cultured by the culture method according to the above example was compared with PBMC before culture.
  • Granzyme B and Perforin were analyzed as follows.
  • a Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD, 554714) was used, and a Fixation/Permeabilization solution was added and reacted in refrigeration for 20 minutes, and Perm/Wash buffer was added and centrifuged twice for 3 minutes at 6000 rpm. .
  • the cell pellet obtained by removing the supernatant was diluted in 100 ⁇ l of Perm/Wash buffer, respectively, and diluted with anti-IgG1k-PE (ebioscience, 12-4714-42), anti-Perforin-PE (ebioscience, 12-9994-42), and anti -GranzymeB-PE (ebioscience, 12-8899-41) antibody was added, and intracellular staining was performed for 30 minutes in refrigerator. After staining, the cell solution was centrifuged by adding 500 ⁇ l of PBS, fixed with 1% PFA, and analyzed using a flow cytometer.
  • Interferon gamma was diluted using a culture solution containing 10% FBS and 1% penicini in RPMI medium containing no phenol red after obtaining a cell pellet in the same manner as described above, and 500 ⁇ l each was dispensed into a 24 well plate. Then, 0.5 ⁇ l of PMA/Ionomycin (Biolegend) and 0.5 ⁇ l of GolgiPlugTM (BD bioscience, USA) were treated and reacted in a 37°C 5% CO 2 incubator for 4 hours. After 4 hours of reaction, the cells were harvested, centrifuged at 6000 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed.
  • PMA/Ionomycin Biolegend
  • GolgiPlugTM GolgiPlugTM
  • Cell pellets were anti-IgG1k-FITC (ebioscience, 11-4714-42), anti-IgG1k-APC (ebioscience, 17-4714-42) and anti-CD3-FITC (ebioscience, 11-0038-42), anti- Surface antigen staining was performed using an antibody of CD56-APC (ebioscience, 17-0567-42), and intracellular staining was performed. Intracellular staining was performed with antibodies of anti-IgG1k-PE (ebioscience, 12-4714-42) and anti-INF- ⁇ -PE (ebioscience, 12-8899-41), fixed with 1% PFA, and then flow cytometry. Analyzed using.
  • 5 is a result of showing the expression of anticancer substances (Granzyme B, Perforin, and interferon-gamma) of natural killer cells and PBMCs before culturing according to an embodiment in a dot plot and graph using a flow cytometer.
  • anticancer substances Gramzyme B, Perforin, and interferon-gamma
  • the natural killer cells expressed at least 80% or more of the anticancer substances granzyme B, perforin, and interferon gamma. This is at least 4 times higher than that of PBMC before culture.
  • CD107a degranulation between natural killer cells and PBMCs before culture K562, a lymphocyte extracted from the bone marrow of a chronic myelogenous leukemia patient, was reacted as a target cell, and the expression level of CD107a was determined. Analyzed.
  • K562 cells 1 ⁇ 10 5 cells per condition were prepared, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed to obtain a pellet.
  • the cell pellet was diluted by adding 250 ⁇ l of a culture solution to which 10% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (gibco, 15140122) were added to RPMI medium without phenol red.
  • Natural killer cells were prepared with 5x10 5 cells per condition in order to prepare activated natural killer cells and target cells in a ratio of 5:1. After the prepared cells were centrifuged, the supernatant was removed, and 250 ⁇ l of the same culture medium in which the target cells were diluted was added and suspended.
  • activated natural killer cells and target cells prepared in a 24-well plate were put in a ratio of 5:1, and then anti-IgG1k-PE (ebioscience) and anti-CD107a-PE (ebioscience) antibodies were added for 4 hours.
  • the reaction in an incubator at 37° C. 5% CO 2 conditions.
  • the cells are harvested, and they contain fluorescent substances of anti-IgG1k-FITC (ebioscience), anti-IgG1k-APC (ebioscience), anti-CD3-FITC (ebioscience), and anti-CD56-APC (ebioscience). Only natural killer cells were identified by staining with antibody. After staining, 500 ⁇ l of PBS was added to wash the cells by centrifugation, fixed with 1% PFA, and analyzed using a flow cytometer, and the results are shown in FIG. 6.
  • FIG. 6 is a graph showing the expression of CD107a degranulation of natural killer cells and PBMCs before cultivation according to an exemplary embodiment.
  • the natural killer cells according to one embodiment expressed CD107a by at least 60%, which was at least three times higher than that of PBMC before culture.
  • the interaction between the ligand of the glioblastoma cell line and the natural killer cell according to one embodiment was analyzed.
  • the glioblastoma cell lines U-87MG and T98G cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), and the other glioblastoma cell lines U-373MG and A172 cells were It was cultured in RPMI medium to which 10% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) were added.
  • glioblastoma cell lines T98G, U-87MG, A172, and U-373MG the ligands of natural killer cells HLA-ABC, HLA-E, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, PVR, ICAM-1 , ICAM-2, ICAM-3, LFA-3, B7-H6, PVR, Necin-2 antibodies were stained to analyze the degree of expression of cells.
  • 0.25% trypsin-EDTA (1X) and phenol red were added and reacted in a 37°C 5% CO 2 incubator for 3 to 5 minutes, and then the cells were suspended.
  • the cells were harvested by inactivating the enzyme with a culture solution to which% FBS was added.
  • 8.5 ⁇ 10 6 cells were prepared by measuring the number of cells, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and then the supernatant was removed and diluted in 1.7 ml with FACS buffer (PBS containing 2% FBS).
  • FIG. 7 is a result of showing the expression of the ligand for the glioblastoma cell line of natural killer cells in a dot plot according to an embodiment.
  • T98G is a glioblastoma cell having Temozolomiede resistance
  • U-373MG and U-87MG are glioblastoma cell lines of grade 3 and 4, respectively.
  • Target cancer cells K562, U-87MG, U-373MG, A172, T98G were collected, centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, and the supernatant was removed. Then, it was diluted with DPBS and washed, and the cell pellets after washing were suspended in a culture solution containing 10% FBS in RPMI medium containing no phenol red. Cells of 1 ⁇ 10 5 were prepared per condition, and stained by standing in an incubator for 10 minutes in 5% CO 2 conditions at a concentration of 5 ⁇ M of CFSE (Life technologies). After washing twice with DPBS, it was diluted with a culture medium containing 10% FBS in RPMI medium not containing phenol red.
  • For activated natural killer cells prepare cells according to E:T ratio (1:1, 1.25:1, 2.5:1, 5:1, 10:1, 20:1) with target cells, and target cells in a 24-well plate. And mixed with it. The reaction was performed for 4 hours, and 7AAD (7-Aminoactinomycin D) was treated 20 minutes before the reaction was completed. After the reaction was over, the cells were collected in a 5 ml FACS tube, and the killing ability of the cells was analyzed through a flow cytometer, and the results are shown in FIGS. 8 and 9.
  • FIG. 9 is a result showing the cell killing ability of natural killer cells according to E:T ratio for glioblastoma cell lines A172, U-87MG, U-373MG, and T98G according to an embodiment.
  • novel natural killer cells not only express immune receptors significant against glioblastoma, but also express immune receptors capable of overcoming self-tolerance, such as hematological cancer and glioblastoma. There is an effect that can be usefully used in the treatment of.
  • FIG. 10 is a graph confirming the cytotoxicity of these natural killer cells to cancer cell lines after blocking specific receptors in natural killer cells according to an embodiment.
  • NKp30, NKp44, and/or NKG2D in natural killer cells is a major factor of cytotoxicity, and according to one embodiment having a specific MFI value of NKp30, NKp44, and/or NKG2D. It means that natural killer cells are cells with remarkably increased anticancer activity.
  • the anticancer activity of natural killer cells according to one embodiment was confirmed in vivo.
  • a xenograft animal model was prepared by subcutaneously administering 1 ⁇ 10 7 cells/mouse of OVCAR3, an ovarian cancer cell line, to NOD-SCID mice. Thereafter, the test group was set as shown in Table 7 below.
  • Cisplatin Cisplatin 1.5 mg/kg was administered.
  • Natural killer cell administration group G3 NK Live group and G4 NK Freeze group was the difference between fresh and frozen cells.
  • G4 NK Freeze group thawed frozen NK cells and administered 1 ⁇ 10 7 cells per head, and G3 NK Live group was cultured. The cells were collected and 1 ⁇ 10 7 cells were administered per head.
  • the administration group was administered twice a week for a total of 6 administrations. During the test period, the survival rate, tumor size, and symptoms of the mice were observed. Monitoring was performed for 78 days. After 78 days, the weight of the tumor extracted by sacrificing the animal was measured, and the results are shown in Table 8 and FIG. 11 below.
  • FIG. 11 is a graph illustrating a decrease in tumor weight after administration of natural killer cells according to one embodiment to an ovarian cancer animal model (arrows indicate drug administration timing).
  • the weight of the tumor was decreased by about 50% to 60% compared to the positive control group.
  • tumor growth was accelerated after 50 days and the tumor volume increased rapidly, whereas in the group administered with natural killer cells according to one embodiment, tumor growth was significantly slowed during the monitoring period.
  • the anticancer activity of natural killer cells according to one embodiment was confirmed in vivo.
  • a xenograft animal model was prepared by administering 1 ⁇ 10 6 cells/mouse of NCI-N87, a gastric cancer cell line, to NOD-SCID mice. Six days after tumor transplantation, the test groups in Table 9 were set.
  • Positive control group G2 HER2 group was administered Herceptin 1mg/kg intravenously twice a week for a total of 6 times.
  • the G3 NK Live group and the G4 NK Freeze group were administered with natural killer cells alone, and 1 ⁇ 10 7 cells/mouse were administered intravenously 6 times a week.
  • G3 NK Live group was administered cells obtained by recovering cells during culture, and G4 NK Freeze group was administered 1 ⁇ 10 7 cells per head by thawing frozen NK cells.
  • the G5 NK L+Herceptin group and the G6 F+Herceptin group which are the combined NK cells and Herceptin group, were administered with Herceptin 1 mg/kg to the same cells as the NK cells alone group, and were administered intravenously twice a week for a total of 6 times.
  • mice During the test period, the survival rate, tumor size and symptoms of the mice were observed. Monitoring was performed for 52 days. After 52 days, the weight of the tumor extracted by sacrificing the animal was measured, and the results are shown in Table 10 and FIG. 12 below.
  • FIG. 12 is a graph illustrating a decrease in tumor weight after administration of natural killer cells according to an embodiment to a gastric cancer animal model.
  • the weight of the tumor was reduced by about 60% to 70% compared to the positive control group.
  • tumor growth accelerated after 28 days and the tumor volume increased rapidly, whereas in the group administered with natural killer cells according to one embodiment, tumor growth was significantly slowed during the monitoring period.
  • the tumor weight decreased by about 17% to 20% in the group administered with Herceptin and natural killer cells alone compared to the group administered with natural killer cells alone.
  • ADCC Antibody-dependent cell cytotoxicity
  • the anticancer activity of natural killer cells according to one embodiment was confirmed in vivo.
  • the test group G2 NK cell group 1 ⁇ 10 6 cells of natural killer cells were administered intravenously per animal, and a total of 6 doses were administered twice a week.
  • IVIS bio-imaging equipment perkinelmer, USA
  • the tumor volume was measured.
  • luciferin promega
  • Anesthetized individuals are sequentially measured using IVIS equipment to measure the optical image (Bioluminescence; BLI) of the tumor, and the measured optical image value of the region of interest (ROI) is determined by the commissioned research institute, Woowoo Bio (Gyeonggi-do). , Korea) in accordance with the internal standards of Threshold. The results are shown in Table 12 and FIG. 13 below.
  • FIG. 13 is a graph illustrating a decrease in tumor weight after administration of natural killer cells according to an embodiment to a gastric cancer animal model.
  • the change in tumor volume until 16 days after administration was 4.28.E+08 p/sec/cm2/sr at 1.09.E+10 p/sec/cm2 /sr was observed to increase continuously during the experiment.
  • the increase was insignificantly from 3.19.E+08 p/sec/cm2/sr to 1.78.E+09 p/sec/cm2/sr during the experiment period.
  • the tumor weight was about 5 times more than the negative control group. This means that the natural killer cells according to one embodiment have a high inhibitory effect on tumor growth in glioblastoma.

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Abstract

항암 활성이 증가된 자연살해세포 및 그의 면역 치료 용도에 관한 것으로, 일 양상에 따른 자연살해세포에 의하면, 교모세포종을 포함한 암에 대해 유의한 특정 수용체의 상대적 MFI가 증가되어 있어, 효과적인 항암 면역치료가 가능한 효과가 있다.

Description

항암 활성이 증가된 자연살해세포 및 그의 면역 치료 용도
항암 활성이 증가된 자연살해세포 및 그의 면역 치료 용도에 관한 것이다.
면역세포치료법에 이용되고 있는 자연살해세포(natural killer cell, "NK 세포"라고도 칭함)는 형태학적으로 세포질에 큰 과립을 가지는 세포로, 혈액 내 림프구의 약 5∼15%를 차지한다. 현재까지 밝혀진 자연살해세포의 주요기능으로는 종양세포를 살해할 수 있는 능력, 바이러스 감염세포에 대한 세포독성, 및 세균과 진균을 살해하는 능력 등이 있다. 따라서 자연살해세포는 항종양, 면역 및 미생물에 대한 보호면역에 대하여 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
자연살해세포는 면역수용체(immune receptor)로서 표면수용체를 가지고 있다. 자연살해세포에는 B세포의 BCR, T세포의 T cell receptor (TCR) 같은 dominant 수용체가 존재하지 않기 때문에 다른 면역세포와 구별되는 활성화 기전이 존재할 것으로 예측된다. 또한, 자연살해세포는 비특이적으로 암을 살상할 수 있는 능력이 있는 세포로 알려져 있다. 이러한 자연살해세포의 살해능력은 림포카인 활성 살생세포(lymphokine activated killer cell, LAK) 및 종양침윤림프구(tumor infiltration lymphocytes, TIL)와 함께 고형암 치료에 활용되거나, 또는 공여자 임파구 주입(donor lymphocyte infusion)을 통한 면역치료법(Tilden. A. B. et al., J. Immunol., 136)을 수행함으로써, 골수이식이나 장기 이식시 발생하는 거부반응을 방지하기 위한 새로운 세포치료 법으로 응용될 수 있다.
한편 신경교종 (glioma)은 원발성 뇌종양 (primary brain tumor)의 60%를 차지하는 종양으로 현재까지도 방사선 치료 외엔 특별한 치료법이 없는 악성 종양이다. 또한, 악성으로 분류되는 교모세포종 (glioblastoma)은 다른 암과 비교하여 방사선 및 항암제 치료에 대한 저항성이 매우 높아 일단 진단되면 기대 생존기간이 1년에 불과하다. 악성 교모세포종은 전체 뇌종양의 12~15%를 차지하고, 뇌에 발생하는 단일 종양 중 가장 많이 발생하는 종양이다.
교모세포종을 포함한 암 환자를 위한 기존 치료 옵션에도 불구하고, 효능이 증진되고, 자기 관용을 극복할 수 있는 치료법이 연구되고 있으며, 이를 위해 특정 면역 수용체의 활성을 증가시킨 자연살해세포의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 특정 범위의 상대적 MFI 값의 수용체 발현 특성을 갖는 항암 활성이 증가된 자연살해세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 집단을 유효성분으로 함유하는 세포 치료제 또는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 집단의 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 특정 범위의 상대적 MFI 값의 수용체 발현 특성을 갖는 항암 활성이 증가된 자연살해세포를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "자연살해세포(Natural Killer cells)" 또는 "NK 세포"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 상기 "자연살해세포" 또는 "NK 세포"는 임의의 조직 공급원(source)으로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 자연살해세포를 포함하고, 성숙한 자연살해세포뿐 아니라, 자연살해 전구세포를 포함할 수 있다. 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해 세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는, 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 표면 수용체를 포함한다. 자연살해세포는 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체, 태반 또는 탯줄 유래 줄기세포, 유도만능줄기세포, 또는 이로부터 분화된 세포로부터 생성될 수 있다.
상기 자연살해세포는 예를 들면 말초혈액 단핵세포로부터 유래된 것일 수 있다. 용어 "말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)"는 포유동물, 바람직하게는 사람의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포로서, 주로 B 세포, T 세포, 자연살해 세포와 같은 면역세포, 및 호염구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구 등을 포함한다. 상기 PBMC는 생체에서 채취한 말초혈액으로부터 통상의 제조방법에 의해 준비될 수 있다. 바람직하게 상기 PBMC는 피콜(Ficoll)을 이용한 비중 원심분리법을 이용하여 말초혈액으로부터 분리할 수 있다.
또한, 혈액으로부터 백혈구를 분리하는 백혈구성분채집술(leukapheresis)의 산물로부터 적혈구를 제거하는 방법으로 자연살해세포를 수득할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 본 명세서의 자연살해세포는 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 잇다;
(a) PBMC의 배양 0일째 대비 NKG2D의 상대적 MFI의 값이 1.2 배 내지 12 배, 2 배 내지 12 배, 4 배 내지 12 배, 2 배 내지 10 배, 2 배 내지 8 배, 4 배 내지 8 배, 3 배 내지 6 배 또는 3.5 배 내지 4.5 배 증가한 것;
(b) PBMC의 배양 0일째 대비 NKp30의 상대적 MFI의 값이 1.5 배 내지 15 배, 1.5 배 내지 12 배, 2 배 내지 12 배, 4 배 내지 10 배, 2 배 내지 10 배, 4 배 내지 8 배, 3 배 내지 6 배, 또는 4 배 내지 6 배 증가한 것;
(c) PBMC의 배양 0일째 대비 배양 14일째에 NKp44의 상대적 MFI의 값이 12 배 내지 22 배, 12 배 내지 20 배, 14 배 내지 22 배, 16 배 내지 22 배, 16 배 내지 20 배, 12 배 내지 18 배, 14 배 내지 18 배, 또는 16 배 내지 18 배 증가한 것;
(d) PBMC의 배양 0일째 대비 ITGA1의 상대적 MFI의 값이 1.8 배 내지 25 배, 2 배 내지 25 배, 4 배 내지 22 배, 4 배 내지 18 배, 6 배 내지 16 배, 6 배 내지 10 배, 또는 6 배 내지 8.5 배 증가한 것; 및
(e) PBMC의 배양 0일째 대비 ITGA2의 상대적 MFI의 값이 1.4 배 내지 6 배, 1.8 배 내지 6 배, 1.8 배 내지 5 배, 2 배 내지 5.5 배, 2 배 내지 5 배, 2 배 내지 4 배, 또는 2.5 배 내지 3.5 배 증가한 것이다.
상기 상대적 MFI의 값은 PBMC의 배양 0일째 대비 배양 14일째의 상대적 MFI의 값일 수 있다.
본 명세서에서 용어 상대적 MFI(relative Mean Fluorescence Intensity)”는 이소타입 대비 양성 세포의 발현 강도의 값을 의미하고, 하기 수학식 1로 정의된다.
[수학식 1]
상대적 MFI = 수용체 MFI/이소타입 MFI
상대적 MFI는 이소타입 대비 양성 세포의 발현 비율을 측정하는 발현 비율과는 구분된 개념으로, 같은 %의 발현 비율을 가지더라도 MFI 값에 따라 각 수용체 기능의 강도는 다르며, 상대적 MFI 값이 높아야 실제적인 기능이 증가된 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서는 PBMC로부터 자연살해세포 배양 시 신규물질, 예를 들면, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, 또는 PDGF-AB로 처리된 신규한 자연살해세포를 제공한다. 상기 신규한 자연살해세포는 공지의 다른 자연살해세포와는 제조 방법이 상이하고, 항암 활성 및 자연살해세포의 활성화와 관련된 인자인 NKG2D, NKp30, NKp44, ITGA1, 및 ITGA2의 상대적 MFI 값이 PBMC 배양 전 대비 적게는 1.2배에서 많게는 30배까지 증가된 세포이다.
다른 구체예에 있어서, 본 명세서의 자연살해세포는,
8 내지 140, 10 내지 140, 8 내지 40, 15 내지 30, 80 내지 140, 100 내지 140 또는 110 내지 130의 MFI 값의 CD16; 20 내지 160, 30 내지 160, 30 내지 150, 20 내지 60, 25 내지 50, 또는 120 내지 160, 135 내지 150의 MFI 값의 LFA-1; 2 내지 30, 5 내지 30, 5 내지 25, 6 내지 15, 12 내지 30, 또는 14 내지 25의 MFI 값의 NKG2D; 2 내지 25, 5 내지 25, 5 내지 20, 2 내지 14, 7 내지 20¸또는 10 내지 18의 MFI 값의 NKp30; 10 내지 40, 12 내지 30, 12 내지 25, 14 내지 22, 12 내지 18, 또는 18 내지 22의 MFI 값의 NKp44; 2 내지 30, 4 내지 25, 4 내지 22, 2 내지 16, 4 내지 12, 10 내지 25, 또는 14 내지 25의 MFI 값의 ITGA1; 1 내지 10, 1.5 내지 10, 2 내지 10, 1.6 내지 4, 2 내지 8, 4 내지 8, 또는 4 내지 6의 MFI 값의 ITGA2; 20 내지 180의 MFI 값의 CD2; 0.1 내지 1.5의 MFI 값의 CD27; 1 내지 10의 MFI 값의 CD69; 2 내지 12의 MFI 값의 CD226; 2 내지 8의 MFI 값의 NKp46; 0.1 내지 4의 MFI 값의 CD160; 0.1 내지 4의 MFI 값의 KIR2DL1; 0.1 내지 5의 MFI 값의 KR2DL3; 0.1 내지 4의 MFI 값의 KIR3DL1; 0.4 내지 16의 MFI 값의 NKG2A; 0.2 내지 12의 MFI 값의 CD161; 0.3 내지 3의 MFI 값의 CCR3; 0.5 내지 4의 MFI 값의 CCR5; 0.8 내지 6의 MFI 값의 CCR6; 0.4 내지 5의 MFI 값의 CXCR3; 0.4 내지 5의 MFI 값의 CXCR1; 0.1 내지 3의 MFI 값의 CXCR2; 및 1 내지 16의 MFI 값의 ITGB7로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 추가적으로 갖는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 자연살해세포는 하기 (f)의 특성을 추가적으로 갖는 것일 수 있다;
(f) PBMC의 배양 0일째 대비 배양 14일째에 KIR2DS4 유전자의 발현량이 적어도 10배 이상, 상세하게는, 10 배 내지 60배, 10 배 내지 50배, 20 배 내지 40배, 20 배 내지 45배, 또는 25 배 내지 40배이다.
다른 구체예에 있어서, 자연살해세포는 하기 (g) 또는 (h)의 특성을 추가적으로 갖는 것일 수 있다;
(g) PBMC의 배양 0일째 대비 배양 14일째에 CD16의 상대적 MFI(mean fluorescence intensity) 값이 0.02 배 내지 0.85 배, 0.04 배 내지 0.8 배, 0.08 배 내지 0.8 배, 0.1 배 내지 0.6 배, 0.1 배 내지 0.4 배 또는 0.12 배 내지 0.3 배 감소한 것; 또는
(h) PBMC의 배양 0일째 대비 배양 14일째에 LFA-1의 상대적 MFI의 값이 0.08 배 내지 0.8 배, 0.1 배 내지 0.8 배, 0.1 배 내지 0.7 배, 0.1 배 내지 0.6 배, 0.2 배 내지 0.6 배, 0.4 배 내지 0.6 배, 또는 0.2 배 내지 0.5 배 감소한 것이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 자연살해세포는 NKG2D, NKp30, NKp44, CD16, LFA-1, ITGA1, ITGA2, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIRDS4, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CCR3, CCR5, CCR6, PSA-NCAM, 네스틴(Nestin), 타이로신 히드록실레이즈(Tyrosine Hydroxylase), CD147, CD127, CD15, CD31, CD146, CD49c, CD107a, NKG2A, CD45, CD140a, 및 CD11b로부터 선택된 어느 하나 수용체를 발현하는 것일 수 있다.
자연살해세포의 활성화 수용체는 주로 표적세포가 비정상 상태에 있을 때 발현이 증가하는 리간드들을 인식하여 세포 독성작용을 일으켜 표적세포를 제거한다.
상기 PSA-NCAM는 신경세포의 분화능 마커로서 배아 발달 중 신경계에서의 뉴런의 발달 시냅스 형성과 관련된 표시 인자일 수 있고, Tyrosine Hydroxylase는 신경전달물질 호르몬 합성에 필요한 효소인 것일 수 있으며, CD147은 배아의 뇌 발달에 관련된 인자로서 뇌 내피에서 인테그린-매개 부착(integrin-mediated adhesion) 기능을 갖는 것일 수 있다. 상기 S100B는 혈관 뇌장벽 투과성을 향상시키는 것일 수 있다. 상기 CD15는 주화성(Chemotaxis), 식세포작용(Phagocytosis) 및/또는 항균력(Bactericidal activity)과 관련된 기능을 하는 것일 수 있고, CD31은 CD38과 결합하여 상처를 치료하거나 또는 혈관신생 및 세포 이동에 관여하는 것일 수 있다. 또한, 상기 CD146은 활성 T세포, 중간엽줄기세포 등에서 발현하는 세포 표면 마커로서 백혈구의 혈관외유출(extravasation)에 관여하는 것일 수 있고, CD49c는 신경의 이동에 관여하거나 세포-세포, 세포-기질 사이의 부착 역할을 하는 것일 수 있다.
NKG2D는 DNA 손상, 암 발생, 바이러스 감염 시 발현이 증가되는 세포내 분자인 UL16 binding proteins(ULBPs)와 MIC A/B, RAE1, H60, MULT1을 감지하여 세포독성 활성을 제공한다.
NKp30은 BAG6 및 NCR3LG1, B7-H6을 포함한 세포 외 리간드의 결합에 의해 활성화되는 수용체이고, 이들 리간드와 결합하여 세포 독성을 자극한다.
NKp44은 세포 표면의 당단백질 및 프로테오글리칸, 세포 외부로 노출될 수 있는 핵 단백질(nuclear proteins), 세포 외 공간에 방출되거나 세포 외 소포(vesicle)로 이동하는 분자를 리간드로 인식한다. 최근에는 NKp44는 세포외 매트릭스(ECM)-유래 당단백질 또는 성장 인자(growth factors)와 같은 가용성 혈장 단백질(예를 들면, PDGF-DD)을 인식하는 것으로 보고된 바 있다(Cell. 2018 January 25; 172(3): 534-548.e19., Front Immunol. 2019; 10: 719.).
KIR2DS4는 암, 임신장애 및 HIV에 대한 내성을 포함하는 다수의 질병과 관련 되어 있고, 정확한 리간드는 정의 되지 않았으나 HLA-C*05:01에 의해 제시된 펩타이드(예를 들면, 재조합 펩타이드:HLA-C 컴플렉스)를 인지하여 NK 세포를 활성화시키고, 활성화된 NK세포는 TNF-알파와 IFN-감마를 생성하고 탈과립한다. 따라서, KIR2DS4는 높은 펩타이드 특이적 활성화 수용체일 수 있고, 면역 방어에 충분한 역할을 수행한다 (J Immunol May 1, 2019, 202 (1 Supplement) 177.24;).
ITGA1은 라미닌 및 콜라겐에 대한 수용체이며, 세포-세포 접착에 관여한다. 콜라겐의 일부 서열을 인식하여 EGF-자극된 세포 성장의 음성 조절에 관여한다.
ITGA2은 라미닌, 콜라겐, 콜라겐 C-프로펩타이드, 피브로넥틴, E-카드헤린 에 대한 수용체이며, 혈소판 및 다른 세포와의 접착, 콜라겐 조절, 합성된 세포외 기질의 구성을 담당한다.
상기 자연살해세포는 세포 집단의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99%, 또는 50 내지 100%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 60 내지 80%, 또는 60 내지 70%가 NKG2D, NKp30, NKp44, CD16, LFA-1, ITGA1, ITGA2, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIRDS4, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CCR3, CCR5, CCR6, PSA-NCAM, 네스틴(Nestin), 타이로신 히드록실레이즈(Tyrosine Hydroxylase), CD147, CD127, CD15, CD31, CD146, CD49c, CD107a, NKG2A, CD45, CD140a, 또는 CD11b를 발현하는 것일 수 있다.
또한, 자연살해세포는 세포 집단의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99%, 또는 50 내지 100%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 60 내지 80%, 또는 60 내지 70%가 KIR2DS1+, KIR2DS2+, KIR2DS3+, KIR2DS4+, CXCR1+, CXCR2+, CXCR3+, CCR3+, CCR5+, CCR6+, PSA-NCAM+, 네스틴+(Nestin+), CD127+, CD15+, CD31+, CD146+, CD49c+, CD107a+, NKG2A+, CD45+, CD140a+, 및 CD11b+로부터 선택된 어느 하나의 특성을 나타내는 것일 수 있다.
또한, 자연살해세포는 세포 집단의 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99%, 또는 50 내지 100%, 50 내지 90%, 60 내지 90%, 또는 60 내지 80%가 CD87-, CD10-, 및 CD80-로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 특성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "양성 또는 +"은 세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 NKp44 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "NKp44+"이다. 본 명세서에서 용어, "음성 또는 -"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD87-에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 " CD87-"이다.
일 구체예에 있어서, 상기 자연살해세포는 모세포, 예를 들면, 조혈 세포, 또는 자연살해전구세포에 비해, 세포 독성, 또는 자연살해세포의 본연의 면역조절능이 활성화된, 또는 상기한 바와 같은 면역 수용체의 발현이 증가된 세포를 의미할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 자연살해세포는 CD3-CD56+이다. 구체적 실시양태에서, 활성화된 자연살해세포는 CD3-CD56+CD16+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 활성화된 자연살해세포는 추가로 CD94+CD117+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 활성화된 자연살해세포는 추가로 CD161-이다. 다른 구체적 실시양태에서, 활성화된 자연살해세포는 추가로 NKG2D+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 활성화된 자연살해세포는 추가로 NKp46+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 활성화된 자연살해세포는 추가로 CD226+이다. 특정 실시양태에서, 상기 활성화된 자연살해세포의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 초과는 CD56+ 및 CD16-이다. 다른 실시양태에서, 상기 활성화된 자연살해세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 82%, 84%, 86%, 88% 또는 90%는 CD3- 및 CD56+이다. 다른 실시양태에서, 상기 활성화된 자연살해세포의 적어도 50%, 52%, 54%, 56%, 58% 또는 60%는 NKG2D+이다. 다른 실시양태에서, 상기 세포의 30%, 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 또는 3%는 NKB1+이다. 특정 다른 실시양태에서, 상기 활성화된 자연살해세포의 30%, 20%, 10%, 8%, 6%, 4% 또는 2% 미만은 NKAT2+이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD3-, CD56+ 활성화된 자연살해세포의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%는 NKp46+이다. 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD3-, CD56+ 활성화된 자연살해세포의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%는 CD117+이다. 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD3-, CD56+ 활성화된 자연살해세포의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%는 CD94+이다. 다른 보다 구체적인 실시양태에서, CD3-, CD56+ 활성화된 자연살해세포의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50%는 CD161-이다. 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD3-, CD56+ 활성화된 자연살해세포의 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 95%는 CD226+이다. 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD3-, CD56+ 활성화된 자연살해세포의 적어도 20%, 25%, 30%, 35% 또는 40%는 CD7+이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 CD3-, CD56+ 활성화된 자연살해세포의 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60%는 CD5+이다.
일 구체예에 있어서, 활성화된 자연살해세포 또는 활성화된 자연살해세포가 풍부한(enriched) 집단은 1종 이상의 기능적으로 관련된 마커, 예를 들어 CD94, CD161, DNAM-1, 2B4, NKp46, KIR, 및 활성화 수용체의 NKG2 패밀리(예를 들어, NKG2D)를 검출함으로써 평가될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 활성화된 자연살해세포는 상기 기재된 조혈 세포로부터 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화된 자연살해세포는 증식된 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 세포 및/또는 조혈 전구 세포로부터 수득될 수 있다. 구체적 실시양태에서, 조혈 세포는 영양 세포의 사용 없이 제1 배지에서 지속적으로 증식 및 분화된다. 이후에, 세포는 영양 세포의 존재 하에 제2 배지에서 배양된다. 이러한 분리(단리), 증식 및 분화는 중앙 시설에서 수행될 수 있고, 이는 사용 지점, 예를 들어 병원 등에서의 증식 및 분화를 위한 증식된 조혈 세포를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 활성화된 자연살해세포의 생성은 조혈 세포의 집단을 증식시키는 단계를 포함한다. 세포 증식 동안, 조혈 세포 집단 내 복수개의 조혈 세포는 자연살해세포로 분화한다.
본 명세서에서 용어 "자연살해 전구세포", 또는 "NK 전구 세포", 또는 그의 세포 집단은 예를 들어, 1종 이상의 표현형 마커(marker), 예를 들어 CD56, CD16, 및 KIR의 발현 수준으로 나타낸 바와 같은, 아직 성숙한 자연살해세포로 발전하지 않은 자연살해세포 계통의 세포를 포함하는 세포 또는 그의 집단을 의미할 수 있다. 일 실시양태에서, 자연살해 전구 세포 집단은 낮은 CD16 및 높은 CD56을 갖는 세포를 포함한다. 예를 들어, 자연살해 전구 세포 집단은 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 CD3-CD56+ 세포를 포함한다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 이하의 CD3-CD56+ 세포를 포함한다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단은 0%-5%, 5%-10%, 10%-15%, 15%-20%, 20%-25%, 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 또는 45%-50% 사이의 CD3-CD56+ 세포를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포는 추가로 CD117+이다. 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%가 CD117+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 이상이 CD117+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, 또는 95%-99% 사이가 CD117+이다.
다른 구체예에 있어서, 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포는 추가로 CD161+이다. 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75%가 CD161+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75% 이상이 CD161+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 40%-45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 또는 70%-75% 사이가 CD161+이다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포는 추가로 NKp46+이다. 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 이상이 NKp46+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 55%가 NKp46+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 55% 이하가 NKp46+이다. 다른 구체적 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 50%-55%, 55%-60%, 60%-65%, 65%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90% 사이 또는 그 이상이 NKp46+이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 상기 자연살해 전구 세포 집단에서 상기 CD3-CD56+ 세포의 25%-30%, 30%-35%, 35%-40%, 40%-45%, 45%-50%, 또는 50%-55% 사이가 NKp46+이다.
또한, 예를 들면, 상기 자연살해 전구 세포 집단은 CD52+, CD16+, CD244+ CD94+, 또는 CD94+에 대해서도 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 상기 자연살해세포는 상기 언급된 수용체를 발현하도록 또는 이들의 발현 또는 활성이 증가되도록 배양되거나 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 명세서에서 상기 배양은 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체로부터 상기에서 언급한 바와 같은 수용체의 발현 또는 활성이 증가되도록 배양된 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한 증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 모세포 또는 야생형 세포 또는 배양 전 세포(예를 들면, PBMC) 세포에 비해 더 높은 수준의 단백질, 또는 효소의 활성을 의미한다.
다른 구체예에 있어서, 상기 자연살해세포는 유전적으로 변형 또는 조작된 것일 수 있다. 상기 자연살해세포는 유전적으로 변형되어, 표적 특이성 및/또는 호밍 특이성이 향상된 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 자연살해세포는 퍼포린, 그랜자임 또는 인터페론을 분비하는 것일 수 있다.
상기 그랜자임은 그랜자임 A(granzyme A), 그랜자임 B, 그랜자임 H, 그랜자임 K 및 그랜자임 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 인터페론은 1형 인터페론(예를 들면, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-κ, 인터페론-ω), 2형 인터페론(예를 들면, 인터페론-γ), 또는 3형 인터페론일 수 있다.
다른 양상은 상기 면역세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 세포치료제 또는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 세포치료제 또는 약학적 조성물은 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용인 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 의약의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 있어서 용어 "질환"은 하나의 병리적 상태, 특히 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역성 장애, 퇴행성 질환, 세포사멸 관련 질환 및 이식편 거부를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
상기 투여는 추가적인 항암제와 병용 투여되는 것일 수 있다. 추가적인 항암제의 예시는 알킬화제 (alkylating agent), 안티메타볼라이트, 방추체 저해제 식물 알칼로이드, 세포 장애성/항종양 항생 물질, 토포이소머라아제 저해약, 항체, 광 증감제 및 키나아제 저해약이 포함될 수 있다. 상기 항암제의 예시는 타겟팅 요법과 종래의 화학 요법에 사용되는 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체의 예시는 알렘투주맙, 아폴리주맙, 아셀리주맙, 아틀리주맙, 바피뉴주맙, 베바시주맙, 비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 시드푸시투주맙, 시드투주맙, 다클리주맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 에를리주맙, 펠비주맙, 폰톨리주맙, 겜투주맙 오조가마이신, 이노투주맙 오조가마이신, 이필리무맙, 라베투주맙, 린투주맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 모토비주맙, 나탈리주맙, 니모투주맙, 놀로비주맙, 누마비주맙, 오크렐리주맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파스콜리주맙, 펙푸시투주맙, 펙투주맙, 퍼투주맙, 펙셀리주맙, 랄리비주맙, 라니비주맙, 레슬리비주맙, 레슬리주맙, 레사이비주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 시브로투주맙, 시플리주맙, 손투주맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 테피바주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 트라스투주맙, 투코투주맙 셀몰류킨, 투쿠시투주맙, 우마비주맙, 우르톡사주맙 및 비실리주맙이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "분리된 세포", 예컨대, "분리된 자연살해세포" 등은 세포가 기원하는 조직, 예컨대, 말초혈로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다.
본 발명의 조성물은 신생물로부터 유래한 종양 또는 암을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 신생물은 악성 또는 양성일 수 있으며, 암은 원발성 또는 전이성일 수 있고; 신생물 또는 암은 초기 또는 말기일 수 있다. 치료될 수 있는 신생물 또는 암의 비-제한적 예에는 폐암, 후두암, 위암, 대장암, 직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암, 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암, 혈액암, 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 및 신경 교종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
또한 상기 신경 교종은 성상세포종(Astrocytic tumours), 핍지교세포종(Oligodendroglial tumours), 혼합신경교종(mixed gliomas) 또는 상의세포종(Ependymal tumours)일 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 성상세포종은 교모세포종, 항암제 내성 교모세포종 또는 재발성 교모세포종인 것일 수 있다.
특정 이론에 제한됨이 없이 교모세포종에서 분비되는 PDGF-DD와 자연살해세포의 NKp44의 상호작용이 보고된 바 있다. 또한, 특정 이론에 제한됨이 없이, 교모세포종에서 발현하는 MICA와 자연살해세포의 NKG2D의 상호작용이 보고된 바 있다. 또한, 특정 이론에 제한됨이 없이, KIR2DS2 양성 자연살해세포와 교모세포종의 관련성이 보고된 바 있다.
따라서, 일 구체예에 따른 자연살해세포는 MICA(MHC class I polypeptide-related sequence A) 또는 PDFG-DD(Platelet-derived growth factor-DD)를 분비 또는 발현하는 암(예를 들면, 신경교종, 교모세포종 등)에 더욱 효과적일 수 있다.
추가적으로, 일 구체예에 따른 자연살해세포는 자기 관용을 억제할 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 자연살해세포는 면역 활성, 혈관 뇌장벽 투과, 세포 이동 촉진 또는 자기 관용을 억제할 수 있는 것일 수 있다.
일 구체예에 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 일 양상에 따른 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회 또는 1,000~100,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
'개체'란 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 면역세포, 면역세포, 또는 그의 활성을 증가시키는 물질은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
일 양상에 따른 자연살해세포에 의하면, 교모세포종을 포함한 암에 대해 유의한 특정 수용체의 상대적 MFI가 증가되어 있어, 효과적인 항암 면역치료가 가능한 효과가 있다.
도 1 은 자연살해세포의 배양기간별 표현형분석을 나타낸 Dot plot이다(a: CD3CD56; b:CD3CD19, CD14SSC; c:CD3SSC, CD4CD8).
도 2 는 도 1에서 7명의 배양 평가 결과에 대한 그래프 및 생존율과 자연살해세포의 증식배수를 나타낸 그래프이다(a:CD3+CD56+, CD3-CD56+, CD3+CD56- 세포의 비율; b: CD19+세포의 비율; c:CD14+ 세포의 비율; d:CD4+, CD8+ 세포의 비율; e: 자연살해세포의 비율 증식; f: 세포의 생존율)
도 3는 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 면역수용체의 발현의 변화를 Dot plot으로 나타낸 결과이다.
도 4는 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 면역수용체의 발현의 변화를 그래프로 나타낸 결과이다(a: NKG2D+, DNAM1+, CD69+, NKp30+; b:NKp44+, NKp46+, CD2+, CD16+; c: KIR2DL1+, KIR2DL3+, KIRDL1+, NKG2A+.)
도 5은 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 항암물질(그랜자임 B, 퍼포린, 및 인터페론-감마)의 발현을 유세포 분석기를 이용하여 Dot plot과 그래프로 나타낸 결과이다.
도 6는 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 CD107a의 탈과립화의 발현을 Dot plot과 그래프로 나타낸 결과이다.
도 7는 일 구체예에 따른 자연살해세포의 교모세포종 세포주에 대한 리간드의 발현을 Dot plot으로 나타낸 결과이다(a: T98G 세포; b: U-87MG 세포; c: A172 세포; d: U-373MG 세포).
도 8은 일 구체예에 따른 자연살해세포의 혈액암 세포주 K562에 대한 E:T 비율별 세포 살상능을 나타내는 결과이다.
도 9은 일 구체예에 따른 자연살해세포의 교모세포종 세포주 A172, U-87MG, U-373MG, T98G에 대한 E:T 비율별 세포 살상능을 나타내는 결과이다.
도 10은 일 구체예에 따른 자연살해세포에서 특정 수용체를 차단한 후, 이들 자연살해세포의 암 세포주에 대한 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 11은 일 구체예에 따른 자연살해세포를 난소암 동물 모델에 투여한 후 종양 무게의 감소를 관찰한 그래프이다(화살표는 약물 투여 시기를 나타냄).
도 12는 일 구체예에 따른 자연살해세포를 위암 동물 모델에 투여한 후 종양 무게의 감소를 관찰한 그래프이다(화살표는 약물 투여 시기를 나타냄).
도 13은 일 구체예에 따른 자연살해세포를 교모세포종 동물 모델에 투여한 후 종양 무게의 감소를 관찰한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예. 면역 수용체의 활성이 증가된 자연살해세포의 제조
교모세포종에 대한 유의한 면역 수용체를 발현하는 자연살해세포를 제조하기 위해 다음과 같이 자연살해세포를 배양하였다.
1. 말초혈액단핵세포의 제조
1.1. 혈액으로부터 말초혈액 단핵세포(PMBC) 및 혈장 분리
혈액은 정상인의 정맥으로부터 채혈하여 준비하였다. 이 때 채혈용기는 헤파린이 포함된 채혈 튜브를 사용하였다. 환자로부터 채취한 혈액을 피콜(Ficoll)(#17-1440-02, GE Healthcare 또는 동등이상)이 담긴 튜브(#352070, BD 또는 동등이상) 2개에 각각 30㎖씩 조심스럽게 옮겨 담았다. 혈액이 담긴 튜브를 2,500rpm로 10분간 break off 상태에서 원심 분리한 후, 상층의 혈장 부분을 새로운 튜브에 옮겨 담았다. 옮겨 담은 혈장을 히트 블록(Heat block)에서 30분 동안 불활성화시킨 후, 4,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리된 튜브에서 상층액을 새로운 튜브로 옮겨, 혈장이라 표기한 후 2~8℃에 보관하였다.
상기 혈액과 피콜을 넣고 원심분리한 튜브에서 혈장을 채취하고 남은 하층에 있는 미황색 층을 새로운 튜브에 적혈구 층과 혼입되지 않도록 주의하여 옮겨 담은 후, Ca/Mg 유리(free) DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) (#14190, Gibco)를 넣어 주었다. 그 다음 1,500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 상층액을 제거하고 남은 침전 세포를 RBC 용해 버퍼(Red Blood Cell Lysis buffer)(#158904, Qiagen) 5㎖로 부유시켰다. 이 후, 세포 현탁액을 1,500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였고, 상층액이 제거된 튜브에 Ca/Mg 유리 DPBS를 넣어 다시 1,500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거되고 남은 침전 세포를 Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 배지 1㎖로 부유시켰다.
상기 Alys505NK-EX로 부유시킨 세포 현탁액에서 소량을 취하여 Ca/Mg 유리 DPBS로 상기 양의 100배로 희석한 다음, 희석액 소량을 취하여 동일 볼륨의 트리판 블루와 섞은 후 혈구계산판(hemocytometer)에 올려놓고 세포수 및 생존율을 측정하였다.
1.2. PBMC의 동결
상기 실시예 1.1에서 얻어지는 모든 세포 현탁액을 1,500rpm, 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 2 내지 8℃에서 보관해 둔 Cryostor CS10 또는 ALyS505NK-EX+Albumin+DMSO 혼합액으로 세포를 부유하여, 세포수가 1~100 Х106 cells/㎖이 되도록 만들었다. 부유한 세포를 2㎖ 동결 바이얼(cryogenic vial)에 1㎖ 씩 분주 한 다음 CRF(controlled rate freezers)를 사용하여 0℃에서 10~15분, -12℃에서 5~10분, 및 -42℃에서 0.5~1분 동안의 조건으로 제1단계 동결시키고, 제1 동결단계 후 -25℃에서 1~3분, 및 -15℃에서 1~3분의 조건으로 동결시키며, 제2 동결단계 후 -42℃에서 20~40분, 및 -120℃에서 20~50분의 조건으로 동결시키거나, 또는 4~-40℃ 범위에서 3℃/m으로 제1 단계 동결하고, 제1 동결단계 후 -40~-90℃ 범위에서 5℃/m의 조건으로 제2 단계 동결시키며, 제2 동결단계 후 -90~-120℃ 범위에서 5℃/m의 조건으로 동결시켰다. 동결한 세포를 LN2 탱크로 옮겨 보관하였다 (-130℃ 이하).
1.3. 동결된 PBMC의 해동
히트 블록을 37℃가 되도록 셋팅한 다음, T 플라스크에 10% 혈장(plasma)이 첨가된 배양액을 넣었다. 세포 농도에 따라 배양액 볼륨은 예를 들어 4㎖, 6㎖, 8㎖, 또는 10㎖ 등으로 다양하게 조절해줄 수 있다. 상기 실시예 2.2에서 동결해 놓았던 동결 바이얼을 히트 블록에 넣어 동결된 PBMC를 녹였다. 동결된 PBMC가 반 정도 녹았을 때, 배양액이 담긴 T 플라스크로 옮겼다. 이어서, 37℃5% CO2 인큐베이터에 넣고 하루 동안 배양하였다. 배양된 PBMC를 튜브에 모은 후 Ca/Mg 유리(free) DPBS를 첨가하고 1,500rpm, 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 원심분리에 의해 분리된 세포를 소량의 배양액으로 부유시킨 후 세포수를 측정하였다. 동결보관된 세포의 해동 후 생존율은 표 1에 기재한다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 동결보관된 후 해동된 PMBC는 93% 이상이 생존하였는바, 높은 생존율이 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
해동 후 PBMC 생존율
Origin 생존율 (%)
Donor 1 98.07
Donor 2 93
Donor 3 97.4
2. 자연살해세포의 배양2.1. 피브로넥틴, 및 감마글로불린으로 코팅된 배양 플라스크 준비 (1차)
15㎖ 튜브에 0.01㎖ 피브로넥틴(#FC-010, Millipore), 및 0.121㎖ 감마글로불린(#020A1004, 녹십자) 용액을 넣은 다음, Ca/Mg 유리 DPBS을 9.859㎖을 첨가하였다. 제조된 코팅액을 피펫을 이용하여 T75 플라스크(#156499, Nunc)에 넣어 주고 16시간 이상 2~8℃에서 반응시켰다. 세포 배양 전 잔여 코팅액을 Ca/Mg 유리 DPBS로 세척한 후 제거하였다.
2.2. 자연살해세포의 1차 배양
실시예 1에서 준비된 세포 현탁액을 취하여 상기 실시예 2.1에서 제조된 코팅 플라스크에 넣고, 자가혈장 1.5㎖과, IL-18 (#B003-2, R&D) 0.075㎖, PDGF-DD (1159-SB, R&D) 0.075㎖, 항-NKp46(#MAB1850, R&D) 0.03㎖, Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 13.4625㎖을 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 2~3일간 배양하였다. 이 후 플라스크에 자가혈장 1.5㎖ 및 Alys505NK-EX 13.5㎖을 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 1~2일간 배양하였다.
2.3. 피브로넥틴, 및 감마글로불린으로 코팅된 배양 플라스크 준비(2차)
50㎖ 튜브에 0.025㎖ 피브로넥틴(#FC-010, Millipore), 및 0.303㎖ 감마글로불린(#020A1004, 녹십자) 용액을 넣은 다음, Ca/Mg 유리 DPBS을 24.647㎖을 첨가하였다. 제조된 코팅액을 피펫을 이용하여 T175 플라스크(#159910, Nunc)에 넣어 주고 16시간 이상 2~8℃에서 반응시켰다. 세포 배양 전 잔여 코팅액을 Ca/Mg 유리 DPBS로 세척한 후 제거하였다.
2.4. 자연살해세포의 2차 배양 및 기능강화 신규 물질의 처리
실시예 2.2의 1차 배양 후 배양기에서 세포가 배양되고 있는 T75 플라스크를 꺼내서 세포를 모은 후 T175 플라스크(#159910, Nunc)에 옮겼다. 혈장 3㎖, 항-NKp46(#MAB1850, R&D) 0.06㎖ 및 Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 27㎖을 T175 플라스크에 첨가하여 CO2 인큐베이터에서 1~2일간 배양하였다. 이 후, 남아 있는 혈장과 항-NKp46 용액 0.12㎖, IL-18 0.03㎖, PDGF-DD (1159-SB, R&D) 0.03㎖, Alys505NK-EX (#01410P10, CSTI) 53.85㎖, 및 기능강화 신규 물질로서, PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD (1159-SB, R&D), 및 PDGF-AB 50 ng/㎖ 중 한 개 또는 두 개 이상을 첨가한 다음 다시 CO2 인큐베이터에서 1~2일간 배양하였다.
2.5. 자연살해세포의 3차 배양
상기 실시예 2.4에서 배양된 T175 플라스크의 세포 및 혈장을 2000 IU/㎖ IL-2을 함유하는 배양액에 넣고, CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 2~3일 후 새로운 동일 볼륨의 배양액 (2000 IU/㎖의 IL-2를 함유하는 배양액)을 세포가 배양되고 있는 세포 현탁액과 섞어준 후 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
상기 배양 (1차배양, 2차배양 및 3차배양 모두)에서, IL-2가 첨가된 배양액 대신, IL-2가 첨가되지 않은 면역 세포 배양액에 IL-2를 소정의 양으로 각각 첨가하여 사용할 수도 있다.
3. 배양 기간별 자연살해세포의 표현형 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 활성화 자연살해세포에 대하여 배양전 PBMC에서 자연살해세포로 분화 및 확장하기까지의 배양기간 동안 0, 6, 10, 14일차에 세포의 특성을 분석하였다.
세포의 특성을 분석하기 위해 주요 마커로서 CD3, CD56, CD19, CD16, CD14, CD4, CD8으로 확인하였다. 배양 기간 중 CD3-CD56+ NK세포의 비율이 증가하고, 배양 후의 14일차에는 NK세포가 주성분으로 85.5%(4.92)를 차지하였다. 그 외 CD3+CD56- T세포는 배양 14일 차에 10%으로 감소하였고, CD3+CD56+ NKT 세포는 5%로 일정 비율을 유지하며 존재했다. Monocyte와 B세포는 0%으로 발견되지 않았다. 또한, 배양 후의 T세포 중 CD4+ 세포보다 CD8+ 세포의 비율이 높았다.
도 1은 배양 전 대비 고순도의 자연살해세포로 분포하고 있음을 나타낸다.
도 2는 도 1의 그림에 대한 7명의 배양 평가를 그래프로 나타낸 결과이다. (a,b,c,d)
도 2의 e, f 의 결과를 통해 14일차의 배양 모두 90%이상의 높은 생존율을 유지하고, 1259배의 자연살해세포의 증식능을 보였다.
4. 배양 전(D0)과 배양 후(D14)에서 NK세포 수용체 발현의 상대적 MFI값
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 활성화 자연살해세포의 상대적 MFI 값을 측정하였다.
상대적 MFI는 이소타입 대비 양성 세포의 발현 강도의 값을 의미하고, 하기 수학식 1로 정의된다.
[수학식 1]
상대적 MFI = 수용체 MFI/이소타입 MFI
상대적 MFI는 이소타입 대비 양성 세포의 발현 비율을 측정하는 발현비율과는 구분된 개념으로, 같은%의 발현 비율을 가지더라도 MFI 값에 따라 각 수용체 기능의 강도는 다르며, 상대적 MFI 값이 높아야 실제적인 기능이 증가된 것으로 이해될 수 있다.
본 실시예에서는 상기 2.5.에서와 같이 신규 물질을 처리한 기능 강화된 신규의 자연살해세포를 제조하였고, 이의 특정 수용체들의 MFI 값을 측정하여 신규의 자연살해세포의 특성을 정의하였다.
상대적 MFI를 측정하기 위해, 먼저 배양 전과 후의 세포를 수거하여 1x107의 세포를 준비하고, 1500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하여, FACS 버퍼(2% FBS가 포함된 PBS)로 2 ㎖에 희석하였다. 하기 표 2에 기재된 물질에 대하여 형광물질을 포함하는 항체를 조건 별로 5 ㎖ FACS 튜브에 넣고, 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 분주하여 냉장에 30분 동안 염색하였다. 염색한 후, PBS를 500 ㎕씩 넣고, 3200 rpm으로 3분간 원심분리 한 다음 상층액을 제거하였다. 염색된 세포의 펠렛을 1% PFA 500 ㎕씩 넣어 고정한 후, 유세포분석기 (Bechman Coulter, USA)를 이용하여 세포의 면역수용체의 발현을 분석하였고, 상기 수학식 1에 따라 상대적 MFI 값을 측정하였다.
상대적 MFI 값의 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
자연살해세포 수용체의 상대적 MFI(N=4~5)
자연살해세포 수용체 D0 D14
범위 평균 SD 범위 평균 SD
Activating Receptor CD2 67-181 117.3 51.4 27-165 115.8 60.7
CD16 156-451 266.7 132.1 19-124 53.5 48.8
CD27 1-1.3 1.2 0.1 0.3-0.9 0.7 0.3
CD69 0.7-1.5 1.2 0.4 1.4-6.8 4.2 2.3
NKG2D 1.9-5 3.4 1.3 8.4-20.3 13.7 6.1
CD226(DNAM-1) 1.7-7.9 4.1 2.7 4-7.6 5.3 1.5
NKp30 1.1-3.6 2.5 1.1 7.2-14.3 9.6 4.0
NKp44 1-1.2 1.1 0.1 16.3-20.3 18.7 2.1
NKp46 2.4-4.7 3.6 1.2 3.2-5.5 4.2 1.2
LFA-1 263-291 275.7 14.3 34-143 109.3 50.1
CD160 2.2-5.5 3.2 1.6 0.3-1.2 0.9 0.4
Inhibitory Receptor CD158a (KIR2DL1) 1.1-2.1 1.4 0.4 0.3-1.0 0.8 0.4
CD158b (KIR2DL3) 1.1-21.8 6.3 10.3 0.3-1.6 1.1 0.5
NKB1 (KIR3DL1) 1.0-1.3 1.1 0.2 0.3-1.1 0.8 0.3
NKG2A (CD159a) 1.2-1.6 1.4 0.2 0.6-8.0 5.7 3.5
CD161 (NKRP1A) 3.9-6.2 4.8 1.0 0.5-5.0 3.2 2.0
ChemokineReceptor CCR3 0.8-1.6 1.2 0.3 0.6-0.8 0.7 0.1
CCR5 1.5-2.1 1.8 0.2 1.0-1.8 1.7 0.5
CCR6 0.7-1.1 8.0 5.9 1.5-2.3 1.9 0.4
CXCR3 0.7-1.1 1.0 0.2 0.8-1.4 1.1 0.3
CXCR1 1.7-4.9 2.6 1.3 0.9-1.6- 1.2 0.2
CXCR2 1.3-7.0 3.5 2.1 0.3-0.9 0.5 0.3
IntegrinReceptor ITGA1 (CD49a) 0.9-2.8 1.4 0.9 6.5-21.1 13.4 6.2
ITGA2 (CD49b) 1.1-1.5 1.4 0.2 2.7-5.6 4.1 1.3
ITGB7 (CD49d) 2.0-8.5 5.3 2.9 2.7-7.7 5.8 2.5
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 항암 활성 및 자연살해세포의 활성화와 관련된 인자인 NKG2D, NKp30, NKp44, ITGA1, 및 ITGA2의 상대적 MFI 값이 적게는 1.5배에서 많게는 25배까지 증가된 것을 알 수 있었다. 이상의 결과는, 일 구체예에 따른 신규 물질 처리된 자연살해세포가 특정 MFI 값을 갖는 신규한 자연살해세포이며, 항암 활성 및 세포 자체의 활성이 증가된 것을 의미한다.
5. 면역수용체의 발현 비교 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 활성화 자연살해세포와 배양 전 PBMC와의 면역수용체의 발현을 비교 분석하였다.
구체적으로 상기 4.와 동일한 방법으로, 하기 표 3에 기재된 물질에 대하여 형광물질을 포함하는 항체를 이용하여 세포의 면역수용체의 발현을 분석하였고, 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
　 FITC PE APC
1 IgG IgG IgG
2 CD3 CD16 CD56
3 CD3 CD69 CD56
4 CD3 NKG2D CD56
5 CD3 NKP30 CD56
6 CD3 NKP44 CD56
7 CD3 NKP46 CD56
8 CD3 CD226(DNAM-1) CD56
9 CD3 CD158b(KIR2DL3) CD56
10 CD3 NKB1(KIR3DL1) CD56
11 CD3 NKG2A(CD159a) CD56
12 CD3 CD158a(KIR2DL1) CD56
13 CD3 CD2 CD56
도 3은 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 면역수용체의 발현을 비교한 Dot Plot 결과이다.도 4는 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 면역수용체의 발현의 변화를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 자연살해세포는 NKG2D, DMAN-1, CD69, CD2, NKp30, NKG2A, 및 NKp44의 발현이 증가되었고, NKp46, CD16, KIR2DL1, KIR2DL2/3, 및 KIR3DL1의 발현은 배양 전 PMBC와 비교하여 발현량이 거의 변화하지 않았음을 알 수 있었다.
6. 활성화 자연살해세포의 뇌조직, 혈관 뇌장벽 투과성, 또는 세포 이동 촉진 관련 인자의 발현 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 활성화 자연살해세포의 뇌조직, 혈관 뇌장벽 투과성, 또는 세포 이동 촉진과 관련된 인자의 발현을 비교 분석하였다.
구체적으로, 하기 표 4에 기재된 물질에 대하여 형광물질을 포함하는 항체를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 4.와 동일한 방법으로 수행하여 세포의 뇌조직, 혈관 뇌장벽 투과성, 또는 세포 이동 촉진 관련 인자의 발현을 분석하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
발현 마커 발현(%)
1 PSA-NCAM 99.8
2 Nestin 99.4
3 S100B 96.9
4 Tyrosine Hydroxylase 89.7
5 CD147 100
6 CD29 100
7 CD49c 99.9
8 CD146 55.3
9 CD15 99.1
10 CD31 57.2
7. 활성화 자연살해세포의 KIR2DS4 의 발현 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 활성화 자연살해세포의 KIR2DS4의 mRNA 발현 양상을 배양 전 PBMC와 비교하였다.
구체적으로, 배양 전 세포와 배양 후 세포에서 트리졸 분리 방법으로 RNA를 추출하였고, 총 RNA 시퀀싱을 수행하여 mRNA의 발현 양상을 확인하였다. 상기 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
ID Gene symbol Fold change(P14 NK cells/P0 PBMC)
9513 KIR2DS4 32.562
상기 표 5에 나타낸 바와 같이 일 구체예에 따른 자연살해세포는 배양 전 PBMC 대비 KIR2DS4의 발현이 약 32배 증가된 것을 알 수 있었다.
실험예 1. 항암 물질의 발현 분석
상기 실시예에 따른 배양방법으로 배양된 활성화 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 항암물질(그랜자임 B, 퍼포린, 인터페론-감마, 및 CD107a)의 발현을 비교 분석하였다.
먼저, 그랜자임 B, 및 퍼포린은 다음과 같이 분석하였다.
각 샘플 당 5x105 의 세포를 준비하고, 1500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하여, 세포 펠렛을 얻었다. 세포 펠렛은 FACS 버퍼로 100 ㎕씩 희석하고, anti-IgG1k-FITC (ebioscience, 11-4714-42), anti-IgG1k-APC (ebioscience, 17-4714-42)와 anti-CD3-FITC (ebioscience, 11-0038-42), anti-CD56-APC (ebioscience, 17-0567-42)의 항체를 넣고, 상온에서 15분간 표면 항원을 염색 하였고, 그 다음 PBS를 500 ㎕씩 넣고, 6000 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 세포 내 염색을 하기 위해서 Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD, 554714)를 이용하였으며, Fixation/Permeabilization solution 을 넣고 20분간 냉장에서 반응시키고, Perm/Wash buffer를 넣어 6000 rpm으로 3분 동안 2회 원심분리 하였다. 상층액을 제거하여 얻은 세포 펠렛은 Perm/Wash buffer 100 ㎕에 각각 희석하여 anti-IgG1k-PE (ebioscience, 12-4714-42), anti-Perforin-PE (ebioscience, 12-9994-42), anti-GranzymeB-PE (ebioscience, 12-8899-41) 의 항체를 넣고, 냉장에서 30분 동안 세포 내 염색을 처리하였다. 염색 한 후, 세포 용액은 PBS 500 ㎕씩을 넣어 원심분리 하고, 1% PFA로 고정한 다음 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
인터페론 감마는 상기와 동일한 방법으로 세포 펠렛을 얻은 후, phenol red가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS와 1% penicini이 첨가된 배양액을 이용하여 희석하였고, 24 well plate에 500 ㎕씩 분주하였다. 그 다음 PMA/Ionomycin (Biolegend) 0.5 ㎕와 GolgiPlugTM (BD bioscience, USA) 0.5 ㎕를 처리하여 4시간 동안 37℃ 5% CO2 incubator에서 반응시켰다. 반응 4시간 후, 세포를 거두어 6000 rpm으로 3분간 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 세포 펠렛은 anti-IgG1k-FITC (ebioscience, 11-4714-42), anti-IgG1k-APC (ebioscience, 17-4714-42)와 anti-CD3-FITC (ebioscience, 11-0038-42), anti-CD56-APC (ebioscience, 17-0567-42)의 항체를 이용하여 표면 항원 염색 하였고, 세포 내 염색을 진행하였다. 세포 내 염색은 anti-IgG1k-PE (ebioscience, 12-4714-42)와 anti-INF-γ-PE(ebioscience, 12-8899-41)의 항체로 염색하여, 1% PFA로 고정한 다음 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다.
상기의 그랜자임 B, 퍼포린 및 인터페론 감마에 대한 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5는 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 항암물질(그랜자임 B, 퍼포린, 및 인터페론-감마)의 발현을 유세포 분석기를 이용하여 Dot plot과 그래프로 나타낸 결과이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 자연살해세포는 항암 물질인 그랜자임 B, 퍼포린 및 인터페론 감마를 적어도 80% 이상 발현하는 것을 알 수 있었다. 이는 배양 전 PBMC에 비해 적어도 4배 이상 증가된 수치이다.
또한, 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC와의 CD107a의 탈과립화의 발현을 비교하기 위하여 만성 골수성 백혈병 환자의 골수에서 추출한 림프아세포인 K562 를 표적세포로 하여 반응시키고, CD107a의 발현 정도를 분석하였다.
구체적으로, 표적세포인 K562 세포는 조건 당 1x105 의 세포를 준비하였고, 1500 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 펠렛을 얻었다. 세포 펠렛은 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS와 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (gibco, 15140122)이 첨가된 배양액을 250 ㎕씩 넣어 희석하였다. 자연살해세포는 활성화 자연살해세포와 표적세포를 5:1의 비율로 준비하기 위하여 조건 당 5x105 의 세포를 준비하였다. 준비된 세포를 원심분리한 다음 상층액을 제거하여 표적세포를 희석하였던 같은 배양액 250 ㎕을 넣어 현탁하였다. 이후에, 24 웰 플레이트에 준비된 활성화 자연살해 세포와 표적세포를 5:1의 비율로 넣어준 뒤, 항-IgG1k-PE (ebioscience)와 항-CD107a-PE (ebioscience)의 항체를 첨가하여 4시간 동안 37℃5% CO2 조건에서 인튜베이터에서 반응시켰다. 4시간 반응이 완료되면 세포를 거두고, 항-IgG1k-FITC (ebioscience), 항-IgG1k-APC (ebioscience)와 항-CD3-FITC (ebioscience), 항-CD56-APC (ebioscience)의 형광물질을 지닌 항체로 염색하여 자연살해세포만을 구분하였다. 염색한 후, PBS 500 ㎕씩을 넣어 원심분리하여 세포를 세척하고, 1% PFA로 고정한 다음 유세포분석기를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 자연살해세포와 배양 전 PBMC의 CD107a의 탈과립화의 발현을 Dot plot과 그래프로 나타낸 결과이다.
도 6에 나타낸 바와 같이 일 구체예에 따른 자연살해세포는 CD107a를 적어도 60%이상 발현하는 것을 알 수 있었고, 이는 배양 전 PBMC에 비해 적어도 3배 이상 증가된 수치이다.
실험예 2. 교모세포종 세포주의 리간드와 활성화 자연살해세포의 상호작용 분석
교모세포종 세포주의 리간드와 일 구체예에 따른 자연살해세포의 상호작용을 분석하였다.
먼저, 교모세포종 세포주인 U-87MG와 T98G 세포는 10% FBS와 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)이 첨가된 DMEM 배지에 배양하였고, 또 다른 교모세포종 세포주인 U-373MG와 A172 세포는 10% FBS와 1% Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)이 첨가된 RPMI 배지에 배양하였다. 이후에, 교모세포종 세포주 T98G와 U-87MG, A172, U-373MG에 대하여 자연살해세포의 리간드인 HLA-ABC, HLA-E, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, PVR, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, LFA-3, B7-H6, PVR, Necin-2의 항체를 염색하여 세포의 발현 정도를 분석하였다.
구체적으로, T75 플라스크로 배양하였던 각 암세포주에 대하여 0.25% 트립신-EDTA(1X), 페놀레드를 첨가하여 3분내지 5분 동안 37℃5% CO2 인큐베이터에 반응시킨 다음 세포를 부유 시키고, 10% FBS가 첨가된 배양액으로 효소를 불활성화하여 세포를 수거하였다. 수거된 세포는 세포수를 측정하여 8.5x106 세포를 준비하고, 1500 rpm으로 5분간 원심분리 한 다음 상층액을 제거하여, FACS 버퍼(2% FBS가 포함된 PBS)로 1.7 ㎖에 희석하였다. 다음에 하기 표 6에 기재된 형광물질을 포함하는 항체를 조건 별로 5 ㎖ FACS 튜브에 넣고, 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 분주하여 상온에 15분간 염색하였다. 염색된 세포는 1% PFA 500 ㎕씩 넣어 고정한 후, 유세포분석기 (Bechman Coulter, USA)를 이용하여 분석하였고, 그 결과는 도 7에 나타내었다.
　 FITC PE APC
1 IgG IgG IgG
2 MICA
3 MICB
4 ULBP-1
5 ULBP-2
6 ULBP-3
7 ULBP-4
8 B7-H6
9 PVR (CD155)
10 Necin-2 (CD112)
11 LFA-3 (CD56)
12 ICAM-1 (CD54)
13 ICAM-2 (CD102)
14 ICAM-3 (CD50)
15 HLA-E
16 HLA-ABC
도 7은 일 구체예에 따른 자연살해세포의 교모세포종 세포주에 대한 리간드의 발현을 Dot plot으로 나타낸 결과이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, T98G는 Temozolomiede 내성을 지닌 교모세포종 세포이며, U-373MG와 U-87MG는 각각 Grade 3,4의 교모세포종 세포주이다. 세포에 대한 Ligand의 분석을 통해 NK세포의 주요 receptor와의 상호작용을 통한 살상능을 기대해 볼 수 있다. 특히, HLA-ABC의 발현이 낮고, NK ligand의 발현이 비교적 높은 T98G (rMFI 24.8)와 U-87MG(rMFI 30.5)에서 좀더 유의한 결과를 예상할 수 있다.
실험예 3. 교모세포종 세포주에 대한 세포 살상능 확인
일 구체예에 따른 자연살해세포의 직접적인 세포 살상능을 확인하기 위해 자연살해세포에 대한 민감성이 높은 혈액암 세포주 K562와 교모세포종 세포주의 A172, U-87MG, U-373MG, T98G 세포를 대상으로 세포의 살상능을 평가하였다.
타겟 암세포(K562, U-87MG, U-373MG, A172, T98G)를 수거하여 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그 다음 DPBS로 희석하여 세척하고, 세척한 후의 세포 펠렛은 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS가 첨가된 배양액으로 부유하였다. 조건 당 1x105 의 세포를 준비하고, CFSE (Life technologies) 5 μM의 농도로 5% CO2 조건에서 인큐베이터에서 10분간 정치하여 염색하였다. DPBS로 두 번 세척한 다음 페놀레드가 포함되지 않은 RPMI 배지에 10% FBS가 첨가된 배양액으로 희석하였다. 활성화 자연살해세포는 타겟 세포와의 E:T ratio (1:1, 1.25:1, 2.5:1, 5:1, 10:1, 20:1) 별 세포를 준비하고, 24 웰 플레이트에 타겟 세포와 함께 분주하여 섞어주었다. 4시간 동안 반응을 시키고, 반응이 끝나기 20분 전에 7AAD(7-Aminoactinomycin D)를 처리하였다. 반응이 끝난 후에는 세포를 5 ㎖ FACS 튜브에 수거하고, 유세포 분석기를 통하여 세포의 살상능을 분석하였고, 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8은 일 구체예에 따른 자연살해세포의 혈액암 세포주 K562에 대한 E:T 비율별 세포 살상능을 나타내는 결과이다.
도 9는 일 구체예에 따른 자연살해세포의 교모세포종 세포주 A172, U-87MG, U-373MG, T98G에 대한 E:T 비율별 세포 살상능을 나타내는 결과이다
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 배양 전 PBMC의 경우, 교모세포종에 대한 항암 활성이 유의적이지 않으나, 일 구체예에 따른 자연살해세포는 혈액암 세포주 및 교모세포종 세포주에서 현저한 항암 활성을 가짐을 확인하였다.
이상의 결과는, 일 구체예에 따른 신규의 자연살해세포는 교모세포종에 대해 유의적인 면역 수용체의 발현할 뿐만 아니라, 자기 관용을 극복할 수 있는 면역 수용체를 발현하는 세포로서, 혈액암과 교모세포종 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
실험예 4. 자연살해세포의 블로킹 어세이
일 구체예에 따른 자연살해세포에서 특정 인자들의 발현이 억제되는 경우 암세포에 대한 세포독성이 억제되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, NKp30에 대한 항체, NKp44에 대한 항체, NKG2D에 대한 항체를 이용하여 이들 수용체의 활성이 차단된 자연살해세포를 제조하였다. 이후에, 상기 실험예 3.과 동일한 방법으로, U-87MG, U-373MG, A172, T98G에 대한 세포 독성을 확인하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 일 구체예에 따른 자연살해세포에서 특정 수용체를 차단한 후, 이들 자연살해세포의 암 세포주에 대한 세포독성을 확인한 그래프이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 자연살해세포에서 NKp30, NKp44, 또는 NKG2D의 활성을 억제한 경우, 세포 독성이 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 특히, NKG2D의 활성을 억제할 경우, 또는 3개의 수용체를 모두 억제할 경우에는 세포 독성 효과가 현저하게 억제됨을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 일 구체예에 따른 자연살해세포에서 NKp30, NKp44, 및/또는 NKG2D의 활성이 세포독성의 주요 인자이며, 특정 MFI 값의 NKp30, NKp44, 및/또는 NKG2D를 갖는 일 구체예에 따른 자연살해세포는 항암 활성이 현저하게 증가된 세포임을 의미한다.
실험예 5. 자연살해세포의 항암 활성 분석
5.1. 난소암 동물 모델에서의 항암 활성 분석
일 구체예에 따른 자연살해세포의 항암 활성을 in vivo에서 확인하였다.
먼저 NOD-SCID 마우스에 난소암 세포주인 OVCAR3를 1x107세포/마리를 피하 투여하여 이종이식 동물 모델을 제조하였다. 이후에, 아래 표 7과 같이 시험군을 설정하였다.
번호 그룹 용량 투여 경로 비고
1 G1 Vehicle 5% 알부민: 덱스트란주 = 1: 1, 100 ㎕ i.v. 음성대조군
2 G2 Cisplatin Cisplatin 1.5 mg/kg i.p. 양성대조군
3 G3 NK Live 1x107 세포/마리 i.v. 신선형 NK세포
4 G4 NK Freeze 1x107 세포/마리 i.v. 동결형 NK세포
음성대조군 G1 Vehicle군은 5% 알부민: 덱스트란주= 1:1 비율로 제조하여 100㎕ 정맥 투여하였다. 양성대조군 G2 Cisplatin군은 Cisplatin 1.5 mg/kg을 투여하였다. 자연살해세포 투여군 G3 NK Live군과 G4 NK Freeze군은 세포의 신선형과 동결형의 차이로서 G4 NK Freeze군은 동결된 NK세포를 해동하여 1x107세포를 마리당 투여하였고, G3 NK Live군은 배양 중 세포를 회수하여 1x107세포를 마리당 투여하였다. 투여군은 1주 2회 투여로 총 6회 투여하였다. 시험기간 동안 마우스의 생존율과 종양의 크기, 증상을 관찰하였고. 78일간 모니터링 수행하였다. 78일 이후에는 동물을 희생하여 추출한 종양의 무게를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 8 및 도 11에 나타내었다.
그룹 종양 무게(평균, g)
G1 1.74±0.27
G2 1.15±0.10
G3 0.49±0.07
G4 0.57±0.09
도 11은 일 구체예에 따른 자연살해세포를 난소암 동물 모델에 투여한 후 종양 무게의 감소를 관찰한 그래프이다(화살표는 약물 투여 시기를 나타냄).
상기 표 8 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 자연살해세포를 투여했을 시, 양성대조군 대비 종양의 무게가 약 50% 내지 60% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히 양성대조군은 50일 이후 종양 성장이 가속화되어 종양 부피가 빠르게 증가한 것에 반해, 일 구체예에 따른 자연살해세포의 투여군은 모니터링 기간 동안 종양 성장이 현저하게 늦춰진 것을 확인할 수 있었다.
5.2. 위암 동물 모델에서의 항암 활성 분석
일 구체예에 따른 자연살해세포의 항암 활성을 in vivo에서 확인하였다.
먼저, NOD-SCID 마우스에 위암 세포주인 NCI-N87를 1x106 세포/마리를 투여하여 이종이식 동물 모델을 제조하였다. 종양이식 6일 후 하기 표 9의 시험군을 설정하였다.
번호 그룹 용량 투여 경로 비고
1 G1 Vehicle 5% 알부민: 덱스트란주 = 1: 1, 200 ㎕ i.v. 음성대조군
2 G2 HER2 Herceptin 1mg/kg i.p. 양성대조군
3 G3 NK Live 1x107 세포/마리 i.v. 신선형 NK세포
4 G4 NK Freeze 1x107 세포/마리 i.v. 동결형 NK세포
5 G5 NK L+Herceptin 1x107 세포/마리+ Herceptin i.v. 신선형 NK세포+ Herceptin
6 G6 NK F+Herceptin 1x107 세포/마리+ Herceptin i.v. 동결형 NK세포+ Herceptin
음성대조군 G1 Vehicle군은 5% 알부민: 덱스트란주= 1:1 비율로 제조하여 200㎕ 정맥 투여하였다. 양성대조군 G2 HER2군은 Herceptin 1mg/kg으로 1주 2회씩 총 6회 정맥 투여하였다. G3 NK Live군와 G4 NK Freeze군은 자연살해세포 단독 투여군으로서 1x107 세포/마리를 1주 2회 투여로 총 6회 정맥 투여하였다. G3 NK Live군은 배양 중 세포를 회수하여 얻은 세포를 투여하였고, G4 NK Freeze군은 동결된 NK세포를 해동하여 1x107세포를 마리당 투여하였다. NK세포와 Herceptin의 병용 투여군인 G5 NK L+Herceptin군과 G6 F+Herceptin군은 NK세포 단독 투여군과 동일한 세포에 Herceptin 1 mg/kg를 병용 투여한 군으로서 주 2회씩 총 6회 정맥 투여하였다.
시험기간 동안 마우스의 생존율과 종양의 크기, 증상을 관찰하였고. 52일간 모니터링 수행하였다. 52일 이후에는 동물을 희생하여 추출한 종양의 무게를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 10 및 도 12에 나타내었다.
그룹 G1 Vehicle G2 HER2
종양 무게(평균, g) 3.38±0.22 2.99±0.28
그룹 G3 NK live G4 NK freeze
종양 무게(평균, g) 1.15±0.23 1.28±0.23
그룹 G5 NK L+HER2 G6 NK F+HER2
종양 무게(평균, g) 0.64±0.15 0.68±0.23
도 12는 일 구체예에 따른 자연살해세포를 위암 동물 모델에 투여한 후 종양 무게의 감소를 관찰한 그래프이다.
상기 표 10 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 자연살해세포를 투여했을 시, 양성대조군 대비 종양의 무게가 약 60% 내지 70% 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히 양성대조군은 28일 이후 종양 성장이 가속화되어 종양 부피가 빠르게 증가한 것에 반해, 일 구체예에 따른 자연살해세포의 투여군은 모니터링 기간 동안 종양 성장이 현저하게 늦춰진 것을 확인할 수 있었다.
또한, 허셉틴과 자연살해세포의 병용 투여군에서는 자연살해세포 단독 투여군 대비 종양의 무게가 약 17% 내지 20% 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 자연살해세포와 허셉틴의 병용 투여의 ADCC(Antibody-dependent cell cytotoxicity)를 적용할 경우, 높은 종양성장의 억제 효과와 항암 효능의 유지기간을 얻을 수 있음을 의미한다.
5.2. 교모세포종 동물 모델에서의 항암 활성 분석
일 구체예에 따른 자연살해세포의 항암 활성을 in vivo에서 확인하였다.
먼저, 7주령 NOG 암컷마우스에 인간 뇌 교모세포종 유래의 세포주 U87MG에 루시퍼레이즈 유전자가 형질도입된 U87MG-luci 세포 1×104 개를 마우스 모델의 우측 대뇌 반구 두개골(Brain Cerebral hemisphere skull) 안에 이식하여 실험 동소 이식 동물 모델을 구축하였다. 세포를 이식하고 일정기간 경과 후에 IVIS 바이오 이미징 장비(PerkinElmer, USA)를 이용하여 종양의 광학 영상 BLI(Bioluminescence; BLI)를 측정하고, 이식 후 7일 차에 BLI의 값이 평균값을 가지도록 개체를 선별하였다. 선별된 동물은 아래 표 11과 같이 시험군별로 구분하여 수행하였다.
번호 그룹 용량 투여 경로 비고
1 G1 Vehicle 5% 알부민: 덱스트란주 = 1: 1, 200 ㎕ i.v. 음성대조군
2 G2 NK 세포 1x106 세포/마리 i.v. 시험군
음성대조군 G1 Vehicle군은 5% 알부민: 덱스트란주= 1:1 비율로 제조하여 마리당 200㎕씩 정맥 투여하였다. 시험군 G2 NK세포군은 자연살해세포 1x106 세포를 마리당 정맥 투여하였고, 1주 2회 투여로 총 6회 투여를 진행하였다.모니터링 기간 동안 주 2 회, IVIS 바이오 이미징 장비 (perkinelmer, U.S.A.)를 이용하여 종양 부피를 측정하였다. 종양 부피 측정을 위하여 150mg/kg 용량의 루시페린(luciferin)(promega)을 10mL/kg으로 복강 투여하였고, 10분 후 투여한 각 개체를 순차적으로 흡입마취기를 이용하여 마취시켰다. 마취가 완전히 된 개체를 순차적으로 IVIS 장비를 이용하여 종양의 광학 영상 (Bioluminescence; BLI)을 측정하고, 측정된 관심 영역 (Region of interest; ROI)의 광학 영상 값은 위탁 연구기관인 우정 바이오社(경기도, 대한민국)의 내부 기준에 준하는 Threshold에 준하여 분석하였다. 상기 결과는 하기 표 12 및 도 13에 나타내었다.
그룹 바이오 발광 (p/sec/cm2/sr)
투여 후 시간 (일)
1 3 7 9 13 16
G1투여 용량: 0 cell/0.2 mL/head Mean 4.28.E+08 1.14.E+09 4.43.E+09 2.98.E+09 6.10.E+09 1.09.E+10
S.E. 7.61.E+07 3.41.E+08 1.00.E+09 5.90.E+08 1.21.E+09 2.94.E+09
N 5 5 5 5 5 5
G2투여 용량: 1x106 cells/0.2 mL/head　 Mean 3.19.E+08 5.70.E+08 5.19.E+09 2.58.E+09 3.17.E+09 1.78.E+09
S.E. 8.28.E+07 1.52.E+08 1.35.E+09 7.16.E+08 1.40.E+09 7.69.E+08
N 5 5 5 5 5 5
각 숫자는 mean + S.E. (n=5)를 나타냄S.E.: Standard errorN: 동물 숫자
도 13은 일 구체예에 따른 자연살해세포를 위암 동물 모델에 투여한 후 종양 무게의 감소를 관찰한 그래프이다.
상기 표 12 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군(G1)은 투여 후 16 일까지 종양 부피의 변동이 4.28.E+08 p/sec/cm²/sr에서 1.09.E+10 p/sec/cm²/sr 로 실험 기간 동안 지속적으로 증가함이 관찰되었다. 이에 반해, 일 구체예에 따른 자연살해세포를 투여했을 시, 3.19.E+08 p/sec/cm²/sr 에서 1.78.E+09 p/sec/cm²/sr로 실험 기간 동안 거의 미비하게 증가하였으며, 16일 기준 음성 대조군 대비 약 5 배 이상 종양 무게가 차이가 남을 알 수 있었다. 이는 일 구체예에 따른 자연살해세포가 교모세포종에서 높은 종양성장의 억제 효과를 가짐을 의미한다.

Claims (15)

  1. 하기 (a) 내지 (e)로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 분리된 자연살해세포;
    (a) PBMC의 배양 0일째 대비 NKG2D의 상대적 MFI의 값이 1.2 배 내지 12 배 증가한 것;
    (b) PBMC의 배양 0일째 대비 NKp30의 상대적 MFI의 값이 1.5 배 내지 15 배 증가한 것;
    (c) PBMC의 배양 0일째 대비 NKp44의 상대적 MFI의 값이 12 배 내지 22 배 증가한 것;
    (d) PBMC의 배양 0일째 대비 ITGA1의 상대적 MFI의 값이 1.8 배 내지 25 배 증가한 것; 및
    (e) PBMC의 배양 0일째 대비 ITGA2의 상대적 MFI의 값이 1.4 배 내지 6 배 증가한 것이고,
    상기 상대적 MFI는 하기 수학식 1로 정의된다;
    [수학식 1]
    상대적 MFI = Receptor MFI / Isotype MFI.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 (a)의 상대적 MFI 값이 3 배 내지 6 배 증가한 것;
    상기 (b)의 상대적 MFI 값이 3 배 내지 6 배 증가한 것;
    상기 (c)의 상대적 MFI 값이 12 배 내지 18 배 증가한 것;
    상기 (d)의 상대적 MFI 값이 6 배 내지 10 배 증가한 것; 및
    상기 (e)의 상대적 MFI 값이 2 배 내지 4 배 증가한 것인 자연살해세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 10 내지 140의 MFI 값의 CD16, 20 내지 160의 MFI 값의 LFA-1, 5 내지 25의 MFI 값의 NKG2D, 5 내지 20의 MFI 값의 NKp30, 12 내지 25의 MFI 값의 NKp44, 4 내지 25의 MFI 값의 ITGA1, 및 2 내지 10의 MFI 값의 ITGA2로 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것인 자연살해세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 20 내지 180의 MFI 값의 CD2, 0.1 내지 1.5의 MFI 값의 CD27, 1 내지 10의 MFI 값의 CD69, 2 내지 12의 MFI 값의 CD226, 2 내지 8의 MFI 값의 NKp46, 0.1 내지 4의 MFI 값의 CD160, 0.1 내지 4의 MFI 값의 KIR2DL1, 0.1 내지 5의 MFI 값의 KR2DL3, 0.1 내지 4의 MFI 값의 KIR3DL1, 0.4 내지 16의 MFI 값의 NKG2A, 0.2 내지 12의 MFI 값의 CD161, 0.3 내지 3의 MFI 값의 CCR3, 0.5 내지 4의 MFI 값의 CCR5, 0.8 내지 6의 MFI 값의 CCR6, 0.4 내지 5의 MFI 값의 CXCR3, 0.4 내지 5의 MFI 값의 CXCR1, 0.1 내지 3의 MFI 값의 CXCR2 및 1 내지 16의 MFI 값의 ITGB7로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 추가적으로 갖는 것인 자연살해세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 하기 (f)의 특성을 추가적으로 갖는 것인 자연살해세포;
    (f) PBMC의 배양 0일째 대비 배양 14일째에 KIR2DS4 유전자의 발현량이 10 배 내지 50배이다.
  6. 청구항 1에 있어서, KIR2DS1+, KIR2DS2+, KIR2DS3+, KIRDS4+, CXCR1+, CXCR2+, CXCR3+, CCR3+, CCR5+, CCR6+, PSA-NCAM+, 네스틴+(Nestin), 타이로신 히드록실레이즈+(Tyrosine Hydroxylase), CD147+, CD127+, CD15+, CD31+, CD146+, CD49c+, CD107a+, NKG2A+, CD45+, CD44-, CD140a+, CD87-, CD11b+, CD10-, 및 CD80-로부터 선택된 어느 하나의 특성을 갖는 것인 자연살해세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포는 세포 집단의 50 내지 90%가 NKp44를 발현하거나; 세포 집단의 50 내지 90%가 KIR2DS2를 발현하거나 또는 세포 집단의 60 내지 100%가 NKG2D를 발현하는 것인 자연살해세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포는 PBMC로부터 배양 시 PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, 또는 PDGF-AB로 처리된 것인 자연살해세포.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 자연살해세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 자연살해세포는 면역 활성, 혈관 뇌장벽 투과, 세포 이동 촉진 또는 자기 관용을 억제하는 것인 조성물.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 암은 폐암, 후두암, 위암, 대장암, 직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 신장암, 피부암, 골암, 근육암, 지방암, 섬유세포암, 혈액암, 백혈병, 림프종, 다발성골수종, 및 신경 교종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 약학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 신경 교종은 성상세포종(Astrocytic tumours), 핍지교세포종(Oligodendroglial tumours), 혼합신경교종(mixed gliomas) 또는 상의세포종(Ependymal tumours)인 것인 약학적 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 성상세포종은 교모세포종, 항암제 내성 교모세포종 또는 재발성 교모세포종인 것인 약학적 조성물.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 암은 MICA(MHC class I polypeptide-related sequence A) 또는 PDFG-DD(Platelet-derived growth factor-DD)를 분비 또는 발현하는 것인 약학적 조성물.
  15. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항의 자연살해세포 또는 그의 집단의 유효량을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법.
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