CN103224563B - 合成型转录因子VP64- Os01g63510的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了合成型转录因子VP64-Os01g63510的应用。其是利用转录因子激活基序VP64（即4个转录因子激活基序VP16）与水稻转录因子Os01g63510基因融合构建得到合成型转录因子，并转化到水稻中从而改善水稻籽粒性状，使转基因水稻种子明显变长、变宽、千粒重增加，具有较好的市场应用前景。

Description

合成型转录因子VP64- Os01g63510的应用

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体地，涉及水稻转录因子Os01g63510基因的应用及合成型转录因子VP64-Os01g63510的应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国和全世界重要的粮食作物，世界1/2以上人口以水稻为主食。粮食安全问题一直是全世界关注的问题，所以水稻的产量性状一直以来都很受科学家们的关注，而水稻籽粒大小则是影响产量的主要因素之一。同时水稻作为农作物的功能基因研究的模式植物，与其相关的遗传学和分子生物学研究一直倍受研究者的重视，水稻籽粒的生长发育是一个有次序的、选择性的基因表达过程，转录因子在基因的精确调控中起到了关键性的作用。

有关籽粒大小性状的分子遗传调控机制科学家们已经有一些研究进展，通过QTL已定位了一些籽粒大小相关基因，GS3编码一个膜蛋白，是籽粒大小和器官大小的负调控因子。张启发等研究发现GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶，是控制籽粒大小的正调节因子，过表达GS5可产生较大籽粒。转录因子在调控籽粒大小方面起着非常重要的作用，OsWRKY78可以调节水稻茎的伸长和种子的发育，OsWRKY78突变体可以使茎杆变矮化影响籽粒发育；螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)类转录因子能通过调控外稃和内稃细胞的长度影响谷粒的大小。PGL1（碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH）异源二聚体作为结合DNA的bHLH的抑制子过表达后可增加籽粒长度和重量。虽然以上很多转录因子家族参与了水稻籽粒大小调控，但是还没有发现WUSCHEL家族转录因子在调控籽粒大小方面的研究。

WUSCHEL-related homebox（WOX）基因是植物特有的转录因子，

在被子植物和裸子植物分化之前人们从拟南芥中克隆并预测了起结构后，其他物种的WOX基因相继被克隆研究(Nardmann et al.,2009)。WOX5是第一个被确定WUSCHEL转录因子，在根茎顶端分生表达调控胚胎肝细胞的再生与分化(Mayer et al.,1998)。在胚胎发育早期WOX8、WOX9和WOX2以及其它相关元件都有动态表达共同8细胞胚胎的极性分化区域形(Haecker et al.,2004)。在玉米中WUS相应的同源基因也被发现，而且在开花植物中功能相对保守。WUX5可以明显的影响顶端分生组织的分化导致不正常胚胎发育。此外还有相关研究表明WUS基因与叶片近轴端和远轴端的极性分化有关，WUS转录因子在中间层影响叶片的源输出，主要有WUS1亚家族和PRESSEDFLOWER（PRS）/WOX3亚家族，而且WOX1在叶片近轴远轴交接处表达量高(Matsumoto and Okada,2001)。WOX4在原基形成层和新生组织干细胞调控干细胞再生，但是WOX4不能抑制木质部的分化，而且在CLE/TDIF-PXY/TDR信号的下游还有其它的因子参与抑制细胞的分化(Hirakawa et al.,2010)。同时WOX基因在抗旱小麦中可以促进根系统发育提高水分的吸收率使其在缺水的条件下很好的生长(Wasson et al.,2012)。综上所述，WUS家族转录因子在植物生长发育的很多方面都起着很重要的作用，但是本发明首次发现水稻WUS家族转录因子可以调控籽粒大小。

本发明就是通过构建组成型表达VP64-Os01g63510融合蛋白发现WOX基因可以调控籽粒大小。VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动物病毒基因中发现，现在已被广泛的应用到植物中主要用于植物基因的转录控制的研究中，因转录因子在其体内其作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，在转基因植株中就会出现更明显的表型变化。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻转录因子Os01g63510基因的应用以及合成型转录因子VP64-Os01g63510的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种融合蛋白，该融合蛋白为（VP16）_n-Linker-Os01g63510；其中，n为≥1的整数；Linker由1～20个柔性氨基酸串联而成，本发明linker，其氨基酸序列为INYPYDVPDYAGSYPYDVPDYAAQCSGTELTSLYKKAGF，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；VP16为来自单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus）的VP16蛋白；Os01g63510为水稻转录因子Os01g63510，其CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的基因序列；其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了用于扩增Os01g63510基因的引物，

其包括正向引物F1：5′-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGCTCTTAGCGGG-3′和反向引物R1：5′-CAAGAAAGCTGGGTCCTAGAGGCCGAAGCTGCA-3′。

更优选地，前述融合蛋白为（VP16）₄-Linker-Os01g63510。

本发明还提供编码所述融合蛋白的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；其中，所述严格条件为65℃，在0.1×SSPE或0.1×SSC、0.1%SDS的溶液中杂交并洗膜。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。所述载体为任一种可引导外源基因在宿主中表达的载体。优选地，所述载体为植物双元表达载体（例如，pCAMBIA1301）。在将本发明编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前添加任一种强启动子（例如，玉米强启动子Ubiquitin）或诱导型启动子。此外，在将本发明编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时，还可以使用增强子，且这些增强子区域必须与编码序列的阅读框相同，以确保整条序列的翻译。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的转基因细胞系。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。

本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在推迟水稻抽穗、延长生育期中的应用。

本发明进一步提供水稻转录因子Os01g63510基因的应用，其是将水稻转录因子Os01g63510基因的CDS序列（完整翻译区）构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化植物，筛选并最终获得转基因植物。所述CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

前述的应用，其是将水稻转录因子Os01g63510基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻（例如，水稻品种‘kitaake’），从而使转基因水稻籽粒变宽变长。其中，水稻转录因子Os01g63510基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示，4个转录因子激活基序VP16的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2_nd Edition）。

本发明首次利用转录因子激活基序VP64（即4个转录因子激活基序VP16）与水稻转录因子Os01g63510基因融合构建得到合成型转录因子，并转化到农作物，并使转基因水稻种子明显变长、变宽、千粒重增加，具有较好的市场应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中nVP64-hyg-asRED载体图谱。

图2为本发明实施例1中ubi：VP64-Os01g63510载体图谱。

图3为本发明VP64-Os01g63510合成型转录因子过表达转基因阳性株系的PCR鉴定，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，UBI：2424-14、2424-22为VP64-Os01g63510转基因水稻株系。

图4为本发明Western blot检测VP64-Os01g63510转基因阳性株系，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，2424-14、2424-18、2424-22为VP64-Os01g63510转基因水稻株系。

图5为本发明VP64(4×VP16)激活Os01g63510改变籽粒性状的表型，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，2424为VP64-Os01g63510转基因水稻株系，其中图5a为WT水稻与转基因水稻籽粒长度的比较，图5b为WT水稻与转基因水稻籽粒宽度的比较，结果表明转基因水稻的籽粒长度和宽度都显著大于WT。

图6为本发明VP64(4×VP16)激活Os01g63510改变籽粒长度考种分析，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，2424-14、2424-22为VP64-Os01g63510转基因水稻株系。

图7为本发明VP64(4×VP16)激活Os01g63510改变籽粒宽度考种分析，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，2424-14、244-22为VP64-Os01g63510转基因水稻株系。

图8为本发明VP64(4×VP16)激活Os01g63510改变千粒重考种分析，其中WT为野生型水稻‘kitaake’，2424-14、244-22为VP64-Os01g63510转基因水稻株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1Os01g63510基因的分离和植物表达载体构建

在植物转录因子数据库（http://planttfdb.cbi.edu.cn/index.php?sp=Osj）中找到Os01g63510基因，根据其序列设计PCR扩增引物（F1：5′-CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGCTCTTAGCGGG-3′和反向引物R1：5′-CAAGAAAGCTGGGTC GAGGCCGAAGCTGCA-3′）以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得Os01g63510基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（F1和R1），而第二轮的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物【attB5′adaptor：5′-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3′，attB3′adaptor：5′-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3′】。将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体（购自Invitrogen）上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将Os01g63510构建到cVP64-hyg-asRED（图1,载体全序列如SEQ ID No.5所示）上，获得载体ubi：VP64-Os01g63510（图2，载体全序列如SEQ ID No.6所示）。其中，植物表达载体cVP64-hyg-asRED的构建过程为：以双元表达载体pCAMBIA1300左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-Gateway-VP64表达单元、35S promoter-asRED表达单元和35S promoter-hyg表达单元与之融合构建得到，载体cVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No.5所示。

实施例2转基因水稻植株的获得

取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体材料，采用农杆菌介导法将ubi：VP64-Os01g63510转入水稻愈伤组织中，用含有100μM的乙酰丁香酮和O.D.值为0.7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25℃暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每10d继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每10d继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。

其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2,4D+0.5g/L谷氨酰胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS（乙酰丁香酮）100～200μg/mL。

筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素（购自上海纽津生物技术有限公司）。

分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin（激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

实施例3转基因水稻的鉴定

为了检测Os01g63510基因是否整合进入水稻基因组DNA，提取了野生型（‘kitaake’）和本发明制备的转基因水稻叶子DNA，从基因两端的植物表达载体上设计一对引物（VP64-1F：5′-ATGGACGCGCTGGACGATTT-3′，2424-R：5′GAGGCCGAAGCTGCAAA3′）按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR鉴定转基因植株，通过PCR结果发现，转基因水稻均扩增出目的条带（867bp），而野生型水稻中无此目的条带，结果见图3。初步确定Os01g63510基因已通过农杆菌介导的方法插入到水稻基因组中，PCR产物经测序结果分析是目的基因序列。

为检测ubi：VP64-Os01g63510基因在T2代转基因水稻中的过表达情况，利用VP64抗体对其在蛋白质水平上进行鉴定，经过SDS-PAGE蛋白电泳→免疫印记→免疫荧光反应，Western Blot鉴定结果表明转基因植株存在目的蛋白，而野生型未杂出条带（图4）。

具体的Western Blot实验流程如下：

将适量样品放入液氮冰冻后研磨成粉末，加入适量上样缓冲液混匀，12000rpm离心10分钟；取5μl上清加样，以90V电压SDS-PAGE电泳30分钟后，120V电泳60-90分钟，当溴酚蓝到达凝胶的底端即可停止电泳；电泳后采用半干转移法转膜，并用丽春红染色液对膜进行染色，观察转膜效果；转膜完毕后，将膜放入含5%的脱脂奶粉的PBST溶液中封闭室温封闭60分钟或4℃过夜；室温下一抗(VP64抗体)孵育1小时或4℃孵育过夜，然后用PBST洗涤3次，每次5分钟；室温下二抗（羊抗兔，购自Abmart，货号M21002S）孵育1小时，然后用PBST洗涤3次，每次5分钟；在膜上加入底物，进行曝光。

其中，VP64抗体是由艾比玛特生物医药（上海）有限公司根据VP64的氨基酸序列合成多肽作为特异抗原而制备的兔源多抗。

实施例4转基因水稻表型分析和考种分析：

将本发明获得的转基因水稻种子和野生型（‘kitaake’）水稻种子进行比较，从表型上可以明显的看出转基因种子明显的变长、变宽、千粒重增加，见图5a、5b、图6、图7、图8。通过考种的数据分析结果可以明显的看出转基因水稻种子性状与野生型相比具有显著的差异变化。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白为(VP16)_n-Linker-Os01g63510；其中，n为4；VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白；Os01g63510为水稻转录因子Os01g63510，其CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Os01g63510的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述的Linker的氨基酸序列为INYPYDVPDYAGSYPYDVPDYAAQCSGTELTSLYKKAGF；

所述(VP16)₄的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示序列的反向互补序列。

2.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

3.含有权利要求2所述基因的载体。

4.含有权利要求2所述基因的工程菌。

5.权利要求2所述的基因在促进水稻种子变长、变宽、千粒重增加中的应用。