JP2008054532A - アルミニウム耐性に関与する遺伝子、およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アルミニウム感受性突然変異体(als2変異体)と、カサラスとの交配によって得られたF2 集団を用いたマップベースクローニングによって、アルミニウム耐性に関与する遺伝子(Als2遺伝子)を同定し、新規遺伝子として単離した。
【選択図】なし
Description
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)以下の(iii)もしくは(iv)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(iii)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは、
(iv)配列番号3に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド;
(c)配列番号6に示されるアミノ酸配列;
(d)配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。
(b)以下の(i)もしくは(ii)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは
(ii)配列番号1に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドをコードするものである。「アルミニウム耐性に関与する」とは、アルミニウム耐性を促進(増強)または抑制(減少)させることを示す。
(b)以下の(i)もしくは(ii)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは
(ii)配列番号1に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;または
(d)以下の(iii)もしくは(iv)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(iii)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは
(iv)配列番号3に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加され、かつ、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチド;
(c)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;または
(d)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加され、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。
本発明にかかるポリペプチドは、上記(1)に記載したポリヌクレオチドの翻訳産物であり、少なくともアルミニウム耐性に関与するものである。
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドである。
(d)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。
本発明にかかるポリヌクレオチドは、形質転換用マーカー遺伝子として利用することができる。すなわち、本発明にかかる形質転換体選抜用マーカー遺伝子は、上記(1)に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドからなるものであればよい。本発明にかかるポリヌクレオチドは、アルミニウム耐性に関与する遺伝子である。
本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記(1)に記載した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されるものではない。例えば、配列番号1または3に示すcDNAが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。
本発明にかかる形質転換体は、上記(1)に記載した本発明にかかるポリヌクレオチド、または、上記(4)に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドが発現している形質転換体であれば、特に限定されるものではない。ここで「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列アミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド;
(c)配列番号6に示されるアミノ酸配列;
(d)配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたなアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドポリペプチド。
本発明の食品は、本発明にかかる形質転換体を含むものである。この食品は、アルミニウム耐性が付与された形質転換体を含むものであることが好ましい。TLO本発明の食品には、ヒトが摂取するものはもちろん、家畜に与える飼料なども含まれる。
als2変異体、als1変異体、および野生型(品種:コシヒカリ)間において、Al感受性を比較するために、0.5mM CaCl2を含む0、10、30および50μMのAl溶液に、5日齢の苗を、24時間曝した。相対的な根の伸長(RRE)を用いて、それぞれの種のAl感受性を評価した。図2は、根の伸長に及ぼすAl濃度の影響を示すグラフである。図2に示すように、10、30、および50μM Alにおける根の伸長は、als2変異体では、それぞれ36%、17%および12%まで抑制された。また、野生型(WT)では、それぞれ73%、51%、および32%まで抑制され、als1変異体では、それぞれ11%、8%、および8%まで抑制された。このことは、als2変異体のAl感受性が、als1変異体よりも低いことを示唆している。なお、相対的な根の伸長(RRE)は、(Al存在下における根の伸長/Al非存在下における根の伸長×100)として算出した。また、データは、平均値±SD(n=10)で示した。
als2変異体と野生型との間で根におけるAlの蓄積を比較するため、als2変異体および野生型の根の各20本を、0.5mMのCaCl2を含む0、10、20および100μMのAl溶液に、12時間曝した。その後、3つの根の切片(0−1cm、1−2cm、および2−3cm)を、根から切り取った。図6(a)〜図6(c)は、根の異なる部分のAl含有量を示すグラフである。図6(a)〜図6(c)に示すように、Al濃度には関係なく、als2変異体の根の先端(0−1cm)におけるAl含有量は、野生型よりも顕著に高かった(図6(a))。しかし、基部では野生型と変異体との間にアルミニウム含量の差がほとんどなかった(図6(b)図6(c))。このことは、根の先端からAlを排除する効果は、als2変異体では崩壊していることを示唆している。なお、Al濃度の測定は、グラファイトファーネス原子吸光分析装置を用い、データは、平均値±SD(n=3)で示した。
als2変異体の遺伝子解析のために、als2変異体および野生型植物間の戻し交配から得られた164本のF2 の苗を用いた。まず、20μMのAl溶液におけるF2 の苗のAl感受性を調べた。そして、各々の苗の相対的な根の伸長(RRE)をそれらの親株と比較して、各苗の表現型を決定した。図7は、そのF2 集団のAl感受性を示すグラフである。図7に示すように、40本の苗(RRE<30%)がAl感受性を示し、124本の苗(RRE>40%)がAlに対して耐性を有していた。Al耐性の苗、およびAl感受性の苗の分離は、3:1の比率に一致した(x2=0.033、0.75<P<0.9)。このことは、als2変異体のAl感受性は、単一の劣性遺伝子により制御されていることを示唆している。
イネのAl抵抗性に必要とされるAls2遺伝子のマッピングのために、als2変異体およびインディカ品種Kasalathの間の交配から得られた196本のF2 の苗のAl抵抗性を、20μM Al溶液を用いて評価した。図8は、そのF2 集団のAl感受性を示すグラフである。図8に示すように、RREの測定結果は、複峰性分布(bi-modal分布)を示した。2つのグループ間に重なりがあるものの、F2 集団はAl感受性グループと、Al抵抗性グループとに分離された。なお、RREが20%より少ない46本の苗をAl感受性であるとみなし、150本の苗(RRE>20%)をAl抵抗性であるとみなした。分離比率は1:3(x2 =0.245、0.5<P<0.75)であり、これにより、als2変異体は、単一の劣勢遺伝子により制御されていることが確認された。
次に、als2変異体/Kasalathからの986本のF2 植物の集団を用い、Als2遺伝子のファインマッピングを行った。図10は、Als2遺伝子をマッピングした遺伝子地図である。なお、図10中の数字は、それぞれのマーカーおよび遺伝子間の組換え体を示す。イネ第12染色体(12S〜12L)を示す線は、BACクローン(BACs)を示す線に部分的に重なる。Als2遺伝子は、後述のように、最終的に、InDelマーカーMaOs1250とMaOs1246の間にある38.5kbの候補領域にマッピングされた。
Als2遺伝子の候補遺伝子の配列を決定するために、als2変異体における候補遺伝子のORFを増幅させるようにプライマーを設計した。抽出されたPCR産物を、QuickStepTM2 PCR精製キットを用いて、そのプロトコルに従って精製した。その後、鋳型として用いる精製産物を、BigDye Terminator V3.1 cycle配列決定キットを用いて増幅させ、製造業者の使用方法に沿ってABI PRISMTM310シーケンサーを通して、配列を決定した。
Als2遺伝子にコードされるAls2タンパク質のマルチプル配列アライメントを、BioEditソフトウエアのClustalW programを用いて行った。選択されたC2H2 Znフィンガータンパク質間の系統発生上の関係を分析するために、まずマルチプル配列アライメントを最初に行った。図1は、コシヒカリ、Kasalathおよびals2変異体のAls2タンパク質のアミノ酸配列を比較する図である。なお、マルチプル配列アライメントには、BioEditソフトウエアのClustalWプログラムを用いた。図1において、四角で囲った部分は、保存ドメインC2H2を示す。
野生型イネ(品種:コシヒカリ)を用いて、Als2遺伝子の発現パターンを調べた。6日齢の野生型の苗を、それぞれ0または50μMのAl溶液を含む、0.5mM CaCl2 溶液に6時間曝した。次に、根の先端(0−1cm)、根の基底部(1−2cm)、および新芽を切り取り、RNA抽出およびcDNAを調製した。Als2遺伝子の相対的な発現を調べるために、リアルタイムRT−PCRを行った。図12は、Als2遺伝子の発現量を示すグラフである。図12に示すように、根の先端におけるこの遺伝子の発現レベルが、地上部における発現レベルの7倍を示した。また、これらを50μM Alに6時間曝したとき、根および地上部のいずれも、この遺伝子がAlにより誘導されなかった。なお、OsHistone3をコントロールとして用い、データは平均値±SD(n=3)で示した。
Claims (10)
- 下記の(a)〜(d)のいずれかのポリヌクレオチドを、発現可能に導入することを特徴とするアルミニウム耐性が促進された形質転換体の生産方法。
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(d)以下の(iii)もしくは(iv)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(iii)配列番号3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは、
(iv)配列番号3に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。 - 下記の(a)または(b)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、(c)または(d)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとが導入されており、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチドを発現してなる形質転換体。
(a)配列番号4に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号4に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド;
(c)配列番号6に示されるアミノ酸配列;
(d)配列番号6に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からり、かつ、アルミニウム耐性を促進するポリペプチド。 - アルミニウム耐性を抑制するポリヌクレオチドであって、
下記の(a)または(b)のポリヌクレオチド:
(a)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)以下の(i)もしくは(ii)のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド:
(i)配列番号1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド;もしくは
(ii)配列番号1に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。 - アルミニウム耐性を抑制するポリペプチドであって、
下記の(a)または(b)のポリペプチド:
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列。 - 請求項4に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項3または5に記載のポリヌクレオチドの少なくとも一部を含む形質転換体選抜用マーカー遺伝子。
- 請求項3または5に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 請求項3または5に記載のポリヌクレオチド、または、請求項7に記載の組換え発現ベクターが導入されており、かつ、アルミニウム耐性に関与するポリペプチドを発現してなる形質転換体。
- 請求項2または8に記載の形質転換体を含む食品。
- 少なくとも請求項3または5に記載のポリヌクレオチド、あるいは、請求項5に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含むことを特徴とする形質転換キット。
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CN105803097A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-07-27 | 中国水稻研究所 | 一种鉴定水稻耐铝和铝敏感品种的功能标记及应用 |
CN116716311A (zh) * | 2023-05-12 | 2023-09-08 | 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 | 狗牙根铝响应基因及其引物和克隆方法 |
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JP2006187209A (ja) * | 2004-12-28 | 2006-07-20 | Kagawa Univ | ケイ素吸収に関与する遺伝子、およびその利用 |
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