CN107641153B - 干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP及其编码基因和应用。本发明公开的干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，所述蛋白TaCDCP的编码基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示，其长度为474bp。本发明通过VIGS技术证实低温响应候选蛋白的功能，能够为小麦抗逆育种提供重要的基因资源，对我国小麦品种遗传改良具有重要意义。

Description

干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP及其编码基因和 应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP及其编码基因和应用。

背景技术

世界上粮食减产的主要原因之一就是逆境胁迫，该因素造成大多数农作物减产超过50％。然而，大田不像室内试验具有一定的可控性。自然条件下，世界上的许多农业种植区往往同时遭受两种或者更多的逆境胁迫，比如，干旱和高盐、低温和干旱或者高光强，造成比单一胁迫更严重的减产。

目前，仅有少量的关于不同非生物胁迫结合的研究报道。比如，干旱和高盐双胁迫对玉米、小麦、烟草和拟南芥的生长和产量的影响，干旱和高盐双胁迫对大麦在转录和代谢水平上的影响。干旱是导致作物减产的重要胁迫因子，特别是在热带和亚热带地区的低温/冷胁迫，包括冷害（<20°C）和/或冻害（<0°C），是另一个限制许多物种包括重要的农作物的产量和地理分布的主要因素。在中国的黄淮海麦区，冬小麦每年10月播种，6月收获。一般而言，这个麦区的小麦整个生育期的降水量大概为150-250mm，仅占全年降水量的25%-29%。特别是，作为小麦产出大省，在过去三年河南地区平均月降水量为25-50mm，并且冬季低温为2-8°C（11月到2月）。因此，低温和干旱频繁出现导致小麦分蘖的减少和减产。以往关于干旱或者低温单因素的对作物的影响已有大量报道，但关于两者结合的影响目前也仅在甘蔗的生理水平上有研究。一些基因可以同时被干旱和低温诱导，暗示低温和干旱信号途径存在交叉。而植物对不同非生物胁迫结合的响应是独特的，不能从它们对单一胁迫的响应中直接推断。然而，无论是在转录、蛋白、还是代谢水平，关于干旱条件下低温胁迫对植物影响的研究都很少。在干旱条件下，植物对低温胁迫响应的分子机制也还未被揭示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP及其编码基因和应用，通过同位素标记相对和绝对定量（isobaric tag for relative andabsolute quantitation，iTRAQ）技术对生产上大面积推广的小麦品种矮抗58进行干旱条件下低温胁迫逆境响应候选蛋白进行挖掘，并通过病毒诱导的基因沉默（Virus InducedGene Silencing，VIGS）技术证实低温响应候选蛋白的功能，能够为小麦抗逆育种提供重要的基因资源，对我国小麦品种遗传改良具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白，命名为蛋白TaCDCP，所述蛋白TaCDCP的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

上述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP基因的cDNA序列如序列表SEQ IDNO.1所示，其长度为1527bp；TaCDCP基因的开放阅读框架（ORF）序列如序列表SEQ ID NO.2所示，为序列表SEQ ID NO.1中自5'末端第494~967位的脱氧核糖核苷酸，并编码如序列表SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，氨基酸的个数为157；TaCDCP基因的基因组水平序列如序列表SEQ ID NO.4所示，其长度为2387bp，含有7个外显子和6个内含子。

本发明还提供扩增干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因的全长序列或其任意片段的引物对，所述引物对如下所示：

TACDCP-1F：5’- AATTACTTTCAGCCCAAATT-3’；

TaCDCP-1R：5’- GTCCACTTTCACCTCCTAAT-3’；

TaCDCP-2F：5’- ATGACGAAAAGGGAGGATCT-3’；

TaCDCP-2R：5’- TTAAGCACCTTCAGCTTTCT-3’。

本发明还提供含有所述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因的重组表达载体、酶切线性化的质粒、体外转录单链RNA或VIGS阳性沉默植株。

进一步地，所述重组表达载体为将如序列表SEQ ID NO.2所示序列中自5'末端第169~441位的特异性DNA片段插入BSMV-γ-PDS载体的Pacl和Notl双酶切位点之间得到的重组质粒。

本发明还提供一种干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的基因功能的验证方法，包括以下步骤：将BSMV-α、BSMV-β与TaCDCP的编码基因的重组表达载体的体外转录产物按照等体积混合后涂抹目标植株，得到TaCDCP基因的阳性沉默植株。

本发明还提供干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的基因功能的验证方法在小麦育种中的应用。

本发明还提供干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP、干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因或干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因的重组表达载体、酶切线性化的质粒、体外转录单链RNA或VIGS沉默阳性植株中的至少一种在小麦育种中的应用。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明通过iTRAQ技术进行小麦低温响应的差异蛋白组学研究，对干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白进行挖掘，通过电子克隆法克隆了一个受干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的基因，该基因具有完整的ORF，并通过VIGS技术证实干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的基因在增强小麦干旱-低温抗性方面发挥着重要作用，为低温响应的生化和分子遗传学基础研究提供重要信息，能够为小麦抗逆育种提供重要的基因资源，对我国小麦品种遗传改良具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例二中BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ、BSMV-γ-PDS及BSMV-γ-TaCDCP体外转录单链RNA的检测图。

图2为本发明实施例二中VIGS侵染成功率和TaCDCP基因在不同处理植株中的相对表达量。

图3为本发明实施例二中用BSMV RNA单链进行病毒感染的小麦沉默表型和干旱条件下低温胁迫处理的第2d表型。

图4为本发明实施例二中干旱条件下小麦低温胁迫小麦植株间株高及相对电导率和叶片相对水分含量的对比图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的（分析纯）。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。引物合成及测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。BMWV-VIGS载体参照 Zhang, N., Huo, W., Zhang, L., Chen, F. & Cui, D. Identification ofWinter-Responsive Proteins in Bread Wheat Using Proteomics Analysis andVirus-Induced Gene Silencing (VIGS). Mol Cell Proteomics15, 2954-69 (2016)。

八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase，PDS）：是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶，而类胡萝卜素在植物中具有光保护作用，被感染植株产生的漂白现象，这是由于PDS基因的mRNA积累量显著降低引起的。

大麦条斑花叶病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）：短棒状病毒，由α、β、γ3条RNA链组成，平均l25-l30nm，直径约为22nm。BSMV由3条正单链RNA及外壳蛋白亚基组成，对侵染性而言三条RNA都是必不可少的。BSMV侵染麦子的症状表现为深绿和浅绿相间的不规则条纹，而早期症状是在新叶的基部出现黄色或白色的退绿条纹，进而扩展到全植株发生系统花叶，并出现植株矮化，花药雌蕊发育不全，种子皱缩等。2002年Holzberg等人通过改造大麦条斑花叶病毒，将一段大麦PDS基因的特异片段插入BSMV的γ链，转染苗期的大麦叶片，成功诱导了内源PDS基因沉默，并建立了大麦上BSMV诱导基因沉默体系。自此之后，BSMV诱导基因沉默体系在其它单子叶作物中相继建立和被应用于苗期抗病基因的功能鉴定（Holzberg et al. 2002）。2005年Scofield等人率先在小麦苗期成功建立了小麦的BSMV诱导基因沉默体系，并利用该技术体系研究了由Lr21介导的抗条锈病基因的功能，以及RAR1、SGT1和HSP90基因在由Lr21介导的抗条锈性中的作用（Scofield et al. 2005）。

FES缓冲液：50mlGP母液（10×GP母液：18.77g甘氨酸、26.13g磷酸氢二钾定容到500ml，高压灭菌20min），2.5g焦磷酸钠，2.5g斑脱土，2.5g硅藻土，定容到250ml，高压灭菌20min。

实施例一 干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP基因的克隆

1.1筛选目的蛋白

将发育良好的小麦品种矮抗58种子用1%（w/v）H₂O₂浸泡0.5h，然后用蒸馏水彻底冲洗干净。消过毒的种子放入直径9cm的培养皿，于人工气候箱中（温度25/15℃白天/黑夜，光照强度5500Lx，光照时间16/8h光照/黑暗）进行水培两周。然后，将有两片完全展开叶的小麦幼苗进行干旱条件下小麦低温处理作为胁迫组，在常规条件下生长的作为对照组。干旱条件下小麦低温处理过程如下：将根浸泡于20% PEG 6000，于人工气候箱中（温度4/4℃白天/黑夜）进行24h低温处理。

24h后，将胁迫组和对照组的根和叶用蒸馏水冲洗干净，快速取样，液氮速冻，放入-80℃备用。-80℃保存的胁迫组及对照租的叶片和根系用于目的蛋白的提取。

利用iTRAQ和LC-MS/MS技术对干旱条件下小麦低温胁迫24h前后的小麦品种矮抗58幼苗的根和叶进行差异蛋白组学研究。根和叶中分别鉴定14060、11270条多肽，包括8938、7448个唯一肽段和3703、3009个蛋白（unique peptides≥1）。Ratio>1.2倍或<0.83倍的差异显著蛋白点分别为250和258个。

Kushwaha等人发现，候选蛋白CBS（Cystathionine β-synthase，CBS）domain-containing protein（CDCP）基因可能和逆境相关（Kushwaha et al., 2009; Singh etal., 2012）。利用蛋白组学中鉴定出一个山羊草（Aegilops tauschii）中的蛋白CDCP（Uniport登录号为R7W8D1），但其在小麦中的功能目前未知。蛋白组学和荧光定量（qRT-PCR）结果显示，该蛋白CDCP在小麦低温处理24h后RNA水平和蛋白水平表达量均上调，故将其作为目标蛋白。

在上述目标蛋白对应的NCBI数据库的基础上，对来源于其它植物的现有相关功能的基因和片段进行BLAST比对，根据比对和序列分析的结果，对小麦的相关片段进行拼接和延伸，最终得到一个完成的开放阅读框。将对干旱条件下小麦低温胁迫响应的蛋白质命名为蛋白TaCDCP，将编码蛋白TaCDCP的基因命名为TaCDCP基因。

具体步骤如下：

1.2 总RNA提取及cDNA第一条链的合成

参照南海波（2006）提取小麦品种矮抗58苗期总RNA。取2μLRNA在2%琼脂糖上电泳，检测RNA的完整性，发现提取的总RNA具有基本清晰的28S和18S的主带；紫外分光光度计检测OD260/OD280比值在1.80-2.00之间，OD260/OD230>2.0。取质量符合要求的总RNA，参照PrimeScript^TM RT Reagent Kit (perfect Real time) 说明书进行cDNA第一条链的合成。

利用作为小麦内参基因（internal control）的β-actin基因（GenBank accessionno. AB181991）引物检测反转录的cDNA质量，该引物为：

β-actin-F：GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC；

β-actin-R：GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC。

1.3 TaCDCP基因的克隆及序列分析

以cDNA数据获得的EST序列（GenBank：KD545581.1）为探针，对小麦的EST数据库进行BLAST检索，筛选与探针同源性在97%以上的EST序列，通过电子克隆法结合PCR扩增获得TaCDCP基因的全长序列，采用DNAMAN软件进行cDNA序列的初步分析、氨基酸翻译，基因的开放阅读框和保守区域分析通过NCBI同源性比对进行，基因结构用Softberry软件分析。

设计巢式PCR引物，TaCDCP-2F和TaCDCP-2R分别设计在起始密码子ATG和终止密码子TAA两端，分别如下：

TaCDCP-1F：5’-AATTACTTTCAGCCCAAATT-3’；

TaCDCP-1R：5’-GTCCACTTTCACCTCCTAAT-3’；

TaCDCP-2F：5’-ATGACGAAAAGGGAGGATCT-3’；

TaCDCP-2R：5’-TTAAGCACCTTCAGCTTTCT-3’。

以小麦品种矮抗58的cDNA为模板，用TaCDCP-1F和TaCDCP-1R组成的引物对进行PCR扩增，PCR产物进行1%琼脂糖胶电泳检测。回收后连接到PMD18载体（TAKARA），送生工进行测序；根据测序结果提取阳性质粒，以其为模板，用TaCDCP-2F和TaCDCP-2R组成的引物对再次进行PCR扩增，PCR产物进行1%琼脂糖胶电泳，回收后连接到PMD18载体（TAKARA），送生工进行测序；PCR参数：先94℃ 4 min；随后94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，共35个循环；再72℃ 10 min。

用上述类似的方法再以小麦品种矮抗58的DNA为模板，用TaCDCP-1F和TaCDCP-1R组成的引物对进行PCR扩增，PCR产物进行1%琼脂糖胶电泳检测。以得到的PCR产物为模板，用TaCDCP-2F和TaCDCP-2R组成的引物对进行巢式PCR扩增跑胶，回收后连接到PMD18载体（TAKARA），送生工进行测序；PCR参数：先94℃ 4 min；随后94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2min，共35个循环；再72℃ 10 min。

测序结果表明，以小麦品种矮抗58的cDNA为模板第一次PCR扩增得到的DNA片段为TaCDCP基因的cDNA序列，如序列表中SEQ ID NO.1所示，其长度为1527bp；以小麦品种矮抗58的cDNA为模板第二次PCR扩增得到的DNA片段为TaCDCP基因的完整开放阅读框架（ORF）序列，如序列表中SEQ ID NO.2所示，其长度为474bp，为序列表SEQ ID NO.1中自5'末端第494~967位的脱氧核糖核苷酸序列，并编码如序列表SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，氨基酸的个数为157；以小麦品种矮抗58的DNA为模板进行巢式PCR扩增得到的DNA片段为TaCDCP基因的基因组水平序列，如序列表SEQ ID NO.4所示，其长度为2387bp，包含7个外显子和6个内含子，6个内含子位置依次为56-141bp、207-863bp、913-1331bp、1391-1976bp、2093-2180bp和2239-2315bp。

实施例二 小麦VIGS阳性沉默植株的获得以及表型鉴定

用于VIGS实验的小麦品种是生产上大面积推广的郑麦9023，该品种对BSMV病毒侵染敏感。采用大田土和营养土1:1，再加入适量蛭石，进行盆栽。每盆含土800g。人工气候箱中（温度23/23℃白天/黑夜，光照强度5500Lx，光照时间16/8h光照/黑暗，相对湿度70%-75%）培养，每株作为一个独立的生物学重复，每个处理共10个重复。在人工气候箱中土培至2周，对叶片进行接种操作。接种1-2周后，进行病毒感染表型观察和阳性植株鉴定。在病毒感染14d后对阳性植株和对照植株进行为期2d的干旱条件下低温胁迫处理，而后进行表型观察，测定生理指标。具体步骤如下：

2.1病毒诱导的基因沉默（VIGS）

2.1.1 TaCDCP重组表达载体的构建

选取SEQ ID NO.2序列中自5’端第169至441位、长度为273bp的特异性DNA片段，插入BSMV-γ-PDS载体的Pacl和Notl双酶切位点之间得到的重组质粒即为TaCDCP的重组表达载体。具体步骤如下：

首先重新设计带酶切位点的引物：在引物的5’端前加上Pacl和Notl的酶切位点和保护性碱基，在正向引物的5’端前加CCTTAATTAA，在反向引物的5’端前加TATGCGGCCGC。上述引物序列如下：

TACDCP-F：5’-CCTTAATTAAGGGTGTGGACTGGCTGATAC-3’，带下划线碱基为限制性内切酶Pacl识别位点；

TACDCP-R：5’-TATGCGGCCGCAGCAGCTCTGACGACATTCC-3’，带下划线碱基为限制性内切酶Notl识别位点；

以小麦品种郑麦9023的cDNA为模板，进行PCR扩增，产物回收后连接到PMD19-T载体上，得到重组质粒PMD19-T-TaCDCP，送生工进行测序鉴定。提取BSMV-γ-PDS质粒，将鉴定过携带目的基因片段的质粒PMD19-T-TaCDCP进行Pacl和Notl的双酶切，回收，连接到以相同酶切后回收的BSMV-γ-PDS（Zhang et al., 2016）载体上，转化。经菌落PCR筛选阳性克隆，将阳性克隆送生工进行测序验证，完成TaCDCP重组表达载体的构建。测序结果表明：构建的TaCDCP的重组表达载体的cDNA片段，其两端分别具有Pacl识别位点和Notl识别位点，两个位点之间为序列表SEQ ID NO.2中自5’端第169至441位的脱氧核糖核苷酸序列。构建的TaCDCP重组表达载体质粒命名为BSMV-γ-TaCDCP。

2.1.2载体的线性化

提取BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ、BSMV-γ-PDS及BSMV-γ-TaCDCP质粒，然后参照Tian Gen公司质粒小提试剂盒（TIANprep Mini Plasmid Kit）方法提取质粒，并用2%的琼脂糖凝胶检测浓度。

BSMV-α、BSMV-γ质粒用MluI进行酶切；BSMV-β质粒用SpeI进行酶切；BSMV-γ-PDS质粒及BSMV-γ-TaCDCP质粒用BssHII进行酶切。37°C孵育2h，65℃温育15 min使酶失活2.1.3体外转录。

使用RiboMAX^TMLarge Scale RNA Production Systems-T7试剂盒将上述五种线性化的质粒进行体外转录，得到BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ、BSMV-γ-PDS及BSMV-γ-TaCDCP的体外转录产物，获取体外转录单链RNA。在微量离心管中加入上述反应物，37℃孵育2h。取0.5μL体外转录产物用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水稀释10倍，电泳检测结果如图1所示（图中M：DL2000Marker）。由图1可以看出，条带清楚，无拖尾。-80℃保存备用。

2.1.4病毒接种

将-80℃单独保存的BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ、BSMV-γ-PDS及BSMV-γ-TaCDCP的体外转录产物，参照Scofield等（Scofield et al. 2005）的方法，对两叶一心期的小麦品种郑麦9023幼苗进行病毒接种。具体步骤如下：将BSMV-α、BSMV-β及BSMV-γ的体外转录产物各2.5μL，按照等体积进行混合，共7.5μL，用DEPC处理水等体积稀释，将混合液加入270μL事先配好的FES缓冲液，制得285μL的接种病毒混合液，然后对郑麦9023幼苗进行BSMV病毒接种，记为BSMV₀植株，作为空载对照；同样，将BSMV-α、BSMV-β及BSMV-γ-PDS的体外转录产物各2.5μL，按照等体积进行混合，共7.5μL，用DEPC处理水等体积稀释，加入270μL事先配好的FES缓冲液，制得285μL的接种病毒混合液，然后对郑麦9023幼苗进行BSMV病毒接种，记为BSMV_PDS植株；将BSMV-α、BSMV-β及BSMV-γ-TaCDCP的体外转录产物各2.5μL，按照等体积进行混合，共7.5μL，用DEPC处理水等体积稀释，加入270μL事先配好的FES缓冲液，制得285μL的接种病毒混合液，然后对郑麦9023幼苗进行BSMV病毒接种，记为BSMV _TaCDCP 植株；未感染病毒的郑麦9023幼苗记为未沉默正常植株（non-stressed non-silenced，NS）。

病毒接种的具体过程如下：取8-10μL接种病毒混合液点加在戴有乳胶手套的食指上，与拇指轻轻接触，后磨擦幼苗第二叶叶片3次（摩擦时从叶片基部直至叶尖，能够听到轻微的吱吱声）；接种后喷少许DEPC处理水，室温保持23±2˚C，保湿、避光24h，再进行正常16/8h光暗周期培养。

在病毒接种14d后，对BSMV₀植株、BSMV_PDS植株、BSMV _TaCDCP 植株及未沉默正常植株NS进行干旱条件下的低温胁迫处理。经干旱条件下的低温胁迫的未沉默正常植株NS记为干旱条件下未沉默低温胁迫植株（dought-cold-stressed non-silenced，DS）。干旱条件下的低温胁迫的处理过程如下：50%田间含水量+2℃干旱条件下低温胁迫处理2d。

整个实验周期共16d，每次独立实验均设置BSMV₀植株、BSMV_PDS植株、BSMV _TaCDCP 植株及未沉默正常植株NS，定期观察、记录病毒侵染症状及表型。

2.2侵染病毒后的成功率统计

侵染病毒14d后病毒侵染表型症状最为显著，以21株为一组，每类BSMV₀植株、BSMV_PDS植株及BSMV _TaCDCP 植株分别调查三组，进行病毒侵染成功率的统计，结果如图2-A所示。从图2-A可知，第14d，BSMV_PDS植株、BSMV₀植株和BSMV _TaCDCP 植株的病毒侵染成功率分别为92%、90.4%、和85.7%。

2.3 TaCDCP基因的阳性沉默植株及相对表达量的鉴定

在干旱条件下的低温胁迫及病毒侵染后的第14d，用荧光定量（qRT-PCR）技术对BSMV₀植株、BSMV _TaCDCP 植株、未沉默正常植株NS和干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS进行阳性沉默植株及沉默效率的鉴定。

qRT-PCR用美国伯乐Bio-Rad IQ5 Real-Time PCR Detection System进行。20μL的反应体系，上下游引物各0.4μL，Go Taq® qPCR Master Mix (Perfect Real Time;Promega)10μL，nuclease-free water 7.2μL。程序：95℃ for 3 min，95℃ for 5 s，60℃for 30 s，72℃ for 30 s，40个循环数。取2μLPCR反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色，UV扫描成像后确认是否与扩增曲线结果吻合。以BSMV₀植株为对照，采用2^-△△CT法计算TaCDCP基因的相对表达量，结果如图2-B所示。从图2-B可知，与BSMV₀植株相比，未沉默正常植株NS的表达差异不显著；TaCDCP基因的阳性沉默植株BSMV _TaCDCP 的表达显著下降，其转录水平上平均下调3.7倍；干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS的表达显著上升，其转录水平上调2.2倍。

从表型鉴定及转录水平的表达结果可以说明TaCDCP基因受干旱-低温诱导表达，该基因的沉默会导致植株对干旱-低温环境的抗性变差。

2.4 TaCDCP基因的阳性沉默植株的表型观察及生理指标测定

2.4.1 经病毒侵染及干旱条件下低温胁迫后的表型观察结果

在病毒侵染的整个试验周期中（从1-16d），每天均进行植株表型观察。一周后，即可从第三叶基部观察到病毒侵染的表型。第14d病毒表型最为显著。如图3-A所示，由于BSMV接种后植株对病毒侵染的反应，BSMV₀植株和所有阳性沉默植株均可以观察到轻微的变色斑，即病毒侵染表型。

经过干旱条件下低温胁迫处理2d，叶片呈现下垂症状，如图3-B所示。由图3-B可知，与其它三种植株相比，BSMV _TaCDCP 植株叶片呈现更严重的下垂和萎焉，表明TaCDCP基因的沉默会导致植株对干旱条件下低温胁迫环境的抗性变差。

2.4.2 TaCDCP基因的阳性沉默植株的生理指标测定

测定植株株高、相对电导率、叶片相对含水量（RWC）的详细方法和步骤参照Zheng等（Journal of plant physiology, 2008, 5, doi: 10.1016/j.jplph.2008.01.001）进行。

干旱条件下低温胁迫2d，进行株高的测定，结果如图4-A所示。从图4-A可以看出，与未沉默正常植株NS相比，干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS以及阳性沉默植株BSMV _TaCDCP 的株高均有显著的下降；与干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS植株相比，阳性沉默植株BSMV _TaCDCP 的株高更低。

干旱条件下低温胁迫处理2d，进行电导率和相对含水量的测定，结果如图4-B所示。从图4-B可以看出，与未沉默正常植株NS相比，干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS的相对电导率显著增加；干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS与BSMV₀植株相比，相对电导率差异不显著，表明病毒侵染与否对植物的相对电导率是没有影响的；此外，与干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS和BSMV₀植株相比，阳性沉默植株BSMV _TaCDCP 的相对电导率显著增加，表明TaCDCP基因的沉默会导致植株在干旱条件低温胁迫环境下相对电导率的增加。相对含水量RWC在干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS和BSMV₀植株中的差异不显著；然而，与未沉默正常植株NS相比，相对含水量RWC在干旱条件下未沉默低温胁迫植株DS中显著下降；与BSMV₀植株相比，相对含水量RWC在阳性沉默植株BSMV _TaCDCP 中显著下降，表明TaCDCP基因的沉默会导致植株在干旱条件低温胁迫环境下相对含水量RWC的降低。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南农业大学

<120> 干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP及其编码基因和应用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aattactttc agcccaaatt ttgcgtcgct tgcttttctg gtctacgtgt agtgcacgga 60

ttaagcaact acgtagctcg cttgctttcg tgctcccctt aattggtaag cgcccagcct 120

gcttttgtag caacgacaaa gcagctggag tacaagggaa tgggccattt catcagaaag 180

aaaagaaacg atgtatcatc tgctatgctt ggggtttccc cagaagcaaa ttgttgcgtg 240

gagtggagga atcaatatct ccacataagc caggaagcag atcttgtgcc actccaccac 300

cagaggaact tggctgacag ctcaaatttc atggcccagc tcgtttcatt ctcgcacata 360

tattcctctc cccaaatact ggacaaaatg ttcttgctgc tgagtgctca tattcagcct 420

caaataatta atttgcttgt gttacatcct gcttactcag aataacaacg gcgggtacac 480

tgttggtgac ttcatgacga aaagggagga tctccatgtc gtcaaaacgt caactccggt 540

tgatgaagcg ctcgagatgc tggtgcagaa caggatctct ggttttcctg ttatcgatga 600

cgactgggag ttggttggcg ttgtctcaga ttacgatcta ttagctttgg actcaatggc 660

agggtgtgga ctggctgata cgaattcaaa tatgttccct gaagtagata gcacttggaa 720

gacatttcgc gagatccaga gactcttgag caaaaccagt ggcaaagtta tcggtgatgt 780

tatgactccc tcacctcttg tggtgcgtga aactactaac ctcgacgctg ctgcaaggtt 840

gctacttgaa actaaatacc acagattgcc tgttgttgat agcgcgggaa aattggttgg 900

gatgatcaca agggggaatg tcgtcagagc tgctctcgaa ataaagaaga aagctgaagg 960

tgcttaaatt agatggttct ttataaggac acccctgggg ttgaacctgc ggcaattcat 1020

caattcagct gaattgaaat attgactggt agcgcagaag cagattttcc ctggagcata 1080

gatggatata atgttgttta caatgtaata taagtagtgt aatgttgcag tgaaatttca 1140

tataggtatt gcatgaggac aattgcaatt catttgaggt gagcatactc agctgtctct 1200

ccatattagg tagtagtagc atggtatatg aaggttaatg ttcttttctc gatggcttgt 1260

acgagcctcg agcatgttaa agtgattcat atagtgcatt caaccctttg agatatgatg 1320

atgacctttc taattgtcca gaaaatgatt tcatcctaca accaatgagg ttgtagcaaa 1380

taatattaaa tcagatgcaa ggttttgttg caaccgtccc aacgctctta tattatggga 1440

tggagggtgt agtttccaac atataattca tgcaatcata ctgtggtgta caagttccaa 1500

acaatctatt aggaggtgaa agtggac 1527

<210> 2

<211> 474

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacgaaaa gggaggatct ccatgtcgtc aaaacgtcaa ctccggttga tgaagcgctc 60

gagatgctgg tgcagaacag gatctctggt tttcctgtta tcgatgacga ctgggagttg 120

gttggcgttg tctcagatta cgatctatta gctttggact caatggcagg gtgtggactg 180

gctgatacga attcaaatat gttccctgaa gtagatagca cttggaagac atttcgcgag 240

atccagagac tcttgagcaa aaccagtggc aaagttatcg gtgatgttat gactccctca 300

cctcttgtgg tgcgtgaaac tactaacctc gacgctgctg caaggttgct acttgaaact 360

aaataccaca gattgcctgt tgttgatagc gcgggaaaat tggttgggat gatcacaagg 420

gggaatgtcg tcagagctgc tctcgaaata aagaagaaag ctgaaggtgc ttaa 474

<210> 3

<211> 157

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Thr Lys Arg Glu Asp Leu His Val Val Lys Thr Ser Thr Pro Val

1 5 10 15

Asp Glu Ala Leu Glu Met Leu Val Gln Asn Arg Ile Ser Gly Phe Pro

20 25 30

Val Ile Asp Asp Asp Trp Glu Leu Val Gly Val Val Ser Asp Tyr Asp

35 40 45

Leu Leu Ala Leu Asp Ser Met Ala Gly Cys Gly Leu Ala Asp Thr Asn

50 55 60

Ser Asn Met Phe Pro Glu Val Asp Ser Thr Trp Lys Thr Ser Arg Glu

65 70 75 80

Ile Gln Arg Leu Leu Ser Lys Thr Ser Gly Lys Val Ile Gly Asp Val

85 90 95

Met Thr Pro Ser Pro Leu Val Val Arg Glu Thr Thr Asn Leu Asp Ala

100 105 110

Ala Ala Arg Leu Leu Leu Glu Thr Lys Tyr His Arg Leu Pro Val Val

115 120 125

Asp Ser Ala Gly Lys Leu Val Gly Met Ile Thr Arg Gly Asn Val Val

130 135 140

Arg Ala Ala Leu Glu Ile Lys Lys Lys Ala Glu Gly Ala

145 150 155

<210> 4

<211> 2387

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> Intron

<222> (56)..(141)

<220>

<221> Intron

<222> (207)..(863)

<220>

<221> Intron

<222> (913)..(1331)

<220>

<221> Intron

<222> (1391)..(1976)

<220>

<221> Intron

<222> (2093)..(2180)

<220>

<221> Intron

<222> (2239)..(2315)

<400> 4

atgacgaaaa gggaggatct ccatgtcgtc aaaacgtcaa ctccggttga tgaaggtgtg 60

gcccattctt cagttgtgtg cttctcttct gcttactcac cagcttccaa actgctaact 120

agttctttgg ttcgcgtgca gcgctcgaga tgctggtgca gaacaggatc tctggttttc 180

ctgttatcga tgacgactgg gagttggtta gtgccattta aatttaaccc actgctcttg 240

tttcctagtc catgttttgt acgacatagc taatcgcaga agataccgct ccttttctgg 300

aacaaaagat tttgggcggc aaatagagca ttgcaatccc aattaaaaaa ttcctatcca 360

tgcatttgga ccacatgatt gcatcaaaac aatttcatag aatgaggttt ttcctacaaa 420

tattggagga agttaaatat gagctctaac ctgatcatgg aaatttcctt ttgatagtcc 480

gaatgtatct tcgctcttta tctcttattc tctgattaat taacacctaa tctaaaattc 540

ctgatgtgca gcatcagaat aactcttcta agcaatccat gtgggattta atatgccatg 600

acaactcaat cctcttccta ccgttttaga ttcttgaatt tcagagaggg cttaaaagaa 660

cgattcttcc caaggaaaaa agggaagagg cctttcgttg ttctgtatca tgttatgtct 720

taggaagcat ttttgtattg caatgatgaa ctggctgact ttcacatgct ttcttcttga 780

gctttttctg ttggtttggg tcgcacacct ggttttctgt catgaaatac tcatccacaa 840

cgcaacttta ttcccacctg caggttggcg ttgtctcaga ttacgatcta ttagctttgg 900

actcaatggc aggtattcca tcttgaactt ctaatcattt ccttgcaaag aaatcataat 960

cacattagaa catattttct gagctgtaaa aatcaattca catatgcatt atcgtcgcat 1020

atcatccaga aggttctcag gatcttaatt cgaagcaccg gtttaaaaga atggccgatc 1080

tcttatgatc ttccaatcct ggattgaagg atttaaaaaa aaactcagct ataatatatc 1140

tacaacacac caatgctaac ggccatggtc ataaaatgtc ttttgctcct gtaagattca 1200

cggataaact tgaggtcatt cattcccaga ctttagtgcc tttgtagtac tctcagatgt 1260

actgaaatta tatctacaac acaatgaatc ttacaagttt tgtcaatatt taatacatta 1320

tcatgcttca gggtgtggac tggctgatac gaattcaaat atgttccctg aagtagatag 1380

cacttggaag gtatattctg taaaaccttg tttgatgatt ttatttttta tatttcctaa 1440

gtatgcatgt cttttcatat gttgagtttt ataacttcca tgtgttggga ttttctgtaa 1500

tgagaattta tcatcttata atgaggattt atcatgtgtt ctggtttgca aggcaggaat 1560

tttctgtaat gagaatttat catctttcta tgttgagaaa cagtgatcta gcaaatgttt 1620

cagcaccctc aatggattaa aatatgtttg gtaatagtaa tataatactg ttgactaaat 1680

agcaccacct ctgtttttaa atgttgaact gccaaaacgt cttacattta ggaacaggga 1740

gtgtataata tactgtgccc ggtgaaactg ttggtgtaat taaacatgtg ttgtggagca 1800

aattgtcact ggttttctct actcaagaat gtgggacatt attggattag gtgccgtata 1860

attaacttac atagtatgta acattcatag tatccagtta ttctttaatt gtgtgttccc 1920

actcaatgtt cttggttcag taacttacag actccttcct aaccacttga gtgcagacat 1980

ttcgcgagat ccagagactc ttgagcaaaa ccagtggcaa agttatcggt gatgttatga 2040

ctccctcacc tcttgtggtg cgtgaaacta ctaacctcga cgctgctgca aggtattttc 2100

aactaatccg tgtgaatccc cagcgctaaa tcggctgact tattattact gagagtggtg 2160

ttctttttat tgttcaacag gttgctactt gaaactaaat accacagatt gcctgttgtt 2220

gatagcgcgg gaaaattggt gagtggatga atctatgact tcccttttct ctctttagct 2280

cagtgtctta aaacgaaatt tctatcctga actaggttgg gatgatcaca agggggaatg 2340

tcgtcagagc tgctctcgaa ataaagaaga aagctgaagg tgcttaa 2387

Claims (8)

1.一种干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP，其特征在于，所述蛋白TaCDCP的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

2.一种干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因，其特征在于，所述蛋白TaCDCP的编码基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示，其长度为474bp。

3.扩增权利要求2所述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因的全长序列的引物对，其特征在于，所述引物对如下所示：

TaCDCP-1F：5’- AATTACTTTCAGCCCAAATT-3’；

TaCDCP-1R：5’- GTCCACTTTCACCTCCTAAT-3’；

TaCDCP-2F：5’- ATGACGAAAAGGGAGGATCT-3’；

TaCDCP-2R：5’- TTAAGCACCTTCAGCTTTCT-3’。

4.含有权利要求2所述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因的重组表达载体、酶切线性化的质粒。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将如序列表SEQ ID NO.2所示序列中自5'末端第169~441位的特异性DNA片段插入BSMV-γ-PDS载体的Pacl和Notl双酶切位点之间得到的重组质粒。

6.一种干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的基因功能的验证方法，其特征在于，包括以下步骤：将BSMV-α、BSMV-β与权利要求4或5所述重组表达载体的体外转录产物按照等体积混合后涂抹目标植株，得到TaCDCP基因的阳性沉默植株。

7.权利要求6所述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的基因功能的验证方法在小麦育种中的应用。

8.权利要求1所述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP、权利要求2所述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因或权利要求4所述干旱条件下小麦低温胁迫响应蛋白TaCDCP的编码基因的重组表达载体、酶切线性化的质粒中的至少一种在小麦育种中的应用。

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