CN109112148A

CN109112148A - 水稻OsMPK1基因在改良水稻抗病性中的应用

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Publication number: CN109112148A
Application number: CN201710669352.XA
Authority: CN
Inventors: 王石平; 马海港; 陈洁
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-08-08
Filing date: 2017-08-08
Publication date: 2019-01-01
Anticipated expiration: 2037-08-08
Also published as: CN109112148B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及水稻OsMPK1基因在改良水稻抗病性中的应用。本发明包含水稻抗病相关基因OsMPK1的DNA片段的分离克隆和功能验证。OsMPK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示，该蛋白的编码产物为一种丝裂原活化蛋白激酶。超量表达OsMPK1的转基因植株对细菌性条斑病的抵抗能力显著增强。

Description

水稻OsMPK1基因在改良水稻抗病性中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及水稻OsMPK1基因在改良水稻抗病性中的应用。本发明包括水稻OsMPK1基因的分离克隆以及调控水稻应对病原入侵的功能验证和应用。OsMPK1基因促进水稻抗病。超量表达OsMPK1基因的转基因植株抵抗水稻细菌性条斑病的能力显著增强。

背景技术

植物在生长过程中会遭受各种病原物的侵害，如细菌、真菌、病毒和线虫等。为了应对侵害，在漫长的进化过程中，植物进化出了一些基因用于保护自身。发掘并利用这些基因来改良植物的抗病性，是在保护环境的前提下防治病害的首选策略。

参与植物抗病反应调控的基因主要分为两类：一类是受体基因，包括主效抗病(major disease resistance,MR)基因和模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)基因；另一类是抗病相关基因，即除受体基因外，其他所有参与抗病反应调控的基因(Kou和Wang,2010；Zhang和Wang,2013)。受体基因的编码产物能够识别病原菌并启动抗病信号的传导，而抗病相关基因的编码产物则参与组成抗病信号传导网络。抗病相关基因的编码产物受病原菌诱导后升高或降低，因此可以根据病原诱导前后基因表达的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)。由于绝大多数抗病相关基因的产物不直接与病原蛋白相互作用，且其参与的抗病反应没有病原特异性，因此它们所介导的抗性具有持久性和广谱性。尽管水稻中已经鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，人们对部分水稻抗病相关基因的机理也进行了深入研究(Ke等，2017)，但是对大多数抗病相关基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变还不清楚。

水稻是研究单子叶植物的模式植物，同时也是世界上最主要的粮食作物之一。然而在实际生产中，各种病害的影响常常造成水稻产量和品质的下降，对粮食的安全形势造成非常严重的影响。危害水稻的各种病害中，由革兰氏阴性菌黄单孢杆菌条斑致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)引起的水稻细菌性条斑病(细条病)属于我国植物检疫性病害，正越来越严重地影响水稻的生产(Li和Wang，2013)。实践和研究表明，发掘和利用优良抗性基因资源改良水稻是控制病害发生、减少或避免病害所带来的损失最经济有效的措施。通过超量表达作为抗病反应正调控因子的一些基因来进行水稻品种的改良，能够达到抵抗病害的目的。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是在水稻品种中分离克隆水稻OsMPK1基因的完整DNA片段。在水稻全基因组序列数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中，OsMPK1的位点为LOC_Os06g06090。利用超量表达技术使该基因在转基因受体中超量表达，鉴定该基因在水稻抗病反应中所起的作用，从而为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。

本发明的技术方案如下所述：依据水稻全基因组序列数据库中位点LOC_Os06g06090的序列信息，采用PCR技术从水稻品种中花11中获得OsMPK1基因的序列，在大肠杆菌中表达OsMPK1蛋白并证明OsMPK1蛋白具有激酶活性。同时采用农杆菌介导的遗传转化方法在水稻中超量表达OsMPK1基因，对遗传转化植株进行抗病性分析，证明超量表达OsMPK1基因能够增强水稻的抗病性。

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，分离得到一种包含OsMPK1基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予水稻对细条病害产生抗性反应。所述片段的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或者其功能相当于SEQID NO：1所示序列的亚片段。对其序列进行分析表明它编码一种丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)。超量表达SEQ ID NO：1所示序列可以增强水稻对细条病的抵抗能力。

可以采用已经克隆的OsMPK1基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsMPK1基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsMPK1基因的序列或者包含一段OsMPK1基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，并超量表达OsMPK1基因，产生抗病转基因植物。

本发明为增强水稻对细条病菌的抵抗能力提供了一种新的方法。这种方法包括将OsMPK1基因的完整编码区的基因组片段与能够超量表达目标基因的载体连接、转入水稻，通过超量表达OsMPK1基因改良水稻对细条病的抵抗能力。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的OsMPK1基因的核苷酸序列。其中该序列的118-5961位序列是该基因的编码区。

序列表SEQ ID NO:2是OsMPK1基因编码的蛋白质序列。

图1：本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因OsMPK1以及验证OsMPK1基因功能的流程图。

图2：OsMPK1基因的结构。“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。无黑框的数字表示每一种结构的核苷酸数目。有黑框的数字表示本发明中来源于中花11的OsMPK1基因与日本晴中的OsMPK1基因的序列差异位点(4105位在日本晴中为G，在中花11中则为C)。

图3：OsMPK1蛋白具有激酶活性。附图标记说明：图3中的A图为聚丙烯酰胺凝胶显影定影后的X-光片图，图3中的B图为考马斯亮蓝染色并脱色后的聚丙烯酰胺凝胶图。泳道1表示髓磷脂碱性蛋白(meylin basic protein)自磷酸化结果，泳道2表示OsMPK1蛋白磷酸化髓磷脂碱性蛋白(meylin basic protein)的结果，泳道3表示OsMPK1蛋白自磷酸化结果。

图4：是本发明起始转化载体pU1301的图谱。

图5：是本发明所用遗传转化载体D257U的结构示意图。附图标记说明：RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，GUS表示β-葡糖苷酸酶基因，Hpt表示潮霉素磷酸转移酶基因，P_Ubi表示玉米泛素基因启动子，TEVL表示烟草蚀刻病毒的5′非翻译区，NOS表示胭脂碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号。

图6：T₀代遗传转化植株(D257UZ1)中OsMPK1基因表达量分析。附图标记说明：对照为水稻品种中花11(遗传转化的受体)。遗传转化植株中OsMPK1基因的表达量是相对于对照中花11中OsMPK1基因的表达量。每个数据是平均值(3个重复)±标准差。双星号(**)表示与对照相比，转基因植株中OsMPK1基因的表达量极显著(P＜0.01)增加。

图7：T₁代遗传转化植株(D257UZ1)对细条病菌RH3的抗性增强与OsMPK1基因表达量增加共分离。附图标记说明：图7中的A图和B图分别为1号遗传转化植株(D257UZ1-1)的T₁代接种细条病菌的病斑长度和OsMPK1基因表达量，图7中的C图和D图分别为9号遗传转化植株(D257UZ1-9)的T₁代接种细条病菌的病斑长度和OsMPK1基因表达量。对照是遗传转化受体中花11。病斑长度为接种细条病菌RH3两周后的数据，每个数据是平均值(6个重复)±标准差。星号(*)或双星号(**)表示与对照相比，转基因植株的病斑长度显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)减小，以及转基因植株中OsMPK1基因的表达量显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)增加。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明。图1描述了鉴定和分离克隆OsMPK1基因以及验证OsMPK1基因功能的流程。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：确定水稻品种中花11中的OsMPK1基因的序列和结构

1.水稻品种中花11中的OsMPK1基因的序列的克隆

根据Hamel等(2006)所述，水稻全基因组序列数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中的LOC_Os06g06090位点中包含有水稻品种日本晴中的OsMPK1基因的序列信息，其对应的cDNA序列(来自于日本晴)信息在GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的注册号为AK111942，该cDNA序列长1740bp。

本发明研究人员依据上述公布的序列信息，设计了两对PCR引物MPK1-genome-1F(5′-AGAGCTACAAAACGAGGCCGA-3′)、MPK1-genome-1R(5′-GGCCTAGACAAGCAAGAGAATCC-3′)和MPK1-genome-2F(5′-TGGCTTTTCTGGTCTGCTTGG-3′)、MPK1-genome-2R(5′-GATCAACTCCAAACTGCCACCAC-3′)，从中花11叶片的DNA中分别扩增得到两条包含OsMPK1基因部分片段的DNA片段。然后将这两条DNA片段混合后作为模板，用引物MPK1-genome-1F和MPK1-genome-2R扩增得到包含OsMPK1全部基因的DNA片段。将扩增得到的片段与T-A克隆载体pGEM-T(美国Promega公司)连接。利用美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法(美国Applied Biosystems公司)对阳性克隆进行测序，得到一条长6408bp的DNA序列，它包括完整的OsMPK1的基因组序列。

2.水稻品种中花11中的OsMPK1基因的结构分析

为了获得中花11中OsMPK1基因的全长cDNA，参照Zhou等(2002)的方法，研究人员首先提取了中花11叶片中的总RNA，然后取5μg总RNA，加入DNaseⅠ(美国Invitrogen公司)去除基因组DNA后作为模板，用oligo(dT)₁₅寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录得到总cDNA。利用实施例1.1中的PCR引物MPK1-genome-1F和MPK1-genome-2R，以总cDNA为模板，扩增得到包含OsMPK1基因全长cDNA的片段。然后将扩增得到的片段与T-A克隆载体pGEM-T(美国Promega公司)连接，对阳性克隆进行测序，得到OsMPK1基因全长cDNA的序列信息。

比较分析OsMPK1基因的基因组序列和cDNA序列，确定OsMPK1基因由6408个核苷酸组成，包含6个外显子，5个内含子(图2)。第一个外显子由245个核苷酸组成(位于序列表SEQID NO:1的118-362bp)，第一个内含子由87个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的363-449bp)，第二个外显子由130个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的450-579bp)，第二个内含子由2557个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的580-3136bp)，第三个外显子由138个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的3137-3274bp)，第三个内含子由1059个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的3275-4333bp)，第四个外显子由333个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的4334-4666bp)，第四个内含子由331个核苷酸组成(位于序列表SEQ IDNO:1的4667-4997bp)，第五个外显子由181个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的4998-5178bp)，第五个内含子由613个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的5179-5791bp)，第六个外显子由170个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO:1的5792-5961bp)。该基因的编码区由5844个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的118-5961bp处)，5’端非翻译区(untranslated region，UTR)由117个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1-117bp处)，3’端UTR由447个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的5962-6408bp)(图2)。将本发明中来自中花11的OsMPK1基因序列同日本晴中的OsMPK1基因序列进行比较，发现两者仅在第三个内含子处有一个碱基的不同。在水稻品种日本晴中该处碱基为G，而中花11中该处碱基为C。

3.OsMPK1基因编码的蛋白质具有激酶活性

OsMPK1基因的编码区编码398个氨基酸。Hamel等(2006)的研究中认为该基因编码的蛋白属于丝裂原活化蛋白激酶家族中的MAPK蛋白。为了验证OsMPK1蛋白是否具有激酶活性，本发明的研究人员在大肠杆菌中表达并纯化了OsMPK1蛋白，用于体外激酶活性分析。具体操作如下：以实施例1-2中含有OsMPK1基因全长cDNA序列的T-A克隆载体为模板，用PCR引物MPK1-F(5′-GGATCCATGGACGCCGGGGCGC-3′)(下划线为BamHI酶切位点)和MPK1-R(5′-CTCGAGCTACTGGTAATCAGGGTTGAACGCA-3′)(下划线为XhoI酶切位点)扩增OsMPK1基因的完整编码区。用BamHI和XhoI消化PCR扩增产物后，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后回收目标DNA片段，用T4-DNA连接酶将其连入表达载体pET28a(德国Novagen公司)。蛋白表达步骤参照随该表达载体提供的说明书。蛋白纯化采用6×His融合蛋白纯化试剂盒(德国Qiagen公司)，操作参照说明书。体外激酶活性实验参照已经报道的方法(Ning等，2010)，具体步骤如下：蛋白在含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM MgCl₂，10mM MnCl₂，1mM DTT，0.1mM ATP和5μCiγ-³²P-ATP的缓冲液中于室温孵育30分钟，之后加入5×SDS-PAGE加样缓冲液(上海生工生物工程股份有限公司)，沸水中煮3分钟，取出冷却至室温，用12％的聚丙烯酰胺凝胶分离后置于X-光片上，暗夹中放置5小时后于暗室进行显影并定影。

结果显示，OsMPK1蛋白大小约为48kDa，与预测的大小相符；OsMPK1蛋白具有自磷酸化活性，且能够磷酸化髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein)(图3)。髓鞘碱性蛋白(美国Sigma公司)通常作为底物用来检测丝裂原活化蛋白激酶的活性。这些结果显示OsMPK1蛋白具有自磷酸化以及磷酸化底物的能力，表明该蛋白属于典型的丝裂原活化蛋白激酶家族。

实施例2：OsMPK1基因的功能验证

本发明采用农杆菌介导的遗传转化方法，通过在水稻品种中花11中超量表达OsMPK1基因，进一步验证该基因的功能。

1.遗传转化载体的构建

本发明所用的起始载体是常用载体pU1301(图4，Qiu等，2007)。它是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。

以实施例1-2中含有OsMPK1基因全长cDNA序列的T-A克隆载体为模板，用PCR引物3-MPK1-F(5′-GGTACCATGGACGCCGGGGCGC-3′)(下划线为KpnI酶切位点)和3-MPK1-R(5′-GGATCCCTACTGGTAATCAGGGTTGAACGC-3′)(下划线为BamHI酶切位点)扩增OsMPK1基因的完整编码区。用KpnI和BamHI消化并回收目标DNA片段，用T4-DNA连接酶将其连入载体pU1301。申请人将该重组载体命名为D257U(图5)。

2.遗传转化和T₀代遗传转化植株表达量分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D257U导入水稻品种中花11。具体的操作步骤在上述参考方法的基础上改良如下：

(1)诱导愈伤组织：将水稻品种中花11的成熟种子去壳后，用0.15％的氯化汞浸泡消毒20分钟，每隔5分钟剧烈震荡一次。之后在无菌操作台上用灭菌蒸馏水清洗种子5次。将种子放置在诱导培养基上(成分见后)，置于暗室培养一个月，温度为25±1℃。

(2)愈伤组织继代：在无菌操作台上挑取亮黄色、质地紧密且干燥的愈伤组织，放置在继代培养基上(成分见后)，置于暗室培养两周，温度为25±1℃。

(3)愈伤组织预培养：在无菌操作台上挑取亮黄色、质地紧密且干燥的愈伤组织，放置在预培养基上(成分见后)，置于暗室培养两周，温度为25±1℃。

(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养含有D256U载体的农杆菌EHA105(来源于CAMBIA，商用菌株)，培养时间为两天，培养温度为28℃；之后将上述农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)，于28℃摇床上培养2-3小时。

(5)农杆菌侵染愈伤组织：调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀数值为0.8-1.0，将预培养后的愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟，之后转移至无菌滤纸上吸干，然后放置在共培养基(成分见后)上于黑暗处培养3天，培养温度为19℃。

(6)愈伤组织选择培养：用灭菌蒸馏水彻底清洗愈伤，之后转移愈伤至无菌滤纸上吸干，将愈伤转移至选择培养基(成分见后)上培养2-3次，每次2周。

(7)愈伤组织分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上于黑暗处培养5-7天，之后转移至分化培养基上(成分见后)，于光照培养室内培养，温度为26℃。

(8)遗传转化苗生根处理：剪去分化得到的遗传转化苗的一部分根，将其转移至生根培养基中，于光照培养室内培养2-3周，温度为26℃。之后将遗传转化苗移栽在土壤中。

遗传转化中所用的培养基组分及其配方如下：

(1)试剂和溶液的缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

于室温下逐一溶解，最后定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制：

于室温下逐一溶解，最后定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制：

准备800ml的去离子水并加热至70℃，加入3.73克的乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，最后定容至1000ml。

4)维生素贮存液(100X)的配制：

加去离子水定容至1000ml。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制：

室温下逐一溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制：

室温下逐一溶解并定容至1000ml。

7)2,4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2,4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml，溶解后分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液的配制：

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入对应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入对应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

申请人将最终获得的遗传转化植株命名为D257UZ1(其中前面部分为遗传转化载体名称，Z1代表水稻品种中花11)。本发明共获得独立转化植株14株。在抽穗期阶段取植株的剑叶，抽提RNA，采用qRT-PCR技术检测转化植株中OsMPK1基因的表达量。结果显示，与对照中花11相比，所有的阳性遗传转化植株中OsMPK1基因的表达量极显著升高(P＜0.01)(图6)。

3.T₁代遗传转化植株的抗病性分析

为检测OsMPK1基因表达量升高的遗传转化植株是否对细条病表现出抗性，本发明的研究人员选取T₀代OsMPK1基因表达量升高的2株遗传转化植株(D257UZ1-1和D256UZ1-9)的T₁代家系进行表达量检测和抗病性分析。接种处理是采用针刺法(Chen等，2006)接种水稻叶片。在孕穗期接种细条病菌RH3，接种两周后调查，同时取样抽提RNA，采用qRT-PCR技术检测转化植株的相对表达量。结果显示，T₁代遗传转化家系中，与对照中花11相比，OsMPK1基因表达量升高的植株对细条病菌RH3的抗性极显著增强(P＜0.01)，而OsMPK1基因表达量没有升高的植株对细条病的抗性没有变化(图7)。

4.T₂代遗传转化植株的抗病性分析

为确定D257UZ1遗传转化植株对细条病表现出的抗性是否能够稳定遗传，本发明的研究人员进一步对上述2株T₀代遗传转化植株(D257UZ1-1和D257UZ1-9)的T₂代家系进行了抗病性分析。每个家系选取5个单株，在孕穗期接种细条病菌RH3，接种两周后调查。结果显示，与对照中花11相比，这些阳性遗传转化植株对细条病菌的抗性极显著增强(P＜0.01)(表1)，其病斑长度减少了大约22％至26％，表明超量表达OsMPK1基因所赋予水稻的对细条病的抗性能够稳定地遗传。

表1 T₂代遗传转化植株(D257UZ1)接种细菌性条斑病菌RH3的表型

⁽¹⁾每个家系选取5株遗传转化植株，每株接种1片剑叶，每片剑叶接种两个点，14天后调查病斑长度，每个数据来自所有接种叶片的平均值±标准差。

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SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 水稻OsMPK1基因在改良水稻抗病性中的应用

<130>

<141> 2017-08-07

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 6408

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(6408)

<223>

<220>

<221> 3'UTR

<222> (5962)..(6408)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (5792)..(5961)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (5179)..(5791)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (4667)..(4997)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (4998)..(5178)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (4334)..(4666)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (3137)..(3274)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (580)..(3136)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (3275)..(4333)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (450)..(579)

<223>

<220>

<221> Intron

<222> (363)..(449)

<223>

<220>

<221> exon

<222> (118)..(362)

<223>

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(117)

<223>

<400> 1

agagctacaa aacgaggccg aaagcgacca aatctcgcga cgaattccgc ctccactttc 60

ccttcccttc ctcctccacc tccacctcct cgtcgcgatc caaatccgaa tccggcc 117

atg gac gcc ggg gcg cag ccg ccg gac acg gag atg gcg gag gcc ggc 165

Met Asp Ala Gly Ala Gln Pro Pro Asp Thr Glu Met Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

ggc ggg cag cag ccg cct gct gcg gct gcg gcg gcg ggg gcg ggg gca 213

Gly Gly Gln Gln Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala

20 25 30

ggg gcg ggg atg atg gag aac atc cag gcg acg ctg agc cat ggc ggg 261

Gly Ala Gly Met Met Glu Asn Ile Gln Ala Thr Leu Ser His Gly Gly

35 40 45

agg ttc atc cag tac aac atc ttc ggg aac gtg ttc gag gtc acc gcc 309

Arg Phe Ile Gln Tyr Asn Ile Phe Gly Asn Val Phe Glu Val Thr Ala

50 55 60

aag tac aag ccc ccc atc ctc ccc atc ggc aag ggc gcc tac ggc atc 357

Lys Tyr Lys Pro Pro Ile Leu Pro Ile Gly Lys Gly Ala Tyr Gly Ile

65 70 75 80

gtc tg gttcgtttgc tcccccctct ctcccattcc gttggcggcg gcggcctgat 412

Val Cys

tttggtttgg attttggatt ttgggtttgg atgacag c tcg gcg ctc aac tcg 465

Ser Ala Leu Asn Ser

85

gag acg ggg gag cag gtg gcg atc aag aag atc gcc aac gcg ttc gac 513

Glu Thr Gly Glu Gln Val Ala Ile Lys Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp

90 95 100

aac aag atc gac gcc aag cgc acg ctc agg gag atc aag ctg ctc cgc 561

Asn Lys Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg

105 110 115

cac atg gac cac gag aat gtcagtgctc ccgatccgct ccattgtttc 609

His Met Asp His Glu Asn

120 125

gaccacggaa ttcccttccc ccccacccac cctcgatttt taggcgcaga ttttgagatt 669

ctcgttgaat gctcttgtct ctggttagtt aagttggttg cattaaatgg ggaaaggagg 729

aggaggtgag ggttaggtta ccaaatgatt gagttcgtca ctgctcggcc taatttggta 789

gagcttttcc ctccattctt gctgctgatg atgagtgctg cgagcttcag aaatagaggt 849

aactttggag atgcctttaa agaagccatc tgccttttgg ggatgttgtt attcattgtg 909

ttcttgaata gtgggggagc gagtgatgtg aacagacctg acctggagag tagcaacatc 969

acatgattct cgtacgtgct gatgtcacaa gccacaacta gcttgaggag gaggaggagg 1029

aggaggagga ggaggaggac caatctggtg ttacaccttt ttcctaagtc agtcaaatcc 1089

agtctgaatg cagtgggagt gactgccagt ggggagggaa ttaggggata ggagtactag 1149

gaattgtgtt attgttggaa agttttgaga ttgactttgt gtgtgcatgt tggacttgga 1209

cctttgaaat ttaccaattt aaagactgac taataggagt agcccactgt tgtatttcct 1269

gcgtaggcct gaagtatcat tttcagctta ccagaggcaa catatttttt ctatggttag 1329

tggtagaaag acagccacag gggaagtgaa ttagagaata ggccatatct tcatagccag 1389

ccctagaaaa actcagcttc ttctgaagag gtgaattaaa tttggatggt cataaatatt 1449

ccgttataat taaactagtg gattttccca tgcaaatatg agaggagcta gatttaaaat 1509

tagagttata ttttgtatag aatttactgg tcaacctgga ccgttgtaat ctagacccac 1569

cactataata aacgggcata tatttatctt ttttccccga ttaatgtcgt tattctaggc 1629

ttctagattg aacgtggtgg cacccttttg caccctcttt attataacat aatagatcaa 1689

ttgatacttc cctaaaaaag gttcatacaa aaagttgctc agatactgct tttgctgaac 1749

catagactgg ttgacacagg catacacaaa tgcatgctca tgcctttttt tggaagtttt 1809

ttcaaactaa aactgatcca ttttgtttgt atcctactgc agaaagagaa gtgtttaatt 1869

tcaggtttta gtgctccaat tatgcagggg aggcttttgg gagttatacc agttacgggt 1929

gtttgtagaa aacgatcgga ttaggcaaat tttggagtag aagtccttag ataatgcacc 1989

tgctttattg ccatcagcta agattgtgta tcaagtcaaa ttctactttt caaatctggc 2049

tataaattca attgtatgta cggaaagttg gaaacatgag ctaagatttg tacatcaagt 2109

ccaattctac ttttaaaata tagcttgcac aaaaaatggc tattttgcat tattacataa 2169

aacattactt ccaaattggc gatcctgtat tctgaaagat gtattggaac tttttttttg 2229

tcatgtgcac gtgctgcagg ttggctgcag acagaaggca gcagcccgag tagcgatttc 2289

tggctgcagt atattacttc aataccaagt tatcatttaa ttatgaagtg cactaagctg 2349

ttgctttcta tgtacatgta agcttatcta tgagataaaa aaacaaacaa acaaaaaaag 2409

cccgtggtta ggatggcttg cggcattcag ctaagtcgag aaaaatgccc ctgaacgtgg 2469

cacgtcactg ggcatgctta acctcacgcg gggagcactc ttctaccagc attaacgagg 2529

ggggattttt tttgtgcaaa acctgggctt gagccttggt cggtgtcccc tctaccagag 2589

actctaccac tgtgctacac acacgtttgt tcagcttatc tatgagataa attattagaa 2649

tcctctacat aagttattag aattatgcaa agtctcctcc attgcttcct tctattgatc 2709

tattatatgt ccatcttcgt ctaaagccct ttactagtca ctattcaagt catcattagc 2769

ttgctgttca tccccattac acactctaat tttcatttta agggaaatgc atgttggtct 2829

gcctccttaa aaaaccacca tgtttgagcg tttaaatggc aaaaacactt gagctataac 2889

attaagccat catgaataag atagatctct ttgtcaagtc attttcatat ggtatttcct 2949

ggtccatgca atatgtttgt tcttgctttg gttggtctgg acatagttga tttacttatt 3009

ttatctactc ctataagata tttggagctg gtctgttgta tttcacatat ccagcaagct 3069

cttgtgtttg cacatcgatg ctccaaaagg caataacttg tctcaacttc ctacttatgt 3129

gatgcag att gtt gcc ata agg gat atc ata cct cct cca caa agg aat 3178

Ile Val Ala Ile Arg Asp Ile Ile Pro Pro Pro Gln Arg Asn

130 135

tca ttc aat gac gtt tat att gca tat gaa ttg atg gat act gat ctg 3226

Ser Phe Asn Asp Val Tyr Ile Ala Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu

140 145 150 155

cat caa att att cgc tca aat caa gca ttg tca gag gag cac tgc cag 3274

His Gln Ile Ile Arg Ser Asn Gln Ala Leu Ser Glu Glu His Cys Gln

160 165 170

gtaccttctt caaaagaaaa acacaacttt atttccactt tagcatttat ttcatacaaa 3334

tggcttttct ggtctgcttg gattctcttg cttgtctagg cctctgctca aattgagttt 3394

tcaagaccta aaaagtggga agtattgaag tatgtattga tggtttataa atgttttgtg 3454

taagaactat aaggaatttg gtacaaaagg ttgaatgtaa agcttttatg gtaattttgt 3514

atcacatttt aagaattctg caggtatgca taatctttga aattaagaaa cgaatttagc 3574

gacctactaa tatacctgaa cgtacctttg ccctgcaaag catatatgca aagtgctaca 3634

attaggttat ctcagtgcac cattgatcat tggatcaaac taacgttttc tttggagata 3694

ccatattatt tgctaaccga tataaaatcg aataatgagt tgattgctat ttatcagtag 3754

accacatact gttaggagct ggcggcaagg caccgcagct ccgaaggttg tagcagtgct 3814

tgacgggagg gtgatgccga tgccctcgcc tcccacaaag ccatggtgag gagaaacaga 3874

gaaaagagtg gccttatata ggcgattaca atctgctaat gaatcagaac taactgaaac 3934

aaacctcaaa tcttaaggga taactcttat ctaatgcaag caacagataa cggcgagaac 3994

gacactgtgg cgtgccatgc acgctcaccg aactcgtgtt cttgagacat tcaaaggatt 4054

ccccacataa cacattcaac gtgagaaggg ttcaatgccc aatcacactg cagaggtctt 4114

gctgtattgc agcttgcaag ctcttatgat caatgctaca gatagatctc tccctttctt 4174

gagtggaact ctagaatggc tgcctcacct atctttcctt atccagataa cttgattgtg 4234

ttctcttgta ttttccttgt gcatgcatct accatgttct gagaaataat acatgtttgg 4294

tataactgtt cttgcgtaat tctttacctt tttgtgcag tat ttc ctt tat cag 4348

Tyr Phe Leu Tyr Gln

175

att ctc cgt ggc ttg aag tat ata cat tca gca aat gtc ctt cac cga 4396

Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg

180 185 190

gac ttg aag ccc agc aac cta ctt ttg aat gca aat tgt gac ctc aaa 4444

Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys

195 200 205

att tgt gat ttt gga ctt gct cgt acc acc tca gaa acc gat ttt atg 4492

Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Thr Ser Glu Thr Asp Phe Met

210 215 220

act gag tat gtt gtc aca aga tgg tat agg gca ccg gaa ctt ctg ttg 4540

Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu

225 230 235 240

aat tcc tct gaa tat act gca gca att gat gtg tgg tct gtg ggc tgt 4588

Asn Ser Ser Glu Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys

245 250 255

att ttt atg gaa ctc atg gat cgt aaa cct ttg ttt cct gga aga gat 4636

Ile Phe Met Glu Leu Met Asp Arg Lys Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp

260 265 270

cat gtc cat caa tta cgt cta cta atg gag gttagaacac actcttatct 4686

His Val His Gln Leu Arg Leu Leu Met Glu

275 280

tttgaacttt attttatatt gaattgatca ggttatgttg tgtggtcata tatttagcat 4746

aactggagta ctgttttgga aatatataat atgttgatta tcctatggga atatgttaaa 4806

actaaggaaa atgcaaagag gagagaattt atgttgctcc agaaggtcct ggctttctgg 4866

ctgatatgca ggatactgaa ttctgagtca tggctattaa tacaaacgca tttctcacta 4926

gaggatttat atactatctg tttcacatta ttgtgtgttt gattttccta tcataaattt 4986

cttaattgca g ctc atc gga acg cca aat gag gct gat ctg gat ttt gta 5036

Leu Ile Gly Thr Pro Asn Glu Ala Asp Leu Asp Phe Val

285 290 295

aat gaa aat gca aga aga tac att cgc caa ctt cct aga cat gca agg 5084

Asn Glu Asn Ala Arg Arg Tyr Ile Arg Gln Leu Pro Arg His Ala Arg

300 305 310

cag tcc ttt cct gaa aaa ttt cca cat gtt cat cct tta gca att gat 5132

Gln Ser Phe Pro Glu Lys Phe Pro His Val His Pro Leu Ala Ile Asp

315 320 325

ctg gtt gaa aag atg ctg aca ttt gat cct aga cag aga ata aca g 5178

Leu Val Glu Lys Met Leu Thr Phe Asp Pro Arg Gln Arg Ile Thr

330 335 340

gtcagtattg gcatagtatg ttttagtgat ttaaagggca tttgaatgtt gtttttgcca 5238

tcttatctat cttgccaata gcaagtaaaa aataggcctt tctcctaaag aaagaaaaga 5298

gtgaaagaag cctttgaaag ccctcataaa ctatggtttt ttttaacacc atgtctacct 5358

ttcttttaat ctgccactgg ccatttctag ttagcgttta ccacttccta tctgttttaa 5418

gatagaaagt aacaactgca gtggatactt aaatatattt gtagagcatc tgtgcatgac 5478

ttctatatta ctaaatcaca tgcaaaccta aatatttttt ttaaaaaaaa aaactatgtc 5538

gatccttttt acctcttgat ccaccctaac ctaatccagg tggtataggt gtgtcatcac 5598

tttattctta atgcgtgaat tgagcatcat tcttaactca taggtgggaa tgttgaaaga 5658

gtcattgcct tgtggtgttt tctaatgttg aaaatgcatt gttccctgtg tcaaaacttt 5718

tgacctgatt ttctctgcat gtttcatatt actgaatgcc cccttatctt ttctcctatt 5778

tcttcttatc cag tt gaa ggt gcc ctt gca cat cct tac ctg gca tca 5826

Val Glu Gly Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu Ala Ser

345 350

ctg cat gac ata agt gat gag cca gtc tgc tca tca ccc ttc agc ttt 5874

Leu His Asp Ile Ser Asp Glu Pro Val Cys Ser Ser Pro Phe Ser Phe

355 360 365 370

gac ttc gag cag cat gca ttg tcc gag gaa caa atg aag gat cta atc 5922

Asp Phe Glu Gln His Ala Leu Ser Glu Glu Gln Met Lys Asp Leu Ile

375 380 385

tac caa gaa ggc ctt gcg ttc aac cct gat tac cag tag ctggtgttct 5971

Tyr Gln Glu Gly Leu Ala Phe Asn Pro Asp Tyr Gln

390 395

atttcagcct tggattgatt ctattcatat ggagtttttt cctcctgcgc cacaaaaggt 6031

cgccgacagt gatcactagt tgtaaataat tgcctcacct gaaaaatcct ccctggttca 6091

aagctgaagg tgttgttcta agagtagaaa tgtactttgt gatcaagttc ctgggtagct 6151

gctatgccat tcttatgctt atgtatgttg tttaatgtgg gatttttttc catcttaaat 6211

gtttttagtc ccttttgtaa gaagagttag ttcatgaacg atgacggcct aaattctgcg 6271

gttatcatca aattccccat tttcttgtcg attcatggat ttctcatggt tttacttaat 6331

gctccatgtt gtaagacgtg gtcaatggaa gaggatatat tgactcttga ttcagtggtg 6391

gcagtttgga gttgatc 6408

<210> 2

<211> 398

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> BINDING

<222> (1)..(398)

<223>

<400> 2

Met Asp Ala Gly Ala Gln Pro Pro Asp Thr Glu Met Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gln Gln Pro Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala

20 25 30

Gly Ala Gly Met Met Glu Asn Ile Gln Ala Thr Leu Ser His Gly Gly

35 40 45

Arg Phe Ile Gln Tyr Asn Ile Phe Gly Asn Val Phe Glu Val Thr Ala

50 55 60

Lys Tyr Lys Pro Pro Ile Leu Pro Ile Gly Lys Gly Ala Tyr Gly Ile

65 70 75 80

Val Cys Ser Ala Leu Asn Ser Glu Thr Gly Glu Gln Val Ala Ile Lys

85 90 95

Lys Ile Ala Asn Ala Phe Asp Asn Lys Ile Asp Ala Lys Arg Thr Leu

100 105 110

Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg His Met Asp His Glu Asn Ile Val Ala

115 120 125

Ile Arg Asp Ile Ile Pro Pro Pro Gln Arg Asn Ser Phe Asn Asp Val

130 135 140

Tyr Ile Ala Tyr Glu Leu Met Asp Thr Asp Leu His Gln Ile Ile Arg

145 150 155 160

Ser Asn Gln Ala Leu Ser Glu Glu His Cys Gln Tyr Phe Leu Tyr Gln

165 170 175

Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Ile His Ser Ala Asn Val Leu His Arg

180 185 190

Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu Leu Leu Asn Ala Asn Cys Asp Leu Lys

195 200 205

Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Thr Thr Ser Glu Thr Asp Phe Met

210 215 220

Thr Glu Tyr Val Val Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Leu Leu

225 230 235 240

Asn Ser Ser Glu Tyr Thr Ala Ala Ile Asp Val Trp Ser Val Gly Cys

245 250 255

Ile Phe Met Glu Leu Met Asp Arg Lys Pro Leu Phe Pro Gly Arg Asp

260 265 270

His Val His Gln Leu Arg Leu Leu Met Glu Leu Ile Gly Thr Pro Asn

275 280 285

Glu Ala Asp Leu Asp Phe Val Asn Glu Asn Ala Arg Arg Tyr Ile Arg

290 295 300

Gln Leu Pro Arg His Ala Arg Gln Ser Phe Pro Glu Lys Phe Pro His

305 310 315 320

Val His Pro Leu Ala Ile Asp Leu Val Glu Lys Met Leu Thr Phe Asp

325 330 335

Pro Arg Gln Arg Ile Thr Val Glu Gly Ala Leu Ala His Pro Tyr Leu

340 345 350

Ala Ser Leu His Asp Ile Ser Asp Glu Pro Val Cys Ser Ser Pro Phe

355 360 365

Ser Phe Asp Phe Glu Gln His Ala Leu Ser Glu Glu Gln Met Lys Asp

370 375 380

Leu Ile Tyr Gln Glu Gly Leu Ala Phe Asn Pro Asp Tyr Gln

385 390 395

Claims

1.OsMPK1基因在增强水稻对细菌性条斑病抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.OsMPK1基因在增强水稻对细菌性条斑病抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK1基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1或2所述的OsMPK1基因在增强水稻对细菌性条斑病抗性中的应用，其特征在于，通过超量表达OsMPK1基因增强水稻对细菌性条斑病的抗性。