CN101993880A

CN101993880A - 水稻抗病相关基因gh3-2和它在培育广谱抗病水稻中的应用

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Publication number: CN101993880A
Application number: CN2009100636923A
Authority: CN
Inventors: 王石平; 傅晶
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2009-08-24
Filing date: 2009-08-24
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2029-08-24
Also published as: CN101993880B

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及包含水稻抗病相关基因GH3-2的DNA片段的分离克隆和功能验证。GH3-2基因编码生长素酰胺合成酶。它能够赋予水稻抵抗由细菌性病原菌-白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzicola)、以及真菌性病原菌-稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的病害。将该片段与其外源调节序列直接转入水稻，超量表达GH3-2的转基因水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病的抵抗能力显著增强。

Description

水稻抗病相关基因GH3-2和它在培育广谱抗病水稻中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域。具体涉及一个水稻抗病相关基因GH3-2的分离克隆、功能验证和应用。GH3-2基因是水稻抗病反应中的正调控因子。超量表达GH3-2基因的转基因植株抵抗白叶枯病、细条病和稻瘟病的能力显著提高。

背景技术

植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果：(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关的病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。

植物的抗病反应是多基因参于调控的复杂过程。参于植物抗病反应的基因分为两类：(1)抗病(主效)基因，又称R(resistance)基因和(2)抗病相关基因。

根据目前人们对抗病基因功能的认识，抗病基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Baker等，1997；Dangl和Jones，2001；Nimchuk等，2001)。抗病基因介导的抗病反应抗性强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：(1)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因大约只有30个，抵抗另一水稻重要病害一稻瘟病的抗病基因也只有大约50个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，即一个抗病基因通常只对某一病原的部分生理小种具有抗性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。

抗病相关基因是指除抗病基因外所有参于抗病反应的基因，它们的编码产物参于合成植物体内抗病信号分子、参于信号传导、阻止信号传导或参于防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Schenk等，2000；Zhou等，2002；Chu等，2004)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源：(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参于的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。但是，水稻中虽然鉴定了很多抗病相关基因(Zhou等，2002；Chu等，2004)，这些基因在水稻抗病反应中的作用机理、以及单个抗病相关基因是否会引起水稻抗病表型的改变都不清楚。

水稻是世界上重要的粮食作物，但病害的影响常常造成其产量和品质的下降。水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害(过崇俭，1995)。水稻细菌性条斑病(细条病)由细条病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)引起，是我国南方稻区的主要病害。稻瘟病由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起，是世界上对水稻危害最大的真菌性病害之一(Zeigler等，1994)。发掘和利用优良抗性基因资源改良水稻是控制病害的发生、减少或避免水稻病害所带来的损失最经济有效的措施。

与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达作为抗病反应正调控因子的抗病相关基因进行水稻品种的改良，将进一步增强水稻的抗病性，拓宽水稻的抗谱。这些方面是采用常规水稻育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是分离克隆水稻中携带的一个抗病相关基因完整DNA片段，并利用超量表达技术通过使目标基因在转基因受体中超量表达鉴定该基因在抗病反应过程中所起作用，为利用这个基因改良水稻品种或其它植物抵御病害的能力奠定基础。这个基因被命名为GH3-2。

本发明涉及分离一种包含GH3-2基因的DNA片段并鉴定其功能，该片段赋予水稻对由白叶枯病菌、细条病菌和稻瘟病菌所引起的病害产生抗病反应。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ ID NO：1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。对GH3-2基因序列进行分析和对GH3-2蛋白质的功能进行分析，确定该蛋白质是一个GH3类的生长素酰胺合成酶。超量表达序列表SEQ ID NO：1所示序列可以增强水稻对白叶枯病、细条病及稻瘟病的抗性。

可以采用已经克隆的GH3-2基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的GH3-2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含GH3-2基因的序列或者包含一段GH3-2基因的序列，将这一序列与合适的载体连接，可以转入植物细胞，并超量表达GH3-2基因，产生抗病转基因植物。采用这种转基因技术创造抗病植物是传统育种技术所不能达到的。

本发明为增强水稻对白叶枯病、细条病和稻瘟病的抗性提供了一种新的方法。这种方法包括将GH3-2基因完整编码区的基因组片段与能够超量表达目标基因的载体连接、转入感病水稻，通过超量表达GH3-2基因改良水稻对白叶枯病、细条病及稻瘟病的抗性。

在本发明的实施例部分，我们阐述了GH3-2基因的分离、功能验证和应用过程以及该基因的特点。

附图说明

序列表SEQ IDNO：1.本发明分离克隆的GH3-2基因的序列和它编码的蛋白质的氨基酸序列。

图1.本发明鉴定和分离克隆水稻抗病相关基因GH3-2以及验证GH3-2基因功能的流程图。

图2.用定量RT-PCR技术分析白叶枯病菌PXO61侵染后抗病水稻品种明恢63和感病水稻品种珍汕97中GH3-2基因的表达变化。对照是接种PXO61前的样品；其他是接种PXO61后的样品。每个样品中GH3-2基因的表达量是相对于接种前珍汕97样品中GH3-2基因的表达量。每个数据是平均值(3个重复)±标准差。

图3.PCR扩增产物和GH3-2基因的结构。“ATG”和“TAG”分别是翻译起始密码和终止密码。数字示每一种结构的核苷酸数目。

图4.GH3-2基因编码的蛋白质具有生长素酰胺合成酶的活性。GH3-2蛋白催化形成IAA-Asp和IAA-Ala的量随反应时间增加(20分钟)而增加。IAA：生长素；Asp：天门冬氨酸；Ala：丙氨酸。

图5.遗传转化载体pU1301的结构。

图6.T₀代遗传转化植株(D176UM)中的GH3-2基因表达量与植株对白叶枯病菌株PXO61的抗性增强相关。对照水稻感病品种牡丹江8是遗传转化的受体。星号(*)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P＜0.01)减小。每个数据是平均值(5个重复)±标准差。

图7.T₁代遗传转化植株(D176UM)中的GH3-2基因的表达量与表型共分离。对照水稻感病品种牡丹江8是遗传转化的受体。病斑面积为接种白叶枯病菌PXO61两周后的数据。星号(*)表示与对照相比，转基因植株的病斑面积显著(P＜0.01)减小。每个数据是平均值(5个重复)±标准差。

具体实施方式

本发明的前期研究结果显示水稻GH3基因家族的一个成员-GH3-8基因的表达受病原侵染的影响(Zhou等，2002)；超量表达GH3-8基因增强水稻对白叶枯病的抗性(Ding等，2008)。而该家族的另一个成员其表达也受病原影响，提示这个成员可能参于抗病反应(Zhou等，2002)。根据Jain等(2006)对水稻GH3基因家族成员的命名，这个成员是GH3-2。本发明的前期研究结果提示GH3-2可能是一个抗病相关基因。为了验证这一分析推测，产生了本发明。

以下实施例中进一步定义本发明，图1描叙了鉴定和分离克隆GH3-2基因以及验证GH3-2基因功能的流程。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：GH3-2基因在不同水稻品种中的表达模式分析

用粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品种日本晴全基因组序列中的GH3-2基因的序列[TIGR(TheInstitute for Genomic Research，http://rice.tigr.org)数据库基因位点编号：LOC_Os01g55940]检索籼稻(Oryzasativa ssp.indica)品种明恢63的表达序列标签(expressed sequence tag，EST)数据库REDB(Rice ESTDataBase，http://redb.ricefgchina.org，Zhang等，2005)，发现一条来源于明恢63、长2248bp的cDNA序列BI101D22与日本晴中的GH3-2基因有99％的序列同源性，故将这个来源于明恢63的基因命名为GH3-2。

为了证实GH3-2基因是否参于抗病反应的调控，本发明采用定量反转录-PCR(quantitative reversetranscription-PCR，qRT-PCR)技术(Qiu等，2007)分析了GH3-2基因在不同水稻品种中接种白叶枯病菌株PXO61(菲律宾生理小种1)(Sun等，2004)后的表达模式。白叶枯病菌接种采用剪叶法对成株期的水稻进行接种(Sun等，2004)。白叶枯病菌菌株PXO61由菲律宾国际水稻研究所惠赠(Sun等，2004)。白叶枯病菌的培养遵循已经公开发表的方法(Sun等，2004)。接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA(Zhou等，2002)。取5μg总RNA用DNaseI(美国Invitrogen公司)处理15分钟以去除基因组DNA污染，然后参照Zhou等(2002)的方法，使用oligo(dT)15寡聚引物和M-MLV反转录酶(美国Promega公司)进行反转录。采用实时定量PCR分析试剂盒

Green PCR Master Mix(大连Tokara公司)、并根据试剂盒使用说明书，在ABI 7500Real-Time PCR system(美国Applied Biosystems公司)仪器上进行实时定量PCR反应。用水稻内源肌动蛋白(actin)基因的表达量衡量、并均一化样品RNA含量(Qiu等，2007)。qRT-PCR分析中的GH3-2基因特异PCR引物是EI5P11aF(5′-GTGCGTGTGTAATTTCTCGTGTTT-3′)和EI5P11aR(5′-GTAACTACCACTGGACAGCATGATCT-3′)，肌动蛋白基因PCR引物是actinF(5′-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3′)和actinR(5′-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3′)。

实验结果显示接种白叶枯病菌PXO61后，中等抗病水稻品种明恢63中GH3-2基因的表达被快速诱导，而感病水稻品种珍汕97(Oryza sativa ssp.indica)中的GH3-2基因的表达首先被快速抑制，接种48小时后才被诱导(图2)。这一结果提示：GH3-2基因可能参于抗白叶枯病反应的调控，增强该基因表达可能可以提高水稻的抗病性。

实施例2：分离克隆GH3-2基因和基因结构分析

为了验证上述推测，本发明从抗病水稻品种明恢63中分离克隆了GH3-2基因，用于基因功能验证分析。

1.GH3-2基因结构的预测

以水稻品种明恢63中的GH3-2基因的cDNA序列BI101D22作为模板，用BLAST方法(Altschul等，1997)检索粳稻全长cDNA数据库KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)，发现BI101D22序列与该数据库中一条来自粳稻品种日本晴、长2365bp的全长cDNA序列(注册号：AK102809)同源性达到99％。AK102809的序列就是水稻全基因组序列中编号LOC_Os01g55940基因的cDNA序列。对这两条序列的排列对比分析证实明恢63的GH3-2基因的cDNA序列BI101D22包含了编码GH3-2蛋白的完整的编码序列(coding sequence)。

2.从水稻品种明恢63中分离克隆GH3-2基因的全长DNA

本发明用明恢63的GH3-2基因的cDNA序列检索本发明所在实验室收集的明恢63BAC(bacterialartificial clone)基因组文库(Peng等，1998)的BAC克隆末端测序序列，确定一个编号OSIMNBa0014L20的BAC克隆包含GH3-2基因。用限制性内切酶XbaI和BglII酶切该BAC克隆后回收了一条包含GH3-2基因、长8592nt(核苷酸)的DNA片段。同时，用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切载体pUC19(美国Amersham Bioscience公司)。将包含GH3-2基因的酶切片段与酶切后的载体连接。获得的重组质粒载体被命名为D181S。

利用PCR引物EI5P11a4(5′-CGGCAAGCAACGCCAACTAA-3′)、P3-2R3443(5′-GGAGGAGATGATGTTGGAGC-3′)、pG3-2F3450(5′-ATCACCGAGTTCCTCACCAG-3′)、EI5P11al(5′-ACAGCCTCCTCATGCCCGTCA-3′)、pG3-2F4127(5′-ATGCGTTTGTAGCCTTGGT-3′)、pG3-2R5514(5′-CCCACCGCTGTAGAACTTGA-3′)、pG3-2R6210(5′-GCGGGAGATGGCGTAGTC-3′)、EI5P11aR(5′-GTAACTACCACTGGACAGCATGATCT-3′)和EI5P11aF(5′-GTGCGTGTGTAATTTCTCGTGTTT-3′)，以及美国Applied Biosystems公司的测序试剂盒，以双脱氧核苷酸末端终止法(美国AppliedBiosystems公司)对质粒D181S测序。序列拼接后得到一长4147bp的DNA序列，它包含完整的GH3-2基因序列(3756bp)和位于GH3-2基因两侧合计391nt的水稻DNA序列(图3)。

3.GH3-2基因结构分析

比较分析来源于籼稻明恢63的GH3-2基因的基因组序列和cDNA序列BI101D22以及来源于粳稻日本晴的GH3-2基因的cDNA序列(注册号：AK102809)，确定GH3-2基因由3756个核苷酸组成，包含三个外显子和两个内含子(图3)。基因的5’端非翻译区(untranslated region，UTR)由95个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1-95bp处)，第一个外显子由350个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的96-445bp处)，第一个内含子由168个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的446-613bp处)，第二个外显子由104个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的614-717bp处)，第二个内含子由1209个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的718-1926bp处)，第三个外显子由1388个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的1927-3314bp处)，3’端UTR由442个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的3315-3756bp)。

4.GH3-2基因编码的蛋白质具有生长素酰胺合成酶的活性

GH3-2基因的编码区由1842个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的96-3314bp处)(图3)，编码一个由614个氨基酸组成的蛋白质。根据Jain等(2006)对水稻GH3基因家族的序列分析和分类，GH3-2蛋白属于典型的水稻GH3类蛋白，它属于水稻GH3类蛋白中的第二亚类，可能是生长素酰胺合成酶，能通过将氨基酸连接到生长素上来调控水稻的生理活动(Ding等，2008)。

为了验证这一推测，本发明采用Ding等(2008)方法，在大肠杆菌中表达GH3-2蛋白，分离纯化GH3-2蛋白用于酶活性分析。具体操作如下：以含有GH3-2基因完整编码序列的cDNA克隆BI101D22为模板，采用PCR技术扩增GH3-2基因的编码区段cDNA。PCR引物为YHBD3.2-F NdeI(5’-CATATGATGGCTCCGGCGGCGGT-3’)(下划线代表NdeI阳制性内切酶消化位点)和YHBD3.2-R(5’-AAGCTTGGACCGTGTAGTGTAGTGAGTG-3’)(下划线代表HindIII限制性内切酶消化位点)。将PCR产物与TA克隆载体pGEM-T(美国Promega公司)连接，通过酶切筛选阳性克隆，再经测序验证有无核苷酸突变。用限制性内切酶NdeI和HindIII消化带有GH3-2基因的编码区段的阳性克隆和pET28a载体(德国Novagen公司)；酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含GH3-2基因的酶切片段和酶切后纯化的载体做连接反应。通过酶切及测序验证阳性克隆，将获得的重组质粒电转化(电转化仪为eppendorf公司产品，本实施例所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)进入大肠杆菌表达用宿主菌株BL21(德国Novagen公司)进行原核表达。将pET28a空载体也导入BL21作为对照。挑取单克隆培养12h，1∶100扩大培养2-3h，待其OD值达到0.5，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)到终浓度1mM/L，诱导5h，收集菌体，表达蛋白的纯化用6xHis融合蛋白纯化试剂盒(德国Qiagen公司)，操作参照说明书。GH3-2蛋白酶反应程序参照前人的方法(Staswick等，2005)。具体操作如下：在20μL反应体系中加入50mM Tris(pH 7.5)、3mM MgCl₂、3mMATP、1mM DTT、1mM IAA、1mM氨基酸和5μL的GH3-2纯化蛋白，25℃反应10-20分钟。反应的产物中加80μL的甲醇，取1μL稀释至200μL后再取10μL进超快速液相色谱-质谱/质谱联用仪(UFLC-MS/MS)(SHIMADZU，日本)做定性分析。使用的色谱柱是Waters C18 Atlantis Column(2.1×150mm)，运行温度30℃；流动相是0.04％的醋酸和乙胫，流速为0.25ml/min。在这种条件下，生长素(IAA)-天门冬氨酸(Asp)、IAA-丙氨酸(Ala)和IAA的保留时间分别是5.9、6.8和7.5分钟。IAA-Asp、IAA-Ala和IAA的标准样品均从美国Sigma公司购得。

结果显示，加入GH3-2蛋白进行反应10分钟就生成了分别与IAA-Asp和IAA-Ala标准样品的保留时间相一致的物质(图4)，说明这两种生成的物质就是IAA-Asp与IAA-Ala。加入GH3-2蛋白进行反应20分钟后，生成的IAA-Asp与IAA-Ala量进一步增加，大约是反应10分钟后生成量的一倍(图4)。另外，GH3-2蛋白催化形成的IAA-Asp的量明显大于催化形成的IAA-Ala的量。而加入空载体的对照反应中没有新物质的生成(图4)。这些结果说明GH3-2蛋白具有生长素酰胺合成酶的活性，它催化形成LAA-Asp的能力大于催化形成IAA-Ala的能力。

实施例3：GH3-2基因的功能验证

1.遗传转化载体的构建

本发明所用载体是pU1301(图5)。pU1301是常用的水稻遗传转化载体(Cao等，2007；Qiu等，2007；Ding等，2008)。它是携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素基因启动子的农杆菌介导的遗传转化载体。

将实施例一所述的包含GH3-2基因完整编码序列的cDNA克隆BI101D22(图3)用限制性内切酶KpnI和BamHI消化后回收2326nt的片段作为外源(图3所示2248nt cDNA片段两侧各包含39nt的载体DNA片段)。同时，用限制性内切酶KpnI和BamHI消化携带玉米泛素基因启动子的遗传转化载体pU1301；酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含GH3-2基因的酶切回收片段和纯化好的载体做连接反应。通过测序验证阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为D176U。

2.遗传转化和T₀代转化植株分析

采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将D176U导入水稻感病品种牡丹江8(Oryzasativa ssp.japonica)。获得的遗传转化植株被命名为D176UM(其中前面部分为遗传转化载体名称，M代表水稻品种牡丹江8)。本发明共获得独立转化植株14株。对全部转化植株在成株期阶段接种白叶枯病菌株PXO61，与对照牡丹江8及遗传转化阴性植株b176UM12相比，所有的阳性遗传转化植株的抗性显著增强(P＜0.01)(表1)。

表1.T₀代遗传转化植株(D176UM)对白叶枯病菌株PXO61的反应

⁽¹⁾每株遗传转化基因植株接种5-7片叶，14天后调查病斑和病叶长度，每个数据来自于5个叶片的平均值。

⁽²⁾阴性转化植株，其它植株为阳性转化植株

为进一步验证遗传转化植株的抗病能力增强是否与GH3-2基因转入引起的表达量升高相关，本发明采用Northern杂交方法(Zhou等，2002)检测T₀代遗传转化植株中GH3-2基因的表达量。以cDNA克隆BI101D22为模板利用PCR引物EI5P11a3(5′-GCTCATCTTCTATCGTCGGCA-3′)和EI5P11a4(5′-CGGCAAGCAACGCCAACTAA-3′)扩增出442nt大小的片段(位于序列表SEQ IDNO：1的57-666bp处)作为杂交的探针。参照已经发表的方法(Zhou等，2002)抽提转基因植株和对照牡丹江8的叶片总RNA、电泳、Northern转膜和杂交。结果显示GH3-2的表达量升高与遗传转化植株的抗性增强密切相关(图6)。该结果提示遗传转化植株对白叶枯病菌的抗性增强可能是因为GH3-2基因的表达量增强。

3.遗传转化植株的共分离分析

为了进一步验证上述推测，对在T₀代抗性增强的3株遗传转化植株(D176UM11、D176UM14和D176UM34)的T₁代家系进行基因表达量和抗性共分离分析。在孕穗期接种白叶枯病菌PXO61，接种14天后调查，同时取样抽取RNA，采用上述Northern杂交方法检测植株中GH3-2基因的表达量。结果显示T₁代遗传转化植株的GH3-2基因表达量与抗性共分离(图7)；与对照牡丹江8相比所有抗性显著增强的植株中的GH3-2基因的表达量都增强，而抗性与对照相比无显著变化的植株GH3-2基因的表达量无显著变化。进一步证明遗传转化植株的抗性增强是因为超量表达GH3-2基因所至。这些研究结果也说明GH3-2基因的编码产物在水稻抗白叶枯病反应中发挥正调控因子的作用。超量表达GH3-2基因，可增强水稻对白叶枯病的抗性。

实施例4：超量表达GH3-2基因的应用前景分析

1.超量表达GH3-2基因的植株对白叶枯病的抗性显著增强

实施例三已经证明GH3-2基因调控水稻对白叶枯病的抗性。与转基因的受体牡丹江8(对照)相比，超量表达GH3-2基因的转基因水稻病斑面积减小了25％至45％(图7)。因此GH3-2是一个在抗白叶枯病育种中有应用前景的基因。

2.超量表达GH3-2基因的植株对细条病的抗性显著增强

本发明对两个超量表达GH3-2基因的T₁家系(D176UM11和D176UM34)和遗传转化的受体材料牡丹江8(对照)在孕穗期采用针刺法接种细条病菌株RH3(赖志兵等，2004；Chen等，2006)。接种14天后检测发病情况(Chen等，2006)，发现与感病对照牡丹江8相比，具有同样遗传背景的D176UM11和D176UM34植株对细条病的抗性显著增强(P＜0.01)，其病斑长度减短了大约74％至76％(表2)。该结果说明超量表达GH3-2也可以增强水稻对细条病的抗性，该基因是一个在抗细菌性病害育种中非常有应用前景的基因。

表2.T₁代遗传转化植株(D176UM11和D176UM34)对细条病菌株RH3的反应

⁽¹⁾每株遗传转化基因植株用针刺法接种5片叶，每片叶针刺接种多个位点；14天后调查病斑长度，每个数据是10到12个针刺点的病斑长度的平均值。

3.超量表达GH3-2基因的植株对稻瘟病的抗性显著增强

本发明对两个超量表达GH3-2基因的T₁家系(D176UM11和D176UM34)、遗传转化的受体材料牡丹江8(对照)和国际上常用的稻瘟病感病水稻品种CO39(Oryza sativa ssp.indica)(Jiang等，2002；Wen等，2003)在4-5叶期接种稻瘟病菌CHL358。CHL358菌株由华南农业大学的潘庆华教授惠赠，是潘教授研究中的常用稻瘟病菌株。稻瘟病菌接种采用喷雾法，接种5天后检测发病情况(Chen等，2003)。感病对照CO39对CHL358表现高感，牡丹江8表现中感，而具有同样遗传背景的D176OM11和D176OM34植株却对CHL358表现抗病(表3)。说明超量表达GH3-2也可以增强水稻对真菌性病害一稻瘟病的抗性，该基因也是一个在抗稻瘟病育种中有应用前景的基因。

表2.T₁代遗传转化植株(D176UM11和D176UM34)对稻瘟病菌株CHL358的反应

4.GH3-2是一个广谱抗病相关基因

以上结果说明GH3-2基因具有广谱抗性。可以通过超量表达GH3-2基因培育对细菌性病原菌和真菌性病原菌具有广谱抗性的水稻。

参考文献

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序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻抗病相关基因GH3-2和它在培育广谱抗病水稻中的应用

<130>

<141>2009-08-20

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3756

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<220>

<221>gene

<222>(1)..(3756)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(95)

<220>

<221>CDS

<222>(96)..(445)

<220>

<221>Intron

<222>(446)..(613)

<220>

<221>CDS

<222>(614)..(717)

<220>

<221>Intron

<222>(718)..(1926)

<220>

<221>CDS

<222>(1927)..(3314)

<220>

<221>3’UTR

<222>(3315)..(3756)

<400>1

tcatcgcaca ctccaagcta agcctaagcg agcgagaaaa aatagcaaaa gctagccggc 60

aagcaacgcc aactaattag gggagagaga tattc atg gct ccg gcg gcg gtg 113

Met Ala Pro Ala Ala Val

1 5

gct gcg gcg gag gcg ggg tcg aag gcg gcg gcg gtg gcg ggg aag gcc 161

Ala Ala Ala Glu Ala Gly Ser Lys Ala Ala Ala Val Ala Gly Lys Ala

10 15 20

gtg gcg gcg tgc gag cgc gac gcg gag aag ctg gag ttc atc gag gag 209

Val Ala Ala Cys Glu Arg Asp Ala Glu Lys Leu Glu Phe Ile Glu Glu

25 30 35

ata acg agg ggg ttc gac gcg gtg cag gag cgg gtg ctg gcg gcg atc 257

Ile Thr Arg Gly Phe Asp Ala Val Gln Glu Arg Val Leu Ala Ala Ile

40 45 50

ctg gcg cgg aac aac ggc gcc gag tac ctc cgc cgc cac ggc atg gaa 305

Leu Ala Arg Asn Asn Gly Ala Glu Tyr Leu Arg Arg His Gly Met Glu

55 60 65 70

ggg cgc acc gac cgg gag gcg ttc aag gcg cgc gtc ccc gtc gtc acc 353

Gly Arg Thr Asp Arg Glu Ala Phe Lys Ala Arg Val Pro Val Val Thr

75 80 85

tac gag gac ctc cgc ccg gag atc gag cgc atc gcc aac ggc gac cgc 401

Tyr Glu Asp Leu Arg Pro Glu Ile Glu Arg Ile Ala Asn Gly Asp Arg

90 95 100

tcc aac atc atc tcc tcc cac ccc atc acc gag ttc ctc acc ag 445

Ser Asn Ile Ile Ser Ser His Pro Ile Thr Glu Phe Leu Thr Ser

105 110 115

gtgtgtatag tagtgctagc taacccaaac aatttctttt ttcaattaat ccggcctttc 505

atttgccggc tcggctccgc cattgactcc aactaattgt ttgattagtt tttggtcgtt 565

gcttggttga tcgttcttgc ttactaattg gcgtgcgtgt gcatccag c tcg ggg 620

Ser Gly

act tcg gcg ggg gag agg aag cta atg ccg acg ata gaa gat gag ctg 668

Thr Ser Ala Gly Glu Arg Lys Leu Met Pro Thr Ile Glu Asp Glu Leu

120 125 130 135

gac agg agg cag atg ctc tac agc ctc ctc atg ccc gtc atg aac ttg t 717

Asp Arg Arg Gln Met Leu Tyr Ser Leu Leu Met Pro Val Met Asn Leu

140 145 150

gggtgatcca tctatgaatc tctggccatt atcctacttt agccatctaa ctgttttctt 777

tttctcacca tgcctttgat tgggacgttt tcttgactcc cggcaacagt tgaagctacc 837

tagctaagat acaagtagcc gtattaattt ctagcatgca atttttaatc ttcttttaat 897

aaaaaagaaa gaaatgattt cttaatctag tgtcattgat cgatgcatta gtttaaggcc 957

taattaatct aatctacaga gacaaaccta aacctaaccg ttctcagttt aaactttacc 1017

atcgaccgat caagaaacag tacgtttaat ttttcatatg ctaaatataa tacttgggaa 1077

atgtaatgac cggggcgagc gagtcatgcg tttgtagcct tggtgacctc acaagggttt 1137

ggctaagaaa caccgcaact tgcgagaggt gtggctaatt aatcattcac gttgagccta 1197

aaatataatg tgtttgtgtc ttagacgcta gagatgctgc tgccttgggt gtctctctac 1257

tttttaggca ccgagattcc ttttctaatt tgtaagacat ctaacgatag ctagctagct 1317

tcctaaaata agattatgta gcagctcaaa gtcgctcgca tacgtaacca ggaagttgga 1377

gtgtaacctt acaaacaaag cgacaaatcg gctaccggcc ttgttgcgct aaaataagct 1437

aagagaaagg gagttttcag aaccattcaa ttagcttgaa gcttgaataa acacacacgt 1497

aaattaatgg tactaacgct catgctcata aaattttatc agcattatta cgtgccctgt 1557

gtcaatccca cattaatgta tcccagctga aaggaatggt gcaaccaccg gtgtatctct 1617

gttaattagc catcacaatg ctaaatcttt cgtacatctg atatcttatc ataggttatg 1677

tcaacatcgg cctgaatctt taattaatcc ggcatgcaga actcagcatc agtgggccat 1737

caattacact gcatgatcat tgttgatccc ttcctgctta acgattcaac gacataacca 1797

accagctgct agctgactga atgactgtag tagtaaacta gtattatagc tagatagtac 1857

tgtactagtg attaatatgt ttatctcaga ttaaattaac taaaggtaat taaataaaaa 1917

atgacaggt ac gtg cca ggg ctg gac aag ggc aag ggg ctc tac ttc ctg 1967

Tyr Val Pro Gly Leu Asp Lys Gly Lys Gly Leu Tyr Phe Leu

155 160 165

ttc atc aag tcg gag acg aag acg ccc ggc ggg ctg ccg gcg agg ccg 2015

Phe Ile Lys Ser Glu Thr Lys Thr Pro Gly Gly Leu Pro Ala Arg Pro

170 175 180

gtg ctg acc agc tac tac aag agc gat cac ttc aag cac cgc ccc ttc 2063

Val Leu Thr Ser Tyr Tyr Lys Ser Asp His Phe Lys His Arg Pro Phe

185 190 195

gac ccc tac aac gtg tac acg agc ccg acg gcg gcc atc ctg tgc acc 2111

Asp Pro Tyr Asn Val Tyr Thr Ser Pro Thr Ala Ala Ile Leu Cys Thr

200 205 210

gac gcg ttc cag tcc atg tac gcg cag atg ctg tgc ggc ctc gtg gcg 2159

Asp Ala Phe Gln Ser Met Tyr Ala Gln Met Leu Cys Gly Leu Val Ala

215 220 225

cgc gcc gag gtg ctc cgc gtc ggc gcc gtc ttc gcc tcg ggc ctc ctc 2207

Arg Ala Glu Val Leu Arg Val Gly Ala Val Phe Ala Ser Gly Leu Leu

230 235 240 245

cgc gcc atc cgc ttc ctc cag ctc cac tgg agg gag ctg gcc cac gac 2255

Arg Ala Ile Arg Phe Leu Gln Leu His Trp Arg Glu Leu Ala His Asp

250 255 260

atc agg acc ggg acg ctg agc gcc aag gtg acg gag ccg tcc atc cgc 2303

Ile Arg Thr Gly Thr Leu Ser Ala Lys Val Thr Glu Pro Ser Ile Arg

265 270 275

gac gcc gtg gcg gag gtg ctc gcg gcg ccc gac gcc gag ctc gcc gcg 2351

Asp Ala Val Ala Glu Val Leu Ala Ala Pro Asp Ala Glu Leu Ala Ala

280 285 290

ttc gtg gag gcc gag tgc ggg aag gac aag tgg gag ggg atc atc acc 2399

Phe Val Glu Ala Glu Cys Gly Lys Asp Lys Trp Glu Gly Ile Ile Thr

295 300 305

agg atg tgg ccc aac acc aag tac ctc gac gtg atc gtc acg ggc gcc 2447

Arg Met Trp Pro Asn Thr Lys Tyr Leu Asp Val Ile Val Thr Gly Ala

310 315 320 325

atg gcg cag tac atc ccc acg ctc aag ttc tac agc ggt ggg ctc ccc 2495

Met Ala Gln Tyr Ile Pro Thr Leu Lys Phe Tyr Ser Gly Gly Leu Pro

330 335 340

atg gcg tgc acc atg tac gcg tcg tcc gag tgc tac ttc ggc ctc aac 2543

Met Ala Cys Thr Met Tyr Ala Ser Ser Glu Cys Tyr Phe Gly Leu Asn

345 350 355

ctg cgc ccc atg tgc gac ccg tcg gag gtg tcg tac acc atc atg ccc 2591

Leu Arg Pro Met Cys Asp Pro Ser Glu Val Ser Tyr Thr Ile Met Pro

360 365 370

aac atg ggc tac ttc gag ctt atg ccg cac gac ccg gac gcg ccg ccg 2639

Asn Met Gly Tyr Phe Glu Leu Met Pro His Asp Pro Asp Ala Pro Pro

375 380 385

ctg ccc cgc gac gcg ccg ccg ccg cgg ctc gtc gac ctg gcc gac gcc 2687

Leu Pro Arg Asp Ala Pro Pro Pro Arg Leu Val Asp Leu Ala Asp Ala

390 395 400 405

gag gtc ggg agg gag tac gag ctg gtg atc acc acc tac gcg ggg ctc 2735

Glu Val Gly Arg Glu Tyr Glu Leu Val Ile Thr Thr Tyr Ala Gly Leu

410 415 420

tgc cgc tac cgc gtg ggc gac atc ctg cag gtg acc ggg ttc cac aac 2783

Cys Arg Tyr Arg Val Gly Asp Ile Leu Gln Val Thr Gly Phe His Asn

425 430 435

gcg gcg ccg cag ttc cgg ttc gtc cgc cgc aag aac gtg ctc ctc agc 2831

Ala Ala Pro Gln Phe Arg Phe Val Arg Arg Lys Asn Val Leu Leu Ser

440 445 450

atc gac tcc gac aag acg gac gag gcg gag ctg cag gcc gcg gtg gag 2879

Ile Asp Ser Asp Lys Thr Asp Glu Ala Glu Leu Gln Ala Ala Val Glu

455 460 465

cgc gcg tcc gcg ctg ctg tcc ccc tac ggc gcc agc atc gtg gag tac 2927

Arg Ala Ser Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Gly Ala Ser Ile Val Glu Tyr

470 475 480 485

acg agc cag gcg gac gcg acc acc atc ccg ggg cac tac gtg gtg tac 2975

Thr Ser Gln Ala Asp Ala Thr Thr Ile Pro Gly His Tyr Val Val Tyr

490 495 500

tgg gag ctg atg gtg cgg gag ggc ggc gcg tgg ccg ccg ccg gcg gag 3023

Trp Glu Leu Met Val Arg Glu Gly Gly Ala Trp Pro Pro Pro Ala Glu

505 510 515

gag gag ggc cgc ggc gtg ttc gaa cgg tgc tgc ctc gag atg gag gag 3071

Glu Glu Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Cys Cys Leu Glu Met Glu Glu

520 525 530

gcg ctc aac gcc gtg tac agg cag gga cgc aac ggc gag gcc atc ggg 3119

Ala Leu Asn Ala Val Tyr Arg Gln Gly Arg Asn Gly Glu Ala Ile Gly

535 540 545

ccg ctc gag atc cgg gtg gtg cgc gcc ggc acg ttc gag gag gtg atg 3167

Pro Leu Glu Ile Arg Val Val Arg Ala Gly Thr Phe Glu Glu Val Met

550 555 560 565

gac tac gcc atc tcc cgc ggc gcc tcc atc aac cag tac aag gcg ccg 3215

Asp Tyr Ala Ile Ser Arg Gly Ala Ser Ile Asn Gln Tyr Lys Ala Pro

570 575 580

cgc tgc gtc tcc ttc ggc ccc atc atc gag ctg ctc aac tcg cgc gtc 3263

Arg Cys Val Ser Phe Gly Pro Ile Ile Glu Leu Leu Asn Ser Arg Val

585 590 595

atc tcc aag cac ttc agc ccg gct tgc ccc aaa tac agc ccg cac aag 3311

Ile Ser Lys His Phe Ser Pro Ala Cys Pro Lys Tyr Ser Pro His Lys

600 605 610

aag tgatcactca ctacactaca cggtccagtt gagctagacg acacaacgat 3364

Lys

atatagcctt ctactacaac tactactact accagcactc agtcccagtg cttatacagt 3424

cggtgtcagt gtcagtgtca gtgcgtgtgt aatttctcgt gtttaaggca gagggcatca 3484

gggccatact cctggatgcc tgcttctttg atcttagatc atgctgtcca gtggtagtta 3544

ccatgtaatc atgtgtgaga tgttatttct gaagtggaaa tggcgagtgt ttgtgatggg 3604

gtaagctggt aacgtcattc ttggccgaat aacataatag gccttgttgg agtatctacc 3664

aactacttct gttgacctat atgtactttt ttctgcttgt gcaaaaatgg gagtgaacta 3724

gtgacactga caccccagga attcaacccc ac 3756

<210>2

<211>614

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Ala Pro Ala Ala Val Ala Ala Ala Glu Ala Gly Ser Lys Ala Ala

1 5 10 15

Ala Val Ala Gly Lys Ala Val Ala Ala Cys Glu Arg Asp Ala Glu Lys

20 25 30

Leu Glu Phe Ile Glu Glu Ile Thr Arg Gly Phe Asp Ala Val Gln Glu

35 40 45

Arg Val Leu Ala Ala Ile Leu Ala Arg Asn Asn Gly Ala Glu Tyr Leu

50 55 60

Arg Arg His Gly Met Glu Gly Arg Thr Asp Arg Glu Ala Phe Lys Ala

65 70 75 80

Arg Val Pro Val Val Thr Tyr Glu Asp Leu Arg Pro Glu Ile Glu Arg

85 90 95

Ile Ala Asn Gly Asp Arg Ser Asn Ile Ile Ser Ser His Pro Ile Thr

100 105 110

Glu Phe Leu Thr Ser Ser Gly Thr Ser Ala Gly Glu Arg Lys Leu Met

115 120 125

Pro Thr Ile Glu Asp Glu Leu Asp Arg Arg Gln Met Leu Tyr Ser Leu

130 135 140

Leu Met Pro Val Met Asn Leu Tyr Val Pro Gly Leu Asp Lys Gly Lys

145 150 155 160

Gly Leu Tyr Phe Leu Phe Ile Lys Ser Glu Thr Lys Thr Pro Gly Gly

165 170 175

Leu Pro Ala Arg Pro Val Leu Thr Ser Tyr Tyr Lys Ser Asp His Phe

180 185 190

Lys His Arg Pro Phe Asp Pro Tyr Asn Val Tyr Thr Ser Pro Thr Ala

195 200 205

Ala Ile Leu Cys Thr Asp Ala Phe Gln Ser Met Tyr Ala Gln Met Leu

210 215 220

Cys Gly Leu Val Ala Arg Ala Glu Val Leu Arg Val Gly Ala Val Phe

225 230 235 240

Ala Ser Gly Leu Leu Arg Ala Ile Arg Phe Leu Gln Leu His Trp Arg

245 250 255

Glu Leu Ala His Asp Ile Arg Thr Gly Thr Leu Ser Ala Lys Val Thr

260 265 270

Glu Pro Ser Ile Arg Asp Ala Val Ala Glu Val Leu Ala Ala Pro Asp

275 280 285

Ala Glu Leu Ala Ala Phe Val Glu Ala Glu Cys Gly Lys Asp Lys Trp

290 295 300

Glu Gly Ile Ile Thr Arg Met Trp Pro Asn Thr Lys Tyr Leu Asp Val

305 310 315 320

Ile Val Thr Gly Ala Met Ala Gln Tyr Ile Pro Thr Leu Lys Phe Tyr

325 330 335

Ser Gly Gly Leu Pro Met Ala Cys Thr Met Tyr Ala Ser Ser Glu Cys

340 345 350

Tyr Phe Gly Leu Asn Leu Arg Pro Met Cys Asp Pro Ser Glu Val Ser

355 360 365

Tyr Thr Ile Met Pro Asn Met Gly Tyr Phe Glu Leu Met Pro His Asp

370 375 380

Pro Asp Ala Pro Pro Leu Pro Arg Asp Ala Pro Pro Pro Arg Leu Val

385 390 395 400

Asp Leu Ala Asp Ala Glu Val Gly Arg Glu Tyr Glu Leu Val Ile Thr

405 410 415

Thr Tyr Ala Gly Leu Cys Arg Tyr Arg Val Gly Asp Ile Leu Gln Val

420 425 430

Thr Gly Phe His Asn Ala Ala Pro Gln Phe Arg Phe Val Arg Arg Lys

435 440 445

Asn Val Leu Leu Ser Ile Asp Ser Asp Lys Thr Asp Glu Ala Glu Leu

450 455 460

Gln Ala Ala Val Glu Arg Ala Ser Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Gly Ala

465 470 475 480

Ser Ile Val Glu Tyr Thr Ser Gln Ala Asp Ala Thr Thr Ile Pro Gly

485 490 495

His Tyr Val Val Tyr Trp Glu Leu Met Val Arg Glu Gly Gly Ala Trp

500 505 510

Pro Pro Pro Ala Glu Glu Glu Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Cys Cys

515 520 525

Leu Glu Met Glu Glu Ala Leu Asn Ala Val Tyr Arg Gln Gly Arg Asn

530 535 540

Gly Glu Ala Ile Gly Pro Leu Glu Ile Arg Val Val Arg Ala Gly Thr

545 550 555 560

Phe Glu Glu Val Met Asp Tyr Ala Ile Ser Arg Gly Ala Ser Ile Asn

565 570 575

Gln Tyr Lys Ala Pro Arg Cys Val Ser Phe Gly Pro Ile Ile Glu Leu

580 585 590

Leu Asn Ser Arg Val Ile Ser Lys His Phe Ser Pro Ala Cys Pro Lys

595 600 605

Tyr Ser Pro His Lys Lys

610

Claims

1.一个分离克隆的增强水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病产生抗性的GH3-2基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.GH3-2基因的编码区，它是序列表SEQ ID NO：1中第96-3314位所示的核苷酸序列或编码与SEQ ID NO：1编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。

3.权利要求1-2任一项所述的基因在增强水稻对白叶枯病、细菌性条斑病和稻瘟病抗性中的应用。