CN113999857A

CN113999857A - 一种烟草烟碱合成调控相关的基因及其应用

Info

Publication number: CN113999857A
Application number: CN202111402264.6A
Authority: CN
Inventors: 孔维松; 李雪梅; 向海英; 曾婉俐; 董石飞; 陈章玉; 杨文武; 米其利; 黄海涛; 蒋佳芮; 高茜; 刘欣; 苏杨
Original assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Yunnan Industrial Co Ltd
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2041-11-22
Also published as: CN113999857B

Abstract

本发明公开了一种烟草烟碱合成调控相关的基因及其应用，该基因为NtLNP1基因，其序列为SEQ ID No.1，对该基因的序列进行翻译后，其所编码蛋白序列为SEQ ID No.2。利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，包括以下步骤：(1)设计sgRNA引导序列，构建sgRNA表达载体；(2)将表达载体导入农杆菌；(3)侵染愈伤组织；(4)通过荧光定量PCR检测NtLNP1基因敲除素材的叶片的烟碱含量；(5)通过GC‑MS检测NtLNP1基因纯合敲除素材的现蕾期叶片的烟碱含量。本申请的基因及方法为烟草烟碱合成调控基因功能研究及低烟碱品种培育研究提供遗传材料和理论依据。

Description

一种烟草烟碱合成调控相关的基因及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种烟草烟碱合成调控相关的基因及其应用。

背景技术

烟草生物碱是烟草属植物含量很高的一类植物碱，烟叶中主要生物碱有烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱；烟碱占生物碱总含量的90-95％，另外三种仅占生物碱总含量的5-10％。生物碱在烟草各器官中的积累变化很大，一般叶片中生物碱的含量最高，其次在根、主脉、茎秆、花和种子中的含量依次递减，而根尖是作为烟碱的合成场所。

近年来，有关烟碱合成、转运及转化的一些重要基因已被陆续克隆，对烟碱合成代谢机理研究和烟草遗传育种工作产生了重要推动作用。1969年发现烟碱水平是受两个不连锁基因位点控制，在1994后这两个基因位点被称为Nic1和Nic2，随后大量研究证明了这两个位点控制烟碱生物合成的相关基因表达。有关烟碱吡咯烷环部分和吡啶环部分缩合反应的研究表明，NADPH依赖性还原酶的PIP家族成员类异黄酮还原酶基因A622及其同源基因参与了这一过程，小檗碱桥接酶家族成员BBL基因也参与了这一反应。烟碱合成受到多种因子调控，已知参与烟碱合成调控调控的植物激素主要有茉莉酸、生长素及乙烯，其中生长素和乙烯是烟碱合成的负调控因子，目前研究主要集中在茉莉酸信号途径调控。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种烟草烟碱合成调控相关的基因及其应用，其为研究烟草烟碱合成调控基因功能及新品种培育提供遗传材料和理论依据。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种烟草烟碱合成调控相关的基因，所述烟碱合成调控相关的基因为NtLNP1基因，其序列为SEQ ID No.1。

优选地，对所述SEQ ID No.1的序列进行翻译后，其所编码蛋白序列为SEQ IDNO.2。

一种利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，所述烟草烟碱合成调控相关的基因为上述的NtLNP1基因，所述方法包括以下步骤：

(1)设计sgRNA引导序列，构建sgRNA表达载体；

(2)将表达载体导入农杆菌；

(3)侵染愈伤组织；

(4)通过荧光定量PCR检测NtLNP1基因敲除素材的叶片的烟碱含量；

(5)通过GC-MS检测NtLNP1基因纯合敲除素材的现蕾期叶片的烟碱含量。

优选地，步骤(1)中，所述CRISPR/Cas9系统采用的sgRNA引导序列为TTGGTTCGAGGAAGTTGCGGAGG，所述sgRNA引导序列采用的引物序列为：

上游引物sgRNA-F：GATTGTTGGTTCGAGGAAGTTGCGG；

下游引物sgRNA-R：AAACCCGCAACTTCCTCGAACCAAC。

优选地，步骤(1)具体为：

设计sgRNA引导序列，上游引物sgRNA-F和下游引物sgRNA-R退火形成双链，限制性内切酶BsaI-HF酶切CRISPR/Cas9载体pORE-Cas9；将退火形成的双链产物与经酶切好的载体骨架用T4连接酶进行连接；连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞，检测获得阳性克隆并提取重组质粒，获得CRISPR-Cas9表达载体。

优选地，步骤(3)具体为：

将携带CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体的农杆菌LBA4404菌液浸泡侵染烟草叶盘，并获得T0代编辑植株种子和T1代种子。

优选地，步骤(4)中，

NtLNP1 qPCR扩增引物如下：

qPCR-Nt NtLNP1-F1：TGGTGGAGAGAGGTTCGCAA；

qPCR-Nt NtLNP1-R1：GTTGCTTTGTCACGTTCGCA；

内参基因扩增引物如下：

18S-F：CCTACGCTCTGTATACATTAGC；

18S-R：GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC。

优选地，所述烟草的品种为红花大金元。

一种利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法创制的烟草突变体。

一种利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法在选育低烟碱烟草新品种中的应用。

本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtLNP1基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtLNP1基因敲除的红花大金元编辑植株。本发明获得的NtLNP1基因敲除的编辑植株，通过荧光定量PCR发现，在正常条件下，NtLNP1基因敲除编辑植株叶片的NtLNP1基因表达量与对照相比明显降低。

本发明提供的烟草烟碱合成调控相关基因NtLNP1，通过气相色谱-质谱联用检测发现，NtLNP1基因敲除编辑植株现蕾期的叶片烟碱含量显著低于对照植株。

综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除NtLNP1基因获得了生物碱和烟碱含量均减低的编辑素材，这为烟草烟碱合成调控基因功能研究及新品种培育提供遗传材料和理论依据。

附图说明

被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。

图1为对照(未编辑)植株和基因编辑植株叶部NtLNP1基因的相对表达量；

图2为对照(未编辑)植株现蕾期和基因编辑植株烟碱含量比较。

具体实施方式

现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。

以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1NtLNP1基因的获得

以栽培种烟草红花大金元根为实验材料，利用RNA提取试剂盒提取烟草根部总RNA，反转录为cDNA备用：

按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。

1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：

Total RNA 1μg；

Oligo(dT)(10μM) 1.5μL；

ddH₂O up to 15μL。

将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：

上述体系放入PCR仪中，42℃65min，65℃10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。

通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：

F：5’-ATGTTTCCGCTCATAATTCTG-3’(SEQ ID No.3)；

R：5’-TCATTCACTGCTATACTTGTGC-3(SEQ ID No.4)。

以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：

扩增体系(50μL)：

混匀离心后进行PCR扩增，PCR反应条件为：95℃10sec，52℃30sec，72℃2min，共30个循环；72℃10min；25℃Hold。

对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草烟碱合成调控相关的基因NtLNP1序列，其碱基序列为SEQ ID No.1所示，共包括1815个碱基。对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示，共包括604个氨基酸残基，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。

实施例2表达载体的构建

利用实施例1中所获得烟碱代谢相关的基因NtLNP1，本发明进一步构建了CRISPR/Cas9载体。

(1)NtLNP1基因的sgRNA序列的设计和合成：

利用在线软件CRISPR-P 2.0(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计sgRNA引导序列，选择分值较高且位于NtLNP1基因序列合适位置的引导序列。本申请选择的sgRNA序列为：TTGGTTCGAGGAAGTTGCGGAGG(SEQ ID No.5)。

(2)设计sgRNA序列的正反引物并交由设计公司合成：上游引物sgRNA-F：GATTGTTGGTTCGAGGAAGTTGCGG(SEQ ID No.6)和下游引物sgRNA-R：AAACCCGCAACTTCCTCGAACCAAC(SEQ ID No.7)；

(3)引物退火：将合成的靶序列引物(上游引物和下游引物)用灭菌ddH₂O稀释成浓度为100ng/μL，而后，上下游引物各取5μL至PCR管中混合均匀，置于PCR仪上进行退火，使上下游Oligo单链经退火形成双链。

PCR仪退火程序为：95℃2min，-0.1℃/8s，退火至25℃，退火产物加入90μL无菌水稀释成10ng/μL。

(4)酶切与连接

a.用限制性内切酶BsaI-HF酶切CRISPR/Cas9载体pORE-Cas9(由西南大学提供)。

酶切体系(50μL)：

37℃过夜酶切，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，切割目的片段条带，用胶回收试剂盒回收骨架片段。

b.连接

将退火形成的双链产物与经酶切好的载体骨架进行连接。

连接体系(10μL)：

连接条件为：16℃连接2小时。

(5)转化大肠杆菌：

a.从-80℃取出Trans-T1感受态细胞置于冰上冻融，分成50μL/份；

b.待感受态细胞融化后，将10μL连接产物加入感受态中，轻轻混匀，冰浴10min；

c.冰浴后，置于42℃水浴锅中热激90s，迅速将感受态放回冰上静置2min。

d.将60μL转化产物均匀涂布于含有16mg/L卡那霉素LB固体培养基中，于37℃细菌培养箱中培养12小时。

(6)阳性克隆筛选：

a.待平板长出单克隆，挑取大肠杆菌单克隆到含有50mg/L的卡那霉素LB液体培养基中，于37℃摇床过夜摇混；

b.取部分菌液进行菌液PCR，经核酸电泳检测是否为阳性克隆；

c.将初步检测为阳性克隆的菌液余下部分提取大肠杆菌质粒。送质粒至诺禾致源公司进行测序，确认阳性克隆的正确性。

实施例3转化农杆菌

利用上一步所构建的CRISPR/Cas9-NtLNP1编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化和组培，获得烟草烟碱代谢相关的基因NtLNP1发生敲除编辑的植株，相关实验过程简要介绍如下。

将烟草种子表面消毒后点种至MS培养基上，待长到4片子叶(15-20d)，移入含MS固体培养基的培养瓶中，于25±1℃、光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d条件继续培养35-40d，备用。

将正确序列的质粒转化农杆菌，具体步骤如下：

(1)取出-80℃保存的LBA4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。

(2)待感受态刚刚解冻时，加入CRISPR/Cas9-NtLNP1编辑载体质粒的2μL，混匀，置于冰上。

(3)将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1mL的YEB液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。

(4)培养基在8,000rpm离心，弃上清，再用200μL的YEB液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/L利福平、50mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。

实施例4侵染愈伤组织

(1)在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用MS液体制备含有CRISPR/Cas9-NtLNP1编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液(OD₆₀₀＝0.6-0.8)。

(2)利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。

(3)将叶盘置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA的MS固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。

(4)进行继代培养，放置于含2.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+250mg/LCb+50mg/L Kan的MS固体培养基上。

培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成，每7-10d更换一次分化培养的培养基，更换3-4次；培养至分化芽形成；将已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件与分化培养条件一致，培养8-14d；再生植株生根培养，将分化芽切下，插入含有500mg/L羧苄青霉素与50mg/L卡那霉素的MS培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养20-30d，再生移栽至花盆后进行培养，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得NtLNP1基因编辑植株，之后进行收种获得T0代编辑植株种子。

T0代种子按23倍进行自交纯合扩繁，待植株长到5-6片叶时，单株的叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得NtLNP1基因发生纯合编辑的植株，之后进行收种获得NtLNP1基因纯合编辑的T1代种子。

实施例5实时荧光定量PCR检测

为了检测对照(未编辑)及NtLNP1基因纯合编辑烟草植株现蕾期烟碱合成调控相关基因NtLNP1的表达情况，利用实时荧光定量PCR方法检测该基因在根和叶片的表达量。实时荧光定量PCR试剂用的是TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq ^TMⅡ。具体检测方法如下：

选择现蕾期烟草植株，采集对照(未编辑)及NtLNP1基因纯合编辑烟草植株的根和叶片，每个处理做三个平行样；随后标记放置于液氮中保存，以便后续RNA提取及实时荧光定量PCR检测试验。

NtLNP1 qPCR扩增引物如下：

qPCR-Nt NtLNP1-F1：TGGTGGAGAGAGGTTCGCAA(SEQ ID NO.8)；

qPCR-Nt NtLNP1-R1：GTTGCTTTGTCACGTTCGCA(SEQ ID NO.9)。

内参基因(18S)扩增引物如下：

18S-F：CCTACGCTCTGTATACATTAGC(SEQ ID NO.10)；

18S-R：GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC(SEQ ID NO.11)。

每个样品进行三次技术重复，反应体系如下：

扩增条件：95℃30s；95℃10s，60℃10s，共40个循环。

溶解曲线：95℃10s，60℃60s,95℃-0.29℃/s。

结果表明(如图1所示)，烟草烟碱代谢相关的基因NtLNP1基因敲除编辑植株叶片的NtLNP1基因表达量与明显低于对照。

实施例6GC-MS检测

利用实施例4中分子检测确定为NtLNP1基因纯合敲除的植株，进行收种获得基因纯合编辑素材。随后以GC-MS进行NtLNP1基因纯合敲除素材的现蕾期叶片的烟碱含量的检测试验。

选择现蕾期的烟株，采集5株对照(未编辑)烟草植株样本，采集同一叶位的叶片；选择现蕾期的烟株，采集5株NtLNP1基因纯合编辑的烟草植株样本；叶片去主筋，锡箔纸包裹液氮保存运输，实验室超低温(-70℃)保存，冻干磨粉过筛。

称取0.2g样品于15mL离心管，精确至0.1mg，加入2.0mL5％氢氧化钠溶液，再分别加入0.05mL内标溶液A(二甲基喹啉溶液，甲醇配制，二氯甲烷稀释到1.0mg/mL)和内标溶液B(2,2’-联吡啶-d2溶液，甲醇配制，二氯甲烷稀释到0.5mg/mL)，振荡混匀后，静置20min，然后加入10.0mL萃取溶液(二氯甲烷和甲醇按照体积比4:1混匀)，加盖密封后至于涡旋振荡器中，以2000r/min的速度振荡提取40min，静置1h后，离心8min，取下层有机相转移到色谱瓶中，上GC-MS进行分析。

气相色谱参考条件为：色谱柱：DB-35MS或等同柱效毛细管色谱柱，规格为：30mm(长度)×0.25mm(内径)×0.25m(膜厚)；进样口温度：250℃；柱流量：1.0mL/min；烟碱进样体积：1.0L，分流进样，分流比为40:1；其它生物碱进样体积：2.0L，分流进样，分流比为10:1；升温程序：初始温度100℃，保持3min；以8℃/min的速率上升至260℃，保持10min。

质谱参考条件：传输线温度：280℃；电离方式：电子轰击源(EI)；电离能量：70eV；离子源温度：230℃；溶剂延迟：8min；测定方式：选择离子监测方式(SIM)扫描。

对照(未编辑)及NtLNP1基因纯合编辑烟草植株现蕾期叶片烟碱含量比较(结果如图2所示)。

结果表明：通过气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测发现，NtLNP1基因敲除编辑植株现蕾期的叶片烟碱含量显著低于对照植株。这为烟草烟碱代谢基因功能研究及低烟碱烟草新品种培育研究提供遗传材料和理论依据。

虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草烟碱合成调控相关的基因及其应用

<130> WPC213279

<141> 2021-11-22

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(NtLNP1)

<400> 1

atggaacaag aaacagagat tatcaatcat aagcacaaag cagaaacaga aattattcgt 60

tggttcgagg aagttgcgga ggatgctgac ctcgtacagc agcagacact acgccagatt 120

cttgaactta accatggtgt ggaatatctc aagaaatggc ttggagatat caaacttcaa 180

gaaatggatg aaaatgcatt agaaacgatt tatacttctt tggtccctct tgtttctcat 240

gcagatttag agccttatat tcagagaatt gctgatggag atactgctcc tctcctcact 300

caacacccca ttaccaatct atctttgagt tctggaacta ctgagggaag acaaaagttt 360

gtgcctttta cttgccatag ctcacaaacc actcttcaga ttttcaagtt ggcagcagca 420

tatagatcaa gtctttatcc aataaaagga ggaggaaaaa ttcttgaatt catatacagc 480

agcaaacaat ataaaacaaa aggaggacta atagcaggaa cagctacaac tcactattat 540

gctagtgagg aattcaaggc taaacagcaa gagacaaagt ccttcacttg cagttctgaa 600

gcagtcattt caagtggaga ttacaaacaa tccacatatt gtcacctcct tcttggcttg 660

catttttctc aggaagtaga atttgttact tcaacttttg catatagtat ggttcaagca 720

ttcagatcat ttgaggagtt gtggaaggaa ttatgtcatg acttaaggga aggtagtctt 780

agctcaagaa ttaacataat caaaatgcga aaagctgtat tagagataat taatttgcct 840

aatccagaat tggcttcaag gattgaatca atatgtgaag agctaaaaag ggaagattgg 900

tgttgcctaa taccaaaatt atggccaaat gctaagtatg tttactcaat aatgacaggc 960

tcaatgcagc catacttgac aaaattaagg cattatggag gggaattgcc tttggtgagt 1020

gctgattatg ggtccactga gagttggatt ggagtaaatg tggatccttc ttctccacca 1080

gaaaatgtta cttttgcagt gataccaact ttttcttact ttgagttcat acccctttat 1140

agacagaagt cgcattataa ttaccaaaat ggaaatatta attcagccaa cgatgatttc 1200

atagaaggtg acgttgtgcc cctatctcaa gtaaagattg gacaacaata tgaaatcgtc 1260

ctaacaactt tcacaggtct atatagatat aggttaggcg atgtggttga agttgctagt 1320

ttttacaaga agacgcccaa acttaacttc atatgcagga gaaagctgat attaacagtg 1380

aatatcgata agaacacaga gaaagacctt cagttagtgg tggagagagg ttcgcaaata 1440

ctaagcaagg cacgagccga cctagtagat ttcacgagcc atgcgaacgt gacaaagcaa 1500

ccagggcact atgtgattta ctgggaaatt aaaggtgaag ttgaagaaat ggttctagga 1560

gagtgttgta gagaaatgga tgcttcattt gttgatcatg ggtatgttgt atcaagaaaa 1620

accaattcaa ttggaccctt agagctttgt attgtggaga gaggtacttt taagaaaata 1680

ttggaatatt tcattggaaa tggggctgca atgagtcagt tcaagactcc tagatgcact 1740

agcaaccaag tattattaaa aatacttaat gtctgcacaa ttaagaggtt tcatagcaca 1800

gcctatgggt ga 1812

<210> 2

<211> 603

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Gln Glu Thr Glu Ile Ile Asn His Lys His Lys Ala Glu Thr

1 5 10 15

Glu Ile Ile Arg Trp Phe Glu Glu Val Ala Glu Asp Ala Asp Leu Val

20 25 30

Gln Gln Gln Thr Leu Arg Gln Ile Leu Glu Leu Asn His Gly Val Glu

35 40 45

Tyr Leu Lys Lys Trp Leu Gly Asp Ile Lys Leu Gln Glu Met Asp Glu

50 55 60

Asn Ala Leu Glu Thr Ile Tyr Thr Ser Leu Val Pro Leu Val Ser His

65 70 75 80

Ala Asp Leu Glu Pro Tyr Ile Gln Arg Ile Ala Asp Gly Asp Thr Ala

85 90 95

Pro Leu Leu Thr Gln His Pro Ile Thr Asn Leu Ser Leu Ser Ser Gly

100 105 110

Thr Thr Glu Gly Arg Gln Lys Phe Val Pro Phe Thr Cys His Ser Ser

115 120 125

Gln Thr Thr Leu Gln Ile Phe Lys Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Ser Ser

130 135 140

Leu Tyr Pro Ile Lys Gly Gly Gly Lys Ile Leu Glu Phe Ile Tyr Ser

145 150 155 160

Ser Lys Gln Tyr Lys Thr Lys Gly Gly Leu Ile Ala Gly Thr Ala Thr

165 170 175

Thr His Tyr Tyr Ala Ser Glu Glu Phe Lys Ala Lys Gln Gln Glu Thr

180 185 190

Lys Ser Phe Thr Cys Ser Ser Glu Ala Val Ile Ser Ser Gly Asp Tyr

195 200 205

Lys Gln Ser Thr Tyr Cys His Leu Leu Leu Gly Leu His Phe Ser Gln

210 215 220

Glu Val Glu Phe Val Thr Ser Thr Phe Ala Tyr Ser Met Val Gln Ala

225 230 235 240

Phe Arg Ser Phe Glu Glu Leu Trp Lys Glu Leu Cys His Asp Leu Arg

245 250 255

Glu Gly Ser Leu Ser Ser Arg Ile Asn Ile Ile Lys Met Arg Lys Ala

260 265 270

Val Leu Glu Ile Ile Asn Leu Pro Asn Pro Glu Leu Ala Ser Arg Ile

275 280 285

Glu Ser Ile Cys Glu Glu Leu Lys Arg Glu Asp Trp Cys Cys Leu Ile

290 295 300

Pro Lys Leu Trp Pro Asn Ala Lys Tyr Val Tyr Ser Ile Met Thr Gly

305 310 315 320

Ser Met Gln Pro Tyr Leu Thr Lys Leu Arg His Tyr Gly Gly Glu Leu

325 330 335

Pro Leu Val Ser Ala Asp Tyr Gly Ser Thr Glu Ser Trp Ile Gly Val

340 345 350

Asn Val Asp Pro Ser Ser Pro Pro Glu Asn Val Thr Phe Ala Val Ile

355 360 365

Pro Thr Phe Ser Tyr Phe Glu Phe Ile Pro Leu Tyr Arg Gln Lys Ser

370 375 380

His Tyr Asn Tyr Gln Asn Gly Asn Ile Asn Ser Ala Asn Asp Asp Phe

385 390 395 400

Ile Glu Gly Asp Val Val Pro Leu Ser Gln Val Lys Ile Gly Gln Gln

405 410 415

Tyr Glu Ile Val Leu Thr Thr Phe Thr Gly Leu Tyr Arg Tyr Arg Leu

420 425 430

Gly Asp Val Val Glu Val Ala Ser Phe Tyr Lys Lys Thr Pro Lys Leu

435 440 445

Asn Phe Ile Cys Arg Arg Lys Leu Ile Leu Thr Val Asn Ile Asp Lys

450 455 460

Asn Thr Glu Lys Asp Leu Gln Leu Val Val Glu Arg Gly Ser Gln Ile

465 470 475 480

Leu Ser Lys Ala Arg Ala Asp Leu Val Asp Phe Thr Ser His Ala Asn

485 490 495

Val Thr Lys Gln Pro Gly His Tyr Val Ile Tyr Trp Glu Ile Lys Gly

500 505 510

Glu Val Glu Glu Met Val Leu Gly Glu Cys Cys Arg Glu Met Asp Ala

515 520 525

Ser Phe Val Asp His Gly Tyr Val Val Ser Arg Lys Thr Asn Ser Ile

530 535 540

Gly Pro Leu Glu Leu Cys Ile Val Glu Arg Gly Thr Phe Lys Lys Ile

545 550 555 560

Leu Glu Tyr Phe Ile Gly Asn Gly Ala Ala Met Ser Gln Phe Lys Thr

565 570 575

Pro Arg Cys Thr Ser Asn Gln Val Leu Leu Lys Ile Leu Asn Val Cys

580 585 590

Thr Ile Lys Arg Phe His Ser Thr Ala Tyr Gly

595 600

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggtccac tgagagttgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgagatagg ggcacaacgt 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttggttcgag gaagttgcgg agg 23

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gattgttggt tcgaggaagt tgcgg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaacccgcaa cttcctcgaa ccaac 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggtggagag aggttcgcaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttgctttgt cacgttcgca 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctacgctct gtatacatta gc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtgttgagtc aaattaagcc gc 22

Claims

1.一种烟草烟碱合成调控相关的基因，其特征在于，所述烟碱合成调控相关的基因为NtLNP1基因，其序列为SEQ ID No.1。

2.根据权利要求1所述的烟草烟碱合成调控相关的基因，其特征在于，对NtLNP1基因的序列进行翻译后，其所编码蛋白序列为SEQ ID NO.2。

3.一种利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，其特征在于，所述烟草烟碱合成调控相关的基因为权利要求1-2任一所述的NtLNP1基因，所述方法包括以下步骤：

(1)设计sgRNA引导序列，构建sgRNA表达载体；

(2)将表达载体导入农杆菌；

(3)侵染愈伤组织；

4.根据权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述CRISPR/Cas9系统采用的sgRNA序列为TTGGTTCGAGGAAGTTGCGGAGG，所述sgRNA序列采用的引物序列为：

上游引物sgRNA-F：GATTGTTGGTTCGAGGAAGTTGCGG；

下游引物sgRNA-R：AAACCCGCAACTTCCTCGAACCAAC。

5.根据权利要求4所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：

6.根据权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，其特征在于，步骤(3)具体为：

7.根据权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，其特征在于，步骤(4)中，

NtLNP1 qPCR扩增引物如下：

qPCR-Nt NtLNP1-F1：TGGTGGAGAGAGGTTCGCAA；

qPCR-Nt NtLNP1-R1：GTTGCTTTGTCACGTTCGCA；

内参基因扩增引物如下：

18S-F：CCTACGCTCTGTATACATTAGC；

18S-R：GTGTTGAGTCAAATTAAGCCGC。

8.根据权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法，其特征在于，所述烟草的品种为红花大金元。

9.一种根据权利要求3-8任一所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法创制的烟草突变体。

10.一种根据权利要求3-8任一所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除烟草烟碱合成调控相关的基因的方法在选育低烟碱烟草新品种中的应用。