CN111004311A - 一种植物储藏蛋白合成相关蛋白f690及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物储藏蛋白合成相关蛋白F690及其编码基因与应用。本发明通过水稻储藏蛋白合成突变体F690的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到储藏蛋白合成相关蛋白F690，该相关蛋白由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成，或将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有储藏蛋白合成相关的由序列SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的储藏蛋白合成相关蛋白影响水稻胚乳中储藏蛋白的合成过程，将所述蛋白的编码基因导入储藏蛋白含量异常的植物中，可以得到储藏蛋白含量正常的转基因植物，因此，本发明所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种植物储藏蛋白合成相关蛋白F690及其编码基因与应用。
背景技术
水稻不仅是重要的模式植物，更是作为重要的粮食作物，世界上一半以上的人口以稻米为主食。通过常规育种进行水稻的遗传改良是水稻育种的主要途径之一，但有限的遗传资源和中国长期以来只重视产量不重视品质，造成中国稻米品质遗传育种研究严重滞后，优质香稻资源也十分欠缺。随着人们生活水平的不断改善，对稻米品质的要求亦越来越高，不断改善稻米的品质一直是科学家们追求的育种目标。几十年以来，围绕着稻米品质遗传，国内外学者已进行了大量的研究，取得了许多突破性进展。淀粉是稻米中第一大营养物质，其含量、组成和结构对稻米的品质有重要的影响，通过改良淀粉来提高米质是目前的主要手段。贮藏蛋白是稻米中仅次于淀粉的第二大类营养物质，约占种子干重的8~10%，它的含量和组成直接影响稻米的各项品质指标和营养价值。因此，解析水稻各储藏蛋白合成、转运、加工和积累的分子机制对稻米的品质改良至关重要。
到目前为止，编码水稻贮藏蛋白的结构基因已经相继被克隆，其中谷蛋白结构基因有15个，醇溶蛋白结构基因有33个，球蛋白结构基因有1个。然而，调控贮藏蛋白组成的功能基因尚未报道。我们从粳稻品种Kittake的化学诱变突变体库中筛选获得了一个贮藏蛋白组分发生变化的突变体F690，该突变体主要表现为谷蛋白含量降低，醇溶蛋白组分（10kDa、13akDa和16kDa）含量显著降低，而13bkDa醇溶蛋白含量明显增加。目前尚无报道关于F690蛋白参与水稻储藏蛋白合成相关的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物储藏蛋白合成相关蛋白F690及其编码基因与应用。
本发明提供的储藏蛋白合成相关蛋白F690，来源于稻属水稻（Oryza sativavar.Kitaaake），是如下（a）或（b）的蛋白质：
（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与谷蛋白分选相关的由序列2衍生的蛋白质。
SEQ ID NO.1由600个氨基酸残基组成。
为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个） | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
Strep-tag  |
8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（b）中的F690可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的F690的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码上述贮藏蛋白合成相关蛋白的基因（F690）也属于本发明的保护范围。
所述基因F690可为如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：
1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码储藏蛋白合成相关蛋白的DNA分子。
SEQ ID NO.2由1803个核苷酸组成。
所述严格条件可为在0.1×SSPE (或 0.1×SSC)，0.1% SDS的溶液中，在65oC下杂交并洗膜。
含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305.1载体(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585) 的多克隆位点SmaI之间重组插入所述基因（F690）得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305.1-F690；所述pCAMBIA1305.1-F690是将由F690基因组编码序列连同上游1983 bp的启动子区和下游737 bp的片段通过重组技术插入到pCAMBIA1305.1多克隆位点SmaI之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。
将含有F690的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-F690。
含有以上任一所述基因（F690）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
扩增所述基因（F690）全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育储藏蛋白合成正常的转基因植物的方法。
本发明提供的培育储藏蛋白合成正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入储藏蛋白合成异常的植物中，得到储藏蛋白合成正常的转基因植物；所述储藏蛋白合成异常植物为胚乳中谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量异常升高或降低的植物；所述储藏蛋白合成正常的转基因植物为谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白含量在该蛋白含量平均水平的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入储藏蛋白合成异常植物中；所述储藏蛋白合成异常植物可为F690。
所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
本发明的储藏蛋白合成相关蛋白影响水稻胚乳中储藏蛋白的合成过程。将所述蛋白的编码基因导入储藏蛋白含量紊乱的植物中，可以得到储藏蛋白含量正常的转基因植物，所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。
附图说明
图1野生型Kitaake和突变体F690的外观表型、SDS-PAGE和Western blot分析，其中，A为野生型Kitaake和突变体F690胚乳横切图，B为Kitaake和F690胚乳扫描电镜比较分析图，C为Kitaake和F690胚乳储藏蛋白组分SDS-PAGE图，D为Kitaake和F690各储藏蛋白家族Western-Blot分析图；
图2野生型Kitaake和突变体F690发育胚乳的考马斯亮蓝和罗丹明染色观察，其中，A为野生型Kitaake发育中期胚乳半薄切片考马斯亮染色图，B为突变体F690发育中期胚乳半薄切片考马斯亮染色图，C为Kitaake发育后期胚乳厚切片罗丹明染色观察图，D为F690发育后期胚乳厚切片罗丹明染色观察图，E为根据发育后期胚乳厚切片蛋白体I的直径统计分析；
图3野生型Kitaake和突变体F690发育胚乳的超微结构观察；
图4突变基因的图位克隆，其中，A为F690的精细定位图，B为F690基因内含子/外显子结构图，C为F690的突变位点及等位突变体的突变位点；
图5转基因互补株系的表型分析，其中，A为自身启动子加基因组全长表达的转基因互补家系胚乳横切图，B为Kitaake和F690以及互补家系储藏蛋白组分图，C为F690与互补家系蛋白体I和蛋白体II结构对比分析图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、水稻中储藏蛋白合成相关蛋白及其编码基因的发现
一、水稻储藏蛋白合成突变体F690的表型分析
在粳稻品种kitaake的化学诱变突变体库中筛选出籽粒粉质的突变株系F690。与野生型相比，F690的主要特征是籽粒粉质，不透明（见图1A）。扫描电镜分析证实F690中淀粉颗粒松散，可能是导致胚乳粉质不透明的主要原因（见图1B）。F690种子蛋白的SDS-PAGE图谱显示谷蛋白含量降低，醇溶蛋白组分（10kDa、13akDa和16kDa）含量显著降低，而13b kDa醇溶蛋白含量明显增加（见图1C）；Western blot分析进一步验证了上述变化（见图1D）。
发育中期胚乳半薄切片经过考马斯亮蓝染色后观察发现，野生型存在两类蛋白体，球形的蛋白体I和不规则形状的蛋白体II，蛋白体II略大于蛋白体I（见图2A，黑色空心三角标示蛋白体I，黑色实心三角标示蛋白体II）。然而，在F690中蛋白体II形态结构异常，且蛋白体I直径明显下降（见图2C和2D）。上述结果表明F690突变体中蛋白体I和蛋白体II发育异常。
为了进一步分析蛋白体I和蛋白体II的形成过程，利用透射电镜观察了发育中期的胚乳超微结构（见图3）。研究表明由于球蛋白的含量急剧降低，导致蛋白体II外周异常的形态结构，谷蛋白在蛋白体II中填充不完整，因此导致F690中的蛋白体II异常积累。而作为蛋白体I核心结构的10 KDa醇溶蛋白含量明显降低，可能致使蛋白体I形成过程中的混乱堆积，导致外周皱缩、直径变小。
二、目标基因定位
1、目标基因的初步定位
利用突变体F690与广亲和品种Dular（购自中国农业科学院作物科学研究所种质资源库）杂交，在F690/Dular的F2分离群体中选取10粒F690表型（籽粒粉质不透明且谷蛋白前体增加）的隐性极端个体，抽提种子DNA，构建DNA混池。利用覆盖水稻全基因组的175对InDel标记进行连锁分析，将负责F690突变体表型的突变基因定位在第1号染色体InDel标记R43-20和R43-11之间，物理距离为409 kb。
2、目标基因的精细定位
依据初定位结果，在InDel标记R43-20和R43-11之间寻找公共图谱上的分子标记，并依据NCBI公布的水稻基因组序列信息在此区间自行开发InDel标记。利用420个隐性极端个体对目标基因进行了精细定位（用于精细定位的分子标记见表2）。
表2 用于精细定位的分子标记
最终将目标基因F690精细定位在InDel标记P1和P2之间，物理距离为40kb（图4）。经过对该区间内基因进行测序，发现第3个ORF的第1个外显子上存在一个单碱基的替换，使得目标蛋白错误翻译（图4）。
三、目标基因F690的获得
提取粳稻品种kitaake叶片cDNA，以cDNA为模板，采用引物primer1和引物primer2进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质如SEQ IDNO.1所示。
primer1：5'- ATGGATCTCTCGCGGCCGG-3'；
primer2：5'- TCATACATCAAAACCTGGCA-3'。
将SEQ ID NO.1所示的蛋白质命名为F690蛋白，由600个氨基酸残基组成。将编码F690蛋白的基因命名为F690基因，其开放阅读框如SEQ ID NO.2所示。
实施例2、F690蛋白及其编码基因的应用
一、基因组互补载体的构建
将pCAMBIA1305.1载体（参考文献：He Gao, Mingna Jin, et al., Days to heading 7, a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity andregional adaptation in rice. Proc Natl Acad Sci USA,2014, 111(46): 16337-16342）的EcoRI和NcoI酶切位点之间的小片段替换为SEQ ID NO.3所示的双链DNA分子（包括F690基因上游1983 bp的启动子区和下游737 bp的终止子序列），得到pCAMBIA1305.1-F690基因组互补载体（已测序验证）。
二、过表达转基因植物的获得
1、将步骤一得到的pCAMBIA1305.1-F690过表达载体导入农杆菌EHA105菌株（美国英俊公司），得到重组农杆菌。
2、采用步骤1得到的重组农杆菌转化粳稻品种kitaake（野生型），具体步骤如下：
（1）取步骤1得到的重组农杆菌菌体，采用N6液体培养基（Sigma公司，C1416）重悬并调整菌液OD600nm为0.5。
（2）将培养至一个月的粳稻品种kitaake（野生型）成熟胚胚性愈伤组织在步骤（1）得到的菌液中侵染30 min，滤纸吸干菌液后转入含有10 g/L 琼脂的固体N6培养基（Sigma公司，C1416）中，24℃共培养3天；
（3）将步骤（2）培养的愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6固体培养基（Sigma公司，C1416）上培养16天（第一次筛选）；
（4）将步骤（3）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第二次筛选）；
（5）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在含有10 g/L 琼脂，100 mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基（Sigma公司，C1416）上培养15天（第三次筛选）；
（6）将步骤（4）培养后的健康愈伤组织接种在分化培养基（PhytoTechnologyLaboratories 公司，M524）上分化，得到T0代植株。
3、对步骤2得到的T0代植株进行鉴定，提取待测植株叶片的总DNA，采用引物primer3和引物primer4进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，替换位点为双峰的为转基因阳性植株。
primer3：5'- CTGCGTCAAGCGTCCAC -3'；
primer4：5'- CGATACATTGATAACTGACTGCA -3'。
三、表型鉴定
分别将T0代转pCAMBIA1305.1-F690植株，F690和野生型Kitaake种植在中国农业科学院转基因试验田内。结果显示转基因株系T2种子中出现了透明的籽粒（图5A），SDS-PAGE检测透明种子（L1，L2和L3）与野生型表现一样。由此验证了转基因前的不透明粉质和储藏蛋白合成异常是由F690基因控制的，即该F690基因为储藏蛋白合成相关基因。将pCAMBIA1305.1-F690转化水稻F690突变体，可以使其储藏蛋白含量恢复正常水平。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 一种植物储藏蛋白合成相关蛋白F690及其编码基因与应用
<160> 3
<210> 1
<211> 600
<212> 氨基酸
<400> 1
MDLSRPESSDLSLGFHSLGHARGHAVTGPLRLFDDMEDAKPEKSVGGGGGGGGGGGEEEDGEEGGDQHFSLLGHALCVKRPRRALYGGGGGGGAGGGGGGGGEASSCSSSSSSLHPAKRQATAERGADLEARRGAVRAWGNQALAEADPDVHALMELERDRQVRGIELIASENFVCRAVLEALGSHLTNKYSEGHPGARYYGGNQHIDGIERLCHERALAAFGLDPACWGVNVQPY
SCTSANLAVYTGLLLPKDRIMGLEPPSGGHVSHGYYTPSGKKVSGASIFFESLSYKVNPQTGYIDYDKLEERAMDFHPKILICGGSSYPREWDFARMRLIADKCGAVLMCDMAHISGLVAAKECRSPFDYCDVVTSTTHKNLRGPRGGIIFFRRGKNLRRRTGSFSQADENDYDFEDRINFAVFPSMQGGPHNNHIAALAITLKQVATPEYKAYIIQVKKNAQALASALLRRKCRLVTGGTDNHLVLWDLRNLGLTGKNFEKVCEACHISINKMPIYGDNGSISPGGVRIGTPAMTTRGCLEDDFEVIADFLIRATQIASNLMKEHGKMQKEFLRGLQNNKDIIELRNQVENFASQFAMPGFDV
<210> 2
<211> 1803
<212> DNA
<400> 2
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cttgaccatt gatacgcttc tt
Claims (10)
1.一种储藏蛋白合成相关蛋白，其特征在于选自如（a）或（b）所示的任一种：
（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有谷蛋白分选相关的由SEQ ID NO.1所示蛋白质衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的储藏蛋白合成相关蛋白，其特征在于，其末端增加有标签序列，优选为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、或c-myc。
3.编码权利要求1或2所述储藏蛋白合成相关蛋白的基因。
4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）至4）任一所示的DNA分子：
1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；
2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码SEQ ID NO.1所述蛋白的DNA分子；
4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码储藏蛋白合成相关蛋白的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是pCAMBIA1305.1载体，更具体的是在其多克隆位点EcoR I和Nco I之间插入权利要求3或4所述基因得到的重组质粒。
7.根据权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中在植物育种中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于其在培育储藏蛋白合成正常的转基因植物中的应用。
9.一种培育储藏蛋白合成正常的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入储藏蛋白合成异常或正常植物中，得到储藏蛋白合成正常转基因植物；其中所述储藏蛋白选自谷蛋白、球蛋白或醇溶蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述基因通过重组表达载体导入储藏蛋白合成所述植物中，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，优选为烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、或苜宿。
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