CN116554292B - 一种负调控植物广谱抗病的蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体为一种负调控植物广谱抗病的蛋白及其编码基因和应用，一种负调控植物广谱抗病的蛋白质为下述(1.1)‑(1.2)中的任一种：(1.1)由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(1.2)由(1.1)衍生的蛋白质，具体是：将如SEQ ID No.2所示的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或添加且与SEQ ID No.2所示蛋白质的抗病功能相关的蛋白质。本发明的蛋白及其编码基因可以通过负调控提高植物广谱抗病性。

Description

一种负调控植物广谱抗病的蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种负调控植物广谱抗病的蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

玉米是我国第一大粮食作物，近年来黄淮海等玉米主产区南方锈病、小斑病和弯孢等叶部病害频发重发，严重影响玉米产量和品质，小麦和水稻同样也受到锈病、小斑病和弯孢病等类似病原菌的影响。传统上主要利用抗病基因来培育抗病品种，抗病基因介导的抗性强，但容易被病菌变异所克服，导致抗性丧失病害流行成灾，使得花费10年左右的时间培育的抗病品种推广3-5年后抗性丧失，同时抗病基因发掘克隆难，抗性资源日趋匮乏。目前玉米中一些抗病基因被克隆，但依然缺乏对同一病原菌的多个生理小种产生抗性或对多种病原菌产生抗性的广谱抗性(broad-spectrum resistance，BSR)基因，因此，提供具有广谱抗性的材料是植物抗病遗传改良研究的前沿热点，也是作物绿色生产的重大需求。

发明内容

为了提供具有广谱抗性的材料，本发明提供了一种负调控植物广谱抗病的蛋白及其编码基因和应用。

一种负调控植物广谱抗病的蛋白质，所述蛋白质为下述(1.1)-(1.2)中的任一种：

(1.1)由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(1.2)由(1.1)衍生的蛋白质，具体是：将如SEQ ID No.2所示的氨基酸残基序列经过氨基酸残基的取代和/或添加且与SEQ ID No.2所示蛋白质的抗病功能相关的蛋白质。

所述的负调控植物广谱抗病的蛋白质的编码基因为下述(2.1)-(2.4)中的任一种：

(2.1)具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2.2)具有能编码如SEQ ID No.2所示的蛋白质序列的多核苷酸；

(2.3)具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

(2.4)具有在高严谨条件下能序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

所述高严谨条件为用0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

所述的负调控植物广谱抗病的蛋白质的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

用于克隆所述的编码基因的引物对，所述的引物对包括上游引物ZmBRY1F和下游引物ZmBRY1R，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述的蛋白质、所述的负调控植物广谱抗病的蛋白质的编码基因或者所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒在通过负调控提高植物广谱抗病性中的应用。

优选的，所述广谱抗病为抗锈病、小斑病和弯孢病。

进一步优选的，抗诱病为抗南方诱病。

优选的，所述负调控为通过敲除或抑制ZmBRY1表达来调控。

优选的，所述植物为玉米、水稻或小麦。

一种广谱抗病植物品种的培育方法，所述方法包括敲除或抑制负调控所述蛋白质的表达，阻止多种病原菌侵染和扩展，从而增强植株的抗病性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

首次报道了一种负调控广谱抗病蛋白及其编码基因，本发明从玉米中克隆得到ZmBRY1基因，其表达水平可以被多种病原菌胁迫诱导。对本发明获得的ZmBRY1敲除突变体功能鉴定，发现敲除突变体可显著提高植株广谱抗病性，具有负调控抗病性的功能，为玉米等植物广谱抗病性育种提供了新的基因资源和技术基础。

附图说明

图1为ZmBRY1启动子病原菌诱导相关顺式作用元件分析；

图2为玉米ZmBRY1组织表达(A)和病原菌诱导表达模式分析图(B)；

图3为ZmBRY1基因EMS诱变敲除突变体；

图4为ZmBRY1基因EMS诱变敲除突变体对玉米南方锈病、小斑病和弯孢病抗性表型图及病害等级分析图，其中，A、B分别为南方锈病抗性表型及等级，C、D分别为小斑病抗性表型及等级，E、F分别为弯孢病抗性表型及等级；

图5为ZmBRY1基因编辑敲除突变体；

图6为ZmBRY1基因编辑敲除突变体对小斑病(A)和弯孢病(B)抗性表型图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

玉米ZmBRY1的克隆

RNA提取：取三叶期的B73玉米植株叶片，加入液氮研磨后，迅速转移到1.5mL的离心管(液氮预冷)中。研磨好的材料统一加到0.5mL刻度上，加入1mL Trizol，室温放置10min，使其充分裂解；4℃，12000rpm，5min，弃沉淀；按200mL氯仿/mL Trizol加入氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s，待其充分乳化后，室温放置15min；4℃，12000rpm离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取上层水相，至另一个离心管中；按0.5mL异丙醇/mLTrizol加入异丙醇混匀，室温放置10min；4℃，12000rpm离心15min；弃去上清，RNA沉于管底；小心弃去上清，按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管悬浮沉淀，4℃，12000rpm离心5min，弃去乙醇，倒放在纸上，室温放干；加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪吹打沉淀，待RNA充分溶解后取适量检测其浓度和纯度，其余放入-80℃保存。

反转录：(1)RNA模板变性：测完浓度后的RNA，为达到总RNA含量为10pg-5μg，根据已知浓度计算出需要加的RNA模板的量，补ddH₂O至8μL，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。

(2)基因组DNA去除：向(1)的8μL混合液中加入2μL 5×gDNA wiper Mix，用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。

(3)配制第一链cDNA合成反应液：(2)的混合液10μL，10×RT Mix 2μL，HiScriptIII Enzyme Mix 2μL，Oligo(dT)₂₀VN 1μL，RNase-free ddH2O 5μL，用移液器轻轻吹打混匀。25℃5min，37℃45min，85℃5sec终止反应，即获得相应的反转录产物cDNA。

扩增：检索MAIZEGDB和NCBI数据库，获得ZmBRY1的推测编码序列，用PrimerPremier 5.0软件设计特异引物，引物由生工生物公司合成。引物序列如SEQ ID No.3和SEQID No.4所示，具体如下：

SEQ ID No.3：5’-ATGAACGCCAAGAAGATTAAGC-3’

SEQ ID No.4：5’-GCTTATCTTCGACTGGAATCCG-3’

以上述获得玉米cDNA为模板，通过PCR得到一个包含有完整开放阅读框的编码区，长度为1374bp，回收，连接到TA/Blunt-Zero载体上，得到ZmB RY1，进行测序。测序结果表明ZmBRY1与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列一致。编码具有SEQ ID No.2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。

SEQ ID No.1的序列如下：ATGAACGCCAAGAAGATTAAGCTGCACG ACTATCACCACTGCTACGGATCGCCGATGTGTGACCCACAGCTGTTCCCGCGCGCCGCCGCCGCCACCACCGCAGGGCTCTCCTTGCACCCGGGGCCGGGGCTCGTGGGCTCCCTGCCGCAGCGGCATGGCGGCGGCGGCGGCGGCTGGGTGCACGAGGAGCACACCGCGACGACCCCGAGGGCGGCGCAGGGGCAGGGCGGCTGCGTCGTCGGCTCCGACGCCGCCGCGTTCTTCGCCGCCGAGGAGCTCATGATGGGCACGGCGCGGTTCGACTCCCCTCTCGGCGGAACGACGACGGCACTCCAGGAGCTGACAGCGTTTGCCAAGGGACCGCCGTTTGGCCGGCCGAGGCCCACGACGGGGGGCGAGCGCGAGCGCGAGCGGCTGTACCCAGTGGACCCGCTGCCGCTCCGCGACTGCGCGGCGGTGAGGACGTACTACGTCCGGCCGCAGCAGCGCGACGGCGCCACGGAGGCGCCTCCTTCACTCGAGCTGCCATTCCAGCGGCGGCAGCAGCAACAAGTGCACGGGCTATTCGGCGACCCTTCCACCGGCAGGCTACTCGGCGGCGGCGAGCCTCAAGCTCACTCCTTTCCAGCTCACACCCTGAAGCAGGTTCCGGCGAGCACGTTTGTCCCCGCGATGGAGGCGCCGCCGGGCATGCAGAGCCTTATGGACAACCCGCTGTCCAGGAGCTGCAGTATCATCGGTGCGGCGGCGACCCACGCAGGGAGCGGTAACGCCGCCGCGCCGGGGCAAGGTGCTCCCAGCAAGACGCGGATTCGGTGGACGCAGGACCTCCACGAGCGCTTCGTCGACTGCGTCAACAAGCTCGGCGGCGCGGACAAGGCGACTCCCAAGGGCATTCTGAAGCTGATGAACTCTGATGGCCTCACAATCTACCACATCAAGAGCCACCTTCAGAAATACCGCATAGCCAAGTACATGCCCGTGTCATCGACGTCCGAAGGGAAAGAGAAACGAGCTGCTGCCGCCAATGACGTGCAGAATCTCGACCCCGGCACCGGGATGAAGATCACGGAAGCGCTACGCGTCCAGCTCGACGTGCAGAGGCGCCTCCACGAGCAGCTCGAGATCCAGAGGAATCTGCAGCTGAGGATCGAGGCGCAAGGCAAGAAGCTGCAGAAGATGTTCGAGGAGCAGATGAAGACGAGCAGGACCGTGATGGGGCCGCCGCAGGGCGCCGACGTCGCCTTCATCGGCGCCGGCGAGCAGGAGGAGGAGGTGGAGGTGGAGGACGCGTTCGACGACGTGCAGCTACTGGCGGCCGTGTCCAGCGCCAGCGTCGGCTACCGCGACGGCGGATTCCAGTCGAAGATAAGCTAG。

SEQ ID No.2的序列如下：MNAKKIKLHDYHHCYGSPMCDPQLFPRAA AATTAGLSLHPGPGLVGSLPQRHGGGGGGWVHEEHTATTPRAAQGQGGCVVGSDAAAFFAAEELMMGTARFDSPLGGTTTALQELTAFAKGPPFGRPRPTTGGERERERLYPVDPLPLRDCAAVRTYYVRPQQRDGATEAPPSLELPFQRRQQQQVHGLFGDPSTGRLLGGGEPQAHSFPAHTLKQVPASTFVPAMEAPPGMQSLMDNPLSRSCSIIGAAATHAGSGNAAAPGQGAPSKTRIRWTQDLHERFVDCVNKLGGADKATPKGILKLMNSDGLTIYHIKSHLQKYRIAKYMPVSSTSEGKEKRAAAANDVQNLDPGTGMKITEALRVQLDVQRRLHEQLEIQRNLQLRIEAQGKKLQKMFEEQMKTSRTVMGPPQGADVAFIGAGEQEEEVEVEDAFDDVQLLAAVSSASVGYRDGGFQSKIS。

实施例2

ZmBRY1组织表达模式分析

利用转录组获得的表达量数据，对ZmBRY1基因各自在玉米不同器官中的表达量进行分析，其中包含不同天数的根、茎、叶、叶柄、花粉、胚。通过TBtool软件进行热图分析发现，ZmBRY1基因主要在成熟叶中表达。

RNA提取：分别提取了玉米幼根、成熟根、花丝、花药、幼叶、成熟叶、苞叶、果穗、幼茎、成熟茎的RNA，提取方法同实施例1。

反转录：(1)基因组DNA去除：在RNase-free离心管中加入4×gDNA wiper Mix 4μL，测完浓度后的RNA，为达到总RNA含量为1pg-1μg，根据已知浓度计算出需要加的RNA模板的量，最后补ddH₂O至16μL，用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。

(2)配制逆转录反应体系：向第一步混合缓冲液中加入5×HiScript III qRTSuperMix 4μL。用移液器轻轻吹打混匀。37℃15min，85℃5sec终止反应，即获得相应的反转录产物cDNA，用于后续qPCR。

qPCR结果如图2中的A显示，ZmBRY1基因主要在成熟叶中表达，在幼根、幼叶、成熟根中也有少量表达。

实施例3

ZmBRY1诱导表达模式分析

以B73为背景的两个突变体株系和野生型对照株，种植后约30d进行南方锈病(SCR)、小斑病(CLS)、弯孢病(SLB)病原菌接种。分别对未接种和接种病原菌后72h的玉米叶片进行RNA提取，反转录后用于qPCR。

结果如图2中的B显示，ZmBRY1受病原菌诱导显著上调表达，这为敲除突变体抗性增强提供了有益信息。

实施例4

ZmBRY1基因启动子元件分析

利用RSAT网站(http://floresta.eead.csic.es/rsat/)，对ZmBRY1基因上游2000bp左右的预测启动子区域进行启动子元件分析，主要包含病原菌诱导相关的启动子元件，得到结果后绘制启动子分析示意图，图1所示，由图可知该启动子区域存在多个响应病原菌的顺式作用元件。

实施例5

ZmBRY1负调控广谱抗性功能分析

1、EMS诱变敲除ZmBRY1突变体广谱抗性功能分析

(a)敲除突变体创制：利用EMS诱变B73突变体库筛选鉴定ZmBRY1敲除突变体，经回交自交获得zmbry1-1和zmbry1-2两个突变体，如图3所示。

(b)病原菌接种：

①南方锈病病原菌接种。先用0.01％.的吐温悬浮液喷施玉米叶片，待其适量挥发后接种来自安徽金寨玉米锈病鉴定中心病原菌孢子，并将其均匀抖洒到玉米穗位叶等叶片上，孢子量约100个/cm²。将接种后的玉米置于温室搭建好的保湿塑料大棚中，黑暗保湿12h，然后按照正常的玉米培养条件继续培养，未处理组除不接病原菌外其它操作相同。

②小斑病病原菌接种。菌种来自安徽省玉米病害鉴定中心优势种，将培养的病菌孢子配置孢子悬液，孢子悬液中加0.01％(V/V)吐温，悬液孢子浓度为1×10¹⁵个/mL，将孢子悬液均匀喷施到生长30天植株每叶叶片上接种保湿24h后正常管理。

③弯孢病病原菌接种。菌种来自安徽省玉米病害鉴定中心优势种，其余与小斑病接种方法相同。

(c)抗性鉴定：接种侵染后13天按三种病害调查方法每材料三次重复，每重复调查15株，按照标准统计分析划分病害等级，其结果见图4，从图可以看出敲除ZmBRY1基因，极显著增强了玉米对南方锈病、小斑病和弯孢病叶部病害的抗性。

南方锈病从对照高感(9级)，提高到中抗(5级)和抗(3级)水平：小斑病从感(7级)提升到中抗(5级)和抗(3级)的水平；弯孢也从感(7级)提升到中抗(5级)和抗(3级)的水平。

2、基因编辑敲除ZmBRY1突变体广谱抗性功能分析

(a)敲除突变体创制：利用玉米自交系KN5585基因组克隆ZmBRY1基因，测序分析核苷酸序列，设计sgRNA，构建Cas9基因编辑载体，通过遗传转化获转基株，分子检测鉴定获敲除突变体zmbry1-3和zmbry1-4(图5)。

(b)病原菌接种：方法同上

(c)抗性鉴定：KN5585背景下ZmBRY1敲除株系和野生型对照株小斑病和弯孢病的抗性显著提高(图6)。进一步印证不同遗传背景下ZmBRY1负调控叶部病害广谱抗性的功能。

经验证，在小麦和水稻中也具有相同的效果。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.蛋白质在通过负调控提高植物广谱抗病性中的应用，其特征在于，所述蛋白质为由如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述植物为玉米，所述广谱抗病为抗锈病、小斑病和弯孢病；

所述负调控为通过敲除SEQ ID No.2所示的蛋白的编码基因来调控。

2.根据权利要求1所述的蛋白质在通过负调控提高植物广谱抗病性中的应用，其特征在于，所述编码基因为下述（2.1）-（2.3）中的任一种：

（2.1）具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

（2.2）具有能编码如SEQ ID No.2所示的蛋白质序列的多核苷酸；

（2.3）具有在高严谨条件下能与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

所述高严谨条件为用0.1×SSPE或0.1×SSC，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

3.根据权利要求2所述的蛋白质在通过负调控提高植物广谱抗病性中的应用，其特征在于，用于克隆所述的编码基因的引物对包括上游引物ZmBRY1F和下游引物ZmBRY1R，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一种广谱抗病植物品种的培育方法，其特征在于：所述方法为通过敲除SEQ ID No.2所示的蛋白的编码基因负调控所述蛋白的表达，阻止多种病原菌侵染和扩展，从而增强植株的抗病性；

所述植物为玉米，所述广谱抗病为抗锈病、小斑病和弯孢病。