CN116217684A - 一种ZmWRKY60基因突变体及其在调控玉米株高中的应用 - Google Patents

一种ZmWRKY60基因突变体及其在调控玉米株高中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ZmWRKY60基因突变体及其在调控玉米株高中的应用，涉及功能基因和植物基因育种技术领域。ZmWRKY60基因突变体是由野生型的ZmWRKY60基因在编码区第736位的碱基C被碱基T取代引起无义突变而得到的，突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因编辑植株KOwryk60采用了单基因双靶点的方式使ZmWRKY60基因丧失功能。结果显示突变体Zmwrky60和基因编辑植株KOwryk60都能够使玉米株高降低，说明ZmWRKY60基因参与玉米株高的调控，这为创制玉米新种质以及培育玉米理想柱型提供了重要的理论意义和应用价值。

Description

一种ZmWRKY60基因突变体及其在调控玉米株高中的应用
技术领域
本发明涉及功能基因和植物基因育种技术领域，具体涉及一种ZmWRKY60基因突变体及其在调控玉米株高中的应用。
背景技术
玉米不仅是养殖业的重要饲料来源，也是食品加工、医疗卫生、轻工及化工等行业的主要原料之一。研究和生产实践证明，增加种植密度是提高玉米产量的有效措施之一。玉米株高与种植密度、生物量、抗倒性和籽粒产量密切相关，是玉米育种中关注的重要性状。因此，挖掘玉米矮杆基因资源，培育理想株高的玉米新品种是进一步提高玉米产量的有效途径。
玉米的株高除与体内激素水平密切相关外，一些转录因子对玉米株高的调控也时有报道。其中WRKY转录因子是高等植物中最大的转录因子家族之一。WRKY蛋白可以通过与其目标基因的启动子中的W-box(TTGACC/T)结合，抑制或激活下游基因的表达，进而调控植物的生长发育。
近年来在水稻、拟南芥等作物中报道了一些WRKY转录因子调控植株株高。例如RNA干扰OsWRKY78引起植株变矮；过表达OsWRKY89能引起水稻茎杆木质素含量增加合株高降低；过表达拟南芥AtWRKY12会抑制茎杆的木质化水平，引起植株矮化以及部分植株不育的表型。但是在玉米中报道的与株高相关的WRKY转录因子依旧很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米株高调控的ZmWRKY60基因突变体，其次在于提供ZmWRKY60基因突变体在玉米育种中的应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供一种ZmWRKY60基因突变体，该突变体是由野生型的ZmWRKY60基因在编码区第736位的碱基C被碱基T取代发生点突变而得到的，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步改进在于，所述ZmWRKY60基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步改进在于，该突变体能使玉米株高降低。
本发明提供一种上述ZmWRKY60基因突变体在调控玉米株高中的应用，利用基因编辑技术或传统遗传育种技术实现，所述基因编辑技术指的是将野生型玉米中的ZmWRKY60基因编辑为上述的ZmWRKY60基因突变体，得到株高降低的玉米；所述传统遗传育种技术指的是将含有ZmWRKY60基因突变体的玉米植株与待改良玉米自交系进行杂交、回交、自交分离获得遗传背景清晰且含有ZmWRKY60基因突变体的矮化的玉米自交系。
本发明提具有如下有益效果：
本发明提供的ZmWRKY60基因突变体能够使玉米株高降低，为创制新种质以及培育玉米理想柱型提供了重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1为ZmWRKY60与其他WRKY转录因子氨基酸序列比对后的进化树分析图；
图2为ZmWRKY60蛋白的亚细胞定位玉米原生质体示意图，用于ZmWRKY60蛋白的亚细胞定位，图中，核定位信号mCherry作为核标记物；
图3为ZmWRKY60基因的组织表达模式；
图4为ZmWRKY60基因突变模式图以及突变体株系测序峰图；
图5为ZmWRKY60基因突变体株高表型(整株)；
图6为ZmWRKY60基因突变体与野生型株高统计图(图中：WT为野生型；Zmwrky60为ZmWRKY60基因突变体)。
图7为ZmWRKY60基因编辑植株株高表型(整株)；
图8为ZmWRKY60基因编辑植株与野生型株高统计图(图中：WT为野生型；KOwryk60为ZmWRKY60基因编辑植株)。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料与试剂
玉米自交系B73为野生型WT，由安徽农业大学生命科学学院作物抗逆育种与减灾国家地方联合工程实验室提供。
ZmWRKY60基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
玉米株高矮化突变体Zmwrky60植株，含有突变后的ZmWRKY60基因。在玉米EM S突变体库(http://elabcaas.cn/memd/public/index.html#/pages/search/geneid)中有一个突变体EMS3-055a7a，通过基因组重测序和Mutmap定位发现，该突变体EMS3-055a7a的ZmWRKY60基因在编码区第736位上发生了由C到T的无义突变，大田种植后观察到该突变体株高矮于野生型即玉米自交系B73。通过与野生型B73回交六代，再进行自交分离出遗传背景更为清晰的矮化突变体植株Zmwrky60。
为了确定ZmWRKY60基因在玉米株高上的功能，除了考察矮化突变体植株Zmwrky60的株高性状，同时也创建了基因编辑株系。对于非编码蛋白，利用华农CRISPR-P网站进行设计(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)，选用靶标分数高，脱靶标率低，位置合适的靶标。对ZmWRKY60基因采用单基因双靶点的靶标设计，靶标1和靶标2的序列分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。将构建好的pCXB053载体寄送到未米生物有限公司，用于基因编辑植株KOwrky60的创制。
SEQ ID NO.5：靶标1：GCCGGAGCATTGGATACGGAGGG
SEQ ID NO.6：靶标2：TTAGCAGAAGACAGAATCCAGGG
所用引物合成以及测序均由上海生工生物有限公司完成；实验中用到的各种限制性内切酶、DNAMarker、TaqDNA聚合酶等购自Takara公司；反转录试剂盒购于Prome ga公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购于全式金生物技术有限公司。
本实施例所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，无特别说明的试剂，均为市售购买产品。
2、方法
2.1玉米ZmWRKY60基因的进化树构建与功能分析
检索MAIZEGENOME和NCBI数据库，获得ZmWRKY60基因推测的碱基序列和蛋白序列，分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示.随后将不同植物的WRKY蛋白序列与ZmWRKY60的氨基酸序列进行系统进化关系的分析，结果如图1所示。
2.2ZmWRKY60的亚细胞定位
2.2.1构建ZmWRKY60的亚细胞定位融合载体
利用pCAMBIA1305(p1305)作为载体骨架，GFP绿色荧光蛋白作为报告基因，构建了p1305-ZmWRKY60-GFP融合表达载体。设计此次基因引物时，要去掉ZmWRK Y60基因的终止密码子。上游酶切位点为XbaI，下游酶切位点为BamHI。引物由生工生物公司合成。引物序列如下：
SEQ ID NO.7：60-1305F:TCCGGAGCTAGCTCTAGAATGGAGGAAGTGGAGGA GGCGA
SEQ ID NO.8：60-1305R:CTTGCTCACCATGGATCCCACCTGTGCTGCTGCTGC TGC
2.2.2原生质体转化
(1)B73玉米种子暗条件下生长约2周时间，取生长状况较好的黄化苗叶片1.5g，剔除叶脉，较暗环境中用手术刀切成0.2mm细小叶条。
(2)将切好的小叶条放入预先配好的酶解液(15mL)中，并使用镊子(枪头)将其完全浸润。
(3)用真空泵黑暗中抽提30min，以加速酶解液与细胞壁充分接触。
(4)用水平摇床40rpm室温孵育，黑暗条件下酶解6h。
(5)预冷一定量W5溶液和空的无菌50mL圆底离心管(冰浴)。
(6)W5润洗100目金属筛，过滤稀释含有原生质体的酶解液。
(7)将冷冻离心机的加速度和减速度调低，100g4℃离心2min，吸去上清，再加入5mL冰上预冷的W5溶液，缓慢倾斜旋转离心管使其混匀。
(8)冰上暗置30min，再次100g4℃离心2min。
(9)暗下尽量除去W5溶液，根据沉淀量的多少加入适量MMG溶液(如300μL)，同法重悬原生质体。在血球计数板上用显微镜下检查溶液中的原生质体的状态及数量，使其终浓度不低于1×106个/mL。
(10)加入5μg重组质粒DNA(浓度最好500ng/μL以上)于2mL圆底EP管中。
(11)加入100μL原生质体(2×104个)，轻柔混合。
(12)加入120μL(体积为第11步+第12步的体积总和)PEG4000溶液，轻柔混合。
(13)冰上暗下进行诱导，根据表达量选择转化时间，一般1h即可。
(14)室温下用480μL(第12步所加体积的四倍)W5溶液稀释转化混合液，轻柔混匀以终止转化反应。
(15)室温下离心2min，尽量去除上清，然后用W5溶液漂洗一次，同法离心去上清。
(16)使用W1/W5溶液轻柔重悬细胞，然后转移至多孔组织培养皿中，并用锡箔纸包裹。
(17)室温培养原生质体24-36h，然后用激光共聚焦显微镜进行观察。
结果如图2所示，ZmWRKY60-GFP融合蛋白定位在细胞核上，符合转录因子的特征。
2.3ZmWRKY60基因表达模式分析
2.3.1玉米材料的获得
组织表达模式分析时，待B73生长至四叶期，将整株从育苗盆中取出，洗净根系的泥土，分别取根、茎、叶各三份于锡箔纸中，做好标记，液氮速冻后置于超低温冰箱待用。另取田间苞叶、花药、花粉、生长的吐丝期玉米花丝、果穗、胚各三份，速冻后待用。
2.3.2Trizol法提取玉米总RNA
提前准备好2mLRNaseEP管和1mLRNase枪头，置于液氮中预冷。打开冷冻离心机4℃预冷；用液氮预冷研钵(180℃干燥烘箱烘6h)，取1g左右叶片，充分快速研磨，期间加入液氮重复研磨至样品粉末微微发白，迅速用枪头转入EP管(预冷后的枪头和EP管内部均不会粘附样品粉末)，加入适量Trizol试剂进行裂解，涡旋振荡后冰上暗置10min；后在每管加入0.25mL氯仿异戊醇(24：1)，在通风橱内盖紧盖子快速震荡15s，然后置于冰上暗置3min，混合液12000g4℃离心机离心5min；小心取上清转移至新的1.5mLRNaseEP管，用等体积的异丙醇混合，冰上静置10min，再次高速离心10min；弃上清，理想的植物幼嫩叶片RNA沉淀应为白色，加入1mL新配置的75％酒精进行洗涤(注意不可将沉淀吹散)；12000g4℃离心5min，弃上清；再加入1mL新配置的75％酒精洗涤后离心，尽量去除残留的酒精后用适量DEPC水溶解RNA沉淀备用。
2.3.3RNA反转录
使用Takara反转录试剂盒进行RNA反转录实验，具体操作步骤如下：
(1)使用超微量核酸蛋白浓度测定仪检测提取的RNA浓度及质量并记录。
(2)对提取完成的RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，质量合格的RNA应有明显的3条带，主要是28S、18S、5.8S和5S四种。
(3)检测合格的RNA，按照试剂盒说明书进行反转录实验，每个反转录反应，根据浓度，准确加入1μg RNA。加样体系如下：
Figure BDA0004000984330000061
ⅡSuperMix 10μL；Total RNA依据测量的浓度添加到1μg；随后用RNase free H2O补充到20μL。小心混匀后，25℃水浴5min，再42℃水浴30min，最后85℃进行酶灭活。
2.3.4 ZmWRKY60基因表达模式
根据ZmWRKY60基因的CDS序列，使用Primer3 Plus在线版设计定量引物60D-F/R。Primer3 Plus在线版：https://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi.
引物由生工生物公司合成，引物序列如下：
SEQ ID NO.9：60D-F：ACGAAGCATGCACCAAGTTT
SEQ ID NO.10：60D-R：TTCTGAGTCAAGAACCCTGGA
以GAPDH(GenBank accession no.EU969279.1)作为内参基因，采用罗氏公司的荧光定量试剂进行实时荧光定量PCR反应，具体反应体系如下：10μL SYBR Green RealtimePCR Master Mix，6.8μL ddH2O，0.8μL forward primre，0.8μL reverse primer，最后添加1.6μL cDNA模板。
热循环程序如下：55℃1min，95℃10min，40个循环，95℃15s，60℃1min。最后一个循环后，在60-95℃的温度范围内以0.5℃的增量进行熔解曲线分析，以验证反应的特异性。扩增信号和数据处理采用比较Ct法(ΔΔCt)，相对表达值RQ＝2(-ΔΔCt)。
结果如图3所示，显示ZmWRKY60基因在茎中的表达量最高，叶中表达次之，其他根、苞叶、花药、花丝等组织中含量较低。
2.4突变体Zmwrky60基因组DNA提取
利用CTAB法提取玉米株高矮化突变体Zmwrky60植株的基因组DNA，步骤如下：
取2cm长度叶片至于2mL离心管中，加入小钢珠，液氮速冻后至于研磨仪，45Hz震荡2min，震荡充分后加入800μL CTAB提取液，涡旋混匀，65℃水浴锅孵育1h，中途翻转几次；通风橱中加入等量氯仿异戊醇(24：1)，涡旋混匀；12000rpm离心10min，小心吸取上清约700μL，转入1.5mL离心管，加入等量异丙醇沉淀核酸，静置2min；随后12000rpm离心10min，弃上清，加入500μL 70％酒精轻柔漂洗两次；最后倒去酒精，通风橱风干后加入100μL去离子水，-20℃保存。
2.5 ZmWRKY60基因终止突变体检测
2.5.1引物设计
ZmWRKY60基因CDS全长1100bp，包含3个外显子，第一个外显子最长为824bp。本研究针对第一个外显子区域，利用Primer Premier 5.0软件设计特异引物，引物由生工生物公司合成。引物序列如下：
SEQ ID NO.11：60EMS-F：5'ATGGAGGAAGTGGAGGAGGC3'
SEQ ID NO.12：60EMS-R：5'CTTCTCTTTGAACAATGGCACC3'
扩增长度为824bp。
2.5.2 PCR扩增条件
以玉米株高矮化突变体Zmwrky60植株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，反应体系如下：总体积为25μL，其中Primer STAR Max premix(2×)有12.5μL，引物60EMS-F和60EMS-R各1μL，突变体基因组DNA加2μL，最终补灭菌水8.5μL。
加完样品后，低速离心机离心混匀，在PCR仪中进行反应，反应程序如下：98℃预变性10min后，再98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸1min，运行35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。
2.5.3 PCR产物电泳及测序
PCR结束后，琼脂糖凝胶电泳检测产物大小，将800bp左右的条带回收，送至南京生工生物公司进行Sanger测序，并与SEQ ID NO.1进行比对。结果(见图4)表明突变体中ZmWRKY60基因的第736-738位碱基CAG变为TAG，获得了ZmWRKY60基因终止纯合突变体。
2.6突变体Zmwrky60株高表型鉴定
选取籽粒大小一致的玉米自交系B73作为对照组，突变体Zmwrky60作为实验组。先用蛭石在室温下萌发2天，出芽后挑选长势一致的种子各30颗，移栽至蛭石：黑土为1：1的花盆中，放入温室中生长。温室的温度保持在白天28℃左右，夜晚22℃左右，光周期大致为16小时光照，8小时黑暗，湿度60％左右。在抽雄后进行株高的统计与拍照，结果分别如图5和图6所示，相对于野生型(对应图6中的WT)，突变体Zmwrky60(对应图6中的W60)株高显著降低。
2.7基因编辑植株KOwrky60株高表型鉴定
将公司返还的基因编辑植株KOwrky60种子在室温下用蛭石萌发2天，对照组用公司返还到玉米自交系B73种子。出芽后挑选长势一致的种子各30颗，移栽至蛭石：黑土为1：1的花盆中，放入温室中生长。温室的温度保持在白天28℃左右，夜晚22℃左右，光周期大致为16小时光照，8小时黑暗，湿度60％左右。在抽雄后进行株高的统计与拍照，结果分别如图7和图8所示，相对于野生型(对应图7中的WT)，基因编辑植株KOwrky60(对应图7中的KOwrky60)株高显著降低。
结果显示突变体Zmwrky60和基因编辑植株KOwrky60相比较野生型B73植株，株高显著降低，这为创制新种质以及培育玉米理想柱型提供了重要的应用价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种ZmWRKY60基因突变体，其特征在于，该突变体是由野生型的ZmWRKY60基因在编码区第736位的碱基C被碱基T取代发生点突变而得到的，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的一种ZmWRKY60基因突变体，其特征在于，所述ZmWRKY60基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的一种ZmWRKY60基因突变体，其特征在于，该突变体能使玉米株高降低。
4.一种如权利要求1-3任一所述的ZmWRKY60基因突变体在调控玉米株高中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用基因编辑技术，将野生型玉米中的ZmWRKY60基因编辑为如权利要求1-3任一所述的ZmWRKY60基因突变体，得到株高降低的玉米。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将含有ZmWRKY60基因突变体的玉米植株与待改良玉米自交系进行杂交、回交、自交分离获得遗传背景清晰且含有ZmWRKY60基因突变体的矮化的玉米自交系。
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