CN103122340A

CN103122340A - 一种改善木薯农艺性状的方法及其应用

Info

Publication number: CN103122340A
Application number: CN2011103698952A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 许佳
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-05-29
Also published as: CN106148293A

Abstract

本发明提供了ROS相关多肽及其编码的多核苷酸的用途，具体地，所述的ROS相关多肽及编码的多核苷酸可以用于改善木薯的农艺性状，尤其是延长木薯的生理性变质，抗旱和/或抗寒等。本发明还提供了一种改善木薯农艺性状的方法及其应用。

Description

一种改善木薯农艺性状的方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物学领域，具体地，本发明涉及一种改善木薯农艺性状的方法及其应用。

背景技术

随着全球化石能源需求的日益增加，能源紧缺是世界各国的面临的普遍难题，利用工业生物技术开展生物质液体燃料研发已经成为全球热点之一。

木薯为大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot)植物。木薯因其具有超常的光、热、水资源利用率，单位面积的生物能产量几乎高于其它所有的栽培作物，且具有适应范围广泛、块根淀粉率高等特性，在生物能源的开发和利用中占有非常重要的位置。利用荒山、荒地、沙土地等边缘地带开展木薯种植，可做到不与粮食争地，同时又有环境效益，符合生物能源与粮食生产和谐发展的长期战略，有利于保障国家的粮食安全。因此，木薯作为我国的重要能源植物，担负着年产50万吨燃料乙醇的任务，成为我国非粮淀粉型能源植物的首选之一。

然而，木薯产业化面临的最大的瓶颈是采后块根的生理衰变。木薯收获之后必须在3天内加工，否则会发生采后生理衰变，导致块根褐化及腐烂，影响其加工及产品性能，同时也为淀粉加工企业带来了压力。每年由于采后块根的生理衰变导致的损失在收获量的5％以上，直接经济损失达2亿元以上。

对于少量的储藏根，在收获后可通过立即封蜡、套袋或加工成干片来抑制生理性变质，但增加了原材料成本，因此不适用于规模化木薯加工企业。采收前两周对木薯的茎杆进行修剪可在一定程度上延缓储藏根的采后生理性变质，但会导致储藏根的食用品质和淀粉质量大大降低，限制了该方法的应用。

此外，木薯能忍受一定的低温，但是在一定温度下，如10℃以下会发生生长缓慢，细胞和细胞膜损伤，器官衰老等变化。在极端的干旱条件下，发生叶片失水、萎蔫、甚至死亡等。

至今，尚未有一种用于改善诸如：抑制木薯储藏根的采后生理性变质、抗旱、抗寒等农艺性状的方法，因此本领域迫切需要开发一种行之有效的能够良好改善木薯农艺性状的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改善木薯农艺性状的方法及其应用。

本发明的另一目的在于提供一种具有改善生理性变质的植株。

本发明的另一目的在于提供一种具有抗旱和/或抗寒的植株。

本发明的另一目的在于提供于ROS相关的多肽或多核苷酸用于改善木薯农艺性状的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的ROS相关多肽或其编码的多核苷酸的用途，其中，所述的ROS相关多肽或其编码多核苷酸为SOD、CAT、APX，或其组合，所述多肽或多核苷酸用于改善植物的农艺性状。

在另一优选例中，所述组合为SOD和CAT的组合，或SOD和APX的组合；或SOD、CAT和APX三者的组合。

在另一优选例中，所述的ROS相关多肽具有以下特征：

所述的SOD多肽选自下组：(i-a)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；或(ii-a)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有SOD功能的由(i-a)衍生的多肽；

所述的CAT多肽选自下组：(i-b)具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽；或(ii-b)由SEQ ID NO：6所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有CAT功能的由(i-b)衍生的多肽；

所述的APX多肽选自下组：(i-c)具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽；或(ii-c)由SEQ ID NO：10所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有APX功能的由(i-c)衍生的多肽。

在另一优选例中，编码ROS相关多肽的多核苷酸具有以下特征：

所述SOD多肽的编码多核苷酸选自下组：(i)具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO：1所示序列互补的多核苷酸；

所述的CAT多肽的编码多核苷酸选自下组：(i)具有SEQ ID NO：5所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO：5所示序列互补的序列的多核苷酸；

所述的APX多肽的编码多核苷酸选自下组：(i)具有SEQ ID NO：9所示序列的多核苷酸；或(ii)具有与SEQ ID NO：9所示序列互补的序列的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的ROS相关多肽或其编码的多核苷酸是来源于大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot)植物，更佳地来源于木薯。

在另一优选例中，所述植物为大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(Manihot)植物，更佳地为木薯。

在另一优选例中，所述农艺性状选自下组：延长保质期；延缓生理性变质；提高抗旱能力；提高耐寒能力；或其组合。

在本发明的第二方面，提供了一种改善木薯农艺性状的方法，所述方法包括：提高木薯中ROS相关多肽的表达或活性，所述ROS相关多肽为SOD、CAT、APX，或其组合。

在另一优选例中，所述的组合为SOD和CAT的组合，或SOD和APX的组合，或SOD、CAT和APX三者的组合，并且：

在另一优选例中，所述的农艺性状选自下组：延长保质期；延缓生理性变质；提高抗旱能力；提高耐寒能力；或其组合。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有ROS相关多肽的编码序列；

(2)将木薯的植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述ROS相关多肽的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择已转入所述ROS相关多肽的编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

在另一优选例中，所述的SOD多肽选自下组：(i-a)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；或(ii-a)由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有SOD功能的由(i-a)衍生的多肽；

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示在PPD发生过程中MeCu/ZnSOD、MeAPX2、MeCAT1三个基因表达水平。

图2显示本发明所构建的基因表达盒：图2a显示了载体pCAMBIA1301-P54-MeCu/ZnSOD的结构，图2b显示了载体pCAMBIA1301s-35s-CAT1的结构，图2c显示了载体pCAMBIA1301s-35s-APX2的结构；图2d和图2e显示了双价载体的结构。

图3显示转基因木薯的表达水平，左图为转入基因APX2和MeCu/ZnSOD转基因木薯的相对表达水平；右图为转入基因CAT和MeCu/ZnSOD转基因木薯的相对表达水平。

图4显示各个植株(处理前，WT，SA1，SC2)经H₂O₂染色结果。

图5显示了未转基因的木薯植株C3的H₂O₂含量显著升高，而转基因的木薯植株(左图)SA1，SA2，SA4，SA6和(右图)SC3，SC4，SC11，SC23基本没有变化。

图6显示转基因株系(SA1，SA2)和C3野生型植物甲基紫精(MV)处理结果。

图7显示植物甲基紫精(MV)处理后叶片的叶绿素含量检测结果。

图8显示木薯块根采后生理性变质发生情况。

图9显示用活性氧探针染色木薯块根荧光图，左列为0h检测结果，右列为24h检测结果，第一排为荧光图片，第二排为透射图片，第三排为合成图片。

图10显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC4)在冷处理前后的整体图和局部图。

图11显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC2，SC4，SC11)在冷处理前后MDA含量，SOD和CAT的酶活。

图12显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC2)干旱处理前和处理16天，30天，和复水7天的生长状态。

图13显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC2，SC4，SC11)干旱处理后的叶片失水结果。

图14显示了遗传转化路线流程。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次建立了一种改善木薯农艺性状的方法，意外地发现，将与ROS代谢有关的重要基因在植物中过表达，基因转化成功的植株具有良好的抗生理性变质和抗旱耐寒的优良农艺特性。

具体地，本发明人将4PX2，CAT，和MeCu/ZnSOD基因转入木薯脆性愈伤组织，获得的再生植株显著提高了抗氧化能力，木薯藏根的生理性变质(PPD)过程显著延缓，且显著提高了植株的抗冷抗旱能力，与ROS代谢有关的重要酶，如CAT、SOD显著提高，与细胞膜保护有关的丙二醛含量显著下降。

术语

活性氧簇(ROS)

需氧细胞在代谢过程中能产生一系列活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，包括：O2-·、H₂O₂、·OH等。中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死，低浓度的自由基能够影响一系列信号转导途径。此外，ROS还可双向调控某些肿瘤细胞的凋亡和增殖，并与自由基与细胞信号转导之间存在的内在关联，机体内的自由基通过其浓度变化调节机体细胞的生死平衡，除了引起细胞凋亡、坏死的功能，ROS还可以激活转录因子，促进细胞增殖和分化。在动物体中，ROS与衰老有关，在植物体中，ROS与果实成熟、腐败以及生理性变质密切相关。

SOD(Super Oxide Dimutase)

SOD即超氧化物歧化酶，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD超氧化物歧化酶以多个常见的形式存在，它们以铜和锌、或锰、铁、或镍作为辅助因子。基本上所有的真核细胞内都含有带有铜和锌的超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)。Cu/Zn SOD是一个二聚体，分子量为32,500，两个亚基主要通过疏水和静电相互作用结合在一起，铜和锌则与活性位点上的组氨酸侧链形成配位键。几乎所有的线粒体和许多细菌(如大肠杆菌)含有结合锰的超氧化物歧化酶(Mn SOD)。锰离子与三个组氨酸的侧链、一个天冬氨酸的侧链和一个水分子或羟基(取决于锰的氧化态)配位结合。大肠杆菌和其他一些细菌还含有结合铁的超氧化物歧化酶(Fe SOD)，一些细菌只含Fe SOD，另一些只含Mn SOD，还有一些则两种都含有，Fe SOD也被发现存在於植物的色素体中，Mn SOD和Fe SOD的活性位点具有同样类型的胺基酸与金属离子配位。人类2型超氧化物歧化酶活性位点的结构在高等植物中，不同形式的超氧化物歧化酶定位於不同的细胞区室中。Mn SOD存在于线粒体和过氧化物酶体；FeSOD主要位于叶绿体，但在过氧化物酶体中也能够被检测到；Cu/Zn SOD则定位于原生质、叶绿体、过氧化物酶体和质外体中。

本领域的技术人员能够使用通用的方法对SOD的活性进行测定。在一个优选例中，测定SOD的活性利用核黄素和NBT及其甲硫氨酸的反应进行测定，其反应混合物可参见表2。

CAT(过氧化氢酶)

过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40％。过氧化氢酶是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。过氧化氢酶普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中。它可促使H₂O₂分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H₂O₂的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H₂O₂的歧化，必须有两个H₂O₂先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H₂O₂浓度越高，分解速度越快。

本领域的技术人员能够使用通用的方法对SOD的活性进行测定。在一个优选例中，反应体系包括酶提取缓冲液，和H₂O₂，在240nm下测定吸光度，以1min内A₂₄₀减少0.1的酶量为一个酶活单位(U)。

APX(抗坏血酸过氧化物酶)

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase)是以抗坏血酸微电子供体的专一性强的过氧化物酶，主要存在于植物叶绿体和胞浆中，被认为是叶绿体中清除一般H₂O₂的关键酶。用愈创木酚作为电子供体测定特异性过氧化物酶(PPOD)的方法不能测出大部分的活性，它和超氧化物歧化酶SOD，过氧化氢CAT，单脱氢抗坏血酸还原酶MDARD，双脱氢抗坏血酸还原酶HDARD以及谷胱甘肽还原酶GR一起构成活性氧清除系统中的酶系统。

在本发明中，术语“SOD蛋白”、“SOD多肽”、“SOD酶”可互换使用，都指具有超氧化物歧化酶活性的蛋白或多肽。在本发明中，术语“CAT蛋白”、“CAT多肽”、“CAT酶”可互换使用，都指具有过氧化氢酶活性的蛋白或多肽。在本发明中，术语“APX蛋白”、“APX多肽”、“APX酶”可互换使用，都指具有抗坏血酸过氧化物酶活性的蛋白或多肽。在未特别指出时，术语“SOD蛋白”、“CAT蛋白”和“APX蛋白”包括野生型和突变型蛋白。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，术语分离的“SOD蛋白”、“CAT蛋白”和“APX蛋白”是指所述蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，该术语还包括具有与所述蛋白相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括所述蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低严谨度的条件下能与所述蛋白的DNA编码序列杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗所述蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了所述蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有野生型蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“蛋白保守性变异多肽”指与野生型蛋白质的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.I％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的编码所述蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物优选使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

重组的蛋白或多肽有多方面的用途。例如用含有过表达的SOD，和/或CAT，和/或APX蛋白的木薯延缓生理性变质，清除果实的ROS，增强植物的抗旱耐寒的能力等。

本发明还涉及一种改良木薯的方法，作为本发明的一种优选方式，所述方法包括步骤：(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有选自SOD、CAT、APX任一或多个蛋白的DNA编码序列；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

通用的实验方法

1.载体构建

以木薯叶片cDNA模板，PCR扩增获得目的基因SOD，APX，CAT。将该基因插入pCAMBI1301载体中构建双价载体。

2.遗传转化路线

遗传转化路线见图14。

3.Real time RT-PCR检测

用Trizol试剂提取总RNA，详细操作见说明书，提取的总RNA经DNase消化，然后使用oligo dT(17-19)进行反转录。将反转录所得cDNA稀释50倍为模板进行PCR扩增。Real time RT-PCR反应体系：2×SYBR Green Master Mix(TOYOBO，Code：QPK-201)10μl，50ng cDNA，400nM正向引物，400nM反向引物，仪器为Bio-Rad CFX96。PCR扩增反应条件为：95℃，1min，95℃15sec，60℃for 15s，72℃30s，循环40次，以actin为内参。

4.CTAB法提取木薯基因组总DNA

1)实验前在CTAB提取缓冲液中加入2％β-巯基乙醇；

2)取新鲜的叶片组织，在液氮中充分研磨，在研磨的叶片粉末中加入400μLCTAB提取缓冲液中，轻轻颠倒混匀；

3)65℃水浴30min，期间轻轻摇动几次，以使提取缓冲液与样品充分接触；

4)加入等体积的氯仿，轻轻混匀，12000rpm，离心10min；

5)吸取上清，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后，-20℃沉淀20min；

6)12000rpm，4℃离心10min，弃上清；

7)沉淀用70％乙醇洗涤2次；

8)将沉淀吹干，溶于适量无菌水中，加入1μL 10mg/L RNaseA，37℃放置20min；

9)得到的DNA现用或-20℃保存备用。

5.H₂O₂含量的测定

1)1g叶片+10ml 0.1％预冷的TCA溶液，冰浴上研磨，匀浆液12000g，15min；

2)1ml上清，添加1ml100mM磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.0)，2ml KI(1mol/L)，摇匀，静置片刻(10min)，390nm测OD值(紫外分光光度计)；

3)根据标准曲线求得H₂O₂含量。

6.CAT，APX，SOD酶活测定方法

1)1g的样品加入5ml酶提取缓冲液(50mM磷酸缓冲液，1％PVP，1mMEDTA)研磨，4℃，10000rpm离心20min，取上清，将酶液转移至EP管中(约3-4ml)，置冰上；

2)CAT测定：2ml反应体系＝1.6ml酶提取缓冲液+0.2ml 0.1mol/L，酶液+0.2ml 0.1mol/L的H2O2。加完H2O2立即记时，试管上下颠倒混匀，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测5min。以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)；

3)APX测定：2ml反应混合液＝1.8ml酶提取缓冲液+0.2ml酶液+0.5mmol/LAsA+20ul 0.01mol/L的H₂O₂，记录第10s和第40s的数值。计算单位时间内AsA减少量及酶活性；

4)SOD测定：显色反应：取透明度、质地相同玻璃试管5支，3支为测定、2支为对照，按表1加入试剂。

表2

按照表1混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应10min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，视酶活性高低适当调整反应时间)。当对照管变蓝，而样品管仍为黄色时，结束反应，测定各管的吸光度。

SOD活性＝(A0-AS)×VT/A0×0.5×FW×V1

A0：照光对照光管的光吸收值；AS：样品管的光吸收值；VT：样液总体积(ml)；VI：测定时样品用量(ml)；FW：样品鲜重(g)

7.Dab染色方法

在50ml离心管中加入10ml Dab染色液，取一定量加入叶片中，抽真空10min，将叶片浸没于Dab液体中，放置在光下，随时观察颜色变化，染色6-8h。显色时倒掉染色液，加入95％乙醇，80℃脱色10min。

8.MV染色

玻璃平皿放上2张滤纸，加入25ml 10uM的MV工作液，将叶片放置在液体中，持续光照条件放置，观察叶片变化。

9.MDA测定方法

1)称取剪碎的试材1g，加入2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心(4000×g)10min，上清液为样品提取液；

2)显色反应和测定吸取离心的上清液2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0.6％TBA溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心，取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度；

3)计算公式：MDA＝6.45×(A532-A600)-0.56×A450。

10.叶绿素含量测定

叶片浸泡95％酒精在黑暗中12-24h提取色素，至叶片白色为止，分光光度计法测定OD663、OD646、OD470；

计算公式如下：

Chl a＝12.21*A663-2.81A646；

Chl b＝20.13*A646-5.03*A663；

Chl a+Chl b＝8.02*A663+20.2A646。

11.线粒体氧化反应对PPD实时测定

1)木薯块根切片，浸没于50uM荧光探针Dihydrorhodamine123避光孵育10min；2)激光共聚焦显微镜在激发光：520nm，发射光：529nm观察染色情况。

实施例1木薯生理性变质(PPD)与ROS的关系

木薯采后生理性变质是一种有氧化激发的木薯特有的生物现象，涉及一系列的生理生化变化，本实施例针对三个基因加以研究，考察木薯生理性变质(PPD)与APX、CAT、Cu/Zn-SOD的关系。

图1显示了木薯在采摘后PPD发生过程中MeCu/ZnSOD、MeAPX2、MeCAT1基因表达水平，结果表明，APX、CAT、Cu/Zn-SOD这三个基因在木薯采后生理性变质过程中上调非常显著。

实施例2cDNA克隆和双元载体构建

根据已公布的MeCu/ZnSOD、MeAPX2、MeCAT1基因序列(NCBI AccessionNo分别为：AY642137，AY973622，AF170272)，克隆全长序列插入到CaMV35S(组成型启动子)或P54(维管束特异表达)启动子驱动的双元载体中，转化木薯。

1.提取木薯叶片RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，扩增目的基因。

2.SOD基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；其编码的多肽序列如SEQID NO：2所示；SOD扩增引物如下所示：

SEQ ID NO：3 5’-GCGTCTAGAATGGTGAAGGCCGTTGCTG-3’

SEQ ID NO：4 5’-GCGGAGCTCCTATCCTTGCAAACCAAT-3’

3.CAT1基因cDNA序列如SEQ ID NO：5所示：其编码的多肽序列如SEQ ID NO：6所示；CAT1扩增引物如下所示：

SEQ ID NO：7 5’-GCGGTACCTTCACTTTCTTTGTCATGG-3’

SEQ ID NO：8 5’-ATACTGCAGCCCATAGCCTCATCTTCA-3’

4.APX2基因序列如SEQ ID NO：9所示，其编码的多肽序列如SEQ ID NO：10所示，APX2扩增引物如下所示：

SEQ ID NO：11 P5’-CAGGTACCGCTCAGAATCGCAGAA-3’

SEQ ID NO：12 P5’-CTACTGCAGTCCGACCATCATCACA-3’

5.载体构建：分别构建pCAMBIA1301-P54-MeCu/ZnSOD载体和pCAMBIA1301s-35s-CAT1，pCAMBIA1301s-35s-APX2载体，其结构如图2a-2c所示。通过EcoRI单酶切P54-SOD-Nos这个片段，再用EcoRI单酶切pCAMBIA1301s-35s-CAT1和pCAMBIA1301s-35s-APX2这两个载体(EcoRI位于35S启动子前面)，将片段和载体再连接，得到双价载体，其结构如图2d-2e所示。

实施例3转基因木薯的制备与植株再生

将实施例2中制备的含有双元载体的农杆菌转化木薯脆性愈伤，利用胚胎发生和器官发生途径再生得到转基因植株并在含抗生素培养基中筛选得到阳性克隆。

实施例4转基因植株基因表达水平检测

利用qRT-PCR从分子水平检测转基因木薯中MeCu/ZnSOD、MeAPX2和MeCAT1基因表达情况。

图3为转基因木薯的表达水平，左图为转入基因APX2和MeCu/ZnSOD转基因木薯的相对表达水平；右图为转入基因CAT和MeCu/ZnSOD转基因木薯的相对表达水平。结果表明，这些基因表达水平得到不同程度的上调，

实施例5转基因木薯抗氧化能力检测

1.转基因植株和C3野生型植株经50mM的H₂O₂处理24h后，利用Dab染色观察叶片中H₂O₂的积累程度。

图4显示各个植株(处理前，WT，SA1，SC2)经H₂O₂染色结果，从图中可以看到野生型植株的叶片已明显变褐色，说明积累了大量H₂O₂；而转基因植株叶片褐色明显较轻，说明H₂O₂积累量很少。

2.H₂O₂处理前后检测H₂O₂的含量，图5显示未转基因的木薯植株C3的H₂O₂含量显著升高，而转基因的木薯植株(左图)SA1，SA2，SA4，SA6和(右图)SC3，SC4，SC11，SC23基本没有变化，即WT含量显著升高，而转基因植株基本变化不大。结果说明，转基因植株的抗氧化能力相对于野生型有了显著提高。

3.对转基因株系和C3野生型植株在100μM的MV(甲基紫精，ROS诱导剂)处理，48h后，转基因株系叶片仍保持绿色，而野生型的叶片已明显变黄(图6)，WT为未转基因的木薯植株C3的叶片经MV处理后的结果；SA1，SC2分别为转基因植株叶片经MV处理后的结果。实验结果说明，转基因植株对抗氧化能力相对于野生型有显著提高。

4.测定MV处理前后叶片中叶绿素的含量。图7显示了植物甲基紫精(MV)处理后叶片的叶绿素含量检测结果，WT叶片叶绿素含量减少非常明显，而转基因植株仍维持较高含量。

实施例6转基因木薯PPD发生延缓能力观察

1.依据CIAT方法观察木薯PPD发生过程：木薯收获后立即将其块根的两端切去，远轴端用保鲜膜封口，近轴端暴露于空气中，将块根放置室温21-28℃湿度70-80％的房间，一定时间取样观察。从图8可以观察到，转基因木薯(SA1，SC2)的块根保存96h仍未发生PPD，而野生型(WT)已明显发生变质，证实转基因株系储藏根PPD发生明显延缓。

2.同时，本发明人利用线粒体氧化反应的荧光探针Dihydrorhodamine123对木薯PPD进行实时测定。图9显示用活性氧探针染色木薯块根荧光图，左列为0h检测结果，右列为24h检测结果，第一排为荧光图片，第二排为投射图片，第三排为合成图片。

结果表明，刚收获的木薯块根内部ROS积累非常少，在WT的PPD发生24h，块根薄壁组织细胞积累了大量的ROS，因而产生明亮的荧光信号。而转基因中24h块根荧光信号较弱，说明尚未发生PPD，ROS积累仍然处于正常水平。

实施例7抗冷作用

野生型木薯和转基因植株P54::MeCu/ZnSOD-35S::MeCAT1(SC)在人工气候室生长1个月左右，4℃冷处理4天。

图10显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC4)在冷处理前后的整体图和局部图，观察到野生型木薯在4℃冷处理后，下部叶片明显皱缩，受冷害表型严重；而转基因植株叶片依然伸展，没有明显的冷害表型。

图11显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC2，SC4，SC11)在冷处理前后MDA含量，SOD和CAT的酶活，显示该转基因植株提高对冷的耐受性。

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛 (MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害，MDA含量越高，则说明膜和细胞的伤害程度大。

CAT酶活在WT中，处理后活性比处理前要低，由于在WT中受冷害伤害严重，在冷害前期CAT酶活有升高来清除ROS，处理后期整株苗伤害严重，生物体内细胞的蛋白严重受损，所以酶活降低。但在转基因植株中，处理后酶活活性比处理前高，这是由于冷逆境环境下，CAT酶活显著提高以清除生物体内产生的ROS，保持植株正常生长。

实施例8抗旱作用

野生型木薯和转基因植株P54::MeCu/ZnSOD-35S::MeCAT1(SC)在人工气候室生长1个月左右，干旱处理1个月，复水7天，观察表型变化。

图12显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC2)干旱处理前和处理16天，30天，和复水7天的生长状态，图中观察到野生型木薯在干旱16天，所有叶片失水萎蔫，而转基因植株叶片只是靠下部叶片萎蔫，上部叶片仍然全展。干旱30天，野生型木薯大部分叶片枯黄掉落，转基因植株叶片上部分叶片维持正常状态，然后浇水观察复水情况，野生型木薯失水枯死，而转基因植株复水回复正常生长。同时在干旱前期，测定野生型木薯和转基因植株叶片相对失水率。图13显示野生型植株(WT)和转基因植株(SC2，SC4，SC11)干旱处理后的叶片失水结果。结果表明，野生型木薯叶片失水率显著高于转基因植株叶片。

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