CN111778247B - 一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x及其应用 - Google Patents

一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向调控Serpin3基因的miR‑199‑x及其应用，所述miR‑199‑x序列如SEQ ID NO:1所示，Serpin3基因序列如SEQ ID NO:2所示。所述miR‑199‑x靶向丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin3基因，miR‑199‑x负调控Serpin3的表达，Serpin3进一步负调控PO活力。说明miR‑199‑x靶向Serpin3对小菜蛾天然免疫进一步进行精准调控，可利用miR‑199‑x作为分子靶标来调控Serpin3的表达来进行生物防治小菜蛾等十字花科蔬菜害虫。

Description

一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，更具体地，涉及一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x及其应用。
背景技术
MicroRNA，简称miRNA，是一类长度为18～24nt的基因组编码的非编码RNA，在真核生物转录后基因表达的过程中发挥着至关重要的作用。要获得成熟的miRNA，需要经历primary miRNA(pri-miRNA)、pre-miRNA。RNA聚合酶最先合成的是miRNA的初始转录本，也就是pri-miRNA。Pri-miRNA一般长达数千nt，内部有茎环结构。在细胞核内，Pri-miRNA的茎环结构被RNase III型的核酸内切酶Drosha从初始转录本上切割下来，得到的大约65nt长的小发卡结构，称为pre-miRNA。随后，pre-miRNA被细胞核中的转运蛋白exportin 5(EXP5)转运到细胞质中。在细胞质中，pre-miRNA会被核酸内切酶Dicer切割，形成一个22nt左右的双链RNA。Drosha和Dicer切割miRNA前体时，需要许多辅助蛋白的帮助，例如DGCR8(针对Drosha而言)、TRBP和PACT(针对Dicer而言)，这个机制确保了整个过程可以受到精准的调控。随后，这个双链RNA会被装载到Ago蛋白中，以便形成最终发挥作用的RISC复合物(RNA-induced silencing complex，RNA介导的沉默复合体)。
miRNA主要有三种作用方式，转录抑制、mRNA的切割或降解。动物中一般不涉及mRNA的切割。miRNA通过碱基互补配对与靶标mRNA的3’端非翻译区结合而降解靶基因mRNA或者抑制其翻译成蛋白。miRNA不光可以与3’UTR结合，研究表明，它也可以与5’UTR或者CDS区结合行使功能。一般来说，结合到CDS区的miRNA主要是负调控，而结合到5’UTR的miRNA则常常起到转录激活的作用。
由于miRNA在转录后水平调控基因的表达，所以它在维持免疫稳态和免疫可塑性方面发挥着关键的作用。miRNA可以调控抗菌肽的表达。Choi和Hyun的研究表明miR-8在黑腹果蝇中负调控抗菌肽Drosomycin和Diptericin的表达，以便在正常非感染条件下维持其正常水平，从而实现免疫平衡。在敲除miR-8的幼虫和果蝇中，抗微生物肽的转录水平显着增加。据预测，miR-8可能靶向革兰氏阴性结合蛋白3(GNBP3)的转录本，该转录本在真菌感染后诱导Toll途径，并靶向JNK途径的调节剂Pvf。但是，目前还未见有可调控小菜蛾PO活力的miRNAs的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x。
本发明的第二个目的在于提供一种提高miR-199-x表达的miRNA模拟物。
本发明的第三个目的在于抑制所述miR-199-x表达的miRNA抑制剂。
本发明的第四个目的在于提供所述miR-199-x和miR-199-x抑制剂的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x，所述miR-199-x序列如SEQ ID NO:1所示，Serpin3基因序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明通过构建小菜蛾免疫绿僵菌后的小RNA文库，筛选到一个特异性的miR-199-x并靶向丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin3基因。构建包含Serpin3基于CDS区域的部分片段的双荧光素报告基因质粒psiCHECK2-Serpin3，在细胞水平上，添加miR-199-x的模拟物，双荧光检测发现Serpin3的表达量显著降低。通过小菜蛾活体饲喂miR-199-x的模拟物发现，Serpin3强烈抑制表达，酚氧化酶活力(PO)活力强烈提高，小菜蛾感染绿僵菌的死亡率显著降低；通过小菜蛾活体饲喂miR-199-x的抑制物，Serpin3强烈表达，PO活力强烈下调，在绿僵菌侵染导致小菜蛾的死亡率升高；说明miR-199-x靶向Serpin3对小菜蛾天然免疫进一步进行精准调控。利用miR-199-x作为分子靶标来调控Serpin3的表达来进行生物防治小菜蛾，具有极佳的应用前景。
本发明还提供一种提高所述miR-199-x表达的miRNA模拟物，包括正义链和反义链，其序列依次如SEQ ID NO:3～4所示；
一种抑制所述miR-199-x表达的miRNA抑制剂。
优选地，所述miRNA抑制剂其序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明还提供所述miR-199-x在靶向负调控Serpin3基因表达进而调控酚氧化酶活力中的应用。
由于miR-199-x靶向并抑制了酚氧化酶PO的表达，从而使得在病原物侵染害虫的同时，害虫体内由于PO活力下降，减弱或中断害虫对外物的黑化反应。使害虫更易感染病原物，害虫死亡率提高，死亡时间缩短。
因此本发明还提供所述miR-199-x作为分子靶标在防治十字花科蔬菜害虫或在制备防治十字花科蔬菜害虫药剂中的应用。
或miR-199-x抑制剂在防治十字花科蔬菜害虫或在制备防治十字花科蔬菜害虫药剂中的应用。
一种防治十字花科蔬菜害虫的方法，通过抑制害虫体内miR-199-x的表达，从而降低其免疫力。
优选地，是将上述miR-199-x抑制剂施用害虫，以降低害虫miR-199-x的表达，降低害虫体内由于PO活力，降低其免疫力。
一种防治十字花科蔬菜害虫的药剂，包含用于抑制害虫体内miR-199-x表达的制剂。
优选地，所述制剂为上述的miR-199-x抑制剂。
优选地，所述药剂还包含微生物杀虫剂，所述miR-199-x抑制剂作为微生物杀虫剂的增效剂使用，提高微生物杀虫剂的使用效率和使用范围，扩大杀虫谱，降低微生物杀虫剂耐药性出现。
进一步优选地，所述微生物杀虫剂为绿僵菌。
本发明还所述miR-199-x在制备抗十字花科蔬菜害虫的转基因植物中的应用。通过将miR-199-x抑制剂前体转到十字花科蔬菜后，当小菜蛾或者其他鳞翅目害虫为害转miR-199-x十字花科蔬菜时，天然免疫失活，害虫死亡率大大提高。
优选地，所述十字花科蔬菜害虫为具有与SEQ ID NO:2所示Serpin3基因高度保守的鳞翅目害虫。
进一步优选地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x，miR-199-x靶向丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin3基因，负调控Serpin3的表达，Serpin3再进一步负调控PO活力。miR-199-x靶向Serpin3对十字花科蔬菜蔬菜害虫天然免疫进一步进行精准调控，可利用miR-199-x作为分子靶标来调控Serpin3的表达来进行生物防治小菜蛾等十字花科蔬菜害虫。
附图说明
图1为miRNA与其靶标基因的位点结合示意图。
图2为miRNA及其靶基因RT-qPCR验证。注：误差线表示来自三次独立实验的标准误，U6及RPS13作为内参。**表示P<0.01，差异极显著。
图3为双荧光表达质粒的构建。注:M1：DNA标准分子量DL2000；M2：DNA标准分子量DL10000；1：Serpin3的PCR鉴定；2：psiCHECK-2双荧光质粒的双酶切鉴定；3：psiCHECK2-Serpin3重组双荧光质粒的双酶切鉴定。
图4为双荧光素的测定。
图5为小菜蛾PO活力测定。将miR-199-x模拟物和miR-199-x抑制剂添食小菜蛾24h后，分别收集血淋巴，获得添食miRNA后的血浆，将miR-199-x模拟物和miR-199-x抑制剂添食小菜蛾24h后，进一步感染绿僵菌，收集血淋巴，获得添食后绿僵菌和添食miRNA的血浆。采用DOPA法对小菜蛾血浆中PO活力进行测定，小菜蛾血浆孵育10min，每孔加入200μL 2mML-DOPA，轻轻震荡10s，使用酶标仪测定10min內，490nm波长下吸光值的变化，每30s测定一次。每min吸光值的变化0.01为1U；作图数值为平均值±SEM(n＝3)，柱上字母表示通过SPSS25对组内数值进行LSD及Duncan差异显著性分析，显著水平p≤0.05。
图6为小菜蛾存活率统计。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1小菜蛾Serpin3基因的CDS片段的克隆
利用Trizol法提取小菜蛾中肠的总RNA，反转录合成cDNA的一条链，并以此为模板进行PCR克隆，包含全部CDS区域的Serpin3目的基因的引物序列为F：5’-ATATCGATGTGGATGTACG-3’；R：5’-TACCTAGCTAATAACTAA-3’。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，经分析其序列大小为2891bp。回收得到的PCR产物连接到pMD18-TVector，并将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，将阳性克隆菌株送去测序鉴定，其序列如SEQ ID NO:2所示。将测序鉴定正确的菌株以甘油菌保存于-80℃。
实施例2miR-199-x靶向Serpin-3的调控关系
基于实验室测定的绿僵菌侵染小菜蛾后小RNA数据库，初步筛选到了miR-199-x，其核酸序列信息如SEQ ID NO:1所示，经miRanda，RNAhybrid和TargetScan三种软件预测了其与Serpin3基因的结合位点，并以Serpin-3特异性区域为引物F:5’-CAATACTGCGTCCAAGCA-3’；R:5’-TGGTGGGAGGTTCATAAG TG-3’，qRT-PCR检测miR-199-x靶向Serpin-3的调控关系，结果如图1和2所示，由图1可知miR-199-x在Serpin3基因存在结合位点，qRT-PCR进一步检测到小菜蛾在绿僵菌诱导下，miR-199-x高表达，Serpin-3基因则低表达，说明两者存在负调控关系。
实施例3细胞表达质粒的构建
根据实验室测定小菜蛾转录组Unigene序列，利用primer5软件设计Serpin3CDS区第1800碱基至第2224碱基的引物，分别在上游引物中引入酶切位点XhoⅠ，上游引物5’-CCGCTCGAGGAAAGACTGAAGCGGAAAT-3’，下游引物引入NotⅠ的序列:引物5’-ATTTGCGGCCGCCTGGGTGTAGAAGCAGGAG-3’；以小菜蛾cDNA为模板，扩增大小为444bp。反应条件为：预变性：94℃2min，变性：94℃30s退火：60℃30s延伸：72℃40s，35个循环，完全延伸：72℃5min，10℃保温。使用DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN)进行PCR产物的回收。选用Takara公司XhoⅠ、NotⅠ限制性内切酶酶切获得的DNA片段。利用NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪检测所得回收产物以及载体的浓度，确定连接体系中的载体以及目标DNA的加入量。16℃过夜连接，将连接产物转化入大肠杆菌DH5α内，平板培养获取单菌落。菌液提取质粒，酶切鉴定结果如图3所示，有DNA凝胶电泳初步确定质粒正确，进一步测序验证质粒，将测序正确的质粒保存备用。
实施例4双荧光素酶活性测定
合成miR-199-x模拟物mimic，
miR-199-x mimic Sense:5’-ACGGGUCACGAGACUUAU-3’(SEQ ID NO：3)；
Anti-Sense:5’-AUAAGUCUCGUGACCGUUU-3’(SEQ ID NO：4)。
将实施案例3所制备的报告重组质粒和合成的miR-199-x模拟物mimic与psiCHECK-2质粒共转染HEK293T细胞，转染前1天将HEK293T细胞按5×105的密度接种于48孔板，含10％胎牛血清培养基，置于5％CO2培养箱37℃过夜培养；将报告重组质粒和合成miR-199-x mimic，以及piCHECK-2质粒分别转染HEK293T细胞；转染24h后，加入PBS洗涤细胞，尽可能的弃净各孔内的残留液体。用双荧光素酶报告系统试剂盒检测各组荧光素酶活性。通过Dual-Luciferase报告基因检测系统测定各实验组中萤火虫荧光素酶的荧光值(F)和海肾荧光素酶的荧光值(R)，取F/R为相对活性值进行数据的统计，结果如图4，由结果可知，miR-199-x mimic能识别serpin3，负调控serpin3的表达。
实施例5活体内添食miR-199-x抑制剂和模拟物
合成miR-199-x抑制物inhibitor：5’-AUAAGUCUCGUGACCCGU-3’(SEQ IDNO：5)；挑取长势一致的3龄的小菜蛾幼虫，将人工饲料/g与inhibitor和人工饲料/g与mimic比列为1:500μL(1μM)饲喂小菜蛾，12h更换一次饲料，用DEPC为对照。饲喂24h后，一部分小菜蛾收集对照组与处理组miR-199-x inhibitor和miR-199-x mimic的小菜蛾，收集血淋巴，进行离心获得血浆；另一部分进一步感染绿僵菌，96h后，取出血淋巴，进行离心获得血浆；利用DOPA法测定血浆中PO的活力，结果如图5。由图5可知，小菜蛾饲喂miR-199-x的模拟物mimic后，PO活力上升，说明miR-199-x的模拟物可以引起Serpin下调，进而PO的活力上调。相反地，当小菜蛾饲喂了miR-199-x的抑制剂inhibitor后。由图5可知，miR-199-x可以降低PO的活力，说明miR-199-x的抑制剂可以引起Serpin上调，进而PO的活力下调。当进一步感染绿僵菌后，发现PO的活力进一步提高。说明miR-199-x负调控Serpin3的表达，Serpin3进一步负调控PO活力。
实施例6小菜蛾miRNA模拟物对微生物杀虫剂的增效作用
选取发育一致健康小菜蛾3龄第一天幼虫。将人工饲料/g与miRNA模拟物mimic或者inhibitor混合。其中两者之间比列为1:500μL(1μM)饲喂小菜蛾，12h更换一次饲料。将miRNA mimic、inhibitor饲喂小菜蛾24h后，小菜蛾进一步感染绿僵菌。
将制备好的孢子悬浮液107CFU/ml处理上述饲喂mimic和inhibitor 24h的小菜蛾。采用体壁浸泡法，即将小菜蛾完全浸泡在各自的孢子悬浮液中10s，用滤纸吸去多余液体后正常饲养，每隔24h记录一次，记录每天小菜蛾的死亡数目和存活数目，一直记录到168h。将0.05％吐温80相同处理作为对照。统计小菜蛾在不同浓度重组绿僵菌下的存活率，实验独立重复三次，进行生物学统计。统计累积存活个数。结果如图6所示，由图6可知，miRNA模拟物可以提高存活率，而miRNA抑制剂可以降低存活率。说明miRNA抑制物可以增效杀虫剂的杀虫效率。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种靶向调控Serpin3基因的miR-199-x及其应用
<141> 2020-06-30
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 1
ugcccagugc ucugaaua 18
<210> 2
<211> 2891
<212> DNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 2
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gaggttccag gtcacgtatg aagaagacct cgtgccgata ctcaaaaaga tgaaaataaa 2520
cgaagcattc accaaagact caaacctgac cggcgtgttt caaggcgagt cggcacaaat 2580
caacgcgcta ttccacaaag tatacattga cgtcaacgag cagggaactg aagcggccgc 2640
ctctaccgga gcagtagtgg tgccgctcat cagcgataac gtccagttgt tagtcgatcg 2700
gcccttcgtg ttcttcatca gggataatga gctggggtcc gtgctgtttg agggcaagat 2760
tgaggagcca actagatggg aggatggccc gcgaggacgc aaacccgcaa aggcatctca 2820
gtcttctggc aataagaaac aaggacgaca ataatttaag acgttaccat aaattagtta 2880
ttagctaggt a 2891
<210> 3
<211> 18
<212> RNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 3
acgggucacg agacuuau 18
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 4
auaagucucg ugaccguuu 19
<210> 5
<211> 18
<212> RNA
<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)
<400> 5
auaagucucg ugacccgu 18

Claims (4)

1.一种靶向负调控Serpin3基因的miR-199-x，其特征在于，所述miR-199-x序列如SEQID NO:1所示，Serpin3基因序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述miR-199-x在防治小菜蛾或在制备防治小菜蛾药剂中的应用。
3.一种防治小菜蛾的方法，其特征在于，抑制小菜蛾体内miR-199-x的表达，所述miR-199-x序列如SEQ ID NO:1所示。
4.权利要求1所述miR-199-x在制备抗小菜蛾的转基因植物中的应用。
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