CN111286515A - 利用植物介导的RNAi创造棉花抗绿盲蝽种质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及利用植物介导的RNAi创造棉花抗绿盲蝽种质的方法。本发明以绿盲蝽LIM基因的保守序列作为靶序列构建了RNAi载体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的绿盲蝽LIM基因成功导入棉花宿主，得到了表达绿盲蝽LIM基因双链RNA的转基因棉花。将该转基因棉花种植于室外网室中，接虫实验表明该转基因棉花可以导致绿盲蝽LIM基因的表达量下调,进而导致其无法完成正常羽化而死亡，最终导致绿盲蝽种群数量减少，从而达到抗虫的效果。本发明的转基因棉花对绿盲蝽具有抵抗能力。且转基因棉花可以与BT棉杂交生产多抗虫棉花的新种质。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用植物介导的RNAi技术创造棉花抗绿盲蝽种质的方法。本发明提供了一种表达绿盲蝽LIM基因双链RNA的转基因棉花的育种方法，为绿盲蝽的防治提供一种新的方法。
背景技术
植食性昆虫的取食是造成农棉花产量损失的重要因素之一(Ute et al.,2004)。在过去的几十年里转基因BT棉被广泛应用于棉花害虫的防治，尤其在鳞翅目害虫的防治中起到了显著的成效，并成功减少了农药的使用，提高了农民的收入(Pray et al.,2010；Wuet al.,2009)。但随着BT棉的大面积广泛种植，其缺点逐渐暴露出来，首先是鳞翅目害虫逐渐对BT毒蛋白产生抗性，使BT毒蛋白的杀虫效率和持久性都大打折扣(Tabashnik et al.,2008；Tabashnik et al.,2013)，其次是因为杀虫剂的使用量减少，导致了BT的非靶标害虫泛滥成灾并发展为主要害虫(Hagenbucher et al.,2013；Lu et al.,2010；Lu et al.,2008)。
在BT棉的非靶标害虫中，绿盲蝽的危害尤其严重，其种群数量迅速增加，由次要害虫上升为了棉花的主要害虫(Lu et al.,2010；Lu et al.,2008)。绿盲蝽通过取食棉花的嫩叶，幼蕾，花药，嫩桃来影响棉花的生长发育，并对棉花生产造成巨大的经济损失。但是由于绿盲蝽迁飞能力强，寄住范围广泛导致绿盲蝽很难控制(Bancroft,2005)。目前，杀虫剂的使用仍然是控制绿盲蝽的主要办法，但杀虫剂的大面积持续使用不但容易诱发绿盲蝽的抗药性，而且对环境造和人类健康也造成威胁(Lu et al.,2008)。因此急需探索出绿盲蝽防治的新策略。
随着生物技术的快速发展，农业害虫管理也发生了很大的变化，特别是植物介导的RNAi技术作为一种有效的害虫防治策略出现在大家面前。植物介导的RNAi技术是一种跨物种的基因沉默机制，它依赖于转基因植物可以稳定表达影响昆虫生长发育关键基因的双链RNA。当昆虫取食转基因植物时，该双链RNA就会转移到昆虫体内，引发昆虫体内的RNAi效应，导致昆虫的靶基因表达量下调，进而导致昆虫生长发育畸形甚至死亡，最终有效的减少昆虫的种群数量(Gordon et al.,2007；Price et al.,2008)。
在2007年，植物介导的RNAi技术被首次应用于棉铃虫的防治，在同一年该技术又被应用于玉米害虫的防治(Baum et al.,2007；Mao et al.,2007)。随后植物介导的RNAi技术被广泛应用于农作物害虫的防治，大大降低了由于害虫危害而带来的农业受损失。到目前为止，植物介导的RNAi技术已被应用于五种作物，用于防治九种农业害虫(Eakteiman etal.,2018；Luo et al.,2017；Mao et al.,2011；Yu et al.,2016；Zha et al.,2011)。许多研究表明，植物介导的RNAi技术是一种有效的农业害虫防治新策略。
LIM蛋白是一类富含半胱氨酸且分子结构中具有一个或多个锌指结构的蛋白家族(Lin-11-Isl-1-Mec-3)，是(cysteine rich protein)CRPS家族成员之一。该家族中的蛋白质分子都含有特征性的氨基酸保守序列(CX2CX1719HX2CH2CX1620CX2C/H/D)，即LIM结构域。LIM结构是一种介导蛋白间相互作用的结构原件，是多种LIM蛋白超家族中家族蛋白发挥其生物学功能必不可少的结构域。LIM蛋白存在于绝大多数真核生物中，并通过介导蛋白之间的相互作用发挥重要的生物功能，其主要影响细胞骨架结构的维持及调节，神经纤维的归巢，介导细胞之间的联系及通讯，调节细胞的分化及其表达的组织特异性。
富含半胱氨酸蛋白(CPR)家族蛋白有两种形式的LIM结构域，CRPS具有三个亚型，分别为CRP1,CRP2及MLP/CRP3。由于CPR3严格分布于肌肉组织中，因此也被成为MLP(muscleLIM protein)，MLP在肌肉的分化及发育、肌肉细胞结构的维持及肌肉对于外界刺激的反应等多个生理过程中发挥着重要的作用。上世纪九十年代，Stronach(1996)等在果蝇中鉴定出两种MLP蛋白，分别为Mlp64A和Mlp84B。其中Mlp64A含有一个富含半胱氨酸的LIM结构域，Mlp84B含有五个富含半胱氨酸的LIM结构域。将果蝇中Mlp84B基因沉默后，会导致果蝇的蜕皮发生异常，从而影响其生长发育。后续研究还表明Mlp84B蛋白还可以通过他蛋白相互作用来维持肌肉细胞结构的稳定(Stronach et al.,1996)。此外有研究发现当小鼠体内的MLP基因表达异常时会引起小鼠的心肌肥大，同时MLP也参与小鼠血管受机械损伤后的修复过程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种构建表达绿盲蝽LIM基因双链RNA的转基因棉花的方法，创造一种防治绿盲蝽的棉花新种质，并为绿盲蝽的防治提供一种新的方法。
申请人构建了绿盲蝽LIM基因的RNAi载体并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其成功转入棉花受体，得到了表达绿盲蝽LIM基因双链RNA的转基因棉花。通过田间抗虫鉴定证明该转基因棉花对绿盲蝽具有显著的抵抗能力。
本发明的技术方案如下所述：
本发明选择了绿盲蝽LIM基因的保守序列作为靶序列构建了RNAi载体，并利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的绿盲蝽LIM基因成功导入棉花宿主细胞，得到了表达绿盲蝽LIM基因双链RNA的转基因棉花。将该转基因棉花种植于室外网室中，通过接虫验证实验，评价该转基因棉花对绿盲蝽的抵抗能力，对绿盲蝽的危害性状进行鉴定。
具体地，申请人提供了一种构建绿盲蝽LIM基因的载体，并提供了该载体在棉花遗传转化中的应用，具体应用步骤如下所述：
(1)在绿盲蝽LIM基因的保守区域内选择一个长度为403bp的cDNA片段并用PCR(Polymerase Chain Reaction)方法进行基因克隆；将这一序列与高效RNAi表达载体pHellsgate 4连接后转化棉花；
(2)将携带有绿盲蝽LIM基因的RNAi表达载体通过农杆菌介导的遗传转化方法导入植物宿主细胞，具体应用步骤如下：
1)挑选饱满、健康的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡8-12min，再用无菌水洗涤3次；
2)将消毒后的棉种接种于无菌苗萌发培养基上，在黑暗条件下，置于28℃恒温箱中培养5-6d,；
3)取棉花无菌苗下胚轴切成0.5-0.8cm的小段接种于用农杆菌活化培养基(MGL)悬浮的农杆菌菌液中，侵染5mim，转移至无菌滤纸吸干残留菌液并吹10min使表面稍微干燥，将棉花下胚轴分散布于垫有滤纸的共培养培养基上，使每段棉花下胚轴均能接触到滤纸，在21℃下共培养48h；
4)将棉花无菌苗下胚轴接种到选择培养基上，每30天继代培养1次；将获得的胚性愈伤组织转移至分化培养基上，每30天继代培养1次直到获得转基因幼苗，然后将获得的未生根的转基因植株转移至生根培养基上诱导生根，直到得到完整的转基因植株。
上述转化过程中使用的培养基及制备方法如下：
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖和2.5g/L的Phytagel，补加蒸馏水定容至1L。
愈伤组织诱导培养基：MSB，附加24-D 0.1mg/L，KT(细胞激动素)0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，补加蒸馏水定容至1L。
农杆菌活化培养基(MGL)：胰化蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L+MgSO4.7H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L,pH5.8，补加蒸馏水定容至1L。
共培养培养基：MSB，附加2，4-D 0.1mg/l，KT 0.1mg/l，50mg/l AS，3％Glucose，0.25％Phytagel，调pH至5.85-5.95，补加蒸馏水定容至1L。
选择培养基：MSB，附加2，4-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.85-5.95，补加蒸馏水定容至1L。
分化培养基：MSB(去掉NH4NO3，将KNO3加倍)，附加吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L，KT0.15mg/L，3％Glucose，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，0.25％Phytagel，pH5.85-5.95，，补加蒸馏水定容至1L。
生根培养基：1/2MSB+，附加Gln 0.5g/L，Asn 0.25g/L，1.5％Glucose，0.25％Phytagel，pH 6.1，补加蒸馏水定容至1L。
MSB的成分如下：MS培养基的无机盐，附加B5培养基的维生素(培养基简写为MSB)
培养基配制好后在121℃高压蒸汽下灭菌15分钟。培养基中涉及到的抗生素的灭菌采用过滤灭菌，即在超净工作台内的无菌环境下加入到冷却至60℃以下的高压灭菌后的培养基中使用。
培养物的培养条件，除愈伤组织诱导阶段(培养温度为28±2℃)不需要光照外，其他的培养阶段的培养条件为28±2℃，光照强度为冷光源135μmol m-2s-1，每天光照14h(特殊需要的培养条件除外)。
(3)对转基因后代进行阳性鉴定：
设计了如下的引物序列：
LIM-F:5’-CTGGAATCGTGCCGTGTCT-3’，
LIM-R:5’-CGCTGGCTGTCTCAGTATGG-3’；
PCR反应体系(20uL)：
16uL的双蒸水；2uL的10×EasyTaq Buffer；0.4uL的dNTP；0.2uL的ForwardPrimer；0.2uL的Reverse Primer；0.2uL的EasyTaq；1uL的DNA样品。
本发明的积极效果如下：
(1)本发明创造的转基因棉花可以提高对绿盲蝽的抵抗能力。
(2)将该转基因棉花与BT棉杂交可以创造出多抗棉花品种。
附图说明
图1：含有绿盲蝽LIM基因的p35S-LIM表达载体T-DNA区段的载体构建图谱。
图2：本发明中涉及的农杆菌介导的遗传转化，进而获得转基因的棉花植株的图片。附图标记说明：图2中的A图：棉花下胚轴与农杆菌共培养状况的图片；图2中的B图：棉花下胚轴在培养基中培养状况的图片；图2中的C图：抗性愈伤组织形成的图片；图2中的D图：愈伤组织分化成胚性愈伤组织的图片；图2中的E图:棉花细胞通过体细胞胚胎发生获得再生幼苗的图片；图2中的F图:再生植株水培过程；图2中的G图：T0代再生植株移栽到营养钵中放置在温室中生长状况。
图3：转基因棉花植株基因阳性检测示意图。
图4：转基因棉花株系拷贝数鉴定结果。
图5：转基因棉花株系表达量鉴定结果。附图标记说明：图5中的A图：普通PCR检测不同转基因棉花株系中基因的表达量差异；图5中的B图：real-time PCR检测转基因棉花株系中基因的相对表达量差异。
图6：绿盲蝽LIM基因的组织表达模式。
图7：转基因棉花抗虫评价的田间布局。图7中的B图,C图,F图：转基因棉花2017年种植情况。图7中的A图,D图,E图：转基因棉花2018年种植情况。
图8：转基因棉花对绿盲蝽靶基因的沉默效应。
图9：转基因棉花对绿盲蝽种群数量的影响。
图10：绿盲蝽对转基因棉花的为害性状调查。附图标记说明：图10中的A图,B图:被盲蝽象危害后转基因棉花和对照棉花的株高统计分析结果。图10中的C图,D图:盲蝽象危害后转基因棉花和对照棉花的危害孔数统计分析结果。
图11：绿盲蝽对转基因棉花棉桃的为害性状调查。附图标记说明：图11中的A图-F图:绿盲蝽对转基因棉花和对照棉花棉桃的危害表型。图10中的G图：绿盲蝽危害后转基因棉花和对照棉花的棉桃单铃重统计结果。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1是本发明涉及的绿盲蝽LIM基因的核苷酸序列。
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在构建绿盲蝽LIM基因的RNAi载体，创造能够表达绿盲蝽LIM基因双链RNA的转基因棉花，并进行田间抗虫评价的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
实施例1绿盲蝽LIM基因植物干涉载体的构建
根据得到的SEQ ID NO：1的核苷酸序列设计引物用于构建得到表达载体，即：在设计引物的两端分别加上BP反应的接头碱基，引物序列分别如下：
LIM-BP-F:5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttgCTGGAATCGTGCCGTGTCT-3’,
LIM-BP-R:5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtt CGCTGGCTGTCTCAGTATGG-3’；
以pGEM-T-LIM质粒为模板进行PCR扩增，PCR条件为95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃5min。经PCR扩增得到正确的含有BP接头的LIM片段。PCR产物经BP反应连接至pHellsgate 4载体上(BP酶购自Invitrogen公司，美国；25℃，4小时)后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，以LIM的特异引物(LIM-F和LIM-R)进行PCR检测来挑取阳性克隆，PCR反应条件为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃5min。并活化提取质粒。提取的质粒分别用Xhol 1(NEB公司)和Xbal 1(NEB公司)单酶切6h验证酶切片段大小是否相同，相同则证明p35S-LIM重组表达载体构建成功，本发明所用载体结构如图1所示。将表达载体通过电击转化农杆菌GV3010，涂皿spe+抗性，2天后挑取单克隆，菌液PCR挑取阳性克隆，PCR反应条件为：含有表达载体p35S-LIM的农杆菌：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃5min；4℃保存。
实施例2绿盲蝽LIM基因的遗传转化与阳性检测
(1)无菌苗的准备
供试材料为棉花品系J668，(专利申请号：2015108336180，发明创造名称：一种提高棉花再生及转化效率的方法及应用，发明专利申请公开级进入实质审查通知书2017-06-14)。在离体培养条件下播种J668棉花无菌苗，具体步骤是：在超净工作台上将去壳后的J668棉花种仁用0.1％升汞消毒8-12min，再用无菌水清洗3-4次，将所得的无菌种仁(或称外植体)接种于无菌苗培养基中，一天后扶苗，去种皮，5天后可以得到棉花无菌苗下胚轴。
2、农杆菌的活化与侵染
从超低温冰箱内取出保存的农杆菌菌液(含有LIM基因的载体p35S-AlLIM)。在加有400mg/L头孢霉素(Rif)和50mg/L卡那霉素的固体LB培养皿上划线于28℃下培养两天，挑取单克隆于加有Kan的LB培养液中摇菌18-24h。将农杆菌菌液5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入10ml MGL培养基(活化液)和25uL As，重悬农杆菌，在摇床中复苏1小时(28℃，200rpm)。将下胚轴切成大小约0.5-0.8cm切段，用活化后的农杆菌侵染5min，倒出风干，转入共培养培养基中于21℃下暗培养48小时。
3、转基因植株的再生
将棉花无菌苗下胚轴转移到到选择培养基上，每一个月用新鲜的愈伤组织诱导培养基继代培养一次直到获得胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转入分化培养基中培养获得胚状体；将胚状体转化成无根小苗并转移至生根培养基上，通过促进生根得到完整的转基因植株，即可用于下步分子检测和表型鉴定。
棉花无菌苗下胚轴转化用的培养基及其配制
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖和2.5g/L的Phytagel，补加蒸馏水定容至1L。
愈伤组织诱导培养基：MSB，附加24-D 0.1mg/L，KT(细胞激动素)0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，补加蒸馏水定容至1L。
农杆菌活化培养基(MGL)：胰化蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L+MgSO4.7H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L,pH5.8，补加蒸馏水定容至1L。
共培养培养基：MSB，附加2，4-D 0.1mg/l，KT 0.1mg/l，50mg/l AS，3％Glucose，0.25％Phytagel，调pH至5.85-5.95，补加蒸馏水定容至1L。
选择培养基：MSB，附加2，4-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，50mg/L卡那霉素和400mg/L头孢霉素，调pH至5.85-5.95，补加蒸馏水定容至1L。
分化培养基：MSB(去掉NH4NO3，将KNO3加倍)，附加吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L，KT0.15mg/L，3％Glucose，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，0.25％Phytagel，pH5.85-5.95，，补加蒸馏水定容至1L。
生根培养基：1/2MSB+，附加Gln 0.5g/L，Asn 0.25g/L，1.5％Glucose，0.25％Phytagel，pH 6.1，补加蒸馏水定容至1L。
MSB的成分如下：MS培养基，附加B5(培养基)的维生素(培养基简写为MSB)
培养基配制好后在121℃高压蒸汽下灭菌15分钟。培养基中涉及到的抗生素的灭菌采用过滤灭菌，即在超净工作台内的无菌环境下加入到冷却至60℃以下的高压灭菌后的培养基中使用。
培养物的培养条件，除愈伤组织诱导阶段(28±2℃)不需要光照外，其他的培养阶段的培养条件为28±2℃，光照强度为冷光源135μmol m-2s-1，每天光照14h(特殊需要的培养条件除外)。
4、转基因棉花的阳性鉴定
从转基因T0代棉花植株上取新鲜叶片提取基因组DNA(试剂盒使用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒，按该试剂盒的说明书操作)，扩增载体序列的上游引物为(5’-ATGCCATCATTGCGATAAAGG-3)和目的基因的下游引物为5’-CGCTGGCTGTCTCAGTATGG-3’)，进行PCR阳性检验。
PCR反应体系：16uL的双蒸水；2uL的10×EasyTaq Buffer；0.4uL的dNTP；0.2uL的Forward Primer；0.2uL的Reverse Primer；0.2uL的EasyTaq；1uL的DNA样品。PCR反应程序：第一步，95℃5min；第二步，95℃30sec；第三步，58℃30sec；第四步，72℃40sec；第五步，从第二步开始循环30次；第六步，72℃5min；第七步，4℃保存。结果见图3。
实施例3：转基因植株的表达量分析，表达模式的建立和拷贝数检测
1、LIM基因表达量分析：
提取转基因T1代植株叶片的总RNA，总RNA的抽提方法参考改良的异硫氰酸胍法(为常规方法)。
cDNA的合成步骤为：以3ug RNA于新的0.5mLRNA离心管中，加入1ul oligo(dT)引物(购自Promega公司)，补充DEPC水至15μl，充分混匀，然后70℃变性5min，置于冰上10min；再加5μl M-MLV 5×Reaction Buffer，1.25uL dNTP,1uL RNasin(40U),1uL M-MLV反转录酶(购自Promega公司，USA)，补水至25uL。轻弹离心管混合溶液，42℃温浴1h合成第一链；反应结束后70℃处理7min，使反转录酶失活。稀释100倍，-20℃备用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物Q-RT-LIM-F(5'-TTATCAGGTCCCTCGCAACAA-3')和Q-RT-LIM-R(5'-ACTCAGGCTCGGAAACACCAG-3')对LIM基因进行特异的PCR扩增(扩增产物大小为193bp)，PCR反应体系：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃12sec，28个循环；72℃10min。同时用陆地棉UB7(Genebank:DQ11644)作为内参基因，其引物分别为UBq7-F(5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC)和UBq7-R(5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3')，PCR反应体系为：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，28个循环；72℃10min。获得的PCR产物取10μl以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测结果如图5中的A图。real-time PCR,结果如图5中的B图。通过对LIM基因表达量情况的验证发现，LIM基因在不同转基因株系中的表达量有明显差异。
2、绿盲蝽LIM基因表达模式分析
对T1代转基因棉花进行取样(样品包括：根、茎、叶、花瓣、花药、幼蕾、幼桃)提取RNA并反转录成cDNA。以反转录合成的cDNA为模板进行real-time PCR检测。(具体实施步骤同本实施例的步骤1)。real-time PCR,结果如图6。通过对绿盲蝽LIM基因的表达模式分析发现，LIM基因在花瓣，花药，叶片中高量表达，在根，茎，幼蕾，幼桃中表达量较低。
3、转基因植株的拷贝数检测：
(1)棉花基因组DNA的提取
1)称取0.1-0.2g棉花幼嫩叶片，加入200uL DNA抽提缓冲液，磨样机打60s频率60Hz，磨匀后补加600uL DNA抽提缓冲液立即混匀，离心5min(室温，11000rpm)。
2)弃上清，加入GP1，即DNA抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)700uL，混匀。65℃水浴40min，中间每隔几分钟颠倒混匀一次，离心8min(室温，11000rpm)。
3)取上清加入到新的离心管中，加酚氯仿800uL，轻摇20min，离心8min(室温，12000rpm)。
4)取上清，加入800uL氯仿，轻摇15min，离心8min(室温，12000rpm)。
5)将上一步所得上层水相转入新的离心管中，加入700uL的GP2，充分混匀。
6)将混匀的液体转入吸附柱CB3中(可分多次加入)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。
7)向吸附柱CB3中加入500uL的缓冲液GD(DNA抽提试剂盒自带，天根生化科技(北京)有限公司)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。
8)向吸附柱CB3中加入600uL的PW(使用前检查是否加无水乙醇)，12000rpm离心30sec，弃掉废液。再重复一遍。然后空离心2min；将吸附柱置于室温晾干。
9)将吸附柱CB3转移到新的1.5mL的离心管中，向吸附膜中间部位加入60uL洗脱液TE,室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将DNA收集到离心管中。
(2)DNA酶切及电泳分离DNA
1)在200μl微量离心管中加入15-20μg DNA样品，80U限制性内切酶(HindIII-HF)，8μl相应的CutSmart Buffer，在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37℃酶切72h。
2)于DYY-Ⅲ34A型电泳槽中制备0.8％的0.5×TBE琼脂糖凝胶；向每个样品中加入2μl上样缓冲液，混匀后稍微离心后点样；在0.5×TBE电泳缓冲液中250V高压电泳10分钟，再在40V电泳12～14h。
(3)DNA变性及转膜
1)切胶：停止电泳，拿出胶板，上端切去点样孔，两边距点样孔0.5cm左右，下端沿溴酚蓝处边缘切开，切左上角以示方位。
2)变性：酸变性15min，碱变性20min，变性期间不时的温和晃动胶块。
3)搭盐桥：取一块洗净的20×30cm瓷盘，倒入碱转液，把干净玻璃板横放于盘上，调平衡后用碱转液湿润玻璃板，把搭盐桥的滤纸平整地铺在玻板上，使纸的两端自然下垂到盘中，用玻棒赶尽玻板与纸之间的气包后，再按同样的方法铺上第二层滤纸，将胶的正面朝上放于滤纸中央，赶尽气泡，用X光片条将胶的四周约0.5cm宽处与滤纸隔开，使碱转液必须经过凝胶进入吸水纸，以保证胶中的DNA充分转移到尼龙膜上。取与胶块等大的尼龙膜准确放于胶上，赶尽气泡，在尼龙膜上放两张等大的滤纸，再放约10cm厚的吸水纸，再放一个玻璃板及约500g的重物，调水平，印记18-24h。
4)将转好的尼龙膜用2×SSC浸泡15min，重复一次，捞出后用滤纸吸干水分，再用干净的滤纸包好，于80℃烘干2h后用保鲜膜包好放在-20℃保存。
(4)Southern杂交
1)预杂交：将预杂交的尼龙膜用2×SSC浸泡15-30min，取出尼龙膜装入杂交管中，赶尽气泡，在杂交管中加入25ml预杂交液，并于42℃预杂交，保持低速转动，几分钟后检查是否漏液。若不漏加入320ul/403ul鲑鱼精。
2)杂交：吸取500ul杂交管中的杂交液于一新离心管中，加入探针，在98℃变性5分钟后，立即置于冰上3min。将变性好的探针加入杂交管中,充分混匀，42℃杂交10～12h。
3)洗膜：2×SSC+0.1％SDS于室温洗2次，每次15min；0.1×SSC+0.1％SDS于68℃洗3次，前2次15min，第3次10min；Washing Buffer洗1次，2～3min；马来酸缓冲液洗1次，2～3min；用马来酸缓冲液将10×Blocking Solution稀释成1×Blocking Solution，取其中80ml用来封阻背景，常温轻摇1h后弃掉溶液；试剂盒中4号管(Anti-AP)，用前12000rmp，离心5min，取2ul加入20ml的1×Blocking Solution，将配好的Blocking Solution加入杂交管中，37℃杂交炉轻摇40min，之后取出尼龙膜，在瓷盘中用500ml的Washing Buffer清洗3次，每次15min。
(5)压膜及显影
1)将尼龙膜用检测缓冲液漂洗，室温3～5分钟。
2)压膜：将足够大的自封袋剪开，平铺于桌面，吸取800ul的CSPD均匀地滴在塑料袋上，取出尼龙膜将DNA面朝下，置于自封袋上，压好膜，用封口机封口，防止气泡的产生。室温孵育10min后将膜置于37℃孵育5-10min，以增强化学发光反应。
3)压磷屏：将膜的DNA面朝上放置于磷屏中，放入1张X光片，盖好磷屏，曝光10～20min。
4)显影：将X光片浸入显影液中，反复几次后，用水冲洗干净X光片，浸入定影液中5min，冲洗干净即可。
对转基因各株系T1代的拷贝数鉴定结果见图4。
实施例4转基因棉花的田间抗虫鉴定
在室外建了两个实验池(10.5m×4.5m)，并用60目的尼龙网完全覆盖。将转基因棉花种植在实验池里，为了防止盲蝽象的逃逸和确保实验的准确性将不同株系(n＝10)之间都用网子隔开。整个生育期棉花均不喷洒农药，不打顶。对照棉花种植于相同的管理条件下。该田间评价连续进行了两年。
2017年，T1代的8个系全部种在实验池内，并在每株转基因棉花和对照棉花上接种6头3龄的绿盲蝽。接虫一个月后，在每个系随机选择15株棉花进行绿盲蝽危害性状(株高、分支数、单龄重)的调查。
2018年，将T3代表达量相对较高，农艺性状较好的两个株系(Line1,Line 4)种植，用于进一步研究转基因棉花的抗虫性。每个转基因株系和对照均有3次生物学重复。接虫情况和危害性状统计同2017年。此外还检测了转基因棉花对绿盲蝽LIM基因的沉默效应，以及对种群数量的影响。
绿盲蝽对棉株危害性状统计结果如图10，图11。统计结果表明，对照棉花的叶片危害孔数显著高于转基因棉花，而株高却显著低于转基因棉花，单铃重也显著低于转基因棉花。以上结果表明转基因棉花对绿盲蝽有很强的抵抗能力。基因沉默效应检测的结果见图8，结果表明与对照相比取食转基因棉花的绿盲蝽的LIM基因的表达量显著下调。种群数量统计结果如图9，结果表明转基因棉花上的绿盲蝽的种群数量显著低于对照植物上绿盲蝽的种群数量。
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序列表
<110> 华中农业大学
<120> 利用植物介导的RNAi创造棉花抗绿盲蝽种质的方法
<141> 2019-01-04
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> 绿盲蝽(Lygocorislucorum Meyer—Dur.)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1482)
<400> 1
atgccattca agccagcaga gaacccaaag tgcccgaagt gtggcaaatc cgtatatgcg 60
gccgaagaaa gagtagccgg cggtctgaaa tggcacaaaa tgtgcttcaa gtgtggcatg 120
tgcagtaagt tcttggactc caccaactgc gcagagcatg aaggtgagct ctactgcaaa 180
gtttgccatg gtcgcaaata cggccccaag ggttacggat tcggcggtgg cgctggctgt 240
ctcagtatgg acaagggtga ccagttttca ggcaacactg aagcgactca ctcaggctcg 300
gaaacaccag tgcgcgccat cgccaaagca cctgaaggtg agggctgccc aagatgtgga 360
ggatacgtct atgccgctga acaaatgcta gcgaggggca ggggatggca taaagaatgt 420
ttcaaatgtg gcgaatgctc gaaacgactg gattccgtca attgttgcga gggacctgat 480
aaggatatct attgtaaagt ttgttacggg aaacgttttg gccctaaagg ctacggatat 540
ggacaaggtg gtggagcatt gcagagtgat cctatttcca atggtgaagt gcctccacca 600
aggaccaccg tggtagacac ggcacgattc caggctcccg ctggccaagg ctgtcctcga 660
tgtggaggaa tagtatttgc tgctgaacaa gtacttgcga agggcaggga atggcatcgc 720
aaatgcttca agtgtaagga ctgcaagaag actcttgatt ccatcatagc ttgcgatggc 780
cctgacaagg acgtgtactg taaaacttgc tacggcaaaa agtggggtcc ccacggatac 840
ggatttgctt gtggatcagg atttttgcag acagatggtc tcactgatga agaaatttca 900
gcatccaggc cgttctacaa cccagataca acttccattc aagctgctgc cggccaagga 960
tgccccagat gtggtggtgc agtatttgca gctgaacagc aactagccaa aggcactatg 1020
tggcacaaaa aatgtttcaa ttgctgccag tgtcatcggc ctcttgactc catgctcgca 1080
tgcgatggac cagacaagga gatctactgc agagcttgtt acggaaagaa cttcgggcct 1140
aaaggttttg gttacggcca tgctcctaca ctagtgtcca ccaatggaga gtctactgct 1200
gcatactgtg acgcacgacc aatttctggt gtcaaagctc ccgaaggtaa aggttgcttg 1260
agatgtggct acgaagttta tgctgctgag caaatgataa gcaaaaatag gatttggcac 1320
aaaagatgct tcaactgcgg agattgccac aggtcccttg attcaacgaa tttgaacgac 1380
gctccagatg gagatatcta ctgcagaggt tgctacggtc gccatttcgg accaagaggt 1440
gttggttttg gactcggagc tggtacttta actatggctt aa 1482
Claims (2)
1.一种转化陆地棉的表达载体pHellsgate 4，其特征在于：所述的表达载体包含有SEQID NO：1所述的核苷酸序列。
2.在棉花中表达一个影响绿盲蝽羽化的基因的应用，其特征在于所述的应用包括下列步骤：
在绿盲蝽LIM基因保守区域内选择一个长度为403bp的cDNA片段并用PCR方法进行基因克隆，将这一序列与RNAi表达载体pHellsgate 4连接后转化棉花植株；
所述的转化步骤为：
1)将含有绿盲蝽LIM基因的载体导入到农杆菌菌株GV3101；
2)挑选饱满、健康的棉花种子剥去种皮后，用0.1％的HgCl2浸泡8-12min，再用无菌水清洗3-4次，将灭菌后的无菌外植体棉花种仁接种于无菌苗培养基中，一天后扶苗，去种皮，5天后得到无菌苗下胚轴；
3)取无菌苗下胚轴作为外植体，用解剖刀切成0.5-0.8cm的小段接种于经农杆菌活化培养基悬浮的农杆菌菌液中，侵染5mim后，将外植体转移到无菌滤纸上吸干残留菌液并吹打10min使外植体表面稍微干燥；
4)将无菌苗下胚轴接种在含有共培养的培养皿中，于21℃下共培养48h，将无菌苗下胚轴转移至选择培养基中，每一个月继代培养一次直到获得胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转入分化培养基中培养获得胚状体；
5)将根生长受到抑制的再生幼苗转移至生根培养基上，促进其生根；
6)对转基因后代进行阳性鉴定，鉴定所用的引物序列如下：
LIM-F:5’-CTGGAATCGTGCCGTGTCT-3，
LIM-R:5’-CGCTGGCTGTCTCAGTATGG-3’；
7)提取转基因植株总RNA并反转录，以cDNA为模板通过荧光定量PCR对目的基因的表达量进行检测，扩增用的引物序列如下：
Q-RT-LIM-F：5'-TTATCAGGTCCCTCGCAACAA-3'，
Q-RT-LIM-R：5'-ACTCAGGCTCGGAAACACCAG-3'；
8)使绿盲蝽LIM基因在转基因棉花中表达；
9)对转基因棉花作抗虫鉴定；
上述步骤(1)至(5)中培养基的配制：
无菌苗萌发培养基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L Phytagel；
愈伤组织诱导培养基：MSB，附加24-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel；
农杆菌活化培养基：胰化蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4.7H2O 0.1g/L，KH2PO4 0.25g/L，甘露醇5g/L，甘氨酸1.0g/L；调pH至5.8；
共培养培养基：MSB，附加24-D 0.1mg/l，KT 0.1mg/l，50mg/l AS，3％Glucose，0.25％Phytagel，pH5.85-5.95；
选择培养基：MSB，附加2，4-D 0.1mg/L，KT 0.1mg/L，3％Glucose，0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L，头孢霉素400mg/L，pH 5.85-5.95；
分化培养基：去掉NH4NO3、并将KNO3加倍的MSB，附加IBA 0.5mg/L，KT 0.15mg/L，3％Glucose，Gln 1.0g/L，Asn 0.5g/L，0.25％Phytagel，调pH至5.85-5.95；
生根培养基：1/2MSB，附加Gln 0.5g/L，Asn 0.25g/L，1.5％Glucose，0.25％Phytagel，调pH至6.1；
MSB的成分：MS培养基的无机盐+B5培养基的维生素。
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