WO2019080167A1

WO2019080167A1 - 重组广谱性绿僵菌及其制备方法和应用

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Publication number: WO2019080167A1
Application number: PCT/CN2017/109850
Authority: WO
Inventors: 王云丹; 童希文; 康乐
Original assignee: 中国科学院动物研究所
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2019-05-02
Also published as: CN107916232B; CN107916232A

Abstract

提供一种重组广谱性绿僵菌，其下调单胺氧化酶的表达或不表达，或者其体内色胺的含量高于野生型广谱性绿僵菌，所述重组广谱性绿僵菌为其菌株本身，其后代、其产生的分生孢子或其产生的菌丝体或者它们之间的任意组合。在该重组广谱性绿僵菌中敲除单胺氧化酶基因，其能够显著提高广谱罗伯茨绿僵菌中色胺的浓度，进而显著提高杀虫效率，使野生型广谱绿僵菌的半致死时间LT50从7.33±0.445天缩短到6.136±0.488天；且对环境无害，生物安全性好，对人类无毒性。

Description

重组广谱性绿僵菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及转基因菌株及其制备方法和用途，尤其涉及能够提高广谱性绿僵菌杀虫效率的重组广谱性绿僵菌及其制备方法和应用。

背景技术

昆虫病原真菌，相较于化学杀虫剂，具有环境友好、抗逆性强、能大量扩散、选择性高等优点，是广泛应用的一类生物农药。然而，目前昆虫病原真菌作为杀虫剂仍然存在着致死时间较长的缺点。通过研究真菌致病机理，利用基因工程手段改造真菌，提高真菌杀虫剂的效果是当前研究的一个重要方向。例如：

1、高表达真菌分泌的水解酶类基因。过表达体壁降解蛋白酶如枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)Pr1A可以提高真菌穿透体壁的速度，显著提高了金龟子绿僵菌的毒力，加快致死速度并且在血腔中激活多酚氧化酶原系统，导致虫体迅速黑化，对烟草天蛾的致死时间减少了25％，害虫的取食率也降低了40％。Fang等将几丁质水解酶Bbchitl基因转入白僵菌基因组中，获得超表达工程菌株。该工程菌株对蚜虫的毒力明显增强。与野生菌株相比，工程菌株对蚜虫的致死剂量降低50％，致死时间缩短50％。

2、对真菌代谢基因的改造。Xia等通过构建真菌酸性海藻糖降解酶(ATM)超表达载体，转化广谱绿僵菌，增强真菌对寄主血淋巴中海藻糖的代谢能力，促进广谱绿僵菌在昆虫体内生长。

3、引入外源基因。北非蝎毒素(Androctonus australis neurotoxin)AaIT是鳞翅目、双翅目昆虫的特异性神经毒素。Wang等人将该基因导入绿僵菌后，能在寄主血腔中特异性表达神经毒素，改造后的真菌对烟草天蛾的毒性提高了22倍。

4、表达与免疫相关的基因。Yang等人在白僵菌中表达昆虫先天免疫识别通路Toll信号通路的丝氨酸抑制酶Spn43Ac，对桃蚜的半致死时间减少了 24％，致死率提高了2倍。Fan等将葡萄糖-果糖氧化还原酶(Glucose-frustose oxidoreductase GFOR)基因基因导入白僵菌中，构建的转基因工程菌通过合成葡萄糖酸内酯(GDL)可以抑制寄主革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins GNBPs)的活性，抑制宿主的免疫反应，使真菌的致死时间减少了48h，杀虫效果得到提高。

但目前通过基因工程手段改造真菌仍然存在一些缺陷。例如，中国发明专利授权公告号为CN101755050公开的将优化的编码北非蝎(Androctonus australis)神经毒素AaIT的多核苷酸序列导入金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)中并表达，其可提高杀虫效率，有效用于昆虫的控制。但导入真菌中的蝎毒基因对人类有毒，会对人类造成一定危险。

绿僵菌属真菌被广泛用于害虫防治。目前超过200种农林害虫可被绿僵菌制剂控制危害。防治对象集中于直翅目的蝗虫类、蜚蠊目、同翅目的蚜虫、粉虱、叶蝉类以及鞘翅目的蛴螬等。绿僵菌属的代表种类有金龟子绿僵菌、罗伯茨绿僵菌和蝗绿僵菌等，不同种类的杀虫范围不同。如金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)为广谱性杀虫真菌。目前，野生型的广谱绿僵菌普遍存在着致死时间长，效果不理想，而通过基因工程手段改造的菌株对环境或人类存在着潜在的危险。

发明内容

本发明的发明人经过长期不懈的努力发现，专性菌蝗绿僵菌之所以比广谱菌绿僵菌的杀虫效率高，可能是由于专性菌蝗绿僵菌比广谱菌绿僵菌在色氨酸代谢中缺失单胺氧化酶(EC1.4.3.4)，造成色胺在专性菌中无法代谢。色胺能通过ARH受体调控宿主细胞内的转录因子，使宿主的代谢产生紊乱，从而提高真菌的杀虫效果。

因此，本发明提供了一种重组广谱性绿僵菌，其下调单胺氧化酶的表达或不表达，或者其体内色胺的含量高于野生型广谱性绿僵菌，所述重组广谱性绿僵菌为其菌株本身，其后代、其产生的分生孢子、或其产生的菌丝体或者它们之间的任意组合。

示例性地，本发明提供的重组广谱性绿僵菌中单胺氧化酶的表达下调50％以上。

示例性地，重组广谱性绿僵菌中单胺氧化酶的表达下调60％，70％，80％， 90％或95％以上或100％。

示例性地，本发明中重组广谱性绿僵菌为重组广谱菌罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)或广谱菌金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。

示例性地，本发明中的重组广谱性绿僵菌为重组广谱菌罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)，其保藏编号为CGMCC NO.14152，分类命名为Metarhizium robertsii，于2017年8月29日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)。

示例性地，本发明中的重组广谱性绿僵菌相较于野生型广谱性绿僵菌，所述重组广谱性绿僵菌下调单胺氧化酶的表达或不表达，进而提高色胺的浓度使宿主的代谢紊乱。色胺通过ARH受体调控宿主细胞内的转录因子，使宿主的代谢产生紊乱，提高宿主ROS，使宿主感染后的死亡率提高。

本发明中，也可以通过其他方法直接提高宿主体内色胺的浓度，使宿主的代谢产生紊乱以提高宿主感染后的死亡率。

本发明另一方面提供了杀虫剂，其包括本发明所述的重组广谱性绿僵菌，以及任选地，农药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可为云母粉、轻质碳酸钙、陶土、滑石粉、高岭土、硅藻土、凹凸棒土、膨润土、海泡石、尿素、氯化钾、硫酸钠、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵中的一种或多种。

所述重组广谱性绿僵菌可为菌株、或其后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体或它们之间的任意组合。

在本发明提供的一具体实施方式中，所述的杀虫剂用于防治以下害虫中的一种或几种：松毛虫、玉米螟、蛴螬、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛、蚂蚁、茶小绿叶蝉、桃小食心虫、蚜虫、蚊子。

本发明另一方面提供了本发明的重组广谱性绿僵菌、或所述重组广谱性绿僵菌的后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体、或它们之间的任意组合在制备杀虫剂中的用途。

优选地，本发明的杀虫剂用于杀灭蝗虫。

任选地，本发明的杀虫剂还可以包含其他能够杀灭蝗虫的活性成分。示例性的，如绿僵菌素、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、类烟碱类、神经钠通道阻断剂、杀虫的巨环内酯、γ-氨基丁酸(GABA)拮抗剂、杀虫脲类和保幼激素模拟物中的一种或多种。

本发明还提供了重组广谱性绿僵菌的制备方法，包括上调和/或增加重组广谱绿僵菌体内的色胺的步骤。

示例性地，通过基因重组，敲除或改造表达单胺氧化酶相关的核苷酸序列而下调单胺氧化酶的表达或不表达。

在本发明的一个具体实施方式中，重组广谱性绿僵菌通过敲除表达单胺氧化酶相关的核苷酸序列而使单胺氧化酶不表达，其具体包括如下步骤：分别扩增野生型广谱性绿僵菌(MAA)中单胺氧化酶核苷酸序列的上游序列和下游序列，将扩增以后的上游序列和下游序列无缝连接，优选地，将扩增以后的上游序列和下游序列无缝连接到Bar基因上或Ben基因上。

在本发明的具体实施例中，并不限定质粒的类型，其只要含有Bar基因(除草剂草铵膦抗性基因)和/或Ben基因(苯菌灵抗性基因)即可。

在本发明的一个具体实施例中，选择含有所述Bar基因的PDHt-Bar质粒，重组广谱性绿僵菌的制备方法具体包括：

设计引物，MAA_03753Fs和MAA_03753Rs，MAA_03753Fx和MAA_03753Rx，以MAA的基因组DNA为模板，分别扩增其上、下游序列。将扩增的上下游序列酶切后，分别无缝连接到PDHt-Bar质粒中Bar的上游和下游，形成重组质粒。根癌农杆菌介导法将重组质粒转入到MAA中。

本发明还提供了一种杀灭蝗虫的方法，其包括施用本发明的重组广谱性绿僵菌或者由上述制备方法制备的重组广谱性绿僵菌的步骤。

其中，重组广谱性绿僵菌包括重组广谱性绿僵菌菌株本身、或所述重组广谱性绿僵菌的后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体或它们之间的任意组合。

优选地，所述施用包括将用本发明的重组广谱性绿僵菌喷洒至农作物，例如玉米、小麦等。

示例性地或优选地，本发明具有以下优势之一：

本发明的重组广谱性绿僵菌能够显著提高广谱罗伯茨绿僵菌中色胺的浓度，进而显著提高杀虫效率。例如本发明的重组广谱性绿僵菌可使广谱罗伯茨绿僵菌的半致死时间LT50从7.33±0.445天缩短到6.136±0.488天；且对环境无害，生物安全性好，对人类无毒性。

附图说明

图1为本发明实施例中重组质粒的结构示意图；

图2为本发明实施例中重组广谱罗伯茨绿僵菌的琼脂糖凝胶电泳图；

图3A为本发明实施例中重组广谱罗伯茨绿僵菌菌丝中色胺的含量；

图3B为本发明实施例中重组广谱罗伯茨绿僵菌感染飞蝗后，飞蝗体内色胺的含量；

图4为本发明实施例中流式细胞仪检测飞蝗血淋巴中ROS的实验结果图；

图5为本发明实施例中重组广谱罗伯茨绿僵菌对飞蝗半致死时间的实验结果图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

实施例1重组广谱的罗伯茨绿僵菌的制备

本实施例中以敲除广谱罗伯茨绿僵菌(记为MAA)中的单胺氧化酶基因(记为MAA_03753)为例进行说明，MAA_03753的gene bank登录号为NW_011942171.1，monoamine oxidase[EC:1.4.3.4]，具体序列如SEQ ID NO：1所示。本实施例中并不限定广谱罗伯茨绿僵菌，也可为其他具有单胺氧化酶的广谱绿僵菌，如金龟子绿僵菌等。本实施例中也并不限定质粒的类型，其只要含有Bar基因和/或Ben基因即可。例如，可为pDHt-Bar质粒，也可用pDHt-Ben质粒。下面以pDHt-Bar质粒为例进行说明。

1.MAA_03753的敲除质粒构建

设计引物，MAA_03753Fs和MAA_03753Rs，MAA_03753Fx和MAA_03753Rx，以野生型MAA的基因组DNA为模板，分别扩增其上、下游序列。在产物的末端分别添加SmaI、SpeI的酶切位点。具体引物序列如下：

MAA_03753Fs(如SEQ ID NO：2所示)：

ATTCCTGCAGCCCGGGATGGCGACAACCCAAATC

MAA_03753Rs(如SEQ ID NO：3所示)：

CGACGGATCCCCCGGGGTGTCAACCCTCGTTCTATT

MAA_03753Fx(如SEQ ID NO：4所示)：

GATCTGATGA3ACTAGTGTTTCGGAACATTCACTTTG

MAA_03753Rx(如SEQ ID NO：5所示)：

CCGCTCTAGAACTAGTCGGGCAAGATTCCGTTCGT

以MAA_03753Fs和MAA_03753Rs引物对扩增单胺氧化酶的上游序列，扩增出880bp片段(记为MAO-S)。通过SmaI单酶切后将MAO-S无缝连接到PDHt-Bar质粒中Bar的上游(如图1所示)。

以MAA_03753Fx和MAA_03753Rx引物对扩增单胺氧化酶的下游序列，扩增出646bp片段(记为MAO-X)。通过SpeI单酶切后，将MAO-X无缝连接到PDHt-Bar质粒(由上海植物生理生化研究所提供，具体可参阅：Yixiong Chen,Zhibing Duan,Peilin Chen,Yanfang Shang&Chengshu Wang,The Bax inhibitor MrBI-1regulates heat tolerance,apoptotic-like cell death,and virulence in Metarhizium robertsii,Scientific Reports 5,Article number:10625(2015)和Wei Huang,Yanfang Shang,Peilin Chen,Kai Cen and Chengshu Wang,Basic Leucine Zipper(bZIP)Domain Transcription Factor MBZ1Regulates Cell Wall Integrity,Spore Adherence,and Virulence in Metarhizium robertsii*,Journal of Biological Chemistry 290(13):8218-8231.)中Bar的下游(如图1所示)。这样，MAA-03753中间的580bp片段被长度为938bp的Bar序列所替代。

PCR反应的混合物为：2.5μL的10×Ex Taq Buffer聚合酶缓冲液，2μL的2.5mM dNTP，10μM的上下游引物各1μL，1μL的模板，0.25μL的Takara Ex Taq DNA聚合酶，加超纯水至总体积为25μL；

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30sec，54℃30sec，72℃1min(35个循环)；最后72℃延伸10min。PCR反应产物用质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收产物。

酶切体系：5μL的10×cutsmart buffer，1μg的质粒DNA，1μL的内切酶(NEB)，补足ddH₂O至50μL。

无缝连接：Clone

IIOne Step Cloning Kit(Vazyme)

4μL的5×buffer，2μL的ExnaseII，载体量为0.02×载体碱基数ng，插入片段量为0.04×插入片段碱基数ng，剩余用H₂O补充至20μL，37℃孵育30min后转化。

2.工程菌株的构建：

分别将扩增的上游序列和下游序列插入到载体PDHt-Bar中，经测序验证后确认为成功构建的敲除载体(如图1所示)。之后用根癌农杆菌介导法将敲除质粒转入MAA中。

根癌农杆菌介导法(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,ATMT)构建真菌遗传转化体系：将所得载体转化至农杆菌AGL-1，PCR鉴定后选取阳性农杆菌AGL-1转化菌株，YEB培养基(含50mg/mL Carb和50mg/mL Kan)扩大培养。收集菌体，用适量的IM液体培养基重悬OD₆₆₀为0.15，28℃避光培养至菌液浓度OD₆₆₀为0.5-0.8。

同时制备野生型广谱罗伯茨绿僵菌(记为MAA)分生孢子孢悬液。将野生型MAA接种于PDA平板上培养。培养14天时，从PDA平板上刮取适量的野生型广谱罗伯茨绿僵菌MAA分生孢子到1mL的含0.05％Tween-20无菌水中，涡旋震荡后用玻璃丝棉过滤除去菌丝，收集滤液。12000rpm离心3min后用Tween-20无菌水洗2次，重悬后用血球计数板计数，并将野生型专性菌蝗绿僵菌MAA孢子悬液调到每mL悬液中含有约1.0×10⁶分生孢子，备用。

将上述培养在IM培养基中的AGL-1菌液及野生型广谱罗伯茨绿僵菌MAA的分生孢子悬液各100μL混和均匀涂布在IM培养基平板上。共培养48h后，用无菌水洗涤共培养物，用含噻孢霉素和草胺膦的M-100培养基避光培养7-10天至抗性菌落出现，分单孢后，保存具有抗性的真菌组织备用。抽提具有抗性的真菌组织基因组并用特异引物PCR验证转化子。

3.真菌基因组验证

使用全式金Plant Tissue PCR Kit(AD301)试剂盒验证转化子的基因组。

挑取上述具有抗性的真菌组织，加入40μL PD1Buffer后涡旋混匀或用移液器吹打。在95℃金属浴孵育10min(提前预热好设备)，之后加入40μL PD2Buffer，混匀后可直接作为模板进行PCR验证。测序验证后确认为成功转入敲除质粒的真菌组织。

将成功转入敲除质粒的真菌组织接种到PDA培养基上，培养至长出分生孢子。将孢子接入到SDB培养基中，28℃，180rpm，避光培养3天后，抽滤收集菌丝后，用液氮研磨菌丝体，之后加入Trizol，提取RNA，反转录为cDNA模板后，进行PCR。本实验中以Tublin的表达作为参照，具体所用引物如下：

MAA_03753-ORF-F：CAAGCTGGGCTACTACTCA(如SEQ ID NO：6所示)；

MAA_03753-ORF-R：AAGCATCAATAACCTCCCTC(如SEQ ID NO：7所示)；

Tublin-F：GATCTTGAACCTGGCACCAT(如SEQ ID NO：8所示)；

Tublin-R：CCATGAAGAAGTGCAGACGA(如SEQ ID NO：9所示)

PRC体系如下：

所得PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，实验结果如图2所示。图2中，第一泳道为marker，第二泳道为野生型MAA的tublin表达，第三泳道为MAA_03753的敲除质粒的tublin表达，第四泳道为野生型MAA_03753的单胺氧化酶的表达，第五泳道为敲除质粒的MAA_03753的单胺氧化酶的表达。由图2可知，敲除质粒的MAA_03753不表达单胺氧化酶，说明单胺氧化酶的基因序列已被敲除，上述具有抗性的真菌即为重组广谱罗伯茨绿僵菌MAA(记为MAA-KO，简写KO)。将其送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.14152。

实施例2重组广谱罗伯茨绿僵菌中色胺含量的测定

将野生型MAA、实施例1中筛选的重组MAA-KO和野生型专性菌蝗绿僵菌(记为MAC)分别培养在PDA平板上。培养15天后，将野生型MAA、重组MAA-KO和MAC的孢子分接种到含有飞蝗的血淋巴液的L15培养基中(飞蝗的血淋巴液的制备：每1mL的L15培养基中加入新鲜的血淋巴液200μL，用0.22μm的滤膜过滤。在培养菌丝时每毫升L15培养基中加入上述制备好的血淋巴液100μL)，在28℃避光培养箱中培养6天，之后收集菌丝，并用ddH₂O洗去培养基两次，之后-20℃冷冻干燥。称量1mg的干燥后的菌丝，用100μL 0.1M的高氯酸裂解，研磨，5200g，4℃，离心30min后取上清，并用Na₂CO₃中和，使pH值在6左右，取上清用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。HPLC检测上清液中色胺的含量。

HPLC检测：

Agilent 1100，G1315A荧光检测器(FLD)，色谱柱为C18柱；

流动相A：【0.05M乙酸溶液/四氢呋喃(96/4)】：甲醇(V：V)为60：40。流动相B为甲醇。

进样程序：

A(in％)：75.00(0min)，75.00(8min)，66.67(12min)，50.00(25min)，0(30min)，66.67(35min)，75.00(40min)；

B(in％):25.00(0min)，25.00(8min)，33.33(12min)，50.00(25min)，100(30min)，33.33(35min)，25.00(40min)。

样品的制备：

配置0.4N的硼酸缓冲液(pH为10.2)；

将衍生化试剂邻苯二甲醛(OPA)1mg溶于100μL的甲醇中，待完全溶解后加入900μL的0.4N硼酸缓冲液，然后加入10μL的3-巯基丙酸(3-MPA)配制混合液H。

将混合液H分别与野生型MAA、重组MAA-KO和MAC上清液混合均匀进样。进样量为0.5μL。实验结果如图3A所示。

从图3A中可以看出，野生型MAA中的色胺的浓度为34.47ng/mg，MAC中的色胺的浓度为85.07ng/mg，重组MAA-KO中的色胺的浓度为84.53ng/mg，重组MAA-KO中与MAC中的色胺的浓度无显著性差异(均为a)，而与野生型MAA存在显著性差异(分别为a和b)，可见实施例1筛选的重组MAA-KO中的单胺氧化酶基因已被敲除，其能够明显提高色胺的浓度。

将野生型MAA、实施例1中筛选的重组MAA-KO和野生型专性菌蝗绿僵菌(记为MAC)的孢子分别感染飞蝗，4天后取飞蝗血淋巴液，测定其中的色胺含量，分别记为MAA-4d，MAC-4d，KO-4d。以没有被感染的正常的飞蝗血淋巴液作为对照，记为CK。其实验结果如图3B所示。

从图3B中可以看出，对照组CK中色胺的浓度为32.11pg/ul，野生型的MAA中的色胺的浓度为152.67pg/ul，MAC中的色胺的浓度为266.89pg/ul，重组MAA-KO中的色胺的浓度为247.02pg/ul。重组MAA-KO中与MAC中的色胺的浓度无显著性差异(均为a)，而与野生型MAA存在显著性差异(分别为a和b)，与对照组也存在着显著性差异(分别为a和c)，可见实施例1筛选的已被敲除单胺氧化酶基因的重组MAA-KO感染飞蝗后，其能够使飞蝗体内的色胺含量显著增加，达到跟专性菌MAC等同的水平，显著高于野生型MAA感染后的含量以及对照组的色胺含量。

实施例3色胺影响ROS生成的检测

将羽化后三天的散居飞蝗雄虫随机的平均分为三组，分别标记为对照组Ck-4d、野生型组MAA-4d和重组型突变组KO-4d，对照组不进行处理，野生型组用野生型MAA进行感染，突变组用实施例1中筛选的MAA-KO进行感染，4天后取飞蝗血淋巴液于500μL的L15培养基中，迅速离心，300rpm，4℃，离心10分钟后倒掉上清，加入含有0.1μM的Mitosox Red(红色荧光探针)的L15培养基500μL，37℃避光孵育10min后，离心去上清，用L15培养基悬起细胞后上机。

检测仪：贝克曼CytoFLEX

检测通道：PE

收集8000个细胞，统计荧光细胞所占比例。实验结果如图4所示。

从图4中可以看出，空白对照Ck-4d荧光标记细胞数量为52.02％，MAA-4d中荧光标记细胞数量为68.38％，重组KO-4d中荧光标记细胞数量为78.99％，敲除单胺氧化酶的重组MAA-KO感染的飞蝗体内的ROS细胞显著高于被野生型MAA感染的飞蝗体内的ROS细胞。

实施例4重组广谱罗伯茨绿僵菌杀虫效率测定

将野生型专性蝗绿僵菌MAA和重组广谱菌罗伯茨绿僵菌(MAA-KO)分别接种于PDA培养基上培养，分别刮取MAA和MAA-KO的孢子，分别加入适量的花生油悬浮孢子，涡旋震荡，用玻璃丝绵过滤后收集孢子，用花生油重悬。在显微镜下使用细胞计数板计数，通过多次重悬和计数，使终浓度为1×10⁶孢子/ml。吸取2μL的孢悬液点滴在羽化后3天的散居东亚飞蝗雄虫的背甲板下，以花生油处理和野生型广谱菌罗伯茨绿僵菌(MAA)孢子感染作为对照。每12小时记录死亡虫数。最后用SPSS 20.0软件统计得出半致死时间(LT50)，比较野生型和转化菌株的杀虫毒力。其实验结果具体见图5。

如图5所示，野生型广谱罗伯茨绿僵菌(MAA)对飞蝗的半致死时间为 7.33±0.445d，敲除单胺氧化酶基因后的重组广谱菌蝗绿僵菌(MAA-KO)对飞蝗的半致死时间为6.136±0.488d。说明敲除单胺氧化酶基因提高了广谱罗伯茨绿僵菌的毒力。

色胺能够调控飞蝗等昆虫的行为和代谢。本实施例通过改变代谢基因，敲除广谱菌罗伯茨绿僵菌中单胺代谢酶基因，从而降低该酶的表达，破坏色胺的代谢通路，使色胺在菌体中积累，从而显著提高广谱罗伯茨绿僵菌的杀虫效率。

本实施例中重组广谱罗伯茨绿僵菌的半致死时间LT50从7.33±0.445天缩短到6.136±0.488天，显著提高了广谱罗伯茨绿僵菌的杀虫效率。无引入外界基因，重组的广谱罗伯茨绿僵菌对环境无害，生物安全性好。

本发明通过敲除色胺代谢的单胺氧化酶基因提高真菌(例如本发明的实施例中广谱罗伯茨绿僵菌)体内色胺的浓度而增强真菌农药杀虫效率的方法。依据该原理，也可通过其他途径提高昆虫(例如飞蝗)自身体内色胺浓度来提高杀虫效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

重组广谱性绿僵菌，其下调单胺氧化酶的表达或不表达，或者其体内色胺的含量高于野生型广谱性绿僵菌，所述重组广谱性绿僵菌为其菌株本身，其后代、其产生的分生孢子或其产生的菌丝体或者它们之间的任意组合。
如权利要求1所述的重组广谱性绿僵菌，其为重组广谱菌罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)或广谱菌金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)。
如权利要求1或2所述的重组广谱性绿僵菌，其为重组广谱菌罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)，其保藏编号为CGMCC NO.14152。
一种杀虫剂，其包括权利要求1-3中任一项所述的重组广谱性绿僵菌、或所述重组广谱性绿僵菌的后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体，或它们之间的任意组合，以及任选地，农药学上可接受的载体。
如权利要求4所述的杀虫剂，其用于防治以下害虫中的一种或几种：松毛虫、玉米螟、蛴螬、蝗虫、马铃薯甲虫、松褐天牛、蚂蚁、茶小绿叶蝉、桃小食心虫、蚊子、蚜虫。
权利要求1-3中任一项所述的重组广谱性绿僵菌、或所述重组广谱性绿僵菌的后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体、或它们之间的任意组合在制备杀虫剂(优选用于杀灭蝗虫的杀虫剂)中的用途。
如权利要求6所述的用途，所述杀虫剂还包含杀灭蝗虫的其他活性成分，优选地，所述其他活性成分选自绿僵菌素、拟除虫菊酯、胺基甲酸酯、新烟碱酸、神经元钠通道阻断剂、杀昆虫巨环内酯、γ-胺基丁酸(GABA)拮抗剂、除虫脲和灭幼脲所组成的组。
重组广谱性绿僵菌的制备方法，包括上调和/或增加重组广谱绿僵菌体内的色胺的步骤，优选地，通过基因重组，敲除或改造表达单胺氧化酶相关的核苷酸序列而下调单胺氧化酶的表达或不表达。
如权利要求8所述的制备方法，重组广谱性绿僵菌通过敲除表达单胺氧化酶相关的核苷酸序列而使单胺氧化酶不表达，其包括如下步骤：

分别扩增野生型广谱性绿僵菌中单胺氧化酶核苷酸序列的上游序列和下游序列，将扩增以后的上游序列和下游序列无缝连接，优选地，将扩增以后的上游序列和下游序列无缝连接到Bar基因上。
一种杀灭蝗虫的方法，包括使用权利要求1-3中任一项所述重组广谱性绿僵菌、或所述重组广谱性绿僵菌的后代、或其产生的分生孢子或其产生的菌丝体、或权利要求4或5中所述杀虫剂的步骤。