CN112410346A

CN112410346A - 一种提升生防真菌杀虫毒力的方法

Info

Publication number: CN112410346A
Application number: CN202011372999.4A
Authority: CN
Inventors: 王正亮; 俞晓平; 付贤树
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112410346B; JP6923780B1; JP2022086963A

Abstract

本发明涉及生物防治领域，尤其涉及一种提升生防真菌杀虫毒力的方法，所述抗虫基因为NlFAF1基因，所述基因能够显著提升金龟子绿僵菌对水稻害虫的毒力，本发明以褐飞虱免疫负调控因子NlFAF1基因为研究对象,对其进行克隆鉴定和生物学信息分析，为杀虫真菌的遗传改良提供了新基因资源。

Description

一种提升生防真菌杀虫毒力的方法

技术领域

本发明涉及生物防治领域，尤其涉及一种提升生防真菌杀虫毒力的方法。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，在我国农业生产和国计民生中占据举足轻重的位置，其中害虫防治是保障水稻安全生产的关键环节。褐飞虱(Nilaparvata lugens

)是我国最主要的水稻害虫之一，不仅直接吸食水稻汁液，产卵破坏水稻组织，造成枯干倒伏，而且还能传播水稻病毒病，引起水稻产量的重大损失。

目前，开发抗性水稻品种和使用化学杀虫剂是防治褐飞虱的两种重要手段。其中抗性品种的利用往往因为褐飞虱致害性的快速与高度变异而造成使用年限缩短，周期长、成本高；化学杀虫剂的持续大量使用，不仅使褐飞虱抗药性水平不断提高，而且对环境和非靶标生物产生了严重的危害。微生物农药因其有效期长、易降解、对环境友好以及不易使害虫产生抗药性等优点而在害虫的生物防治中广泛应用。其中生防绿僵菌已被证实在防治褐飞虱中具有应用潜能。但是绿僵菌对褐飞虱的致病能力受诸多因素影响，包括环境因子、寄主昆虫自身的防御机制等，杀虫速度较为缓慢，这样的时滞效应使其在褐飞虱生物防控效果上大打折扣，成为其大规模应用推广的重要限制因素。因此，寻求一条新的防治途径，有效减少化学杀虫剂的使用，延缓抗性水稻品种的使用年限，拓宽微生物农药应用规模是开展褐飞虱防控工作的关键所在。

随着生防真菌致病机理和分子生物学的深入研究，利用基因工程技术对生防真菌进行遗传改造、提高菌株毒力的工程菌构建方面取得了较大的进展。发掘新的可利用的基因资源，尤其是参与菌虫互作过程中宿主免疫调控相关的基因，将为真菌制剂的改良提供新途径。

发明内容

为了解决上述技术问题，提高生防真菌毒力，本发明提供一种提升生防真菌杀虫毒力的方法。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种提升生防真菌杀虫毒力的方法，包括将一包含NlFAF1基因的表达盒导入真菌基因组中使其有效表达，所述NlFAF1基因对褐飞虱具有免疫负调控作用。

进一步地，所述NlFAF1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

进一步地，所述NlFAF1基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述方法包括将上述任一所述NlFAF1基因表达盒导入金龟子绿僵菌基因组中使其有效表达。

进一步地，所述方法包括将经NcoI/BamHI消化的NlFAF1基因片段克隆至真菌表达载体pAN52-1N中，使其位于构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子PgpdA和终止子TtrpC之间，形成pAN52-NlFAF1，通过XbaI单酶切pET29b-Bar质粒，将切下的草丁膦抗性基因bar表达元件PgpdA-bar-TtrpC导入同样经XbaI单酶切并去磷酸化的pAN52-NlFAF1中，筛选获得NlFAF1和bar基因两个表达框方向相同的双元质粒pAN52-NlFAF1-Bar，所述双元质粒经HindIII线性化后通过PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌野生株中。

进一步地，所述NlFAF1基因能够显著提升金龟子绿僵菌对褐飞虱的毒力。

本发明的有益效果是：

1)本研究以褐飞虱免疫负调控因子NlFAF1基因为研究对象,对其进行克隆鉴定和生物学信息分析，利用qRT-PCR分析其时空表达规律以及病原真菌诱导表达模式，构建真菌表达载体，利用PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌，从而获得对褐飞虱毒力显著提升的超表达NlFAF1的遗传重组菌株。

2)无污染。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制害虫的为害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制害虫的构建体及其方法，可以消除上述不良后果。

3)本发明以褐飞虱免疫负调控因子NlFAF1基因为研究对象,对其进行克隆鉴定和生物学信息分析，本发明为杀虫真菌的遗传改良提供了新策略和基因资源。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1显示金龟子绿僵菌野生株侵染褐飞虱成虫后NlFAF1的诱导表达模式；

图2显示NlFAF1超表达菌株筛选鉴定；

图3显示野生株和超表达株MaT3的菌丝生长(A)和产孢量(B)；

图4显示野生株和超表达株MaT3对褐飞虱毒力的时间-死亡率模拟曲线及致死中时LT₅₀。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的抗虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有抗虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗褐飞虱的生物活性的蛋白。

本发明中所述的“抗虫”是指对目标昆虫生长发育繁殖具有抑制作用，更具体地，目标昆虫是褐飞虱。

本发明中所述的“超表达株”、“超表达株MaT3”和“MaT3”均指同一真菌菌株。本发明所述“野生株”优选地指金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae野生株Ma456。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的抗虫活性特征的部分和/或片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有抗虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗褐飞虱的生物活性的蛋白。

本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)具有抗虫活性的蛋白或多肽。

FAF1(Fas-associated factor 1)是广泛存在于动物体内一类结构保守、功能多样的蛋白质，主要通过泛素相关结构域(ubiquitin-associated domain，UBA)和泛素样调节X结构域(ubiquitin regulatory X domain，UBX)形成泛素化蛋白酶体介导靶蛋白的泛素化降解，可通过调控昆虫免疫信号通路中转录调控因子的生物学活性而抑制核内转录因子的表达和翻译，从而降低宿主应对外来入侵物的防御响应并维持体内免疫稳态。

实施例1：

供试褐飞虱种群为本实验室保存建立，于人工气候室内(温度24±1℃、光周期16L：8D、相对湿度70％±5％)以TN1水稻苗饲养，维持种群。金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae野生株于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)斜面上4℃保存，25℃培养传代。

提取褐飞虱RNA并合成cDNA，具体地，取褐飞虱五龄若虫10头置于研钵中用液氮研磨均匀。采用Trizol法提取褐飞虱总RNA，并用微量紫外分光光度计(NanoDrop ND-2000，美国)和琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度。以检测合格后的RNA为模板，使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)试剂盒，参照说明书合成cDNA并于-20℃保存备用。

以家蚕免疫负调控因子BmFAF1基因的蛋白序列为搜索源，在褐飞虱基因组数据库中通过本地Blast进行同源序列搜索，获得一个预测蛋白，命名为NlFAF1。使用PrimerPremier 5设计NlFAF1扩增引物，

cS1F：5'-ATGTCCGAAAATAGAGAAGAAAT-3'

cS1R：5'-CTATCGTTCTTCCAATATCAGT-3'

以实施例1所述褐飞虱cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：cDNA模板1μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL,LATaq酶0.25μL，ddH₂O补充至25μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸7min。PCR反应完成后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物数量及分子量大小。目标扩增产物经割胶回收后与pMD18-T载体(TaKaRa，日本)连接，并转化入大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞中，阳性转化子送上海桑尼测序有限公司测序。以褐飞虱cDNA为模板扩增得到的产物经过测序和序列分析，结果显示褐飞虱NlFAF1基因cDNA序列全长1920bp(如序列表中SEQ ID NO：1所示)，编码含有639个氨基酸的蛋白(如序列表中SEQ ID NO：2所示)，所述蛋白分子量大小为157.22kD，等电点4.95。

实施例2：

用金龟子绿僵菌野生株(下称野生株)分生孢子悬液喷雾法接种褐飞虱成虫，检测诱导不同时间后褐飞虱NlFAF1的表达量。具体地，将野生株分生孢子以0.02％Tween-80水溶液制成5×10⁷个/mL浓度的悬液，用喷雾法接种褐飞虱若虫，接种体积为1mL，接种3批次，每批次100头。以接种相同体积的0.02％Tween-80水溶液为对照。分别于0h(未接种)，接种后6、12、24和48h后收集虫体，用75％的酒精表面消毒虫体3次，每次3min，再用无菌蒸馏水清洗5遍，晾干虫体备用。根据NlFAF1基因cDNA序列，设计一对定量PCR引物，如下，

qS1F：5'-TGGAGCAATCTAAATGGAACCT-3'

qS1R：5'-CATGTCGGGACTGAGTATGACG-3'

样品RNA提取和cDNA合成步骤同实施例1。qRT-PCR分析采用

Premix ExTaqTM II试剂盒，反应体系如下：

Premix Ex TaqTM II 10μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL，适量稀释的cDNA2μL和ddH₂O 6μL，反应体系20μL。扩增程序：95℃预变性30s，进入40个扩增循环(95℃变性5s，60℃退火34s)；融解曲线为：95℃15s，60℃1min，95℃15s。以褐飞虱β-Actin基因作为内参，扩增引物如下，

ActinF：TGCGTGACATCAAGGAGAAGC；

ActinR：CCATACCCAAGAAGGAAGGCT，反应体系和程序同上。每个实验设置3次生物学重复和3次技术重复。NlFAF1基因在病原真菌接种不同时间诱导后的相对表达量用2^-ΔΔCt计算，以0.02％Tween-80接种组的表达量为基数，其值设为1。与对照组(未接种)相比，48h内野生株诱导NlFAF1表达量均呈显著下调趋势(P<0.05)。在野生株接种6h后，NlFAF1表达量最低，仅为对照的51.8％。诱导24h和48h后其表达量为对照的72.4％和83.5％，与对照组差异均达到显著水平(P<0.05)，具体结果如图1所示。

实施例3：

NlFAF1表达载体的构建。具体地，消除NlFAF1序列中XbaI限制性内切酶位点以便于后续表达载体的构建，利用融合PCR技术，以褐飞虱cDNA为模板，经过两轮PCR扩增获得NlFAF1全长，第一轮包括2次PCR，分别扩增NlFAF1的两段A和B，第二轮PCR以第一轮的产物A和B混合物为模板，扩增获得不含XbaI限制性内切酶位点的全长NlFAF1序列。

第一轮PCR扩增体系：cDNA模板1μL,dNTPs(10mmol/L)2μL，正反向引物A段引物：A-F/A-R、B段引物：B-F/B-R(10μmol/L)各0.5μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，LaTaq酶0.25μL，ddH₂O补充至25μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s(A段)/1.5min(B段)，35个循环；72℃延伸7min。

第一轮扩增A段引物：

A-F：5'-CATGCCATGGATGTCCGAAAATAGAGAAGAAAT-3'

A-R：5'-TGAAGAAGGTGCATTTTCCCATCCATCCAGAATTTGTTGACAAATCGG-3'

第一轮扩增B段引物：

B-F：5'-CACAAATCCCGATTTGTCAACAAATTCTGGATGGATGGGAA AATGCACC-3'

B-R：5'-CGCGGATCCTATCGTTCTTCCAATATCAGTG-3'

第二轮PCR扩增体系：第一轮A和B模板各1μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，正反向引物A-F/B-R(10μmol/L)各0.5μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，LaTaq酶0.25μL，ddH₂O补充至25μL。扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸2.0min，35个循环；72℃延伸7min。

将经NcoI/BamHI消化的NlFAF1基因片段克隆至真菌表达载体pAN52-1N中，使其位于构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子PgpdA和终止子TtrpC之间，形成pAN52-NlFAF1。通过XbaI单酶切pET29b-Bar质粒，将切下的草丁膦(PPT)抗性基因bar表达元件PgpdA-bar-TtrpC导入同样经XbaI单酶切并去磷酸化的pAN52-NlFAF1中，筛选获得NlFAF1和bar基因两个表达框方向相同的克隆，即成功构建出含目的基因和抗性标记基因的双元质粒pAN52-NlFAF1-Bar。此质粒经HindIII线性化后通过PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌野生株中。

实施例4：

随机在选择性平板上挑取8个生长和产孢良好的转化子，将其分生孢子均匀涂布于铺有玻璃纸的PDA平板上，在25℃下培养3天后，CATB法提取菌丝体基因组DNA进行PCR鉴定。经两轮PCR分别鉴定NlFAF1和bar基因的存在。具体地，以各转化子的基因组DNA为模板，首先用bar基因的引物，

Bar-F：5'-AGAACGACGCCCGGCCGACAT-3'

Bar-R：5'-CTGCCAGAAACCCACGTCATGC-3'

进行PCR反应，以鉴定bar是否存在于基因组中。再以bar基因阳性的转化子基因组为模板，以NlFAF1基因鉴定引物，

iFAF1-F：5'-TACTTCTTCCCAGGCACATTAG-3'

iFAF1-R：5'-TCCTCTTTGGCTTGGTCTATTT-3'进行PCR扩增反应，以进一步鉴定基因组中NlFAF1基因的存在。上述bar基因和NlFAF1基因PCR扩增体系：cDNA模板1μL，dNTPs(10mmol/L)2μL，正反向引物(10μmol/L)各0.5μL，10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL，LaTaq酶0.25μL，ddH₂O补充至25μL；扩增反应程序为：94℃预变性5min后进入35个扩增循环，每循环依次94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸45s，循环结束后再在72℃延伸7min。以野生菌株作为对照，选取两个基因都呈阳性信号的转化子进行下一步鉴定。

采用TRIzol法提取上述PCR鉴定为双阳性转化子的RNA，通过

RTreagent Kit试剂盒，将其反转录为cDNA。反转录体系为：4μL

缓冲液、1μL 50μM Oligo dT Primer、1μL 100μM Random 6mers Primer、1μL

RTEnzyme Mix I反转录酶和2μL的总RNA，并用双蒸水补足至20μL。逆转录反应的程序为先37℃下反应15min，再85℃下5s失活反转录酶。qRT-PCR分析采用

Premix Ex Taq^TM II试剂盒，反应在实时定量PCR仪

ep realplex(Eppendorf,Hamburg,Germany)上操作完成。qRT-PCR体系为：

Premix Ex Taq^TM II 10μL、10μM上下游检测引物各1μL(同实施例2的qS1F/qS1R)、和2μL适量稀释的cDNA，并用双蒸水补足至20μL。扩增程序为：95℃预变性30s后，进入40个扩增循环(95℃变性5s，60℃退火34s)；融解曲线为：95℃15s，60℃1min，95℃15s。并以18S rRNA作为内参，其反应体系和程序同上。2^-ΔΔCt法计算不同转化子中NlFAF1基因的相对表达量，选NlFAF1基因转录表达水平最高的阳性转化子进一步实验。结果如图2所示。

图2(A)显示了超表达转化子T1-T8中NlFAF1和bar基因的PCR鉴定，其中M代表100bp分子量Marker；图2(B)显示了超表达阳性转化子中NlFAF1基因转录表达水平；柱状图上不同小写字母表示其所示数值间差异显著(P<0.05)。由图2可知，基因bar和NlFAF1基因能在4个转化子中检测出，对所获4个阳性转化子的总RNA进行反转录，用qRT-PCR法测定NlFAF1基因的相对转录表达水平。结果显示，在4个阳性转化子在PDA平板上培养3天，其菌丝中均有NlFAF1表达，其中T3转化子中NlFAF1的转录表达量最高。将该菌株命名为MaT3，作为后续实验的NlFAF1超表达工程菌株。

实施例5：

菌落生长速率测定。具体地，接种超表达株与野生株分生孢子悬液(1×10⁷个/mL)于PDA平板的玻璃纸上，25℃培养3天，而后用打孔器切下直径为5mm的菌落块，将其分别接种于PDA培养基平板上，25℃下连续培养8天，每天十字交叉法测定菌落直径并拍照。

产孢潜能测定。具体地，将野生株和超表达株的分生孢子用0.02％吐温80分别调成1×10⁷个/mL的孢子悬液，取200μL分别涂到PDA平板上，25℃培养7天，用打孔器取0.6mm直径的菌丝圆片，放入1mL 0.02％吐温80中，涡旋振荡混匀后，在显微镜下计数孢子浓度。

结果表明，在PDA平板上生长时，MaT3与野生株的菌落直径大小无显著差异；在PDA平板上培养8天后，MaT3的产孢量为3.02×10⁸个/cm²，比野生株的产孢量(3.07×10⁸个/cm²)无显著变化，如图3所示。

实施例6：毒力测定

将野生株和超表达株分生孢子悬液(1×10⁷个/mL)分别涂布于PDA平板上连续培养7天后，刮取分生孢子粉移入盛有20mL 0.02％吐温80溶液的三角瓶中，充分震荡使分生孢子均匀分布。在显微镜下用血球计数板检查计算出孢子数和浓度，用0.02％吐温80溶液将其分别配置成浓度为1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸个/mL的孢子悬液。

取事先准备好的稻苗，每杯稻苗接褐飞虱成虫40头，吸取1mL各浓度孢子液，用喷雾法处理成虫，喷雾后在杯口覆盖事先已经刺孔的塑料盖以防止试虫逃跑。每个浓度重复3次，以1mL 0.02％吐温80溶液作为对照。在25℃和14L：10D条件下饲养，逐日定时观察记录死亡率，连续观察10天，并及时将虫尸移出，置于25℃下保湿培养，根据虫尸表面长出的菌落特征确定真菌致死的显症率。实际接种剂量用平放于稻苗旁的盖玻片(20×20mm)收集孢子，棉兰染色后在显微镜下镜检孢子数，从而将沉降到褐飞虱及水稻叶片上的孢子附着量标准化为孢子数。

通过超表达菌株MaT3与野生株Ma456对褐飞虱的平行生物测定的结果表明，MaT3对褐飞虱成虫的毒力显著高于与野生菌株Ma456。褐飞虱成虫接种MaT3和Ma456分生孢子(1×10⁸个孢子/mL)后的死亡率及接种后时间呈正相关，累积死亡率随喷菌后时间的增加而递增。MaT3第7天引发的累积死亡率分别为79.7％，而对照菌株约为59.2％，虫尸经保湿培养后均出现典型的真菌感染致死症状。

根据MaT3和Ma456对褐飞虱成虫毒力测定数据的机率分析，拟合出可接受的时间-死亡率模型。野生株Ma456和超表达株MaT3对褐飞虱毒力的时间-死亡率模拟曲线及致死中时LT₅₀，具体如图4所示，其中，CK为空白对照组(0.02％吐温80处理)。分析结果显示，MaT3对褐飞虱成虫的毒力显著上调，其半致死时间LT₅₀为3.4天，较对照菌株(～5.1天)提前1.7天。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种提升生防真菌杀虫毒力的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1920

<212> DNA

<213> Nilaparvata lugens

<400> 1

atgtccgaaa atagagaaga aattctagca aattttcagg cctgcactga cattgatgat 60

ctgggcatag cattggatca cttggagcaa tctaaatgga accttctgga agcaatccag 120

agagcgatgc cacaggactc gcagacgctg ccttcggagc agacgcccga cgttgagatc 180

atagacgtgc gtccggctcc tgtagtgaat ggcgtcggcg tcggggtgcc cgtcatactc 240

agtcccgaca tggcgcatgc gccttcgacc tcgttcggcg ccaccactcg cctccttcat 300

ttccacatcc actacgtcga caacatgatc actctgcaaa tcaacgacca caatcgtgtt 360

ggtgatttga aaatgttgat atttgcaaaa acacaaatcc cgatttgtca acaaattcta 420

gatggatggg aaaatgcacc ttcttcagat tcagtattgc tgtcatctct caacctgcct 480

cacgaaaatc tattattctt aacagttcca gaacagaata atctttcggt caattcctca 540

tcaagtgaca ccttatcgca aaaatataat ctagtaatat ttgatgagaa aaaatgtaag 600

gagcacagac tagaagtttt aggatcaaaa actattggtg aagtcaaagc agaagttcgt 660

ctacttatag atataactgt gaaaaatcaa gtttggactg gatggcctat cgaagatgac 720

agatgtacgc tgtcacgcgc tcgcctcgaa attcctgagc ataagttgag cgtgcggcca 780

aaaagggagt acaagaggcc agttattgtc gaccaagtga tggatagtga tagttctgtt 840

gaagaatttg aagatgcttc ggaatctttc actggagaag acgaaatgtt cgttgaagaa 900

attggttcaa ggaaattgca gccattgatt ccagataatg tggaagatga aacggctggt 960

tgtatccatt tcaacgacga attcacaaac agatatggcg atttgcatcc ttacttcttc 1020

ccaggcacat tagaggatgc aatcaaagac tcgtgtctaa aacctgctag agagagaagg 1080

cctttagcag tgtatctaca tcacgatggc agcgtgttgt ccaatgtatt ctgcactgag 1140

ctgctttgct ttgaatcggt gatgcagtac ttgaacagca acttcttggt ttggggctgg 1200

gatctcacgt tcgattccaa caaaactaag ttcctgaatt ccgtgtcaaa aagccttggg 1260

aacatggcag ctgttactgt gagaagcatc gaccttgaaa gactgccagc gttgataatc 1320

atcatgagaa tgcgttctaa cactgaaatt ttctcagtaa taaatggtaa catcggtgtg 1380

agtgagcttt tgacgagcct tattcaagcg gtggatgtgt tcagcgacca gcaaagactc 1440

gaagtgcaag aggaagacga acgagccgcc agagaaatga tcaaaatcga acaggatcaa 1500

gcatatcaag catctctcga aatagaccaa gccaaagagg aagcgaaaaa acaacaaatc 1560

atgattgaaa cgcaagaaaa aaggaggata gaagaagaaa aacaacaaga agaagccaga 1620

aaagaggcgg aaaggcggtt gttggaatcg cagttacctg acgagccgga tgagactagt 1680

gaaggtattt ccaaaattcg tttcagactt ccaagtggtg atttcctcga aagacgcttc 1740

tcaatcttga atagtttaca ggtggtcttg cactatcttg ttgtcaaagg ttatcataca 1800

gaaaattaca aagtgattag tagttggcca aggagagatt tgaccacact tgacgtccac 1860

tcaaccatcc aagatttgaa gctgtatcca caagaaacac tgatattgga agaacgatag 1920

<210> 2

<211> 639

<212> PRT

<213> Nilaparvata lugens

<400> 2

Met Ser Glu Asn Arg Glu Glu Ile Leu Ala Asn Phe Gln Ala Cys Thr

1 5 10 15

Asp Ile Asp Asp Leu Gly Ile Ala Leu Asp His Leu Glu Gln Ser Lys

20 25 30

Trp Asn Leu Leu Glu Ala Ile Gln Arg Ala Met Pro Gln Asp Ser Gln

35 40 45

Thr Leu Pro Ser Glu Gln Thr Pro Asp Val Glu Ile Ile Asp Val Arg

50 55 60

Pro Ala Pro Val Val Asn Gly Val Gly Val Gly Val Pro Val Ile Leu

65 70 75 80

Ser Pro Asp Met Ala His Ala Pro Ser Thr Ser Phe Gly Ala Thr Thr

85 90 95

Arg Leu Leu His Phe His Ile His Tyr Val Asp Asn Met Ile Thr Leu

100 105 110

Gln Ile Asn Asp His Asn Arg Val Gly Asp Leu Lys Met Leu Ile Phe

115 120 125

Ala Lys Thr Gln Ile Pro Ile Cys Gln Gln Ile Leu Asp Gly Trp Glu

130 135 140

Asn Ala Pro Ser Ser Asp Ser Val Leu Leu Ser Ser Leu Asn Leu Pro

145 150 155 160

His Glu Asn Leu Leu Phe Leu Thr Val Pro Glu Gln Asn Asn Leu Ser

165 170 175

Val Asn Ser Ser Ser Ser Asp Thr Leu Ser Gln Lys Tyr Asn Leu Val

180 185 190

Ile Phe Asp Glu Lys Lys Cys Lys Glu His Arg Leu Glu Val Leu Gly

195 200 205

Ser Lys Thr Ile Gly Glu Val Lys Ala Glu Val Arg Leu Leu Ile Asp

210 215 220

Ile Thr Val Lys Asn Gln Val Trp Thr Gly Trp Pro Ile Glu Asp Asp

225 230 235 240

Arg Cys Thr Leu Ser Arg Ala Arg Leu Asn Ile Pro Glu His Lys Leu

245 250 255

Ser Val Arg Pro Arg Arg Glu Tyr Lys Arg Pro Val Ile Val Asp Gln

260 265 270

Val Met Asp Ser Asp Ser Ser Val Glu Glu Phe Glu Asp Ala Ser Glu

275 280 285

Ser Phe Thr Gly Glu Asp Glu Met Phe Val Glu Glu Ile Gly Ser Arg

290 295 300

Lys Leu Gln Pro Leu Ile Pro Asp Asn Val Glu Asp Glu Thr Ala Gly

305 310 315 320

Cys Ile His Phe Asn Asp Glu Phe Thr Asn Arg Tyr Gly Asp Leu His

325 330 335

Pro Tyr Phe Phe Pro Gly Thr Leu Glu Asp Ala Ile Lys Asp Ser Cys

340 345 350

Leu Lys Pro Ala Arg Glu Arg Arg Pro Leu Ala Val Tyr Leu His His

355 360 365

Asp Gly Ser Val Leu Ser Asn Val Phe Cys Thr Glu Leu Leu Cys Phe

370 375 380

Glu Ser Val Met Gln Tyr Leu Asn Ser Asn Phe Leu Val Trp Gly Trp

385 390 395 400

Asp Leu Thr Phe Asp Ser Asn Lys Thr Lys Phe Leu Asn Ser Val Ser

405 410 415

Lys Ser Leu Gly Asn Met Ala Ala Val Thr Val Arg Ser Ile Asp Leu

420 425 430

Glu Arg Leu Pro Ala Leu Ile Ile Ile Met Arg Met Arg Ser Asn Thr

435 440 445

Glu Ile Phe Ser Val Ile Asn Gly Asn Ile Gly Val Ser Glu Leu Leu

450 455 460

Thr Ser Leu Ile Gln Ala Val Asp Val Phe Ser Asp Gln Gln Arg Leu

465 470 475 480

Glu Val Gln Glu Glu Asp Glu Arg Ala Ala Arg Glu Met Ile Lys Ile

485 490 495

Glu Gln Asp Gln Ala Tyr Gln Ala Ser Leu Glu Ile Asp Gln Ala Lys

500 505 510

Glu Glu Ala Lys Lys Gln Gln Ile Met Ile Glu Thr Gln Glu Lys Arg

515 520 525

Arg Ile Glu Glu Glu Lys Gln Gln Glu Glu Ala Arg Lys Glu Ala Glu

530 535 540

Arg Arg Leu Leu Glu Ser Gln Leu Pro Asp Glu Pro Asp Glu Thr Ser

545 550 555 560

Glu Gly Ile Ser Lys Ile Arg Phe Arg Leu Pro Ser Gly Asp Phe Leu

565 570 575

Glu Arg Arg Phe Ser Ile Leu Asn Ser Leu Gln Val Val Leu His Tyr

580 585 590

Leu Val Val Lys Gly Tyr His Thr Glu Asn Tyr Lys Val Ile Ser Ser

595 600 605

Trp Pro Arg Arg Asp Leu Thr Thr Leu Asp Val His Ser Thr Ile Gln

610 615 620

Asp Leu Lys Leu Tyr Pro Gln Glu Thr Leu Ile Leu Glu Glu Arg

625 630 635

Claims

1.一种提升生防真菌杀虫毒力的方法，其特征在于，包括将一包含NlFAF1基因的表达盒导入真菌基因组中使其有效表达，所述NlFAF1基因对褐飞虱具有免疫负调控作用。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述NlFAF1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述NlFAF1基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于，包括将权利要求1-3任一所述NlFAF1基因表达盒导入金龟子绿僵菌基因组中使其有效表达。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述方法包括将经NcoI/BamHI消化的NlFAF1基因片段克隆至真菌表达载体pAN52-1N中，使其位于构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子PgpdA和终止子TtrpC之间，形成pAN52-NlFAF1，通过XbaI单酶切pET29b-Bar质粒，将切下的草丁膦抗性基因bar表达元件PgpdA-bar-TtrpC导入同样经XbaI单酶切并去磷酸化的pAN52-NlFAF1中，筛选获得NlFAF1和bar基因两个表达框方向相同的双元质粒pAN52-NlFAF1-Bar，所述双元质粒经HindIII线性化后通过PEG介导的原生质体转化法导入金龟子绿僵菌野生株中。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述NlFAF1基因能够显著提升金龟子绿僵菌对褐飞虱的毒力。