CN113698461B - 一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因的应用 - Google Patents

一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因的应用。本发明通过基因敲除的方法获得了稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1的敲除突变体，揭示了稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1在稻瘟病菌菌丝生长产孢和致病中的重要生物学功能。本发明发现MoRIP1是一个新的潜在的药物靶点，为开发以线粒体复合体III为作用靶标的新型杀菌剂提供理论基础和重要参考。

Description

一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因的应用。
背景技术
水稻是我国最重要的粮食作物之一，水稻的高产稳产对保障经济发展和社会稳定具有重要意义。稻瘟病是水稻种植上主要的病害之一，严重威胁水稻的生产，该病害是由子囊菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的一种真菌性病害。该病害在我国水稻种植区每年都有不同程度的发生，一般减产10-30％，部分严重田块颗粒无收。因此，科学防治稻瘟病对保障粮食安全至关重要。
在我国，防治稻瘟病的药剂主要有三环唑，富士一号，稻瘟净，异稻瘟净和嘧菌酯等。嘧菌酯属于甲氧丙烯酸酯类杀菌剂，已登记可用于防治水稻稻瘟病和稻曲病。有研究报道该药剂可以抑制稻瘟病菌菌丝生长、孢子萌发、产孢和致病力。这类杀菌剂属于环境友好型农药，杀菌活性高，防病谱广，对非靶标生物安全。甲氧丙烯酸酯类杀菌剂是一类仿生药剂，通过作用于真菌线粒体电子传递链中的细胞色素bc1复合体的细胞色素b亚基的Qo部位，阻止电子从细胞色素b亚基向细胞色素c1亚基传递，从而抑制ATP的合成起到杀菌的作用。但是，由于该药剂在真菌体内的靶标细胞色素b亚基是由线粒体基因组DNA编码，易突变。近些年随着嘧菌酯在蔬菜病害防治上的广泛使用，目前有些病原菌如辣椒疫霉和黄瓜褐斑病菌的抗药性逐渐显露。为防止稻瘟病菌抗药性问题出现，挖掘新的药物靶点对于延缓该类药剂抗药性产生具有重要意义。
公开号为CN110669115A的发明公开了一种稻瘟病菌线粒体自噬相关的致病因子、基因及应用。本发明所涉及的基因因为同源重组造成的基因缺失突变导致稻瘟病菌生长缓慢、产孢量下降，侵染菌丝形成降低，并在感病水稻品种上的致病力大幅下降。因此，本发明最重要的用途是：应用上述成果，设计和筛选能够破坏该基因的表达、剪切及其编码蛋白表达的化合物，或设计和筛选能对该蛋白的氨基酸序列进行修饰的化合物，从而开发出新的抗真菌药物。同时，由于此类基因所在的基因家族在植物中不存在同源基因，因此以此基因为靶点开发的抗真菌药物对宿主植物本身的影响会比较小。
公开号为CN103146716A的发明专利申请公开了一个来源于稻瘟病菌的、在营养生长、孢子产生、附着胞形成致病性中起重要作用的新基因Movma11的编码区的核苷酸序列及其编码蛋白质的氨基酸序列。具体而言，本发明公开了一种源于稻瘟病菌的真菌致病性基因Movma11，该基因Movma11的核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。该真菌致病性基因Movma11编码的蛋白质具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。基因Movma11的表达作为用于设计和筛选抗真菌药物的靶标，蛋白质的表达和修饰作为设计和筛选抗真菌药物的靶标。
线粒体细胞色素bc1复合体是线粒体电子传递链中的第三个重要复合体，该复合体包含三个核心亚基，分别是一个细胞色素b亚基，一个细胞色素c1亚基和一个铁硫蛋白。铁硫蛋白是由核基因编码的，氨基酸序列比细胞色素b更稳定。在真菌中该亚基的生物学功能尚未有报道。
发明内容
本发明提供了一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因的应用。
一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因作为药物作用靶点在筛选抗稻瘟病菌药物中的应用，所述致病因子为稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1。
所述致病因子的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码所述致病因子的基因序列如SEQ ID No.2所示。
本发明又提供了一种抗稻瘟病菌药物，靶点为稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因，所述抗稻瘟病菌药物的活性成分为以下物质中的至少一种：
(1)能够抑制所述致病因子的抑制剂；
(2)能够降低所述基因表达水平的DNA或RNA序列；
(3)能够将所述基因敲除的序列。
优选的，能够将所述基因敲除的序列为：将序列分别如SEQ ID No.3和4所示的上游侧翼序列MoRIP1-up和下游侧翼序列MoRIP1-dn分别插入到载体质粒中所得的重组质粒。
更优选的，所述载体质粒为pFGL821。更优选的，使用农杆菌转化法将所述质粒导入到稻瘟病菌细胞内。
本发明还提供了所述抗稻瘟病菌药物在抑制稻瘟病菌中的应用。
本发明还提供了所述抗稻瘟病菌药物在预防或治疗作物稻瘟病菌感染中的应用。优选的，所述作物为水稻、小米、大麦或小麦。
本发明通过基因敲除的方法获得了稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1的敲除突变体，揭示了稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1在稻瘟病菌菌丝生长产孢和致病中的重要生物学功能。本发明发现MoRIP1是一个新的潜在的药物靶点，为开发以线粒体复合体III为作用靶标的新型杀菌剂提供理论基础和重要参考。
附图说明
图1为稻瘟病菌MoRIP1的敲除导致生长减慢、不产分生孢子的结果图，其中，(A)野生型菌株、ΔMorip1和回补突变体菌株Morip1c在CM和OA培养基平板上培养7天后拍照；(B)野生型菌株、ΔMorip1和回补突变体菌株在CM和OA培养基平板上生长7天后的菌落直径统计；(C)野生型菌株、ΔMorip1和回补突变体菌株在CM和OA培养基平板上生长7天后的菌落产孢量统计；(D)显微观察野生型菌株、ΔMorip1和回补突变体菌株分生孢子梗的分化。
图2为MoRIP1的敲除导致稻瘟病菌致病力丧失检测结果图。
图3为在稻瘟病菌不同的生长发育阶段MoRip1定位于线粒体检测结果图。
图4为MoRIP1的敲除导致胞内ATP含量减少检测结果图。
图5为MoRIP1参与稻瘟病菌对嘧菌酯的敏感性检测结果图，其中，(A)野生型菌株、ΔMorip1和回补突变体菌株Morip1c在不同浓度嘧菌酯的平板上的生长；(B)培养5天后测量菌落直径并计算菌株对不同浓度嘧菌酯的敏感性。
图6为MoRIP1的敲除导致稻瘟病菌对过氧化氢敏感检测结果图。
具体实施方式
所需引物如下表1所示。
表1
引物名称 序列(5’-3’)
MoRIP1-upF CCGGGGATCCTCTAGATCCTCGTGATAGCACTTACC
MoRIP1-upR CTTCAATATACTCGACGAGCGGACCTTTCGTTTA
MoRIP1-dnF ATGCCGACCGGAACCAAATGGAGGGTGGTGTCTG
MoRIP1-dnR GGCCAGTGCCAAGCTTTCTGGTTCTGGTCCGTGT
HPH-F GTCGAGTATATTGAAGGAGC
HPH-R TGGTTCCGGTCGGCATCTAC
MoRIP1inneryzF CAGGGTGAGTTGGAGGAA
MoRIP1inneryzR CGTAGTGAGATCCGTGGC
MoRIP1upyzF CGTGATTGTCTCGCTGTTG
HPH-yzR ACCTCCACTAGCTCCAGCCAAG
npRIP1C-F AGAAACTCGAGAATTCCCTACCACAGCCTAACGG
npRIP1C-R TACCGAGCTCGAATTCCCACAGTTGGTGCACTTGGC
实施例1：MoRIP1基因的敲除和缺失突变体的回补
稻瘟病菌MoRIP7编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，稻瘟病菌MoRIP1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2(含有非编码区)所示。
为了揭示MoRIP1在稻瘟病菌生长发育和致病力中的生物学功能，我们利用同源重组的策略构建MoRIP1基因的缺失突变体。
(1)首先构建MoRIP1的敲除载体：以野生型基因组DNA为扩增模板，通过PCR利用引物MoRIP1-upF/upR和MoRIP1-DnF/DnR分别扩增MoRIP1基因约1Kb的上游侧翼序列MoRIP1-up(SEQ ID No.3)和下游侧翼序列MoRIP1-dn(SEQ ID No.4)。利用引物HPH-F/R，以含潮霉素抗性基因的质粒pFGL821(addgene ID：58223)为模板，PCR扩增HPH抗性基因序列(SEQ IDNo.5)。利用商业化的同源重组酶试剂盒将MoRIP1的上下游DNA序列，抗性基因HPH片段和限制性内切酶XbaI和HindIII酶切后的骨架质粒pKOIB连接在一起，最终获得敲除载体pKOIB-MoRIP1。
(2)农杆菌介导的稻瘟病菌转化：将敲除载体转化进入农杆菌菌株AGL1，再将农杆菌和稻瘟病菌的分生孢子液混合，均匀涂布在贴有硝酸纤维素膜的诱导培养基上，2天后将硝酸纤维素膜转移到含有潮霉素的抗性平板上。四天后在硝酸纤维素膜边缘有转化子生长，将转化子挑取到新的抗性平板上。
(3)敲除转化子验证：提取转化子基因组DNA，利用内部验证引物MoRIP1inneryz-F/R和同源重组后验证引物MoRIP1upyzF/HPH-R对转化子验证，最终获得一个敲除突变体，命名为ΔMorip1。
(4)缺失突变体ΔMorip1的回补：为了说明菌株ΔMorip1中观察到的表型变化都是由于MoRIP1基因的缺失导致的，我们构建了回补载体p822-npRIP1C。利用引物npRIP1C-F/R，以野生型基因组DNA为模板，通过PCR扩增MoRIP1的基因组序列npRIP1C(SEQ ID No.6)连接到pFGL822(addgene ID：58225)载体上。测序正确后转入农杆菌AGL1，之后再转入缺失突变体ΔMorip1。筛选获得表型回补的菌株命名为Morip1c。
实施例2：MoRIP1在稻瘟病菌生长和产孢方面的功能分析
将野生型WT、ΔMorip1和Morip1c菌株在完全型培养基(CM)平板上培养7天，在菌落的边缘用打孔器打直径0.5cm的菌柄，将菌柄接种在CM和番茄燕麦培养基(OA)平板上，3个重复，培养7天后测量菌落直径并拍照。拍照后在平板上加入3mL的无菌水用涂布器收集平板上的孢子液，并在显微镜下观察孢子浓度。结果如图1所示，在两种培养基上，ΔMorip1的直径与WT比均减小，回补菌株Morip1c的直径与野生型无差异，表明MoRIP1参与稻瘟病菌菌丝生长。WT和Morip1c的孢子量在两种培养基平板上也无显著差异，但在ΔMorip1中未观察到分生孢子，表明MoRIP1对稻瘟病菌的产孢是必要的。
实施例3：MoRIP1在稻瘟病菌致病力方面的作用
由于ΔMorip1菌株没有分生孢子，我们利用菌柄接种大麦离体叶片的方法判断MoRIP1在致病力方面的功能。将野生型WT、ΔMorip1和Morip1c菌株在完全型培养基(CM)平板上培养7天，在菌落的边缘用打孔器打直径0.5cm的菌柄，将菌柄放到大麦叶片上，保湿放置于光照培养箱里，5天后拍照。结果如图2所示，在接种WT和Morip1c的大麦叶片上可以看到褐色病斑，但接种ΔMorip1并没有产生病斑，说明敲除MoRIP1后，稻瘟病菌致病力完全丧失。
实施例4：MoRIP1在稻瘟病菌不同生长发育阶段的定位和对线粒体功能的影响
为了观察MoRIP1在稻瘟病菌不同阶段定位情况，我们构建了MoRIP1的荧光表达菌株MoRIP1-mCherry。以野生型基因组DNA为PCR模板，利用引物MoRip1-mCherryF/R扩增获得DNA片段，将片段连入pFGL823-mCherry载体获得荧光表达载体pFGL823-MoRIP1-mCherry。然后利用农杆菌介导的转化将pFGL823-MoRIP1-mCherry转化进入线粒体标记菌株MitoGFP菌株。筛选获得红色荧光表达的转化子，并用激光共聚焦显微镜观察在菌丝，孢子，附着胞和侵染菌丝中MoRip1的定位。结果如图3所示，在菌丝，分生孢子，附着胞和侵染菌丝中，红色荧光蛋白mCherry标记的MoRip1始终与线粒体标记蛋白Mito-GFP共定位，表明MoRip1在稻瘟病菌的不同生长发育阶段都定位在线粒体中。
由于MoRip1在酵母中的同源基因Rip1是线粒体电子传递链细胞色素bc1复合体中的一个核心亚基，介导电子从细胞色素b向细胞色素c1传递，进而影响膜电位和胞内ATP合成。因此我们检测MoRIP1缺失后细胞内ATP的合成是否受影响。用液体CM培养基培养WT、ΔMorip1和Morip1c，收集菌丝并用液氮研磨，用ATP检测试剂盒检测WT、ΔMorip1和Morip1c含量。结果如图4所示，ΔMorip1中的ATP含量显著低于WT和Morip1c中ATP含量，表明MoRIP1对胞内ATP合成非常重要。
实施例5：MoRIP1参与稻瘟病菌对嘧菌酯敏感性
嘧菌酯是防治真菌和卵菌的重要药剂，其药靶是细胞色素b亚基，该亚基由线粒体DNA编码。MoRip1是细胞色素bc1复合体中的核心亚基，由基因组DNA编码。因此，我们检测MoRIP1在稻瘟病菌对嘧菌酯的敏感性中的角色。在CM平板上培养WT、ΔMorip1和Morip1c 7天后，用打孔器打菌柄，将菌柄接种到含有不同浓度嘧菌酯(10、20、40和100μg/mL)的CM平板上继续培养，以添加DMSO的CM平板作为对照，避光培养5天后测量菌落直径并计算生长抑制率。如图5所示，在不同浓度的嘧菌酯平板上ΔMorip1的抑制率显著低于WT和Morip1c，表明MoRIP1的缺失导致稻瘟病菌对嘧菌酯的抗性增强。
实施例6：MoRIP1参与氧化逆境响应
我们检测了WT、ΔMorip1和Morip1c菌株在氧化逆境中的敏感性，用打孔器在培养7天的WT、ΔMorip1和Morip1c菌落边缘打菌柄，将菌柄接种到含有不同浓度过氧化氢(5和10mM)的CM平板上继续培养，以不添加过氧化氢的CM平板作为对照，避光培养5天后测量菌落直径并计算生长抑制率。如图6所示，在两种不同浓度过氧化氢条件下，ΔMorip1的抑制率显著高于WT和Morip1c，表明MoRIP1的缺失导致稻瘟病菌对氧化逆境更加敏感。
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 236
<212> PRT
<213> 子囊菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)
<400> 1
Met Ala Pro Leu Thr Thr Ala Thr Arg Ala Ile Thr Arg Cys Ala Ala
1               5                   10                  15
Ser Pro Ser Lys Ala Val Thr Thr Ala Ala Arg Ala Leu Ser Thr Thr
            20                  25                  30
Pro Ala Gln Asn Gly Ser Ser Gly Ala Ser Phe Ser Ser Pro Phe Arg
        35                  40                  45
Gly Glu Gln Lys Ser Thr Gln Ile Pro Asp Phe Lys Lys Tyr Met Ala
    50                  55                  60
Pro Lys Gly Ser Ser Thr Ser Asn Ala Val Phe Ser Tyr Phe Met Val
65                  70                  75                  80
Gly Ala Met Gly Ala Ile Ser Ala Ala Gly Ala Lys Ser Thr Val Gln
                85                  90                  95
Glu Phe Leu Val Asn Met Ser Ala Ser Ala Asp Val Leu Ala Met Ala
            100                 105                 110
Lys Val Glu Val Asp Leu Thr Thr Ile Pro Glu Gly Lys Asn Val Ile
        115                 120                 125
Ile Lys Trp Arg Gly Lys Pro Val Phe Ile Arg His Arg Thr Gly Arg
    130                 135                 140
Glu Ile Asp Glu Ala Asn Lys Ile Asp Val Ala Ser Leu Arg Asp Pro
145                 150                 155                 160
Glu Ala Asp Ser Asp Arg Val Lys Lys Pro Glu Trp Leu Val Met Leu
                165                 170                 175
Gly Val Cys Thr His Leu Gly Cys Val Pro Ile Gly Glu Ala Gly Asp
            180                 185                 190
Phe Gly Gly Trp Phe Cys Pro Cys His Gly Ser His Tyr Asp Ile Ser
        195                 200                 205
Gly Arg Ile Arg Lys Gly Pro Ala Pro Leu Asn Leu Glu Ile Pro Ala
    210                 215                 220
Tyr Asp Phe Pro Glu Asp Asp Lys Leu Val Ile Gly
225                 230                 235
<210> 2
<211> 1047
<212> DNA
<213> 子囊菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)
<400> 2
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<212> DNA
<213> 子囊菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 12
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<212> DNA
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<400> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taccgagctc gaattcccac agttggtgca cttggc 36

Claims (7)

1.一种稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因作为药物作用靶点在筛选抗稻瘟病菌药物中的应用，所述致病因子为稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1，
所述致病因子的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，
编码所述致病因子的基因序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种抗稻瘟病菌药物，其特征在于，靶点为稻瘟病菌的致病因子或编码所述致病因子的基因，所述致病因子为稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1，所述致病因子为稻瘟病菌铁硫蛋白亚基MoRIP1，所述致病因子的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码所述致病因子的基因序列如SEQ ID No.2所示，
所述抗稻瘟病菌药物的活性成分为能够将所述基因敲除的序列，
能够将所述基因敲除的序列为：将序列分别如SEQ ID No.3和4所示的上游侧翼序列MoRIP1-up和下游侧翼序列MoRIP1-dn分别插入到载体质粒中所得的重组质粒。
3.如权利要求2所述的抗稻瘟病菌药物，其特征在于，所述载体质粒为pFGL821。
4.如权利要求2所述的抗稻瘟病菌药物，其特征在于，使用农杆菌转化法将所述质粒导入到稻瘟病菌细胞内。
5.如权利要求2～4任一所述抗稻瘟病菌药物在抑制稻瘟病菌中的应用。
6.如权利要求2～4任一所述抗稻瘟病菌药物在预防或治疗作物稻瘟病菌感染中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述作物为水稻、小米、大麦或小麦。
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