CN113106106B - 源于希金斯炭疽菌的真菌致病性基因ChAtg8及应用 - Google Patents

源于希金斯炭疽菌的真菌致病性基因ChAtg8及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了源于希金斯炭疽菌的真菌致病性基因ChAtg8及应用。具体公开了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白、或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的启动子中的一种或几种，作为药物靶点在设计或筛选抗植物真菌药物中的应用。本发明利用基因敲除技术和基因回补技术证明了希金斯炭疽菌中的一个对希金斯炭疽菌致病力具有关键性作用的致病性基因ChAtg8。以ChAtg8基因作为药物开发的靶标，通过对大量化合物进行筛选，可以找到能够与药靶起作用的物质，为开发新型的抗真菌药物提供了特异的药物作用靶标。因此，致病性基因ChAtg8在防治植物真菌及真菌病害中具有广阔的应用空间和前景。

Description

源于希金斯炭疽菌的真菌致病性基因ChAtg8及应用
技术领域
本发明涉及微生物基因工程技术领域，更具体地，涉及源于希金斯炭疽菌的真菌致病性基因ChAtg8及应用。
背景技术
希金斯炭疽菌(Colletotrichumhigginsianum Sacc.)，又称希金斯刺盘孢，俗称十字花科(Brassicaceae)植物炭疽菌，可为害芸薹属(Brassica)和萝卜属(R aphanus)等蔬菜、油菜以及模式植物拟南芥等为数众多的十字花科植物，尤其是严重侵害菜心、大白菜、甘蓝和萝卜等蔬菜，引起严重的炭疽病，造成严重的经济损失。由希金斯炭疽菌引起的菜心炭疽病是菜心上最常见和最严重的病害之一，由于华南地区高温高湿的气候条件非常适合该病的发生，致使该病严重时农业的产量损失可达30％～40％，这成为了制约菜心产量和品质的重要因素。希金斯炭疽菌主要通过菌丝体或孢子盘随病残体或在种子上进行越冬，其生长需要适合的温度光照。在下一年的春季时，菌丝体或分生孢子侵染寄主植物，在病组织上产生分生孢子盘，随之繁殖出较多的分生孢子，当分生孢子与水相遇后，孢子萌发产生芽管，之后芽管顶端开始膨大形成附着孢；附着孢成熟黑化后产生巨大的膨压，然后产生侵入钉，侵入钉穿透植物表皮细胞后产生侵染囊泡，随后囊泡形成初生菌丝，初生菌丝粗大、分支较多并集中在侵入的第一个细胞中，而植物此时还处于活体阶段。随后，初生菌丝迅速发展为细长的次生菌丝，侵染周围相邻的细胞。
希金斯炭疽菌与拟南芥的互作是一种研究植物病原真菌-寄主植物相互作用的典型模型，希金斯炭疽菌具有许多病原真菌共有的植物致病侵染循环，包括孢子产生、萌发、附着孢形成、侵入钉形成、侵入菌丝生长等致病过程。
目前，在其他的植物病原真菌中，已有一些致病相关基因的专利报道，比如，专利CN103275994A已经在稻瘟病菌中克隆到相关的真菌致病性基因Mosyn8，CN105483138A在灰霉病菌中克隆到真菌致病性基因BcAtm1。但希金斯炭疽菌的致病过程是一个复杂的分子过程，虽然目前参与植物真菌致病过程的较多基因都有研究，但涉及到希金斯炭疽菌致病性相关基因的研究却寥寥无几，其致病过程的分子机制更是不清楚。而且炭疽菌属的致病相关基因尚无报道，希金斯炭疽菌致病相关基因的研究则更为稀少。鉴定、克隆植物病原真菌的致病基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为设计、筛选抗真菌药物提供更多有用的新靶点。因此，亟需通过研究希金斯炭疽菌致病的分子机制，利用分子生物学技术鉴定、克隆新的在希金斯炭疽菌的致病过程中具有重要功能的致病性基因，为设计筛选新的抗真菌药物提供有用的药物靶点，从而开发、设计出新型的抗真菌药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的、对希金斯炭疽菌等真菌的菌丝生长、分生孢子产生、分生孢子萌发、附着胞形成以及对致病力有重要影响的真菌致病性基因ChAtg8及其应用。
本发明的第一个目的是提供核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的启动子中的一种或几种，作为药物靶点在设计或筛选抗植物真菌药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供所述的基因、蛋白或启动子的抑制剂在抗植物真菌中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述的基因、蛋白或启动子中的一种或几种在设计或筛选抑制植物真菌的菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成和/或致病力的药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述的基因、蛋白或启动子的抑制剂在抑制植物真菌的菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成和/或致病力中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种防治植物炭疽菌和/或炭疽病的药物。
本发明的第六个目的是提供一种防治植物炭疽菌和/或炭疽病的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明通过构建ChAtg8基因同源置换载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入野生型希金斯炭疽菌中，得到基因缺失突变体ΔChAtg8；在基因缺失突变体ΔChAtg8中，重新引入ChAtg8基因，突变体的表型恢复。本发明利用基因敲除技术和基因回补技术证明了希金斯炭疽菌中的一个对希金斯炭疽菌的菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成以及致病力具有关键性作用的致病性基因ChAtg8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，该基因的启动子、编码蛋白的表达和修饰可以作为药物设计和筛选的靶点。
因此，本发明要求保护以下应用：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的启动子中的一种或几种，作为药物靶点在设计或筛选抗植物真菌药物中的应用。
所述的基因、蛋白或启动子的抑制剂在抗植物真菌中的应用。
所述的基因、蛋白或启动子中的一种或几种在设计或筛选抑制植物真菌的菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成和/或致病力的药物中的应用。
所述的基因、蛋白或启动子的抑制剂在抑制植物真菌的菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成和/或致病力中的应用。
优选地，所述植物真菌为希金斯炭疽菌Colletotrichumhigginsianum Sacc.。
设计和筛选能够破坏核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的希金斯炭疽菌致病性基因ChAtg8的表达、剪切，以及抑制氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白表达的化合物，或设计和筛选能对该蛋白的氨基酸序列进行修饰的化合物，从而开发出新的抗真菌药物。
因此，本发明要求保护一种防治植物炭疽菌和/或炭疽病的药物，包含所述的基因、蛋白或启动子的抑制剂。
优选地，所述植物炭疽菌为希金斯炭疽菌Colletotrichumhigginsianum Sacc.。
优选地，所述炭疽病为希金斯炭疽菌Colletotrichumhigginsianum Sacc.所引起的炭疽病。
本发明还要求保护一种防治植物炭疽菌和/或炭疽病的方法，抑制所述的基因、蛋白或启动子的表达。
优选地，所述植物炭疽菌为希金斯炭疽菌Colletotrichumhigginsianum Sacc.。
优选地，所述炭疽病为希金斯炭疽菌Colletotrichumhigginsianum Sacc.所引起的炭疽病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明利用基因敲除技术和基因回补技术证明了希金斯炭疽菌中的一个对希金斯炭疽菌的菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成以及致病力具有关键性作用的致病性基因ChAtg8，该基因的启动子、编码蛋白的表达和修饰可以作为药物设计和筛选的药物靶点。
2、希金斯炭疽菌借助分生孢子在广东菜心等十字花科蔬菜叶片之间传播，分生孢子是十字花科炭疽病的病害循环中的一个环节，消灭分生孢子或抑制分生孢子产生，从而切断病害循环是防止炭疽病流行的一个有效措施。ChAtg8基因和希金斯炭疽菌的致病性密切相关，孢子、附着胞是希金斯炭疽菌侵入寄主植物的重要结构，ChAtg8基因参与希金斯炭疽菌孢子及附着胞的产生；ChAtg8的失活或缺失会导致希金斯炭疽菌孢子产量降低(约为野生型的10％)、附着胞难以形成、致病力丧失，可以有效地控制十字花科炭疽病的流行和爆发。因此，ChAtg8基因在希金斯炭疽菌的致病过程中的作用重大。
3、ChAtg8基因为开发新型的抗真菌药物提供了特异的药物作用靶点。以ChAtg8基因作为药物开发的靶点，可以筛选到降低真菌致病力的化合物，这些化合物可用于防治真菌的侵染。因此，致病性基因ChAtg8在防治植物真菌及真菌病害中具有广阔的应用空间和前景。
附图说明
图1为ChAtg8基因敲除载体构建示意图。
图2为ChAtg8基因敲除位置和过程示意图。
图3为Southern杂交验证ChAtg8的敲除结果。
图4为ChAtg8基因回补载体构建示意图。
图5为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8及ChAtg8回补转化子CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21在PDA培养基、缺氮培养基、缺碳培养基上的生长速度比较图；PDA为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，–N为缺氮培养基，–C为缺碳培养基。
图6为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8及ChAtg8回补转化子CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21在PDA培养基上生长7天时测定的菌落直径。
图7为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8及ChAtg8回补转化子CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21的分生孢子形成率的比较图。
图8为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8及ChAtg8回补转化子CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21的孢子萌发率比较图。
图9为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8的孢子萌发变化，标尺＝10μm。
图10为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8及ChAtg8回补转化子CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21的附着胞形成率比较图。
图11为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8菌株对附着胞形成的致病性比较图，标尺＝10μm。
图12为野生型菌株WT与ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8及ChAtg8回补转化子CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21在拟南芥品种Col-0上的致病性比较图；WT为野生型菌株，ΔChAtg8为ChAtg8基因缺失突变体，CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21均为ChAtg8基因回补恢复转化体，H2O为对照溶液。
图13为几种病原真菌中ATG8蛋白的序列比较图(Phylip tree,NJ)；ChATG8、CtAtg8、MoAtg8、FgAtg8、SsAtg8、SnAtg8的ATG8蛋白分别来自于希金斯炭疽菌(C.higginsianum)、平头炭疽菌(C.truncatum)、稻瘟菌(M.oryzae)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、油菜菌核病菌(S.sclerotiorum)、小麦颖枯病菌(P.nodorum)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 ChAtg8基因的分离和克隆
使用来源于NCBI网站的基因数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/获得序列信息Gene ID:28871786，在希金斯炭疽菌数据库http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html通过同源序列搜索，获得希金斯炭疽菌ChAtg8基因，为了研究该基因的功能，从希金斯炭疽菌(C.higginsianum)野生型菌株IMI 349063的基因组中，利用引物ChAtg8F和ChAtg8R克隆了ChAtg8基因全序列(引物序列见表1)，并且连接到p821载体上，进行了测序；同时，在野生型菌株IMI 349063的cDNA中克隆了该基因的编码序列并且连接到p821载体上进行了测序分析。ChAtg8基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，同时提供了ChAtg8基因的的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
表1.引物序列信息
Figure BDA0002968422200000061
实施例2 ChAtg8基因缺失突变体和回补突变体的获得
一、ChAtg8基因敲除载体的构建
以野生型菌株IMI 349063的基因组DNA为模板，利用引物A8upF/R和A8dsF/R分别扩增上、下游片段，引物A8upF/R和A8dsF/R的序列见表1。
PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0002968422200000071
PCR扩增程序如下：
Figure BDA0002968422200000072
用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切p821载体后，采用无缝克隆的技术将上游片段连入含有潮霉素基因盒的p821载体中，随后再用HindⅢ和SalⅠ双酶切已连入片段F1的p821载体，同样采用无缝克隆的技术将下游片段连入载体中，形成p821-Atg8KO敲除载体。所得载体包括ChAtg8基因上游序列—潮霉素抗性基因—下游序列的p821-Atg8KO载体。具体如下：
表2.上游片段重组反应体系
Figure BDA0002968422200000073
表3.下游片段重组反应体系
Figure BDA0002968422200000074
Figure BDA0002968422200000081
重组反应条件为：37℃，孵育30min。
扩增得到的上游片段的序列具体如SEQ ID NO.5所示，下游片段的序列具体如SEQID NO.6所示。
二、ΔChAtg8突变体的获得
1、实验方法
将包含ChAtg8基因上游序列—潮霉素抗性基因—下游序列的p821-Atg8KO载体转化到农杆菌中后，通过农杆菌介导的方法转化希金斯炭疽菌野生型菌株IMI 349063。在基因置换的过程中，大部分外源DNA插入到希金斯炭疽菌的基因组中，由于两端同源序列的存在，部分会发生同源重组，同源重组的基因敲除位置和过程如图1和图2所示。挑取试验中长出的转化子，提取所有转化子的基因组DNA，利用HygF/R和Atg8TF/R引物分别进行PCR(引物的序列见表1)，1-8号转化子均为865bp的潮霉素条带，而希金斯炭疽菌野生型菌株WT不能扩增到条带。而使用Atg8TF/R引物进行扩增，1～8号转化子均不能扩增到条带，而希金斯炭疽菌野生型菌株WT可以扩增到大小为436bp的条带，初步判断这些没有目的条带的转化子为基因置换突变体(这部分被潮霉素抗性基因替换)。
选取其中两个突变体(1号和5号)大量提取基因组DNA进行Southern杂交验证。用BamHⅠ对这两个突变体的基因组进行酶切，野生型菌株IMI349063为对照，利用引物PAtg8F和PAtg8R的PCR扩增产物，合成杂交探针。
Southern杂交采用Roche公司地高辛DNA标记与检测试剂盒(DIG-High Prime DNALabeling and Detection KitⅠ)进行。杂交探针的合成：PCR扩增反应体系和程序与上述上游片段的操作方法相同。将获得的PCR产物进行探针合成，步骤如下：
(1)将全部50μL体系的PCR产物进行胶回收，回收产物沸水浴中孵育5min，使DNA变性，并迅速在冰水中冷却。
(2)混匀DIG-High Prime，加4μL DIG-High Prime到16μL变性的模板DNA中，混合并稍离心。在37℃金属浴24h。
2、实验结果
Southern杂交验证结果如图3所示，野生型菌株(WT)检测到一条4070bp的条带，而敲除ChAtg8基因的转化子(ΔChAtg8)则检测到一条2740bp的条带，表明ΔChAtg8中的ChAtg8基因已被敲除且插入的含有潮霉素的片段为单拷贝。选取1号突变体命名为ΔChAtg8进行后续试验。
三、ChAtg8基因缺失突变体的回补恢复
1、实验方法
为了验证突变体的表型是由于基因ChAtg8的缺失引起的，构建了回补载体pNeo3300-HBAtg8。利用引物HBAtg8F1F/R扩增了ChAtg8基因的1500bp上游片段，利用引物HBAtg8F2F/R扩增了ChAtg8基因的489bp的CDS序列，利用引物HBAtg8F3F/R扩增了eGFP基因的717bp片段，利用HBAtg8F4F/R扩增了ChAtg8基因的1000bp下游片段(引物序列见表1)，无缝克隆到pNeo3300载体SacⅠ和HindⅢ的位点上，获得回补载体pNeo3300-HBAtg8(基因回补载体构建示意图见图4)。将pNeo3300-HBAtg8载体转化到农杆菌中后，通过ATMT方法利用农杆菌转化希金斯炭疽菌突变体ΔChAtg8。
ΔChAtg8表型的变化是由ChAtg8基因的缺失引起的，由于ΔChAtg8缺失突变体和野生型的差异非常大，回补后，缺失突变体的表型得到恢复，表型和野生型菌株IM 349063相同。选取回补菌株CΔChAtg8进行后续实验(CΔChAtg8是由ΔChAtg8缺失突变体回补后而得，C表示恢复、补充的意思)。
通过以下方法比较基因恢复表型的变化状况：在PDA培养基、缺氮培养基、缺碳培养基上培养野生型菌株WT、ChAtg8基因缺失突变体(ΔChAtg8)和回补转化子(即回补菌株CΔChAtg8)，观察比较菌株的生长变化，在PDA培养基上生长7天时测定的菌落直径，比较菌落生长速度变化；菌株在PDA固体培养基中培养7天后，用直径为0.7cm的打孔器打取两块菌丝片，放入PDB液体培养基中摇培6天后，过滤菌液，统计孢子数量，单位为105个孢子/瓶，比较菌株产孢量变化、孢子萌发变化、形成的附着胞及形成率的变化。
2、实验结果
结果如图5～10所示，图5显示ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8在PDA培养基上菌丝无法产生黑色素，菌落颜色较浅，在缺氮培养基和缺碳培养基上的菌丝较野生型菌株WT及回补菌株CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21更为稀疏，而回补菌株CΔChAtg8的气生菌丝浓密，与野生型IM 349063相同；图6为在PDA培养基上生长7天时测定的菌落直径，野生型菌株WT与基因缺失突变体ΔChAtg8及回补转化体CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21的菌丝生长速率并没有显著差异；图7显示ΔChAtg8的产孢量大幅下降，而回补转化体CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-2恢复到与野生型菌株WT一样的产孢量水平；图8显示ΔChAtg8的孢子萌发率显著降低，而回补转化体CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-2恢复到与野生型菌株WT一样的孢子萌发率水平；图9显微观察表明，突变体ΔChAtg8的孢子萌发出现了明显的变化，突变体ΔChAtg8难以产生正常的附着胞，孢子膨大，孢子萌发芽管异常生长；图10显示ΔChAtg8的附着胞形成率显著降低，而回补转化体CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-2的附着胞形成率显著提高。
以上结果说明，在PDA培养基、缺氮培养基、缺碳培养基上，突变体ChAtg8的菌丝生长情况、菌落生长速度、产孢量、孢子萌发率、附着胞的产生及形成率均差于或低于野生型菌株WT，ChAtg8基因回补后，回补菌株CΔChAtg8能够使突变体ΔChAtg8的缺失表型得到恢复，与野生型IM 349063相同。
实施例3 ChAtg8基因缺失突变体和回补转化子的致病性测定
一、实验方法
将野生型菌株WT、ChAtg8基因缺失突变体和回补转化子的3种菌株的分生孢子分别稀释成5×105个/mL，分别接种于完整的拟南芥叶片的表面，24h后用乙醇脱色，再使用苯胺蓝染色，观察试验菌株的致病结果。
喷雾接种：制备好5×105个/mL孢子悬浮液后，采用喷雾接种的方法将3种菌株的孢子悬浮液喷洒到活体的拟南芥植株上，每个菌株喷雾接种3株拟南芥，拟南芥叶面与叶背都喷雾接种完全后，放进塑料盆中，并在塑料盆上蒙上一层保鲜膜，于25℃培养箱中培养，培养光照条件为16h光照，8h黑暗，培养4d后观察活体拟南芥发病情况并拍照和评价植物的病情指数。
二、实验结果
致病性测定结果见图11和12，图11显示ΔChAtg8缺失突变体的附着胞形成严重受阻；图12显示ChAtg8基因缺失突变体ΔChAtg8接种的植株丧失致病力，而野生型菌株WT及ChAtg8回补转化体CΔChAtg8-8、CΔChAtg8-21则能够正常侵染。结果说明ChAtg8基因是希金斯炭疽菌的关键致病性基因。
实施例4真菌Atg8蛋白的生物信息学分析
为了明确Atg8在其他病原真菌中是否保守，针对下列病原真菌：希金斯炭疽菌(C.higginsianum)、平头炭疽菌(C.truncatum)、稻瘟菌(M.oryzae)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、油菜菌核病菌(S.sclerotiorum)、小麦颖枯病菌(P.nodorum)，将ChAtg8的氨基酸序列对这些真菌的蛋白质序列进行Blastp检索，获得上述病原真菌的同源蛋白的氨基酸序列，其序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7～11所示，并将这些蛋白分别命名为ChATG8、CtAtg8、MoAtg8、FgAtg8、SsAtg8、PnAtg8。
序列分析表明，上述真菌的Atg8蛋白在氨基酸序列上与ChAtg8蛋白的一致性分别达到74.69％、70.70％、73.25％、72.61％和73.25％。利用MEGA-X程序绘制的上述真菌的Atg8蛋白的同源性关系图(Phylip tree)，结果见图13。
实施例5利用ChAtg8蛋白的表达或修饰作为靶标筛选抗真菌的药物
在液体完全培养基中大量培养希金斯炭疽菌，收集菌丝后分成若干小份，每份加入待筛选的化合物或候选药物后继续在完全培养基培养数小时，然后在缺氮培养基中(同样也加入带筛选的化合物或候选药物)继续诱导培养2h左右，取菌丝在相差显微镜下观察菌丝的自噬泡形成状况，或者利用常规电镜制片方法将菌丝制成超薄切片后，在电子显微镜下观察自噬泡的形成情况。如果ChAtg8蛋白因发生被候选药物修饰事件而失去活性，则菌丝不形成自噬泡。获得的化合物再利用实施例3的方法，测定野生型希金斯炭疽菌在这种化合物存在的条件下对拟南芥的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。
实施例6利用ChAtg8基因的表达作为靶标筛选抗真菌的药物
在液体完全培养基中大量培养希金斯炭疽菌，收集菌丝后分成若干小份，每份加入待筛选的化合物或候选药物后继续在完全培养基培养数小时，然后在缺氮培养基中(同样也加入带筛选的化合物或候选药物)继续诱导培养2h左右，提取菌丝RNA，采用实时定量PCR的方法检测ChAtg8的表达状况。如果ChAtg8的表达被候选药物抑制，则菌丝细胞内没有ChAtg8的转录本或ChAtg8的转录本显著减少。获得的化合物再利用实施例3的方法，测定野生型希金斯炭疽菌在这种化合物存在的条件下对拟南芥的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。
实施例7利用ChAtg8的启动子作为靶标筛选抗真菌的药物
把ChAtg8的启动子与荧光蛋白GFP构建成融合蛋白载体，或把ChAtg8的启动子与荧光蛋白GFP以及ChAtg8蛋白一起构建成融合蛋白载体，通过实施例2的方法转入到希金斯炭疽菌中，然后把ChAtg8的启动子调控下的GFP表达的希金斯炭疽菌转化子菌株在液体完全培养基中大量培养，收集菌丝后分成若干小份，每份加入待筛选的化合物或候选药物后继续在完全培养基培养数小时至数天，取菌丝在荧光显微镜下观察菌丝的GFP的绿色荧光表达情况。如果ChAtg8的启动子被化合物抑制而失去活性，则GFP蛋白不表达，从而菌丝失去绿色荧光。获得的化合物再利用实施例3的方法，测定野生型希金斯炭疽菌在这种化合物存在的条件下对拟南芥的致病性有没有减弱，进一步确定化合物的抗真菌效果。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<120> 源于希金斯炭疽菌的真菌致病性基因ChAtg8及应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 623
<212> DNA
<213> 希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)
<400> 1
atgcgatcca agttcaagga cgagcacccc ttcgagaagc gaaaggctga ggctgagcgc 60
atccgtcaga agtactctga ccgtatcccc gtatgtcgtc cccttttctg cgtttggttt 120
cttttcgcgg ttgttcgtac ggggatgtct gccgttcggc agccgtcgcc gcattcgcca 180
gcttcgcgtc ttatcggcgg tgccccacgt cccccggtca tcaccgccga tctcgtatct 240
actgtcgagg actctgcgcc gctaaccaag gcttttgcgg tacaggttat ctgcgagaag 300
gtcgagaagt ctgatatcgc tactatcgac aagaagaagt accttgtccc cgcggacctg 360
acggtcggcc agttcgtcta cgtcatccgc aagcgcatta agctctctcc ggagaaggcc 420
atcttcatct tcgtcgatga ggtgctgccg cccactgctg ctctgatgag cagcatttat 480
gaggagcaca aggacgagga cgggtgagtt gtcaagcctc gtgacttcgt ttcaggcaac 540
agtgtgctga catgatgtct cctagtttcc tctacatcac ctactccggc gagaacacct 600
ttggcggctt cgaaacggct taa 623
<210> 2
<211> 366
<212> DNA
<213> 希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)
<400> 2
atgcgatcca agttcaagga cgagcacccc ttcgagaagc gaaaggctga ggctgagcgc 60
atccgtcaga agtactctga ccgtatcccc gttatctgcg agaaggtcga gaagtctgat 120
atcgctacta tcgacaagaa ggagtacctt gtccccgcgg acctgacggt cggccagttc 180
gtctacgtca tccgcaagcg cattaagctc tctccggaga aggccatctt catcttcgtc 240
gatgaggtgc tgccgcccac tgctgctctg atgagcagca tttatgagga gcacaaggac 300
gaggacggtt tcctctacat cacctactcc ggcgagaaca cctttggcgg cttcgaaacg 360
gcttaa 366
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)
<400> 3
Met Arg Ser Lys Phe Lys Asp Glu His Pro Phe Glu Lys Arg Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Arg Ile Arg Gln Lys Tyr Ser Asp Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
Cys Glu Lys Val Glu Lys Ser Asp Ile Ala Thr Ile Asp Lys Lys Glu
35 40 45
Tyr Leu Val Pro Ala Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Val Tyr Val Ile
50 55 60
Arg Lys Arg Ile Lys Leu Ser Pro Glu Lys Ala Ile Phe Ile Phe Val
65 70 75 80
Asp Glu Val Leu Pro Pro Thr Ala Ala Leu Met Ser Ser Ile Tyr Glu
85 90 95
Glu His Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Glu
100 105 110
Asn Thr Phe Gly Gly Phe Glu Thr Ala
115 120
<210> 4
<211> 800
<212> DNA
<213> 希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)
<400> 4
gatctcgtgg gactcttttc gcactccagc ttagtagaaa gaaacacaaa gcgacagagt 60
gtgtcaggac ctcctgtgac tcaggtcgga tccagaaggc gtgacagact gccaggctgt 120
gtcaagtggc tgcgtggtcg gtcacctgcc ctgtccctgg ggcctgcacc ggcatggttg 180
gtcaagctga gatgatagtc ggtgtgttgc cccgctccga gaatccgata aggataagaa 240
caaacctcgc tggccgctgt cgagatgaga ggggggcgtg gggttcaatg tacggcggtg 300
cctatccgta tggtctcccc aggtggctta gtcattctgt tggcctaaaa ggtacttcgc 360
ccgccaggtc gcaccgtcaa aggtacctgg cttcagcttt cccgccttcc attctaggta 420
cccctcatgc taggtagagg tcggtacgca agccagccag ccaaccaccc acccacccaa 480
ccaaccaacc tacctacctg gcgcctgagc cacccagaca cccagacacc tccagtcagt 540
gaccgcccat tcccgtgtgt ctgaccccaa ggcacccaaa gcatagcagg cgaggcggca 600
accgatcagt cctttcttct tccttcgcaa acgtgcccct cgtcacctaa actctccctt 660
ctacatactt tgacacaact tgtcaacgct atcgacggac atctcgccat ctataacttg 720
accatcaccc aactccacag gagcagacca tatccagaac cacaacccac tttcccgtcg 780
cccacccgca atccgtcatc 800
<210> 5
<211> 804
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gcttcccaac cttctgatgg tccagtcacc taacggcttc agaatgttca cggcgtttcg 60
gtctgctatg cgcggttcag cacttttgga atggggtttt cacacggata tcggtttccc 120
ccgaagcagg ggtttatgac gaagaaacgc agtcacgtta tcgcgcgggg tcacaggaca 180
gggtcaggcg tggccctcgg ccgatcgcag agaaactccc gcgcggcttg ggaacgcacc 240
aagaaatgaa ggctcgcgag gacgatgcac ggaaactggc ttcatgaatt tcaagtggtt 300
tctttagatc gcatggtcag ctgctttcac gcatttctct cattctctct cccctctttc 360
gctatggtga ccttggcatt ttgtatagca taccatccat tagtgcgcat atcagcctgg 420
cttgactcct ctagcacgcc tttttttttt taacccctgt ccccttcgcc ccgttttgaa 480
atcgggcgtt cttccgtgag gccgaagcac caacatcgtg ggtgatggcg catggcccag 540
agccgcaaaa gtgaagcgac acaaaacgtg caagtacctc aagcaacatt ccctgaaaga 600
caacggtcaa agagtcgagt gtgaaatcga gtccacggcg gaaaggatga gttctccgag 660
accccgaaag agggattcgg ctcgccccgg catcatgcat aatcgtgttg gaaacgcacc 720
agcgagttga gcttggatgc tcgagcgaac agatggcacg tctgagagtg agatgacacg 780
agccgacatc agatcgcatt gaat 804
<210> 6
<211> 1500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgctgcatca tccgccttta atgatgtact ccttttctgt gaccattgct gcttcttccg 60
tctgcttaca tatctgctag cgcatttaaa tacttccctt ctctcatgct cggccttccc 120
agttgtccag atcagcagag ctttcatttc atagcttttc caagtgttgc attcattcgc 180
tgccccacgg gtggcaagaa aacgccgagg gccaaagtca cagcagactc gctctcccat 240
tgtccaacat cctaggtccg gcctcgtctg caaaagatga tcgttctttc agacgttttc 300
ctcccattta agctcaacga gaggatgaaa agagctggtg tccggcgcct tgggtgcagc 360
ttgcagtagt tcacaagagc tcgatgtcgg ctatccgagg ttcagagcgg gactgtatcc 420
attaggtaat cttgctcgat aagcccagac cgtgtgtgct gttggttgtc cgaactgtcc 480
gccacagtat tcgtactgca gtaatagaat gtgagtgggc tctagcagac tcccatctct 540
tacctcttac tggggacaaa tgacgtcaag acggggggac gctgaacaag gcattgtggc 600
atctggtccg cagacgacaa tgcacttcaa gcagcttacg gctttggaag cacagacaga 660
aagtggttgc gtgcgcgtat cagaaggttg cgcttcctgc gatctcgtgg gactcttttc 720
gcactccagc ttagtagaaa gaaacacaaa gcgacagagt gtgtcaggac ctcctgtgac 780
tcaggtcgga tccagaaggc gtgacagact gccaggctgt gtcaagtggc tgcgtggtcg 840
gtcacctgcc ctgtccctgg ggcctgcacc ggcatggttg gtcaagctga gatgatagtc 900
ggtgtgttgc cccgctccga gaatccgata aggataagaa caaacctcgc tggccgctgt 960
cgagatgaga ggggggcgtg gggttcaatg tacggcggtg cctatccgta tggtctcccc 1020
aggtggctta gtcattctgt tggcctaaaa ggtacttcgc ccgccaggtc gcaccgtcaa 1080
aggtacctgg cttcagcttt cccgccttcc attctaggta cccctcatgc taggtagagg 1140
tcggtacgca agccagccag ccaaccaccc acccacccaa ccaaccaacc tacctacctg 1200
gcgcctgagc cacccagaca cccagacacc tccagtcagt gaccgcccat tcccgtgtgt 1260
ctgaccccaa ggcacccaaa gcatagcagg cgaggcggca accgatcagt cctttcttct 1320
tccttcgcaa acgtgcccct cgtcacctaa actctccctt ctacatactt tgacacaact 1380
tgtcaacgct atcgacggac atctcgccat ctataacttg accatcaccc aactccacag 1440
gagcagacca tatccagaac cacaacccac tttcccgtcg cccacccgca atccgtcatc 1500
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 平头炭疽菌(C. truncatum)
<400> 7
Met Arg Ser Lys Phe Lys Asp Glu His Pro Phe Glu Lys Arg Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Arg Ile Arg Gln Lys Tyr Ser Asp Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
Cys Glu Lys Val Glu Lys Ser Asp Ile Ala Thr Ile Asp Lys Lys Lys
35 40 45
Tyr Leu Val Pro Ala Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Val Tyr Val Ile
50 55 60
Arg Lys Arg Ile Lys Leu Ser Pro Glu Lys Ala Ile Phe Ile Phe Val
65 70 75 80
Asp Glu Val Leu Pro Pro Thr Ala Ala Leu Met Ser Ser Ile Tyr Glu
85 90 95
Glu His Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Glu
100 105 110
Asn Thr Phe Gly Gly Phe Glu Thr Ala
115 120
<210> 8
<211> 123
<212> PRT
<213> 稻瘟菌(M. oryzae)
<400> 8
Met Arg Ser Lys Phe Lys Asp Glu His Pro Phe Glu Lys Arg Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Arg Ile Arg Gln Lys Tyr Thr Asp Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
Cys Glu Lys Val Glu Lys Ser Asp Ile Ala Thr Ile Asp Lys Lys Lys
35 40 45
Tyr Leu Val Pro Ala Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Val Tyr Val Ile
50 55 60
Arg Lys Arg Ile Lys Leu Ser Pro Glu Lys Ala Ile Phe Ile Phe Val
65 70 75 80
Gln Asp Thr Leu Pro Pro Thr Ala Ala Leu Met Ser Ser Ile Tyr Glu
85 90 95
Leu His Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Glu
100 105 110
Asn Thr Phe Gly Asp Leu Phe Glu Glu Val Glu
115 120
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> 禾谷镰刀菌(F. graminearum)
<400> 9
Met Arg Ser Lys Phe Lys Asp Glu His Pro Phe Glu Lys Arg Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Arg Ile Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
Cys Glu Lys Val Glu Lys Ser Asp Ile Ala Thr Ile Asp Lys Lys Lys
35 40 45
Tyr Leu Val Pro Ala Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Val Tyr Val Ile
50 55 60
Arg Lys Arg Ile Lys Leu Ser Pro Glu Lys Ala Ile Phe Ile Phe Val
65 70 75 80
Asp Glu Val Leu Pro Pro Thr Ala Ala Leu Met Ser Ser Ile Tyr Glu
85 90 95
Glu His Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Glu
100 105 110
Asn Thr Phe Gly Glu Ala
115
<210> 10
<211> 123
<212> PRT
<213> 油菜菌核病菌(S. sclerotiorum)
<400> 10
Met Arg Ser Lys Phe Lys Asp Glu His Pro Phe Glu Lys Arg Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Arg Ile Arg Gln Lys Tyr Ser Asp Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
Cys Glu Lys Val Glu Lys Ser Asp Ile Ala Thr Ile Asp Lys Lys Lys
35 40 45
Tyr Leu Val Pro Ser Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Val Tyr Val Ile
50 55 60
Arg Lys Arg Ile Lys Leu Ser Pro Glu Lys Ala Ile Phe Ile Phe Val
65 70 75 80
Asp Glu Val Leu Pro Pro Thr Ala Ala Leu Met Ser Ser Ile Tyr Glu
85 90 95
Glu His Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Glu
100 105 110
Asn Thr Phe Gly Glu Ala Leu Glu Glu Ala Asn
115 120
<210> 11
<211> 119
<212> PRT
<213> 小麦颖枯病菌(P. nodorum)
<400> 11
Met Arg Ser Lys Phe Lys Asp Glu His Pro Phe Glu Lys Arg Lys Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Arg Ile Arg Gln Lys Tyr Asn Asp Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
Cys Glu Lys Val Glu Lys Ser Asp Ile Ala Thr Ile Asp Lys Lys Lys
35 40 45
Tyr Leu Val Pro Ala Asp Leu Thr Val Gly Gln Phe Val Tyr Val Ile
50 55 60
Arg Lys Arg Ile Lys Leu Ser Pro Glu Lys Ala Ile Phe Ile Phe Val
65 70 75 80
Asp Glu Val Leu Pro Pro Thr Ala Ala Leu Met Ser Ser Ile Tyr Glu
85 90 95
Glu His Lys Asp Glu Asp Gly Phe Leu Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Glu
100 105 110
Asn Thr Phe Gly Glu Ala Ile
115

Claims (3)

1.抑制核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因或氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的蛋白的表达，在设计或筛选抗植物真菌药物中的应用，所述植物真菌为希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)。
2.抑制权利要求1中所述的基因或蛋白的表达在设计或筛选抑制植物真菌的菌丝生长、分生孢子萌发、附着胞形成和/或致病力的药物中的应用，所述植物真菌为希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)。
3.一种防治植物炭疽菌和/或炭疽病的方法，其特征在于，抑制权利要求1中所述的基因或蛋白的表达，所述植物炭疽菌为希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianumSacc.)，所述炭疽病为希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum Sacc.)所引起的炭疽病。
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