CN104357413A - 一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂 - Google Patents

一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂。采用分子生物学技术构建一个重组核苷酸序列，其中含有编码球孢白僵菌（ Beauveria bassiana ）几丁质酶的信号肽序列与编码运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶的成熟蛋白区域序列。本发明将PgpdA-BbSP-GFOR片段克隆入pUC-Bar载体，得真菌表达载体，并将真菌表达载体导入球孢白僵菌野生型Bb0062菌株，得BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子。本发明重组葡萄糖-果糖氧化还原酶有效封阻了宿主体内GNBPs的活性，将真菌击倒害虫的时间缩短了48h，显著提高杀虫效果。

Description

一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂，具体涉及一种含有真菌的分泌型信号肽和细菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶GFOR序列的重组蛋白及其真菌表达载体和真菌杀虫剂。
 
背景技术
我国是农业生产大国，粮食产量连年丰收，其中农药的使用功不可没。但数据显示，我国平均农药使用量是世界平均水平的2.5倍，农药的过量使用对环境造成了污染，威胁着农产品的质量安全与食品安全。因此，开发高效、对环境安全、专一性强的生物农药，减少常规化学农药的使用，将有利于环境健康及食品安全。
昆虫病原真菌是控制自然界昆虫种群数量的主要因素之一，以其为主要活性成份的生物农药已在我国、欧美及非洲得到广泛应用。但生物农药，包括细菌、病毒及真菌类杀虫剂均存在击倒害虫时间过长和防效不稳定等缺点，因此如何提高这些生物类杀虫剂的效率，并研究其作用机理已成为该领域的一个研究重点。
在真菌侵染宿主的过程中，昆虫会利用自身的防御系统抵御真菌的侵入。昆虫体壁可以为其提供物理屏障，自身的免疫系统则可识别入侵的病原体，将免疫细胞附着在病原体表面，吞噬病原体，形成黑色素。此外，免疫系统还会产生大量的抗菌蛋白，抑制真菌的生长，在此过程中，昆虫的免疫系统可产生革兰氏阴性细菌结合蛋白（Gram-negative bacteria binding proteins GNBPs），检测不应存在的微生物，并引发相关的免疫反应。由此可以看出，及时、准确地识别入侵微生物是昆虫抵御入侵微生物的前体条件。然而，研究者发现， D-δ-葡萄糖酸内酯（GDL）可以封阻GNBPs的活性，从而让真菌可以快速控制昆虫 (Bulmer MS, 2009)。我们设想，如能在真菌侵染宿主过程中产生D-δ-葡萄糖酸内酯，则可能会帮助真菌逃脱宿主免疫系统的识别，加速真菌在宿主体内的繁殖，从而有效提高真菌的杀虫效果。经筛选发现，来自运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶Glucose-frustose oxidoreductase (GFOR) 能利用葡萄糖和果糖为底物，产生葡萄糖酸内酯和山梨醇（Kanagasundaram V, 1992）。但能否将该基因导入到杀虫真菌，在真菌侵染过程中产生葡萄糖酸内酯，抑制宿主的免疫反应，提高真菌的杀虫效果，目前还没有相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶，具体来说，是一种含有来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的分泌型信号肽和来源于运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶重组蛋白区域的融合蛋白。
本发明的另一个目的在于提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的构建方法。
本发明的又一个目的在于提供一种含有上述基因核苷酸序列的真菌表达载体。
本发明的再一个目的是提供能产生本发明重组蛋白的真菌杀虫剂。
实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶，含有一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的分泌型信号肽与来源于运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的成熟蛋白区域融合而成；采用分子生物学技术构建本发明重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌几丁质酶的信号肽序列与编码运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶的成熟蛋白区域序列，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
所述重组葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的构建方法，包括如下步骤：
1）葡萄糖-果糖氧化还原酶序列GFOR、信号肽BbSP及启动子PgpdA的扩增：
设计引物PGFOR-F与PGFOR-R，扩增GFOR序列的成熟蛋白区域（GFOR，基因bank登录号M97379），模板为运动发酵单胞菌的基因组；设计引物PBbsp-F与PBbsp-R，扩增信号肽序列（BbSP，基因bank登录号AY145440），模板为球孢白僵菌基因组；设计引物PgpdA-F与 PgpdA-R，扩增球孢白僵菌的磷酸甘油醛脱氢酶组成性启动子（PgpdA，基因bank登录号AY679162），模板为球孢白僵菌基因组。引物序列如下：
PGFOR-F：5’- CCCTTGGCGCCGCGAGCCGGCGCGACGCTTCCTGCTGGTGCCAG-3’
PGFOR-R：5’-CTCGAGTTAACCCAAATAGGTTAAGTC-3’
PBbsp-F：5’-ATG GCT CCT TTT CTT CAA AC-3’
PBbsp-R：5’- GCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’
PgpdA-F:：5’-GTTGGGTATGCTCCGGC-3’
PgpdA-R：5’-GTTTGAAGAAAAGGAGCCATGGTTGTTATTGATTAAAAGG -3’ 
PCR反应的混合物为：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM的 dNTP，10μM的上下游引物各1μL，30 ng的基因组模板，0.4 U 的phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积为25 μL。
PCR反应条件为：98oC预变性2 min； 98oC变性20 s，56oC退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后 72oC 延伸5 min。
PCR反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳后，分别用胶回收试剂盒回收GFOR、Bbsp和PgpdA。
2）融合基因的构建：
因为PgpdA的羧基端与BbSP的N端，BbSP的羧基端与GFOR的N端分别有20bp的相同序列，所以可利用无引物PCR组装的方法将三个片段组装在一起。
其中，PCR反应的混合物为：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液, 2 μL 2.5 mM dNTP，回收的GFOR、BbSP、PgpdA各30 ng，0.4 U 的phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积 25 μL。PCR反应条件为：98oC预变性2 min; 98oC变性20 s, 56oC退火30 sec, 72℃延伸1min，20个循环；最后72oC 延伸5 min。
取上述PCR反应组装产物1 μL做模板，用引物PgpdA-F与PGFOR-R扩增PgpdA-BbSP-GFOR。PCR反应混合物：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM dNTP，10μM的PgpdA-F与PGFOR-R引物各1μL，1 μL组装产物，0.4 U 的Phusion Taq DNA 聚合酶, 加超纯水至总体积 25 μL。PCR反应条件为：98℃预变性2 min; 98℃变性20 s, 56℃退火30sec, 72℃延伸2.5min，32个循环; 最后72℃ 延伸5 min。
将PCR反应扩增的PgpdA-BbSP-GFOR经琼脂糖电泳，并用胶回收试剂盒回收后，克隆进pCR-Blunt vector，得pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR；经测序分析发现，所获目标片段与预期一致。用内切酶EcoRI酶切pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR质粒，回收PgpdA-BbSP-GFOR片段。
进一步，一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌表达载体：将上述回收得到的PgpdA-BbSP-GFOR片段克隆进pUC-Bar，得pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR真菌表达载体，其上游含有一个球孢白僵菌的磷酸甘油醛脱氢酶组成性启动子PgpdA。
更进一步，本发明还提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌杀虫剂，将上述真菌表达载体pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR用XbaI单酶切后，利用PEG4000介导的芽孢子遗传转化法导入球孢白僵菌野生型Bb0062菌株，得BbSP-GFOR的杀虫真菌转化子，即重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌杀虫剂。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明真菌杀虫剂，利用葡萄糖-果糖氧化还原酶基因生成的葡萄糖酸内酯，有效地封阻宿主产生识别入侵真菌的革兰氏阴性菌细菌结合蛋白（GNBPs），从而抑制昆虫宿主对真菌的识别，帮助真菌逃脱宿主免疫系统的识别，避免了免疫系统对入侵真菌的清除。
2、由于真菌逃脱了宿主免疫系统的识别，继而加速了真菌在宿主体内的繁殖，将真菌击倒害虫的时间缩短了48h，有效地提高了真菌的杀虫效果。
3、目前还未有相关的研究报道将葡萄糖-果糖氧化还原酶基因导入到杀虫真菌中，而本发明创造性地实现了这一设想，具有非同凡响的意义。
4、本发明取得的成功既可为害虫的防治提供高毒力菌株，也可以为菌株改良提供一个新的思路。
 
附图说明
图1是本发明融合基因BbSP-GFOR的质粒图谱；
图2是本发明融合基因BbSP-GFOR的真菌表达载体图谱；
图3是本发明融合基因BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子PCR验证；
图4是本发表的生物测定结果。
 
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶，含有一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌几丁质酶的分泌型信号肽与来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的成熟蛋白区域融合而成。
采用分子生物学技术构建了本发明重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的信号肽序列与编码运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶的成熟蛋白区域序列，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
本发明还提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌表达载体pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR，将PgpdA-BbSP-GFOR片段克隆进pUC-Bar而得。
另外，本发明又提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌杀虫剂，将真菌表达载体pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR用限制性内切酶XbaI单酶切后，利用PEG4000介导的芽孢子遗传转化法导入杀虫真菌中而得，其中杀虫真菌是球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。
以下具体实施中，所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
一、葡萄糖-果糖氧化还原酶序列GFOR、信号肽BbSP及启动子PgpdA的扩增：
设计引物扩增GFOR基因的成熟蛋白区域（GFOR，基因bank登录号M97379）、球孢白僵菌几丁质酶基因的信号肽序列（BbSP，基因bank登录号AY145440）、以及球孢白僵菌的组成性启动子（PgpdA，基因bank登录号AY679162）。引物序列如下：
PGFOR-F：5’- CCCTTGGCGCCGCGAGCCGGCGCGACGCTTCCTGCTGGTGCCAG-3’
PGFOR-R：5’-CTCGAGTTAACCCAAATAGGTTAAGTC-3’
PBbsp-F：5’-ATG GCT CCT TTT CTT CAA AC-3’
PBbsp-R：5’- GCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’
PgpdA-F:：5’-GTTGGGTATGCTCCGGC-3’
PgpdA-R：5’-GTTTGAAGAAAAGGAGCCATGGTTGTTATTGATTAAAAGG -3’ 
引物PGFOR-F与PGFOR-F扩增运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因GFOR，模板为运动发酵单胞菌的基因组序列； PBbsp-F与PBbsp-R扩增球孢白僵菌几丁质酶基因的信号肽序列，模板为球孢白僵菌基因组序列； PgpdA-F与 PgpdA-R扩增球孢白僵菌的磷酸甘油醛脱氢酶组成性启动子，模板为球孢白僵菌基因组。
以上PCR反应的混合物包含：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM dNTP，10μM的上下游引物各1μL，30 ng基因组模板，0.4 U 的phusion Taq DNA 聚合酶, 加超纯水至总体积 25 μL。
PCR反应条件为：98℃预变性2 min; 98℃变性20 s, 56℃退火30sec, 72℃延伸1min，32个循环; 最后72℃ 延伸5 min。
PCR反应产物经质量分数为1.0%琼脂糖凝胶电泳后，分别用胶回收试剂盒回收GFOR（约1.1kb）、Bbsp（约90bp）、PgpdA（约1.2kb）片段。
二、融合基因的构建：
因为PgpdA的羧基端与BbSP的N端，BbSP的羧基端与GFOR的N端分别有20bp的相同序列，所以可利用无引物PCR组装的方法将三个片段组装在一起。
其中，PCR反应混合物：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液, 2 μL 2.5 mM dNTP，回收的GFOR、BbSP、PgpdA各30 ng，0.4 U的phusion Taq DNA 聚合酶, 加超纯水至总体积 25 μL。PCR反应条件为：98oC预变性2 min; 98oC变性20 s, 56oC退火30 sec, 72℃延伸1min，20个循环；最后72oC 延伸5 min。
取上述PCR反应组装产物1 μL做模板，用引物PgpdA-F与PGFOR-R扩增PgpdA-BbSP-GFOR。PCR反应混合物：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM dNTP，10 μM的PgpdA-F与PGFOR-R引物各1μL，1 μL组装产物，0.4 U 的Phusion Taq DNA 聚合酶, 加超纯水至总体积 25 μL。PCR反应条件为：98℃预变性2 min; 98℃变性20 s, 56℃退火30sec, 72℃延伸2.5min，32个循环; 最后72℃ 延伸5 min。
将PCR反应扩增的PgpdA-BbSP-GFOR经琼脂糖电泳，并用胶回收试剂盒回收后（约2.4kb），克隆进pCR-Blunt vector (Invitrogen)，得pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR（图1），经测序分析发现，所获目标片段与预期一致。用限制性内切酶EcoRI酶切pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR质粒，回收PgpdA-BbSP-GFOR片段。
将上述回收得到的PgpdA-BbSP-GFOR片段克隆进pUC-Bar，得pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR真菌表达载体（图2），其上游含有一个球孢白僵菌的磷酸甘油醛脱氢酶组成性启动子PgpdA。
三、真菌遗传转化及鉴定
将上述真菌表达载体pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR经限制性内切酶XbaI线性化后，利用PEG4000介导的芽孢子遗传转化法（Fan, et al., 2011）导入球孢白僵菌野生型Bb0062菌株（球孢白僵菌Bb0062菌株分离自感染的菜青虫（Pieris rape），保存于西南农业大学生物技术中心，也可以从公知途径获得，例如CCTCC AF93297或从其它途径分离得到），得到BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子。
以引物PgpdA-t（序列为PgpdA-t：5’-GTGAGTTTTCCCATTCGTTC-3’）和PGFOR-R验证BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子，反应体系为：12.5 μL 2×Taq mixture，上下游引物各1μL（10μM），50 ng基因组DNA，加超纯水补至25 μL。PCR反应参数： 94oC预变性5 min； 94oC变性30 s, 56oC 退火30sec；72oC延伸2min，32个循环；72oC延伸5 min，预期片段大小1.4kb。
将PCR反应产物用质量分数为1.2%琼脂糖电泳检测，检测结果如图3所示，图3中M泳道为Biolab公司的1kb DNAmarker ；WT泳道以球孢白僵菌野生型菌株DNA为模板；1泳道以pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR质粒为模版；2泳道以H2O为模板；3-6泳道为不同的BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子。结果显示，3、4、5、6球孢白僵菌转化子与阳性对照有相同大小的条带，表明均有目的基因的转入。
四、重组果糖-葡萄糖氧化酶还原酶活性测定
在100 mL SDB中接种100 uL孢悬液(浓度为108个/mL)，26℃培养48h，真空抽滤收集菌丝，转移1g菌丝到30 mL CZB培养基中培养17 h。分析上清液中的GFOR活性。将500 uL的上清液加入到500 uL反应混合物（pH6.4，含50 mM K-Mes，200mM 葡萄糖，200mM 果糖)，室温放置1h。经GFOR产生的葡萄糖酸内酯利用试剂盒(Cat. No. 10428191035, r-biopham)进行分析。1单位的GFOR活性定义为反应1小时释放1mg葡萄糖酸内酯所需的酶量。实验结果显示，BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子的上清液中能检测到GFOR活性（12mU/mL），而球孢白僵菌野生型菌株的上清液中没有GFOR活性，表明GFOR成功导入到球孢白僵菌中，并具有生物学活性。
五、转化子的毒力测定：
用0.05%（v/v）的无菌Tween-80，收集野生型球孢白僵菌和BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子的孢子，涡旋，四层擦镜纸过滤，离心，调节孢子终浓度1×107个/mL，将配制好的孢子悬液采用体表接种的方法接种大蜡螟，以0.05%（v/v）Tween-80为空白对照。结果如图4，图4表明：与野生型菌株相比，野生型菌株的半致死时间为9d，而表达GFOR的球孢白僵菌转化子的半致死时间为7d，表明表达GFOR基因可以缩短真菌击倒害虫的时间，BbSP-GFOR的球孢白僵菌转化子的毒力半致死时间缩短了48h。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围的，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110>  西南大学；
 
<120>  一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂；
 
<160>  9
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
 
<210>  1
<211>  1254
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  SEQ ID NO.1的核苷酸序列
 
<400>  1
atggctcctt ttcttcaaac cagcctcgcg ctccttccat tgttggcttc cactatggtc        60
agcgcctcgc ccttggcgcc gcgagccggc gcgacgcttc ctgctggtgc cagcctggtt       120
ccgaccacgc ctgcaggtcg cccgatgcct tacgcgatcc gcccgatgcc ggaagatcgt       180
cgtttcggtt atgctatcgt cggtctgggt aaatatgccc ttaaccagat tttaccgggt       240
tttgccggat gccagcattc ccgcatgaag ctttggtcag cggtaaccga aaaagctaaa       300
atcgttgccg ctgaatatgg cgtcgatccc cgtaaaattt atgattacag caacttcgac       360
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gatatcggta tttatggctt gaacggtacc cgttacttgc tgggtgaaga accgatcgaa       780
gtccgtgctt acacctacag cgatccgaat gatgaacgtt tcgttgaagt cgaagatcgt       840
attatttggc agatgcgctt cagaagcggt gctctgtctc atggtgcatc ttcttattcg       900
accacgacga cttcacgttt ctcggtgcag ggcgacaaag ctgttctgtt gatggatccg       960
gctaccggat attatcagaa tttgatttct gtccagaccc caggccatgc taaccagtcg      1020
atgatgccac agttcatcat gccagcgaac aaccagttct ctgcacagtt ggatcatctg      1080
gctgaagccg tcatcaataa caaaccagtt cgtagcccgg gtgaagaagg tatgcaggat      1140
gtgcgcctga ttcaggccat ttatgaagca gctcgtaccg gtcgcgccgt caacacggat      1200
tggggttatg tgcgtcaggt ggttattgat tctgacttaa cctatttggg ttaa            1254
 
 
<210>  2
<211>  417
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  SEQ ID NO.2的氨基酸序列
 
<400>  2
MAPFLQTSLA LLPLLASTMV SASPLAPRAG ATLPAGASLV PTTPAGRPMP YAIRPMPEDR        60
RFGYAIVGLG KYALNQILPG FAGCQHSRMK LWSAVTEKAK IVAAEYGVDP RKIYDYSNFD       120
KIAKDPKIDA VYIILPNSLH AEFAIRSFKA GKHVMCEKPM ATSVADCQRM IDAAKAANKK       180  
LMIGYRCHYD PMNRAAVKLI RENQLGKLGM VTTDNSDVMD QNDLHSSGVC VVNSGGGSLM       240
DIGIYGLNGT RYLLGEEPIE VRAYTYSDPN DERFVEVEDR IIWQMRFRSG ALSHGASSYS       300
TTTTSRFSVQ GDKAVLLMDP ATGYYQNLIS VQTPGHANQS MMPQFIMPAN NQFSAQLDHL       360
AEAVINNKPV RSPGEEGMQD VRLIQAIYEA ARTGRAVNTD WGYVRQVVID SDLTYLG          417
 
 
<210>  3
<211>  44
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PGFOR-F
 
<400>  3
cccttggcgc cgcgagccgg cgcgacgctt cctgctggtg ccag                         44
 
 
<210>  4
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PGFPR-R
 
<400>  4
ctcgagttaa cccaaatagg ttaagtc                                            27
 
 
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PBbsp-F
 
<400>  5
atggctcctt ttcttcaaac                                                    20
 
 
<210>  6
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PBbsp-R
 
<400>  6
gccggctcgc ggcgccaagg g                                                  21
 
 
<210>  7
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PgpdA-F
 
<400>  7
gttgggtatg ctccggc                                                       17
 
 
<210>  8
<211>  40
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PgpdA-R
 
<400>  8
gtttgaagaa aaggagccat ggttgttatt gattaaaagg                              40
 
 
 
<210>  9
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<220> 
<223>  引物PgpdA-t
 
<400>  9
gtgagttttc ccattcgttc                                                    20

Claims (4)

1.一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶，其特征在于，含有一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的分泌型信号肽与来源于运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的成熟蛋白区域融合而成；采用分子生物学技术构建本发明重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌几丁质酶的信号肽序列与编码运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶的成熟蛋白区域序列，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2.一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的构建方法，包括如下步骤：
1）葡萄糖-果糖氧化还原酶序列GFOR、信号肽BbSP及启动子PgpdA的扩增：
设计引物PGFOR-F与PGFOR-R，扩增GFOR序列的成熟蛋白区域（GFOR，基因bank登录号M97379），模板为运动发酵单胞菌的基因组；设计引物PBbsp-F与PBbsp-R，扩增信号肽序列（BbSP，基因bank登录号AY145440），模板为球孢白僵菌基因组；设计引物PgpdA-F与 PgpdA-R，扩增球孢白僵菌的磷酸甘油醛脱氢酶组成性启动子（PgpdA，基因bank登录号AY679162），模板为球孢白僵菌基因组；引物序列如下：
PGFOR-F：5’- CCCTTGGCGCCGCGAGCCGGCGCGACGCTTCCTGCTGGTGCCAG-3’
PGFOR-R：5’-CTCGAGTTAACCCAAATAGGTTAAGTC-3’
PBbsp-F：5’-ATGGCTCCTTTTCTTCAA AC-3’
PBbsp-R：5’- GCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’
PgpdA-F:：5’-GTTGGGTATGCTCCGGC-3’
PgpdA-R：5’-GTTTGAAGAAAAGGAGCCATGGTTGTTATTGATTAAAAGG -3’ 
PCR反应的混合物为：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM的 dNTP， 10μM的上下游引物各1μL，30 ng的基因组模板，0.4 U 的phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积为25 μL；
PCR反应条件为：98oC预变性2 min； 98oC变性20 s，56oC退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后 72oC 延伸5 min；
PCR反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳后，分别用胶回收试剂盒回收GFOR、Bbsp和PgpdA；
2）融合基因的构建：
因为PgpdA的羧基端与BbSP的N端，BbSP的羧基端与GFOR的N端分别有20bp的相同序列，所以可利用无引物PCR组装的方法将三个片段组装在一起；
其中，PCR反应的混合物为：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液, 2 μL 2.5 mM dNTP，回收的GFOR、BbSP、PgpdA各30 ng，0.4 U 的phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积 25 μL；
PCR反应条件为：98oC预变性2 min; 98oC变性20 s, 56oC退火30 sec, 72℃延伸1min，20个循环；最后72oC 延伸5 min；
取上述PCR反应组装产物1 μL做模板，用引物PgpdA-F与PGFOR-R扩增PgpdA-BbSP-GFOR，PCR反应混合物：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM dNTP，10 μM的PgpdA-F与PGFOR-R引物各1μL，1 μL组装产物，0.4 U 的Phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积 25 μL；
PCR反应条件为：98℃预变性2 min；98℃变性20 s，56℃退火30sec, 72℃延伸2.5min，32个循环；最后72℃ 延伸5 min；
将PCR反应扩增的PgpdA-BbSP-GFOR经琼脂糖电泳，并用胶回收试剂盒回收后，克隆进pCR-Blunt vector，得pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR；经测序分析后，用限制性内切酶EcoRI酶切pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR质粒，回收PgpdA-BbSP-GFOR片段。
3.一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌表达载体，其特征在于，将上述回收得到的PgpdA-BbSP-GFOR片段克隆进pUC-Bar，得pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR真菌表达载体，其上游含有一个球孢白僵菌的磷酸甘油醛脱氢酶组成性启动子PgpdA。
4.一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌杀虫剂，将上述真菌表达载体pUC-Bar-PgpdA-BbSP-GFOR用限制性内切酶XbaI单酶切后，利用PEG4000介导的芽孢子遗传转化法导入球孢白僵菌野生型Bb0062菌株，得BbSP-GFOR的杀虫真菌转化子，即重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的真菌杀虫剂。
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