KR101389254B1 - 거대 게놈 ｄｎａ의 포획 및 변형 및 합성 엽록체를 갖는 생물의 구성을 위한 시스템 - Google Patents

거대 게놈 ｄｎａ의 포획 및 변형 및 합성 엽록체를 갖는 생물의 구성을 위한 시스템 Download PDF

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Abstract

유전자의 기능적 분석은 거대 게놈 영역의 조작을 자주 요구한다. 상동성 재조합에 의한 거대 영역을 클로닝하기 위하여 사용될 수 있는 효모-세균 셔틀 벡터가 개시된다. 또한, 엽록체 게놈, 또는 이들의 거대 부분을 분리 및 이들을 조작하는 방법이 개시된다. 또한, 최소 게놈, 최소 경로 요구 및 최소 세포소기관 게놈을 결정하는 방법이 개시된다.

Description

거대 게놈 ＤＮＡ의 포획 및 변형 및 합성 엽록체를 갖는 생물의 구성을 위한 시스템 {SYSTEM FOR CAPTURING AND MODIFYING LARGE PIECES OF GENOMIC DNA AND CONSTRUCTING ORGANISMS WITH SYNTHETIC CHLOROPLASTS}
상호 참고
본 출원은 참고문헌으로 본 명세서에 통합된 미국 가출원 번호 60/978,024 (2007년 10월 5일 출원)의 우선권과 이익을 주장한다.
많은 유전자의 기능 분석에 있어서, 연구진은 거대 DNA 단편을 분리하고 조작할 필요가 있다. 유전체학의 출현과 DNA의 게놈 영역은 거대 DNA 영역을 운반할 수 있는 벡터의 필요성을 발생시켰다.
일반적으로 효모 벡터 시스템의 두 가지 타입이 현재 이용된다. 제 1 타입의 벡터는 효모와 세균 사이에 작은 삽입 DNA를 전사할 수 있는 벡터이다. 제 2 타입의 벡터는 효모 인공 염색체(YACs) 내에서 세포 간 또는 종단 결실을 발생시키는 단편 벡터이다. 작은 삽입 셔틀 벡터는 재조합할 수 있으며, 상동 서열을 복구할 수 있다. 상기 셔틀 벡터는 센트로미어에 기반을 두며, 효모에서 센트로미어를 이용하여 안정적이며 자가 복제하지만, 또한 세균 플라스미드로서 유지를 위하여 고 사본 복제 기점을 포함한다. 반면 이들 벡터는 작은 삽입 용량에 의해 한정된다. 제 2 타입의 벡터(단편 벡터로 알려짐)는 재조합성(recombiogenic) 서열인 반면, 다량의 DNA 준비에 대하여 복구된 삽입 DNA를 세균으로 전달할 수 있다.
연구진은 YACs의 관심 영역을 좁히기 위해서 단편화 기술을 이용한다. 그러나, 마이트로인젝션(microinjection) 또는 일렉트로포레이션(electroporation)에 대한 아가로스 겔로부터 분리한 충분한 양의 YAC DNA는 다루기 힘든 것으로 남아있다. YAC이 내생적 염색체와 동시에 이동하는 경우 정제의 문제가 남는다. 또한, YACs은 키메릭(chimeric)이거나, 특별한 기능 연구를 요하지 않는 추가 DNA 영역을 포함할 수도 있다.
세균 내에 거대 단편을 클로닝할 수 있는 타입의 벡터는 코스미드(cosmid), P1 및 세균 인공 염색체(BACs)이다. 이들 벡터는 세균에 한정되며, 상동 재조합에 의한 변형을 위하여 효모로 왕복될 수 없다. 세균 벡터는 형질 전환 식물 및 조류를 이용하는 이들로 한정되지 않는다. 예컨대, 엽록체는 광합성 세균으로부터 진핵 숙주로의 내부공생으로부터 기원된다고 하더라도, 엽록체의 번역은 보다 복잡하다. 유전적 가공 식물 및 조류의 복잡성의 증가는 엽록체 게놈의 다수 사본을 가진 다수 엽록체의 존재 때문이다. 따라서, 식물 및 조류의 엽록체 내 DNA의 거대 단편으로부터 단백질을 발현하는 방법을 발전시킬 필요가 있다.
발명의 개요
본 발명은 조성물 및 분리, 특성화 및/또는 거대 DNA 변형하는 방법과 관한 것이며, 세균 및 엽록체의 전제 게놈을 포함한다. 상기 조성물은 표적 DNA가 삽입될 수도 있는 셔틀 벡터를 포함한다. 상기 방법은 변형 또는 표적 DNA를 제거함으로써 조작, 첨가 또는 재배열 및 변형된 DNA를 숙주 내에 도입한다.
본 발명의 일 측면은 효모 성분, 세균성 복제 원점 및 적어도 20 kb 게놈 DNA를 포함하는 분리된 벡터를 제공한다. 몇몇 벡터에 있어서, 상기 효모 성분은 효모 센트로미어, 효모 자가 복제 서열, 효모 영양요구 마커 및 이들의 조합물이다. 상기 DNA는 비관다발 광합성 생물, 예컨대 상기 생물은 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스이다. 몇몇 구체예에 있어서, 상기 게놈DNA는 변형되며 예컨대, 이종 또는 동종 폴리뉴클레오티드의 삽입, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 결실, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 변이, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 재배열, 또는 이들의 조합이다. 몇몇 실시예에 있어서, 상기 변형은 합성이다. 본 발명의 벡터는 숙주 세포로에서 형질 전환하는 경우, 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되는 것이 아닌 생산물을 생산하는 결과일 수도 있다. 이들 생산물의 몇몇 실시예는 바이오매스-분해 효소, 지방산, 테르펜 또는 테르페노이드를 포함한다. 몇몇 숙주 세포에서, 벡터의 발현은 상기 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산된 생산물의 증가 생산의 결과이며 예컨대, 생산물은 바이오매스-분해 효소, 테르펜 또는 테르페노이드이다. 본 발명의 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 마커 예컨대, 효모 마커, 효모 영양요구 마커, 효모 항생제 저항 마커, 세균성 마커, 세균성 영양요구 마커, 세균성 항생제 마커, 조류 마커, 조류 영양요구 마커, 조류 항생제 마커 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군을 더 포함할 수도 있다. 또한 ,본 발명의 벡터는 엽록체 게놈 DNA는 1) 10-200 유전자; 2) 필수적인 모든 엽록체 유전자; 및/또는 3) 30-400kb를 포함하는 엽록체 게놈 DNA를 포함할 수도 있다.
또한 상기 숙주 세포는 상기 벡터를 포함한다. 예시적인 숙주 세포는 원래 비광합성 또는 광합성일 수도 있으며 예컨대, 효모, 대장균, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 벡터를 생산하는 방법은 표적 DNA을 효모 센트로미어, 효모 자가 복제 서열, 및 세균 복제 원점인 벡터 내로 삽입하고, 생물을 상기 벡터로 형질전환시키고, 엽록체 게놈의 부분을 포획함으로써 상기 엽록체 게놈의 부분을 갖는 벡터를 생산하는 것과 관련되는 방법이 제공된다. 몇몇 실시예에 의하면, 표적 DNA는 엽록체 게놈 DNA이다. 상기 방법은 10-400kb 길이의 게놈 부분을 포획하는데 이용될 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 표획 단계는 제조합으로 나타난다. 엽록체 게놈의 포획된 부분은 벡터를 갖는 생물로 동시 형질 전환될 수 있으며, 따라서 재조합 단계는 체내에서 나타날 수 있다. 상술한 실용적인 방법을 이용하는 생물은 진핵생물 및/또는 광합성 생물일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물은 비관다발 광합성 생물 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스이다. 또한, 상술한 실용적인 방법을 이용하는 생물은 비광합성 생물 예컨대, 효모일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 비광합성 생물은 외래성 엽록체 DNA를 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 엽록체 게놈 부분을 변형하는 추가적인 단계가 이용된다. 변형은 상동성 재조합을 통해서 이루어질 수도 있다. 이러한 재조합은 생물 예컨대, 진핵 및/또는 광합성 생물에서 나타날 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물은 비관다발성 광합성 생물 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스이다. 그밖의 실시예에 의하면, 생물은 비광합성 예컨대, 효모일 수도 있다. 변형 단계를 포함하는 구체예에 의하면, 상기 단계는 폴리뉴클레오티드의 첨가, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 결실, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 돌연변이, 재배열 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다.
상술한 발명은 필수적 엽록체 유전자, 선별가능 마커 및 벡터에서 하나 또는 그 이상의 핵산의 조작을 포함하는 분리된 벡터이다. 몇몇 실시예에 의하면, 필수적 엽록체 유전자는 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스 등과 같은 비관다발성 광합성 생물로부터 클론화된다. 상술한 벡터에서 사용하기 위한 필수적 엽록체 유전자는 합성일 수도 있다. 상술한 벡터는 표적 DNA 예컨대, 세포소기관 DNA로의 통합을 위한 영역을 더 포함하는 발현 카세트를 더 포함할 수도 있다. 또한, 상술한 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별 마커 예컨대, 영양요구 마커, 항생제 내성 마커, 엽록체 마커, 또는 이들의 조합물을 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 필수적 엽록체 유전자는 엽록체 기능, 광합성, 탄소 고정, 하나 또는 그 이상의 탄화수소의 생성, 또는 이들의 조합을 위하여 요구되는 것이다. 필수적 엽록체 유전자는 최대 200 유전자를 포함 및/또는 최대 400kb로 이루어질 수 있다. 상술한 몇몇 벡터에 있어서, 하나 또는 그 이상의 핵산 조작은 첨가, 결실, 돌연 변이 또는 재배열을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 숙주 세포에서 벡터의 발현은 상기 숙주 세포에서 자연적으로 생산되지 않는 생산물을 생산한다. 그 밖의 실시예에 의하면, 본 발명의 벡터의 발현은 상기 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산된 생산물이 생산을 증가시키는 결과를 나타낸다. 상기 생산물의 예로는 바이오매스 분해 효소, 지방산, 테르펜 또는 테르페노이드이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 측면은 본 발명의 벡터를 포함하는 분리된 엽록체이다. 또 다른 측면에 의하면, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명에서 이용되는 숙주 세포는 원래 비광합성 또는 광합성 생물일 수도 있다. 본 발명에 이용되는 생물의 예로는 효모, 대장균, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 세포 또는 생물을 형질 전환하기 위한 방법은 필수적인 모든 엽록체 유전자 및 선택적으로 세포 또는 생물에서 자연적으로 생기지 않는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 벡터를 상기 세포 또는 생물 내로 삽입하는 것을 포함하는 방법으로 제공된다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 상기 세포 또는 생물의 실질적으로 모든 엽록체 게놈을 제거시키는 단계를 더 포함한다. 상기 방법에 유용한 세포 또는 생물은 광합성적, 비광합성 및/또는 진핵성일 수도 있다. 상기 방법에 유용한 세포 또는 생물은 비관다발성일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 또한 상기 방법에 이용하기 위한 벡터는 발현 카세트 일 수도 있으며, 상기 발현 카세트는 비-핵(non-nuclear) DNA내로 통합될 수도 있다. 일 구체예에 의하면, 세포 또는 생물에 자연적으로 나타나지 않는 하나 이상의 유전자는 이소프레노이드 경로, MVA경로 또는 MEP경로의 유전자이다. 또 다른 실시예에 의하면, 필수적 엽록체 유전자는 엽록체 기능, 광합성, 탄소 고정, 하나 또는 그 이상의 탄화수소의 생산, 또는 이들의 조합을 위하여 요구되는 것들이다.
본 발명은 생물을 엽록체 기능을 수행하기에 충분한 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계를 포함하는 생물의 변형 방법이다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법에 유용한 벡터는 상기 생물로부터의 화합물을 생산 또는 분비하기 위한 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 화합물은 이소프레노이드이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 상기 벡터는 모든 필수적 엽록체 유전자를 포함한다. 또한 다른 실시예에 의하면, 필수적 엽록체 유전자는 재배열되거나 돌연변이된다. 몇몇 구체예에 유용한 생물은 형질전환 이전에 엽록체 게놈을 필수적으로 포함하지 않는다.
또한, 본 발명의 또 다른 방법은 적어도 20 kb의 게놈 DNA 및 하나 또는 그 이상의 (ⅰ) 생물에서 자연적으로 나타나지 않는 유전자, (ⅱ) 상기 생물에서 자연적으로 나타나는 유전자의 결실, (ⅲ) 상기 생물에서 자연적으로 나타나는 유전자의 재배열, 및 (ⅳ) 상기 생물에서 자연적으로 나타나는 유전자의 돌연변이를 포함하는 벡터로 상기 생물을 형질전환하는 단계를 포함하는 생물로부터 생산물을 제조하는 방법이다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물은 원래 광합성적이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 추가적인 유전자는 이소프레노이드 경로, MVA 경로, 또는 MEP 경로에서 효소를 암호화한다. 또한, 다른 구체예에 의하면, 본 발명은 세포 또는 생물 내로 엽록체 및 모든 필수적 엽록체 유전자를 포함하는 벡터를 삽입하는 것을 포함하는 세포 또는 생물을 형질전환하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 하나 또는 그 이상의 필수적 엽록체 유전자를 포함하는 벡터를 제공하고, (b) 상기 벡터에 DNA 단편을 첨가하고, (c) 세포 또는 생물을 상기 (b)로부터 생산된 벡터로 형질전환하고, (d) 상기 첨가된 DNA 단편으로 엽록체 기능이 존재하는지를 결정하는 단계들을 포함하는 인공 엽록체 게놈을 생산하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에 의하면, 첨가된 DNA 단편은 이소프레노이드, MVA 또는 MEP 경로의 효소에 대한 하나 또는 그 이상의 코딩 영역을 포함한다.
또한, 본 발명은 엽록체 게놈을 포함하는 셔틀 벡터를 제공한다. 게놈은 변형될 수도 있다. 또한, 상기 발명은 분리된, 기능적인 엽록체 게놈을 포함하는 벡터이다. 이런 벡터에 유용한 엽록체 게놈은 변형될 수도 있다.
상술한 발명은 (a) 모든 필수적 엽록체 유전자를 포함하는 벡터를 제공하고, 그리고 (b) 상기 엽록체 게놈 기원인 DNA를 제거, 첨가, 돌연변이, 또는 재배열하는 단계들을 포함하는 인공 엽록체 게놈을 생산하는 방법을 더 제공한다. 이런 방법은 (c) 숙주 생물 내로 변형된 게놈을 형질전환시키고, 그리고 (d) 숙주 생물에서 엽록체 기능을 결정하는 단계들을 더 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 단계 (b), (c), 및 (d)는 반복된다. 또한, 그 밖의 실시예에 의하면, 엽록체 게놈은 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로부터 선택되는 생물로부터 기원한다. 그 밖의 실시예에 의하면, 숙주 생물은 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에 있어서, 상기 방법은 엽록체 게놈으로부터 반복적 DNA를 제거하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 그 밖의 구체예에 의하면, 벡터는 모든 또는 실질적으로 모든 엽록체 게놈을 포함한다. 본 발명에서 유용한 엽록체 게놈은 광합성 생물로부터 클로닝되거나, 합성 엽록체 게놈일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 벡터는 예컨대, 이소프레노이드 경로, MVA 경로, 또는 MEP 경로로부터의 유전자인 숙주 생물에서 자연적으로 나타나지 않는 유전자를 더 포함한다.
게다가, 본 발명의 또 다른 방법은 (a) 전체 엽록체 게놈을 포함하는 벡터를 제공하고, (b) 상기 전체 엽록체 게놈의 부분을 결실시키고, 그리고 (c) 상기 결실된 부분 없이 엽록체 기능이 존재하는지를 결정하는 단계들을 포함하는 인공 엽록체 게놈을 생산하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 일 측면에 의하면, 분리되고 기능적인 엽록체 게놈을 포함하는 조성물이 제공된다. 몇몇 실시예에 의하면, 조성물은 상기 엽록체 게놈에 변형을 포함한다.
본 발명은 적어도 약 10%의 엽록체 게놈을 포함하는 핵산, 및 벡터에서 하나 또는 그 이상의 핵산을 조작하는 것을 포함하는 생체 외 벡터이다. 몇몇 실시예에 의하면, 핵산은 비관다발성 광합성 생물 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로부터 클로닝된다. 몇몇 실시예에 의하면, 핵산은 합성적이다. 본 발명의 벡터는 발현 카세트를 더 포함할 수 있으며, 발현 카세트는 표적 DNA 내로 통합을 위한 영역을 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 표적 DNA는 세포소기관 DNA이다. 본 발명에서 유용한 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별 마커 예컨대, 영양요구 마커, 항생제 내성 마커, 엽록체 마커, 또는 이들의 조합물을 더 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 벡터 내에서 하나 또는 그 이상의 핵산 조작은 첨가, 결실, 돌연변이, 또는 재배열을 포함할 수 있다. 벡터의 발현은 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되지 않는 생산물의 생산 및/또는 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되는 생산물 증가로 결과일 수도 있다. 본 발명의 몇몇 생산물의 예로는 테르펜, 테르페노이드, 지방산, 또는 바이오매스 분해 효소를 포함한다.
또한, 본 발명은 적어도 약 20 kb의 엽록체 게놈을 포함하는 핵산, 및 상기 벡터에서 하나 또는 그 이상의 핵산을 조작하는 것을 포함하는 생체 외 벡터이다. 몇몇 실시예에 의하면, 핵산은 비관다발성 광합성 생물 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로부터 클로닝된다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 핵산은 합성이다. 본 발명의 벡터는 발현 카세트를 더 포함할 수 있으며, 발현 카세트는 표적 DNA 내로 통합을 위한 영역을 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 표적 DNA는 세포소기관 DNA이다. 본 발명에서 유용한 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별 마커 예컨대, 영양요구 마커, 항생제 내성 마커, 엽록체 마커, 또는 이들의 조합물을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 벡터 내 하나 또는 그 이상 핵산 조작은 첨가, 결실, 돌연변이, 또는 재배열일 수 있다. 벡터의 발현은 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되지 않는 생산물 및/또는 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되는 생산물의 생산 증가로 결과될 수 있다. 본 발명의 몇몇 생산물의 예로는 테르펜, 테르페노이드, 지방산 또는 바이오매스 분해 효소를 포함한다.
본 발명은 게놈 단편을 포함하는 두 개 또는 그 이상의 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 벡터들을 적어도 약 90%의 게놈을 포함하는 단일 벡터 내로 재조합하는 것을 포함하는 재축조된 게놈을 포함하는 벡터를 생산하는 방법이다. 몇몇 실시예에 의하면, 숙주 세포는 진핵생물성 예컨대, 효모이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 게놈은 세포소기관 게놈이다. 세포소기관은 엽록체 예컨대, 조류 엽록체, 특히 Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스 등과 같은 미세 조류일 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 둘 이상의 벡터는 선별가능 마커를 포함한다. 그 밖의 실시예에 의하면, 적어도 하나의 상기 단편은 합성적이다. 또한, 게놈의 부분을 변형시키는 것을 더 포함하는 단계는 본 방법에서 유용하다. 이러한 변형은 첨가, 결실, 돌연변이, 또는 재배열을 포함할 수 있다. 다른 실시예에 의하면, 변형은 테르펜, 테르페노이드, 지방산 또는 바이오매스 분해 효소의 생산 또는 증가된 생산으로 결과되는 외래성 핵산의 첨가이다.
참고문헌에 의한 통합
본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 각각 개별적인 문헌 또는 특허출원이 참고문헌으로 통합되는 것으로 특별하고 개별적으로 지시되는 것과 동일하게 참고문헌으로 본 발명에 통합된다.
본 발명의 새로운 특징은 부가된 청구항에서 자세히 설명한다. 본 발명의 특징 및 장점을 더 잘 이해하는 것은 본 발명의 원리를 이용하는 실례가 되는 구체예 및 동반된 도면에서 제시된 다음의 상세한 설명을 참조하여 얻을 수 있다.
도면에서, 다음 약어가 사용된다: HIS3: 효모 HIS3 유전자; TRP1: 효모 TRP1 유전자; URA3: 효모 URA3 유전자; ADE2: 효모 ADE2 유전자; LYS2: 효모 LYS2 유전자; TEL: 효모 텔로미어; CEN: 효모 센트로미어; ARS: 자가 복제 서열, 효모 복제 원점; 5FOA: 5-플루오로오트산; Kan: 카나마이신 저항성 유전자; P1 플라스미드 레플리콘: P1 플라스미드 레플리콘; p1 용균 레플리콘: p1 용균 레플리콘.
도 1은 본 발명의 잡종 벡터의 일반적인 기술을 제공한다. 도 1a) 벡터 개략도. 도 1b) DNA 생물 사이에 셔틀링.
도 2는 잡종 벡터의 구조를 개략적으로 나타낸다.
도 3은 엽록체 게놈 DNA에서 통합 부위를 개략적으로 나타낸다. 원으로 둘러싸인 숫자는 변형을 위한 표적 부위를 가리킨다. 네모 박스는 잡종 갭-필링 벡터에 의해 표적화된 부위를 가리킨다.
도 4의 a, b, 및 c는 변형 및/또는 안정화를 위한 선별 가능 마커의 개략적인 도면이다.
도 5는 엽록체 게놈 DNA 내로 잡종 벡터의 도입을 위한 개략적인 도면이다.
도 6은 조류에서 잡종 벡터(및 안정화 벡터)의 통합을 나타내는 PCR 데이터이다.
도 7은 포획된 DNA의 분석을 나타낸다. 도 7a) 엽록체를 함유하는 분리된 벡터의 EcoRI으로의 제한 절단(L, 사다리; C, 부 잡종 벡터; 1, 클론 1; 및 2; 클론 2). 도 7b) 효모를 통과된 클론 1의 분리물의 EcoRI으로의 제한 절단(L, 사다리; C 1, 클론 1; 및 A-M, 효모 분리물). 도 7c) 클론 1과 2의 EcoRI으로의 절단 및 C. 레인하르티로부터의 방사성 HindIII-절단된 총 DNA로 탐침된 서던 분석.
도 8a 및 b는 엽록체 게놈 DNA를 포함하는 분리된 체외 벡터의 구조를 나타내는 개략적인 도면이다.
도 9는 다양한 선택 상황에서 부 조류 세포 및 형질 전환된 조류 세포의 성장을 나타낸다.
도 10은 조작 벡터에 대한 제한 분석의 개략적인 도면이다. 도 10a)는 벡터 구조의 개략도이다. 도 10b)는 EcoRI으로 제한 분석된 변형된 벡터의 분석.
도 11은 바이오매스 분해 효소를 생산하기 위한 엽록체 변형을 나타낸다. 도 11a)은 분리된 형질전환체의 PCR 스크리닝을 나타낸다. 도 11b)는 분리된 형질전환체로부터의 엔도자일라나아제 활성을 나타낸다.
도 12는 위치 3(도 12a) 또는 위치 4(도 12b)로 표적된 FPP 합성효소 발현 카세트를 갖는 이소프레노이드를 생산하기 위하여 변형된 분리된 형질전환체의 PCR 스크리닝을 나타낸다.
도 13은 효모에서 재조합을 이용한 부분적 엽록체 게놈의 포획을 나타내는 개략적인 도면이다.
도 14는 효모에서 재조합을 이용한 전체 엽록체 게놈의 포획을 나타내는 개략적인 도면이다.
도 15는 효모에서 재조합을 이용한 전체 엽록체 게놈의 재조합을 나타내는 개략적인 도면이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 바람직한 구체예를 제시하고 설명되지만, 이들 구체예는 당업자에게 실시예의 방법으로 제공된다는 것이 명백할 것이다. 본 발명 범위를 벗어나기 않는 한 당업자는 다수의 변형, 변화 및 치환이 가능하다. 상술한 발명의 구체예에 다양한 선택은 본 발명을 수행하는데 사용될 수도 있다. 본 발명은 본 발명의 범위로 정의되는 다음의 청구항 및 이들 청구항 범위의 방법, 구조 및 이에 의해 커버되는 동일 범위를 의도한다.
본 발명에서 사용되는 기술적 과학적 용어는 본 발명과 관련되는 당업자에 의해 흔히 이해되는 의미를 말한다. 당업자에게 알려진 다양한 물질 및 방법론은 본 발명에서 참조된다. 재조합 DNA 기술의 일반적인 원리를 제시하는 표준 참고 문헌은 Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y., 1989; Kaufman et al., eds., "Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine", CRC Press, Boca Raton, 1995; 및 McPherson, ed., "Directed Mutagenesis: A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1991를 포함한다. 본 발명의 선택된 관점에 유용한 효모 유전학의 일반적인 방법론 및 원리를 제시하는 표준 참고 문헌은 Sherman et al. "Laboratory Course Manual Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986 및 Guthrie et al., "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", Academic, New York, 1991을 포함한다.
당업자에게 알려진 어떤 적합한 물질 및/또는 방법은 발명을 즉시 수행하는데 이용될 수 있다. 본 발명을 수행하기 위한 물질 및/또는 방법은 상술된다. 물질, 시약 등 참조는 다음에서 상술하고 실시예는 상업적 출처로부터 얻어지며, 그렇지 않다면 언급하지 않는다. 본 발명은 다수 조각의 DNA를 캡처하고 변형하기 위한 방법 및 도구를 알려준다. 본 발명은 생물, 세포소기관 또는 이들의 부분의 전체 게놈을 포함하는 게놈 DNA를 변형하는데 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 새로운 선구적 사용이 상술된다. 본 발명은 거대 핵산의 조작 및 전달과 관련된다. 본 발명은 재조합 클론 벡터 및 시스템 및 이를 이용한 방법과 관련된다.
유전자 조작 게놈(예컨대, 엽록체 게놈)에 대한 현재 방법은 시간 집중(> 1달)이며, 한번에 제한되는 횟수의 조작만을 허용한다. 표적 게놈에 다수의 변형을 요구한다면, 그 공정은 반복되어야 하며, 바람직한 유형을 발생시키기 위해 요구되는 시간이 더 증가한다. 대사공학 및/또는 합성 생물학은 게놈에 많은 변형을 요구하기 때문에 이들 기술은 게놈 변형에 빠르게 도입되지 않는다. 따라서, 짧은 시간에 엽록체 게놈의 다수 변형을 허용하는 새로운 기술을 엽록체 게놈을 대사 공학 및/또는 합성 생물학에 적용하게 될 것이다. 여기에 개시된 발명이 이런 기술을 상술한다.
본 발명은 표적 세포 및 세포소기관(예컨대, 엽록체)으로부터 거대 핵산의 포획, 클로닝 및 조작에 다각적, 재조합적 접근을 제공한다. 본 발명의 일 측면은 재조합 클로닝 시스템을 제공한다는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 몇몇 구체예에서 상동 재조합 기술에 의존하여 거대 핵산 단편의 분리 및 조작을 가능하게 한다. 본 발명의 또 다른 측면은 클론에 이러한 재조합 클로닝 벡터를 이용하는 방법을 제공하고 표적 세포 및/또는 엽록체 등과 같은 세포소기관에 거대 핵산을 조작 및 전달하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에 있어서, 상동성 재조합은 시험관 내에서 수행된다. 본 발명의 보다 바람직한 구체예에 있어서, 상동성 재조합은 생체 내 수행된다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 상동성 재조합은 조류 세포에서 발생한다. 또 다른 보다 바람직한 구체예에 있어서, 상동성 재조합은 효모 세포에서 발생한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상동 재조합은 사카로마이세스 세르비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 사카로마이세스 폼베(S. pombe)에서 발생한다. 효모에서, 효율적인 재조합 공정의 조합 및 많은 선택적 마커의 효용은 표적 DNA 서열의 빠르고 복잡한 기술에 제공된다. 일단 모든 변형이 엽록체 게놈 DNA을 포함하는 체외 벡터에서 이루어지면, 전체 벡터는 단일 형질 전환 단계에서 엽록체 내로 도입될 수 있다. 따라서, 이용된 효모 기술은 엽록체 게놈에 대사 공학 및/또는 합성 생물학을 적용할 수 있다. 본 발명의 일 측면은 효모 성분, 세균성 복제 원점, 및 적어도 20kb 게놈 DNA를 포함하는 분리된 벡터를 제공한다. 몇몇 벡터에서, 효모 성분은 효모 센트로미어, 효모 자가 복제 서열 또는 이들의 조합물이다. 상기 DNA는 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스인 비관다발 광합성 생물로부터 기원할 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 게놈 DNA는 예컨대, 이종 또는 동종 폴리뉴클레오티드의 삽입, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 결실, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 변이, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 재배열, 또는 이들의 조합에 의해 변형된다. 몇몇 실시예에서, 상기 변형은 합성이다. 본 발명의 벡터가 숙주 세포 내에서 형질전환하는 경우, 숙주 세포에 의해 자연적으로 생산되는 것이 아닌 생산물을 생산하는 결과일 수도 있다. 이러한 생산물의 몇몇 실시예는 바이오매스-분해 효소, 지방산, 테르펜 또는 테르페노이드인를 포함한다. 몇몇 숙주 세포에서, 벡터의 발현은 예컨대, 바이오매스-분해 효소, 테르펜 또는 테르페노이드인 상기 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산된 생산물의 증가 생산의 결과이다. 본 발명의 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택 마커 예컨대, 효모 마커, 효모 항생제 저항 마커, 세균성 마커, 세균성 항생제 저항 마커, 조류 마커, 조류 항생제 저항 마커 또는 이들의 조합을 더 포함할 수도 있다. 또한 본 발명의 벡터는 1) 1-200 유전자; 2) 필수적인 모든 엽록체 유전자; 및/또는 3) 30-400 kb를 포함하는 엽록체 게놈 DNA를 포함할 수도 있다.
또한 여기에 상술한 바는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 예시적인 숙주 세포는 원래 비광합성 또는 광합성일 수도 있으며, 예컨대, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 대장균(Escherichia coli), 미세조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 벡터를 생산하는 방법은 표적 DNA을 효모 센트로미어, 효모 자가 복제 서열, 및 세균 복제 원점인 벡터 내로 삽입하고, 생물을 상기 벡터로 형질전환시키고, 엽록체 게놈의 부분을 포획함으로써 상기 엽록체 게놈의 부분을 갖는 벡터를 생산하는 것과 관련되는 방법이 제공된다. 몇몇 실시예에 의하면, 표적 DNA는 엽록체 게놈 DNA이다. 상기 방법은 10-400 kb 길이의 게놈 부분을 포획하는데 이용될 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 표획 단계는 제조합으로 나타난다. 엽록체 게놈의 포획된 부분은 벡터를 갖는 생물로 동시 형질 전환될 수 있으며, 따라서 재조합 단계는 생체 내에서 나타날 수 있다. 상술한 실용적인 방법을 이용하는 생물은 진핵생물 및/또는 광합성 생물일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물은 비관다발 광합성 생물, 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스이다. 또한, 상술한 실용적인 방법을 이용하는 생물은 비광합성 생물, 예컨대, 효모일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 비광합성 생물은 외래성 엽록체 DNA를 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 엽록체 게놈 부분을 변형하는 추가적인 단계가 이용된다. 변형은 상동성 재조합을 통해서 이루어질 수도 있다. 이러한 재조합은 생물 예컨대, 진핵 및/또는 광합성 생물에서 나타날 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물은 비관다발성 광합성 생물 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 생물은 비광합성 예컨대, 효모일 수도 있다. 변형 단계를 포함하는 구체예에 의하면, 상기 단계는 폴리뉴클레오티드의 첨가, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 결실, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 돌연변이, 재배열 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다.
상술한 발명은 필수적 엽록체 유전자, 선별가능 마커 및 벡터에서 하나 또는 그 이상의 핵산의 조작을 포함하는 분리된 벡터이다. 몇몇 실시예에 의하면, 필수적 엽록체 유전자는 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스 등과 같은 비관다발성 광합성 생물로부터 클론화된다. 상술한 벡터에서 사용하기 위한 필수적 엽록체 유전자는 합성일 수도 있다. 상술한 벡터는 표적 DNA 예컨대, 세포소기관 DNA로의 통합을 위한 영역을 더 포함하는 발현 카세트를 더 포함할 수도 있다. 또한, 상술한 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별 마커 예컨대, 영양요구 마커, 항생제 내성 마커, 엽록체 마커, 또는 이들의 조합물을 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면,필수적 엽록체 유전자는 엽록체 기능, 광합성, 탄소 고정, 하나 또는 그 이상의 탄화수소의 생성, 또는 이들의 조합을 위하여 요구되는 것이다. 필수적 엽록체 유전자는 최대 200 유전자를 포함 및/또는 최대 400kb로 이루어질 수 있다. 상술한 몇몇 벡터에 있어서, 하나 또는 그 이상의 핵산 조작은 첨가, 결실, 돌연 변이 또는 재배열을 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 숙주 세포에서 벡터의 발현은 상기 숙주 세포에서 자연적으로 생산되지 않는 생산물을 생산한다. 그 밖의 실시예에 의하면, 본 발명의 벡터의 발현은 상기 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산된 생산물이 생산을 증가시키는 결과를 나타낸다. 상기 생산물의 예로는 바이오매스 분해 효소, 지방산, 테르펜 또는 테르페노이드이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 측면은 본 발명의 벡터를 포함하는 분리된 엽록체이다. 또 다른 측면에 의하면, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명에서 이용되는 숙주 세포는 원래 비광합성 또는 광합성 생물일 수도 있다. 본 발명에 이용되는 생물의 예로는 효모, 대장균, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 세포 또는 생물을 형질 전환하기 위한 방법은 필수적인 모든 엽록체 유전자 및 선택적으로 세포 또는 생물에서 자연적으로 생기지 않는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 벡터를 상기 세포 또는 생물 내로 삽입하는 것을 포함하는 방법으로 제공된다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법은 상기 세포 또는 생물의 실질적으로 모든 엽록체 게놈을 제거시키는 단계를 더 포함한다. 상기 방법에 유용한 세포 또는 생물은 광합성적, 비광합성 및/또는 진핵성일 수도 있다. 상기 방법에 유용한 세포 또는 생물은 비관다발성일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 또한 상기 방법에 이용하기 위한 벡터는 발현 카세트 일 수도 있으며, 상기 발현 카세트는 비-핵(non-nuclear)DNA 내로 통합될 수도 있다. 일 구체예에 의하면, 세포 또는 생물에 자연적으로 나타나지 않는 하나 이상의 유전자는 이소프레노이드 경로, MVA 경로 또는 MEP 경로의 유전자이다. 또 다른 실시예에 의하면, 필수적 엽록체 유전자는 엽록체 기능, 광합성, 탄소 고정, 하나 또는 그 이상의 탄화수소의 생산, 또는 이들의 조합을 위하여 요구되는 것들이다.
본 발명은 생물을 엽록체 기능을 수행하기에 충분한 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환하는 단계를 포함하는 생물의 변형 방법이다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 방법에 유용한 벡터는 상기 생물로부터의 화합물을 생산 또는 분비하기 위한 서열을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 화합물은 이소프레노이드이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 상기 벡터는 모든 필수적 엽록체 유전자를 포함한다. 또한 다른 실시예에 의하면, 필수적 엽록체 유전자는 재배열되거나 돌연변이된다. 몇몇 구체예에 유용한 생물은 형질전환 이전에 엽록체 게놈을 필수적으로 포함하지 않는다.
또한, 본 발명의 또 다른 방법은 적어도 20 kb의 게놈 DNA 및 하나 또는 그 이상의 (ⅰ) 생물에서 자연적으로 나타나지 않는 유전자, (ⅱ) 상기 생물에서 자연적으로 나타나는 유전자의 결실, (ⅲ) 상기 생물에서 자연적으로 나타나는 유전자의 재배열, 및 (ⅳ) 상기 생물에서 자연적으로 나타나는 유전자의 돌연변이를 포함하는 벡터로 상기 생물을 형질전환하는 단계를 포함하는 생물로부터 생산물을 제조하는 방법이다. 몇몇 실시예에 의하면, 생물은 원래 광합성적이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 추가적인 유전자는 이소프레노이드 경로, MVA 경로, 또는 MEP 경로에서 효소를 암호화한다. 또한, 다른 구체예에 의하면, 본 발명은 세포 또는 생물 내로 엽록체 및 모든 필수적 엽록체 유전자를 포함하는 벡터를 삽입하는 것을 포함하는 세포 또는 생물을 형질전환하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 하나 또는 그 이상의 필수적 엽록체 유전자를 포함하는 벡터를 제공하고, (b) 상기 벡터에 DNA 단편을 첨가하고, (c) 세포 또는 생물을 상기 (b)로부터 생산된 벡터로 형질전환하고, (d) 상기 첨가된 DNA 단편으로 엽록체 기능이 존재하는지를 결정하는 단계들을 포함하는 인공 엽록체 게놈을 생산하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에 의하면, 첨가된 DNA 단편은 이소프레노이드, MVA 또는 MEP 경로의 효소에 대한 하나 또는 그 이상의 코딩 영역을 포함한다.
또한, 본 발명은 엽록체 게놈을 포함하는 셔틀 벡터를 제공한다. 게놈은 변형될 수도 있다. 또한, 상기 발명은 분리된, 기능적인 엽록체 게놈을 포함하는 벡터이다. 이런 벡터에 유용한 엽록체 게놈은 변형될 수도 있다.
상술한 발명은 (a) 모든 필수적 엽록체 유전자를 포함하는 벡터를 제공하고, 그리고 (b) 상기 엽록체 게놈 기원인 DNA를 제거, 첨가, 돌연변이, 또는 재배열하는 단계들을 포함하는 인공 엽록체 게놈을 생산하는 방법을 더 제공한다. 이런 방법은 (c) 숙주 생물 내로 변형된 게놈을 형질전환시키고, 그리고 (d) 숙주 생물에서 엽록체 기능을 결정하는 단계들을 더 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 단계 (b), (c), 및 (d)는 반복된다. 또한, 그 밖의 실시예에 의하면, 엽록체 게놈은 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로부터 선택되는 생물로부터 기원한다. 그 밖의 실시예에 의하면, 숙주 생물은 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에 있어서, 상기 방법은 엽록체 게놈으로부터 반복적 DNA를 제거하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 그 밖의 구체예에 의하면, 벡터는 모든 또는 실질적으로 모든 엽록체 게놈을 포함한다. 본 발명에서 유용한 엽록체 게놈은 광합성 생물로부터 클로닝되거나, 합성 엽록체 게놈일 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 벡터는 예컨대, 이소프레노이드 경로, MVA 경로, 또는 MEP 경로로부터의 유전자인 숙주 생물에서 자연적으로 나타나지 않는 유전자를 더 포함한다.
게다가, 본 발명의 또 다른 방법은 (a) 전체 엽록체 게놈을 포함하는 벡터를 제공하고, (b) 상기 전체 엽록체 게놈의 부분을 결실시키고, 그리고 (c) 상기 결실된 부분 없이 엽록체 기능이 존재하는지를 결정하는 단계들을 포함하는 인공 엽록체 게놈을 생산하는 방법이다. 본 발명의 또 다른 일 측면에 의하면, 분리되고 기능적인 엽록체 게놈을 포함하는 조성물이 제공된다. 몇몇 실시예에 의하면, 조성물은 상기 엽록체 게놈에 변형을 포함한다.
본 발명은 적어도 약 10%의 엽록체 게놈을 포함하는 핵산, 및 벡터에서 하나 또는 그 이상의 핵산을 조작하는 것을 포함하는 생체 외 벡터이다. 몇몇 실시예에 의하면, 핵산은 비관다발성 광합성 생물 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로부터 클로닝된다. 몇몇 실시예에 의하면, 핵산은 합성적이다. 본 발명의 벡터는 발현 카세트를 더 포함할 수 있으며, 발현 카세트는 표적 DNA 내로 통합을 위한 영역을 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 표적 DNA는 세포소기관 DNA이다. 본 발명에서 유용한 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별 마커 예컨대, 영양요구 마커, 항생제 내성 마커, 엽록체 마커, 또는 이들의 조합물을 더 포함할 수도 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 벡터 내에서 하나 또는 그 이상의 핵산 조작은 첨가, 결실, 돌연변이, 또는 재배열을 포함할 수 있다. 벡터의 발현은 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되지 않는 생산물의 생산 및/또는 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되는 생산물 증가로 결과일 수도 있다. 본 발명의 몇몇 생산물의 예로는 테르펜, 테르페노이드, 지방산, 또는 바이오매스 분해 효소를 포함한다.
또한, 본 발명은 적어도 약 20 kb의 엽록체 게놈을 포함하는 핵산, 및 상기 벡터에서 하나 또는 그 이상의 핵산을 조작하는 것을 포함하는 생체 외 벡터이다. 몇몇 실시예에 의하면, 핵산은 비관다발성 광합성 생물 예컨대, 거대 조류, 미세 조류, Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스로부터 클로닝된다. 몇몇 실시예에 의하면, 상기 핵산은 합성이다. 본 발명의 벡터는 발현 카세트를 더 포함할 수 있으며, 발현 카세트는 표적 DNA 내로 통합을 위한 영역을 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 표적 DNA는 세포소기관 DNA이다. 본 발명에서 유용한 벡터는 하나 또는 그 이상의 선별 마커 예컨대, 영양요구 마커, 항생제 내성 마커, 엽록체 마커, 또는 이들의 조합물을 더 포함한다. 몇몇 실시예에 의하면, 벡터 내 하나 또는 그 이상 핵산 조작은 첨가, 결실, 돌연변이, 또는 재배열일 수 있다. 벡터의 발현은 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되지 않는 생산물 및/또는 숙주 세포에 의하여 자연적으로 생산되는 생산물의 생산 증가로 결과될 수 있다. 본 발명의 몇몇 생산물의 예로는 테르펜, 테르페노이드, 지방산 또는 바이오매스 분해 효소를 포함한다.
본 발명은 게놈 단편을 포함하는 두 개 또는 그 이상의 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 벡터들을 적어도 약 90%의 게놈을 포함하는 단일 벡터 내로 재조합하는 것을 포함하는 재축조된 게놈을 포함하는 벡터를 생산하는 방법이다. 몇몇 실시예에 의하면, 숙주 세포는 진핵생물성 예컨대, 효모이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 게놈은 세포소기관 게놈이다. 세포소기관은 엽록체 예컨대, 조류 엽록체, 특히 Ch. 불가리스, C. 레인하르티, D. 살리나, S. 콰드리칸다 또는 H. 플루발리스 등과 같은 미세 조류일 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 둘 이상의 벡터는 선별가능 마커를 포함한다. 그 밖의 실시예에 의하면, 적어도 하나의 상기 단편은 합성적이다. 또한, 게놈의 부분을 변형시키는 것을 더 포함하는 단계는 본 방법에서 유용하다. 이러한 변형은 첨가, 결실, 돌연변이, 또는 재배열을 포함할 수 있다. 다른 실시예에 의하면, 변형은 테르펜, 테르페노이드, 지방산 또는 바이오매스 분해 효소의 생산 또는 증가된 생산으로 결과되는 외래성 핵산의 첨가이다.
거대 DNA 클로닝 및 구성
본 발명의 장점은 클로닝, 조작 및 최대 모든 엽록체 유전자 (또는 서열)을 구성하는 엽록체 게놈을 포함하는 벡터의 전달을 제공한다는 점이다. 벡터에 포함된 엽록체 게놈 DNA는 하나의 연속적인 단편의 DNA를 갖는 잡종 클로닝 벡터를 재조합하거나, 둘 이상의 연속적인 단편의 DNA의 재조합에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 미토콘드리아 DNA 또는 플라스미스 DNA 등과 같은 세포소기관으로부터 DNA를 포함하는 포획 및/또는 변형된 거대 조각 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 포획 및/또는 변형된 거대 조각 DNA는 전체 세포소기관의 게놈 예컨대, 엽록체 게놈으로 이루어질 수 있다. 그 밖의 실시예에 의하면, 포획 및/또는 변형된 거대 조각 DNA는 엽록체 게놈의 일부분을 이룰 수 있다. 엽록체 게놈은 임의의 관다발 또는 조류 선태류(예컨대, 이끼류, 양치류)를 포함하는 비관다발 식물, 겉씨 식물 (예컨대, 구과 식물) 및 속씨 식물 (예컨대, 꽃 식물- 나무, 잔디, 허브, 관목)으로부터 기원할 수도 있다. 엽록체 게놈, 또는 이들의 필수적 부분은 합성 DNA, 재배열 DNA, 결실, 첨가 및/또는 돌연 변이로 이루어질 수도 있다. 엽록체 게놈, 또는 이들의 부분은 하나 이상의 결실, 첨가, 돌연 변이 및/또는 재배열을 포함할 수 있다 결실, 첨가, 돌연 변이 및/또는 재배열은 예컨대, 자연적으로 돌연변이가 발생하는 생물에서 발견되거나, 또는 자연에서 자연적으로 발생하지 않을 수도 있다. 몇몇 생물의 엽록체 또는 플라스미드 게놈은 예컨대, http://www. ncbi. nlm. nih.gov/genomes/static/euk_o.html에서 이용가능한 NCBL Organelle Genomes section의 공공 데이터 베이스에서 다양하게 이용가능하다.
본 발명의 표적 DNA 서열은 조절 서열 (자연적으로 나타나는 서열)과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5 결실, 첨가, 돌연 변이 및/또는 재배열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 돌연 변이는 기능적 또는 비기능적일 수도 있다. 예컨대, 돌연변이 없는 조절 세포와 비교하여 숙주 세포에 돌연변이가 현존하는 경우, 기능적 돌연 변이는 세포 기능에 영향을 미칠 수도 있다. 비기능적 돌연 변이는 예컨대, 돌연 변이를 갖는 세포와 비교하여 돌연변이 없는 숙주 세포의 표현형의 식별할 수 있는 차이가 없다면, 기능면에서 나타나지 않을 수 있다.
포획 및/또는 변형된 거대 조각의 DNA (예컨대, 표적 DNA)는 최소값 또는 최소화된 엽록체 게놈 (예컨대, 엽록체 기능을 위해 요구되는 최소의 유전자 및/또는 DNA 단편)을 포함할 수 있다. 포획 및/또는 변형된 DNA는 필수적 엽록체 유전자를 포함할 수 있고, 이는 부분 또는 전체 또는 실질적으로 모든 필수적 엽록체 유전자를 포함할 수 있다. 필수적 유전자는 하나 이상의 물질 대사 과정 또는 생화학적 경로에서 필수적인 유전자 일 수도 있다. 또한, 필수적 유전자는 전사, 번역 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 다른 공정 등과 같은 유전자 발현에서 필수적인 유전자일 수도 있다. 필수적 유전자는 돌연 변이 또는 재배열을 이룰 수도 있다. 또한, 필수적 유전자는 기능을 수행하기 위해 최소의 기능을 갖는 유전자 세트로 이루어질 수 있다. 예컨대, 특수한 기능 (예컨대, 광합성)은 일련의 유전자/유전자 생산물에 의해 비효율적으로 수행될 수 있다. 반면, 이들 세트는 기능이 수행되기 때문에 필수적 유전자를 포함할 수 있다.
변형된 DNA는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 또는 50 필수적 유전자를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, DNA는 길이가 최대 150kb의 필수적 엽록체 게놈 서열을 포함할 수 있다. DNA는 한 가닥 또는 두 가닥, 직선 또는 원형, 릴렉스 또는 슈퍼코일일 수도 있다. 또한, DNA는 발현 카세트의 형식일 수도 있다. 예컨대, 발현 카세트는 숙주 세포에서 발현되도록 필수적 유전자를 포함될 수 있다. 발현 카세트는 필수적 유전자의 발현을 촉진시키는 DNA 서열뿐만 아니라 하나 이상의 필수적 유전자를 포함할 수 있다. 또한 발현 카세트는 숙주의 표적 DNA에 통합을 위한 영역을 포함할 수 있다. 또한, 발현 카세트는 하나 이상의 필수적 유전자를 포함할 수 있으며, 하나 이상의 유전자는 상기 발현 카세트로 이루어진 숙주 세포에서 자연적으로 나타나지 않는다. 이 분야에서 일반적인 기술 중 하나는 발현 카세트의 전술한 측면의 다양한 재조합을 용이하게 확인할 것이다.
그 밖의 실시예에 의하면, 포획 및/또는 변형된 DNA 조각은 플라스미드 또는 세포소기관의 전체 게놈을 포함할 수 있다. 예컨대, 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 플라스미드 게놈, 또는 그 이상. 일 실시예에 의하면, 포획 및/또는 변형된 라지 조각의 DNA는 플라스미드 또는 세포의 전체 게놈의 10-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 또는 90-100%를 포함할 수 있다.
또한, 다른 실시예에 의하면, 포획 및/또는 변형된 거대 조각의 DNA는 약 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 20 kb, 21 kb, 22 kb, 23 kb, 24 kb, 25 kb, 26 kb, 27 kb, 28 kb, 29 kb, 30 kb, 31 kb, 32 kb, 33 kb, 34 kb, 35 kb, 36 kb, 37 kb, 38 kb, 39 kb, 40 kb, 41 kb, 42 kb, 43 kb, 44 kb, 45 kb, 46 kb, 47 kb, 48 kb, 49 kb, 50 kb, 51 kb, 52 kb, 53 kb, 54 kb, 55 kb, 56 kb, 57 kb, 58 kb, 59 kb, 60 kb, 61 kb, 62 kb, 63 kb, 64 kb, 65 kb, 66 kb, 67 kb, 68 kb, 69 kb, 70 kb, 71 kb, 72 kb, 73 kb, 74 kb, 75 kb, 76 kb, 77 kb, 78 kb, 79 kb, 80 kb, 81 kb, 82 kb, 83 kb, 84 kb, 85 kb, 86 kb, 87 kb, 88 kb, 89 kb, 90 kb, 91 kb, 92 kb, 93 kb, 94 kb, 95 kb, 96 kb, 97 kb, 98 kb, 99 kb, 100 kb, 101 kb, 102 kb, 103 kb, 104 kb, 105 kb, 106 kb, 107 kb, 108 kb, 109 kb, 110 kb, 111 kb, 112 kb, 113 kb, 114 kb, 115 kb, 116 kb, 117 kb, 118 kb, 119 kb, 120 kb, 121 kb,122 kb, 123 kb, 124 kb, 125 kb, 126 kb, 127 kb, 128 kb, 129 kb, 130 kb, 131 kb, 132 kb, 133 kb, 134 kb, 135 kb, 136 kb, 137 kb, 138 kb, 139 kb, 140 kb, 141 kb, 142 kb, 143 kb, 144 kb, 145 kb, 146 kb, 147 kb, 148 kb, 149 kb, 150 kb, 151 kb, 152 kb, 153 kb, 154 kb, 155 kb, 156 kb, 157 kb, 158 kb, 159 kb, 160 kb, 161 kb, 162 kb, 163 kb, 164 kb, 165 kb, 166 kb, 167 kb, 168 kb, 169 kb, 170 kb, 171 kb, 172 kb, 173 kb, 174 kb, 175 kb, 176 kb, 177 kb, 178 kb, 179 kb, 180 kb, 181 kb, 182 kb, 183 kb, 184 kb, 185 kb, 186 kb, 187 kb, 188 kb, 189 kb, 190 kb, 191 kb, 192 kb, 193 kb, 194 kb, 195 kb, 196 kb, 197 kb, 198 kb, 199 kb, 200 kb, 201 kb, 202 kb, 203 kb, 204 kb, 205 kb, 206 kb, 207 kb, 208 kb, 209 kb, 210 kb, 211 kb, 212 kb, 213 kb, 214 kb, 215 kb, 216 kb, 217 kb, 218 kb, 219 kb, 220 kb, 221 kb, 222 kb, 223 kb, 224 kb, 225 kb, 226 kb, 227 kb, 228 kb, 229 kb, 230 kb, 231 kb, 232 kb, 233 kb, 234 kb, 235 kb, 236 kb, 237 kb, 238 kb, 239 kb, 240 kb, 241 kb, 242 kb, 243 kb, 244 kb, 245 kb, 246 kb, 247 kb, 248 kb, 249 kb, 50 kb, 51 kb, 252 kb, 253 kb, 254 kb, 255 kb, 256 kb, 257 kb, 258 kb, 259 kb, 260 kb, 261 kb, 262 kb, 263 kb, 264 kb, 265 kb, 266 kb, 267 kb, 268 kb, 269 kb, 270 kb, 271 kb, 272 kb, 273 kb, 274 kb, 275 kb, 276 kb, 277 kb, 278 kb, 279 kb, 280 kb, 281 kb, 282 kb, 283 kb, 284 kb, 285 kb, 286 kb, 287 kb, 288 kb, 289 kb, 290 kb, 291 kb, 292 kb, 293 kb, 294 kb, 295 kb, 296 kb, 297 kb, 298 kb, 299 kb, 300 kb, 301 kb, 302 kb, 303 kb, 304 kb, 305 kb, 306 kb, 307 kb, 308 kb, 309 kb, 310 kb, 311 kb, 312 kb, 313 kb, 314 kb, 315 kb, 316 kb, 317 kb, 318 kb, 319 kb, 320 kb, 321 kb, 322 kb, 323 kb, 324 kb, 325 kb, 326 kb, 327 kb, 328 kb, 329 kb, 330 kb, 331 kb, 332 kb, 333 kb, 334 kb, 335 kb, 336 kb, 337 kb, 338 kb, 339 kb, 340 kb, 341 kb, 342 kb, 343 kb, 344 kb, 345 kb, 346 kb, 347 kb, 348 kb, 349 kb, 350 kb, 351 kb, 352 kb, 353 kb, 354 kb, 355 kb, 356 kb, 357 kb, 358 kb, 359 kb, 360 kb, 361 kb, 362 kb, 363 kb, 364 kb, 365 kb, 366 kb, 367 kb, 368 kb, 369 kb, 370 kb, 371 kb, 372 kb, 373 kb, 374 kb, 375 kb, 376 kb, 377 kb, 378 kb, 379 kb, 380 kb, 381 kb, 382 kb, 383 kb, 384 kb, 385 kb, 386 kb, 387 kb, 388 kb, 389 kb, 390 kb, 391 kb, 392 kb, 393 kb, 394 kb, 395 kb, 396 kb, 397 kb, 398 kb, 399 kb, 400 kb 또는 그 이상의 게놈 (예컨대, 핵 또는 세포소기관) DNA를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 포획 및/또는 변형된 거대 조각의 DNA는 약 10-400 kb, 50-350 kb, 100-300 kb, 100-200 kb, 200-300 kb, 150-200 kb, 200-250 kb 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
또한, 그 밖의 실시예에 의하면, 포획 및/또는 변형된 거대 조작의 DNA는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182,1 83, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 50, 51, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 부분 오픈 리딩 프레임, 비발현 유전자 및/또는 반복 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 카세트 엽록체 게놈 또는 이들의 부분 (예컨대, 엽록체 게놈 또는 이들의 기능적 부분으로 이루어진 제거 가능한 DNA 단편)을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 기능적 엽록체 단위 (예컨대, 물질 대사 과정에서 필수적인 단위, 광합성, 유전자 발현, 광시스템 Ⅰ, 광시스템 Ⅱ)를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 이식가능한 엽록체 게놈 또는 이들의 부분을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 전사가능한 엽록체 게놈 또는 이들의 부분을 포함할 수 있다. 그 밖의 실시예에 의하면, 벡터는 1) 하나 또는 그 이상의 거대 조각의 변형된 DNA, 2) 광합성을 수행하기 위해 필수적인 모든 유전자, 3) 엽록체 생존 및/또는 기능을 위해 요구되는 모든 유전자, 4) 필수적인 엽록체 유전자 및/또는 5) 광합성 등과 같은 하나 또는 그 이상의 엽록체 기능을 수행하기 위하여 충분히 자연적으로 발생 또는 변형된 엽록체 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 적어도 5, 10, 15, 20,25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 필수적 유전자를 포함할 수 있다.
벡터는 길이가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 kb 또는 그 이상인 엽록체 DNA를 포함할 수 있다. 벡터는 비 필수적 엽록체 유전자 서열뿐만 아니라 필수적 엽록체 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 벡터로 이루어진 숙주 세포에 자연적으로 나타나지 않는 하나 또는 그 이상, 또는 모든, 필수적 엽록체 유전자 및/또는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 벡터는 엽록체 유전자를 포함할 수 있으며, 유전자는 엽록체에서 자연적으로 나타나지 않는다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 필수적 엽록체 유전자 및/또는 엽록체 기능, 광합성, 탄소 고정 및/또는 탄화수소 생산과 관련된 하나 또는 그 이상의 DNA 서열 또는 유전자를 포함할 수 있다. 예컨대, 벡터는 광합성에 요구되는 서열 및 이소프레노이드 생산, MVA, 및/또는 테르펜 합성을 암호화하는 DNA 서열 또는 테르펜 또는 이소프레노이드 등과 같은 탄화수소를 생산하는 그 밖의 폴리펩타이드 등과 같은 MEP 경로와 관련된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 거대 표적 핵산을 예컨대, 효모 또는 세균과 같은 세포 또는 입자 (particle)에 클로닝, 조작 및 전달하기 위한 방법을 더 제공한다. 본 방법의 다른 구체예는 잡종 효모-세균 클로닝 시스템(예컨대, 미국 특허번호 5,866,404, 및 7,083,971 및 Hokanson et al.,(2003) Human Gene Ther.:14:329-339)을 이용한다. 본 발명의 벡터 (예컨대, 클로닝 시스템)은 효모와 세균 양쪽에서 기능 및 복제를 위한 요소를 함유하는 셔틀 벡터를 포함하므로써, 양 생물에서 안정적으로 작용 및 복제되는 것이 가능하게 된다. 기능적 및 복적성 요소의 이러한 성분들은 양 유전적 가공 시스템의 이익을 향유하는 잡종 시스템을 수득한다. 효모(예컨대, S. 세레비시아)의 유전학은 잘 이해되어 있으며, 강력한 분자생물학 도구의 집합이 효모의 유전적 가공을 위하여 존재한다.
본 발명의 또 다른 측면은 두 개의 팔(arm)과 표적 핵산 사이에 상동성 재조합에 의해 갭-필링된 벡터를 생산한다. 또한 또 다른 실시예에 의하면, 적어도 하나의 팔은 복제 원점을 더 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 각 팔은 드문 제한 효소 인식 부위를 더 포함한다. 상동성 재조합은 시험관 내 또는 생체 내 예컨대, 진균 세포(예컨대, S. 세레비시아, S. 폼베 또는 U. 마이디스)에서 수행될 수도 있다. 또한, 본 발명은 본 발명 예컨대, 진균 세포(예컨대, S. S. 세레비시아, S. 폼베 또는 U. 마이디스)에 따른 재조합 클로닝 시스템 또는 벡터를 갖는 진균 세포를 제공한다.
갭-필링된 선형 벡터는 시험관 내(예컨대, T4 리가아제를 이용) 또는 생체 내, 예컨대, 세균에서 원형 벡터로 전환될 수도 있다. 관심있는 원형 벡터는 증폭, 정제, 절단될 수 있고, 표적 세포에 다음 운반을 위하여 세포 내로 직접 또는 적절한 운반 시스템으로 도입되도록 충분한 양의 DNA를 재생시키곤 한다. 방법론은 임의의 다수 세균 또는 비세균 게놈을 클로닝하고 변형시키며, 재조합 벡터로서 이들의 사용을 용이하게 하는 많은 융통성을 제공한다. 갭-필드 벡터를 세포로 직접 운반하는 것은 예컨대, 칼슘 인산 형질 전환 방법론 및 전기 천공법과 같은 당해 분야에서 널리 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다(Sambrook et al., supra 참고).
따라서, 본 발명은 (a)표적 서열을 포함하는 갭-필드 벡터를 생산, (b) 본 발명의 갭-필드 벡터 단편을 선택적으로 원형으로 만들고, (c) 상기 벡터를 증식시키고, (d) 갭-필드 벡터를 전달 단위에 도입하는 단계를 포함하는 재조합 전달 단위를 생산하기 위한 방법을 제공한다.
세균 시스템은 DNA를 증폭, 정제시키는데 유용하며 유전적 변형 및 경로에서 이들의 영향을 기능적으로 실험하는데 유용하다. 본 발명의 일 실시예는 임의의 거대 게놈을 클로닝하고 변형하는데 도움이 될 것이며, 경로의 클로닝과 도입을 쉽게하는데 도움이 될 것이다. 전체 경로 전달 기능과 함께, 본 발명의 실시예는 문제를 해결하기 위한 생물학적 접근 시스템에 관한 것이다.
일반적으로, 표적 DNA(예컨대, 게놈 DNA)는 벡터의 동종 제조에 대하여 허용된 부위를 생산함으로써 포획될 수 있다. 예컨대, 이런 부위는 한정되진 않으나, 일반적으로 효모 내에서 형질전환되기 이전에 제한 효소 소화에 의해 벡터 내에서 생성되는 갭 내 갭-복구 클로닝(gap-repair cloning)에 의해 생성될 수도 있다. 표적 DNA가 벡터와 혼합되는 경우, 표적 DNA는 벡터 내에서 재조합된다. 이와 같은 작용을 "갭-필링(gap-filling)"이라고 한다. 이와 같은 재조합은 세균, 효모, 오리지널 숙주 생물, 또 다른 생물 또는 체외에서 생성될 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 재조합은 상동성 재조합의 고비율로 인해 효모에서 수행될 수 있다. 일단 포획되면, 표적 DNA는 DNA 서열을 첨가, 변경 또는 제거를 포함하는 많은 방법으로 변형될 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 표적 DNA는 게놈 DNA이다. 그 밖의 실시예에 의하면, 표적 DNA는 세포소기관 (예컨대, 미토콘드리아 또는 엽록체) DNA이다.
몇몇 구체예에 의하면, 표적 DNA는 유전자, 코드 서열, 부분적 코드 서열, 규칙적인 요소, 양성 및/또는 음성 선별 마커를 첨가, 치환 또는 제거함으로써 변형된다. 예컨대, 표적 DNA 서열은 형질전환되는 생물에서 발현에 대하여 바이어스 코든일 수 있다. 당업자는 주어진 아미노산을 특정하기 위하여 뉴클레오티드 코돈의 사용에 특이 숙주 세포에 의하여 표현되는 "코돈 바이어스"를 알 수 있다. 이론에 의해 경계되어지지 않으며, 숙주 세포의 선호하는 코돈을 이용함으로써, 전사 비율이 증가될 수도 있다. 따라서, 숙주 세포 내 개선된 발현을 위해 유전자를 합성하는 경우, 코돈 이용 빈도를 숙주 세포의 선호하는 코돈의 빈도에 가깝도록 유전자를 디자인하는 것이 바람직하다. 본 발명의 코돈은 예컨대, 코돈의 제 3 뉴클레오티드 위치에 풍부한 A/T 에 풍부할 수도 있다. 일반적으로, A/T 리치 코돈 바이어스는 조류에서 이용된다. 몇몇 구체예에 의하면, 코돈의 제 3 뉴클레오티드 위치의 적어도 50%는 A 또는 T 이다. 그 밖의 구체예에 의하면, 코돈의 제 3 뉴클레오티드 위치의 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 99%는 A 또는 T이다(미국 특허번호 2004/0014174).
이러한 재조합은 해당 분야에서 잘 알려져 있으며, 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 몇몇 구체예에 의하면, 재조합은 클론된 서열을 이용하여 수행될 수도 있다. 그 밖의 구체예에 의하면, 변형은 합성 DNA를 이용하여 수행될 수도 있다.
유전적 재조합은 표적 거대 조각의 DNA (예컨대, 염색체, 게놈)을 클로닝 및/또는 대사 경로 또는 오페론 등과 같은 유전자 사이의 기능적인 관계에 기초하는 표적 DNA를 분배 및 재인식하는 것을 포함한다. 또한, 유전자 재조합은 대사 경로를 도입하고 제거, DNA를 기능적 단위(예컨대, 대사 경로, 합성 오페론), 및/또는 거대 조각의 DNA(예컨대, 네이티브(native) 또는 비 네이티브 숙주는 DNA 서열을 결실 또는 재조합 시키는 경향이 있는 부위)에서 불안정한 부위를 결정하는 것을 포함한다.
표적 DNA는 원핵 생물로부터 DNA일 수도 있다. 또한, 표적 DNA는 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA 또는 진핵 생물로부터 미토콘드리아 DNA일 수도 있다. 게놈 및/또는 세포소기관 DNA로부터 이러한 생물의 예로는 Z. 모빌리스로 한정되지는 않으나, 조류(예컨대, C. 레인하르티와 같은 거대 조류 또는 미세 조류), 로도파이트(rhodophyte), 클로로파이트(chlorophyte), 헤테로콘토파이트(heterokontophyte), 트리보파이트(tribophyte), 글라우코파이트(glaucophyte), 클로라라크니오파이트(chlorarachniophyte), 유글레노이드(euglenoid), 합토파이트(haptophyte), 크립토모나드(cryptomonad), 다노플라겔룸(dinoflagellum), 또는 피토플랑크톤(phytoplankton)을 포함한다. 당업자는 이들 생물이 실시예로서만 열거되고, 상술한 방법은 세균, 식물, 균류, 원생 생물 및 동물을 포함하는 임의의 생물로부터 거대 DNA에 적용된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 유전적 재조합은 형질 전환된 세포가 DNA의 특정 서열을 보존하도록 하여 그 자손에서 서열을 안정적으로 유지하도록 하는 서열을 제거 또는 삽입함으로써 거대 조각의 DNA를 안정화시키는 것을 포함할 수도 있다. 또한, 유전적 재조합은 표적 DNA, 벡터 DNA 및/또는 합성 DNA의 코돈을 숙주 생물의 임의의 코돈 바이어스를 반영하도록 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 유전적 재조합은 생물이 독자 생존 가능하도록 요구되는 최소 세트의 유전자를 결정하는 것을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예에 의하면, 본 발명의 유전적 재조합은 특정 대사 경로가 생성되고 유지되도록 요구되는 최소 세트의 유전자를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 유전적 재조합은 하나의 게놈 내부 및 두 개의 게놈(예컨대, 핵 및 엽록체 게놈 사이에 풍부함)사이 풍부한 유전자를 결정하는 것을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명의 유전적 재조합은 인위적으로 합성 (예컨대, 특정 대사 경로 내 유전자, 기능적 게놈의 유전자)될 수 있는 기능적 서열의 DNA를 결정하는 것을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예에 의하면,본 발명의 유전적 재조합은 DNA 및 카세트 (예컨대, 유전자가 용이하게 삽입되거나 제거될 수 있는 벡터 내의 부위)내에 패키지된 게놈을 생성하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 유전적 재조합은 다수 종 (예컨대, 이식 가능한 엽록체 게놈)에서 독자 생존가능한 핵 또는 세포소기관 게놈을 생성하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 유전적 재조합은 임의의 이들 제조물 또는 생성물 (예컨대, 셔틀 벡터를 숙주 시스템으로 다시 전달하고, 생존을 검정)의 생존 가능성을 테스트하기 위한 방법을 포함할 수도 있다.
벡터, 마커 및 형질 전환
벡터 또는 그 박의 재조합 생산 분자는 선별가능 마커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다. "선별 가능 마커" 또는 "선별 마커"는 감지 가능한 표현형에 부여되는 폴리뉴클레오티드(또는 암호화된 폴리펩타이드)를 언급한다. 선별 가능 마커는 예컨대, 적절한 시약(특정 파장의 빛 또는 루시페린 각각)와 접촉한 루시페라아제 등과 같은 녹색 형광 단백질 또는 효소가 적절한 시약(특정 파장의 빛 또는 루시페린 각각)와 접촉하여 눈 또는 적절한 도구를 이용함으로써 감지될 수 있는 신호를 생산하는 경우, 일반적으로 감지 가능한 폴리펩타이드 을 암호화한다(Giacomin, Plant Sci . 116:59-72, 1996; Scikantha, J. Bacteriol . 178:121, 1996; Gerdes, FEBS Lett . 389:44-47, 1996; 또한, Jefferson, EMBO J. 6:3901-3907, 1997, fl-glucuronidase 참고). 일반적으로 선별 가능 마커는 세포 내에서 현존 또는 발현되는 경우 예컨대, 인자가 있을 때 성장시키거나 세포를 죽이는 능력이 있는 마커를 포함하는 세포에 선택적인 장점 (또는 단점)을 제공하는 분자이다.
선별 가능 마커는 원핵 생물 세포 또는 식물 세포 또는 둘 다에게 마커를 발현하는 수단을 제공할 수 있으며 따라서, 본 발명의 벡터의 구성 요소로서 유용할 수 있다(예컨대, Bock, supra, 2001 참조). 선별가능 마커의 예로는 한정되지는 않으나, 메토트레세이트에 저항성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(Reiss, Plant Physiol . (Life Sci . Adv.) 13:143-149, 1994); 아미노글리코사이드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스페라아제 (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983), 하이그로마이신에 저항성을 부여하는 하이그로 (Marsh, Gene 32:481-485, 1984), 세포가 프립토판 대신에 인돌을 이용하는 것을 가능하게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용하는 것을 가능하게 하는 hisD (Hartman, Proc . Natl . Acad . Sci., USA 85:8047, 1988); 세포가 만노오스를 이용하는 것을 가능하게 하는 만노오스-6-포스페이트 이소머라아제(WO 94/20627); 오르니틴 디카르복실라아제 저해제에 저항성을 부여하는 오르니틴 디카르복실라아제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴(DFMO; McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); 및 블라스티시딘 S에 저항성을 부여하는 아스파르질러스 테레우스 기원의 디아미나아제 (Tamura, Biosci . Biotechnol . Biochem . 59:2336-2338, 1995)과 같은 대사길항물질 저항성을 부여하는 것들을 포함한다. 추가적인 선별가능한 마커는 예를 들어, 포스피노트리신에 저항성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸트렌스페라아제 유전자 (White et al., Nucl . Acids Res . 18:1062, 1990; Spencer et al., Theor . Appl . Genet . 79:625-631, 1990), 글리포세이트 저항성을 부여하는 돌연변이 EPSPV-합성효소 (Hinchee et al., BioTechnology 91:915-922, 1998), 이미다졸리온 또는 설포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이 아세토락테이트 합성효소 (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988), 아트라진에 저항성을 부여하는 돌연변이 psbA(Smeda et al., Plant Physiol . 103:911-917, 1993), 또는 돌연변이 프로토포르피리노겐 산화효소 (U.S. Pat. No. 5,767,373 참고), 또는 글루포시네이트와 같은 제초제에 저항성을 부여하는 다른 마커와 같은 제초제 저항성을 부여하는 것들을 포함한다. 선별가능 마커는 진핵세포에서 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 또는 네오마이신 저항성을 부여하는 폴리뉴클레오티드 및 테트라사이클린; 대장균과 같은 원핵세포에 대한 앰피실린 저항성; 및 식물에서 블레오마이신, 젠타마이신, 글리포세이트, 하이그로마이신, 카나마이신, 메토트레세이트, 플레오마이신, 포스피노트리신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 솔폰아마이드 및 설포닐우레아 저항성을 포함한다(예를 들어, Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, page 39 참고).
핵 및 플라스미드 형질 전환 방법은 통상적이며, 식물 세포 엽록체 (미국 특허 번호 5,451,513, 5,545,817, 및 5,545,818; WO 95/16783; McBride et al., Proc. Natl. Acad. Sci ., 미국 91:7301-7305, 1994 참조)에 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것으로 잘 알려져 있다. 몇몇 구체예에 의하면, 엽록체 형질 전환은 바람직한 뉴클레오티드 서열을 인접한 외래성 DNA의 상동성 재조합을 위하여 허용되는 엽록체 DNA 영역을 표적 엽록체 게놈에 도입하는 것과 관련된다. 몇몇 실시예에 의하면, 엽록체 게놈 DNA의 1.5kb 입접 뉴클레오티드 서열에서 하나가 사용될 수도 있다. 이런 방법을 이용하면, 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신에 저항성을 부여하는 엽록체 16S rRNA 및 rps12 유전자 내 점돌연변이는 형질전환을 위한 선별 마커로서 이용될 수 있고(Svab et al., Pro.Natl. Acad. Sci., USA 87: 8526-8530,1990), 표적 잎에 약 1초당 100번의 충격 주기로 안정적인 동종 플라즈믹 형질 전환의 결과를 나을 수 있다.
또한, 형질 전환을 매개하는 미세주입(microprojectile)은 식물 세포 엽록체에 폴리뉴클레오티드를 도입하는데 사용될 수 있다 (켈빈 등., 네이쳐 327:70-73,1987). 이런 방법은 염화 칼슘, 스페르미딘 또는 폴리에틸렌 글리콜 침전에 의해 바람직하게는 폴리뉴클레오티드로 코팅된 금 또는 텅스텐 등과 같은 미세 입자를 이용한다. 미세 입자는 BIOLISTIC PD-1000 입자 총(BioRad; Hercules Calif.) 등과 같은 장치를 이용하여 식물 조직에서 높은 속도로 가속된다. 바이오리스틱(biolistic) 방법을 이용하는 형질 전환 방법은 해당 분야에서 널리 알려져 있다 (예컨대, Christou, 식물 과학의 트렌드 1:423-431, 1996 참조). 형질 전환을 매개하는 미세주입은 예컨대, 면, 담배, 옥수수, 잡종 포플러 및 파파야를 포함한 다양한 형질 전환 종을 생산하는데 이용되어 왔다. 밀, 귀리, 수수 및 쌀 등과 같은 중요 곡물 또한 미세주입 매개 전달을 이용하여 형질전환하였다 (두안 등., 네이쳐 바이오텍. 14:494-498, 1996; 시마모토, Curr. Opin. 바비오텍. 5:158-162, 1994). 대부분의 쌍떡잎 식물 형질 전환은 상술한 방법으로 가능하다. 또한 외떡잎 식물의 형질 전환은 예컨대, 원생 동물 형질 전환, 부분적으로 투과가능한 세포, 유리 섬유를 이용한 DNA 도입, 유리구슬 교란 등의 상술한 바이오리스틱 방법을 이용하여 할 수 있다.
형질 전환 주기는 세균성 aadA유전자에 한정되지 않으나, 열성의 r-RNA 또는 우성의 선별 마커를 갖는 r-단백질 항생제 저항 유전자를 대체하여 증가할 수도 있다(Svab and Maliga, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 90:913-917,1993). 약 15에서 20 세포 분열 주기를 따르는 형질 전환은 일반적으로 호모플라스티딕(homoplastidic) 상태에 이르도록 요구된다. 엽록체가 엽록체 게놈의 다수 복사를 포함할 수 있고, 따라서 "호모플라스틱" 또는 "호모플라스미(homoplasmy)"라는 용어는 관심있는 특정 유전자좌의 모든 사본이 실질적으로 동일한 상태를 의미한다는 것은 해당 분야의 당업자에게 자명하다. 상동성 재조합에 의해 식물 세포마다 존재하는 환형 플라스미드 게놈의 모든 수천 개의 사본에 삽입되는 유전자에서 플라스미드 발현은 전체 가용성 식물 단백질의 10%를 용이하게 초과할 수 있는 발현 레벨을 허용하기 위하여 핵-발현 유전자보다 많은 사본 수 이점의 이익을 갖는다.
본 발명의 벡터에서 표적 DNA, 벡터 DNA 또는 합성 DNA의 임의의 뉴클레오티드 서열은 생물 형질 전환에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여 바이어스된 코돈을 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 뉴클레오티드 서열에서 코돈은 코돈의 제 3 뉴클레오티드 위치에서 A/T가 풍부하다. 예컨대, 적어도 50%의 제 3 뉴클레오티드 위치의 코돈은 A 또는 T일 수도 있다. 그 밖의 실시예에 의하면, 코돈은 G/C 가 풍부하며 예컨대, 적어도 50%의 제 3 뉴클레오티드 위치의 코돈은 G 또는 C일 수도 있다.
본 발명의 셔틀 벡터 뉴클레오티드 서열은 엽록체 발현에 위하여 조정될 수 있다. 예컨대, 여기서 뉴클레오티드 서열은 엽록체 종 프로모터 또는 엽록체 종 제어 조절 영역으로 이루어질 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 핵 발현을 위하여 조정될 수 있다. 예컨대, 뉴클레오티드 서열은 핵 특이 프로모터 또는 핵 특이 제어 조절 영역으로 이루어질 수 있다. 핵 서열은 엽록체 표적(targeting) 단백질(예컨대, 엽록체 운반 펩타이드)을 암호화하는 표적(targeting)서열, 또는 단백질이 소포체 또는 원형질막 내 침착을 위하여 내막계로 향하도록 하는 신호 펩타이드로 단백질을 암호화할 수 있다.
벡터가 연료를 생산할 수 있는 유전자를 암호화하는 실시예에 의하면, 특이 연료 분자의 생합성을 증가시키기 위하여 세포의 효소 함량을 변화시킴으로써 연료 생산물을 생산한다. 예컨대, 생합성 효소를 암호화한 뉴클레오티드 서열(예컨대, 외래원으로부터 분리된 ORF)은 광합성 생물의 엽록체에 도입될 수 있다. 또한, 연료 생합성 효소를 암호화한 뉴클레오티드 서열은 광합성 생물의 핵 게놈에 도입될 수 있다. 핵 게놈에 도입된 뉴클레오티드 서열은 세포의 세포질 내 생합성 효소를 직접 축척하거나, 광합성 생물의 엽록체 내 생합성 효소를 직접 축적할 수도 있다.
또한 임의의 뉴클레오티드 서열은 제어 조절 서열로 이루어질 수도 있다. 제어 조절 서열은 다음의 하나 이상을 포함할 수 있다: 프로모터, 인트론, 엑손, 가공 요소, 3' 비번역 영역, 5' 비번역 영역, RNA 안정 요소 또는 번역 인핸서. 프로모터는 다음의 하나 이상을 포함할 수도 있다: 생물 내 발현을 조정하는 프로모터, 조류 프로모터, 엽록체 프로모터 및 핵 프로모터, 이들 중 임의의 자연적 또는 합성적 프로모터. 제어 조절 서열은 유도되거나 자동조절될 수 있다. 제어 조절 서열은 동종 및/또는 이종 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 조절 서열은 제 1 동종 서열 및 제 2 동종 서열 측면에 배치될 수 있다. 제 1 및 제 2 동종 서열은 길이가 적어도 각각 500 뉴클레오티드일 수 있다. 동종 서열은 양쪽 상동성 재조합에 대하여 허용되거나 유전자 발현을 용이하게 하기 위하여 이종 서열을 격리시킬 수 있다.
또한 벡터는 한정되진 않으나, 항생제(이들의 기능적 부분을 포함), 인터류킨 및 그 밖의 면역 조절자 및 항생제 등과 같은 생물 약제로 유용한 생산물을 생산하는데 관련된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Mayfield et al., (2003) Proc. Nat'l Acad. Sci .: 100 (438-42) 및 U.S. Pub. No. 2004/0014174.
본 발명의 벡터는 카세트 세균 게놈 또는 이들의 부분(예컨대, 세균 게놈 또는 이들의 기능적 부분을 포함하는 제거 가능 DNA 단편)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 기능적 게놈 단위(예컨대, 대사 과정을 위한 필수적 단위, 생화학 경로, 유전자 발현)를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 이식 가능 세균 게놈 또는 이들의 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 전이 가능 세균 게놈 또는 이들의 부분을 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에 의하면, 다수의 표적 DNA는 변형된다. 변형된 DNA는 에탄올 생성을 수행하는데 필요한 모든 유전자, entner-duodorff 경로, 포도당 내성 경로, 에탄올 내성 경로, 카르복실산 부산물 저항 경로, 아세트산 내성 경로, 당 운반 경로, 당 발효 경로 및/또는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 소화 경로에 요구되는 모든 유전자로 이루어질 수도 있다.
본 발명의 잡종 클로닝 시스템 및 방법은 주어진 핵산의 포획 및 조작을 위한 시스템으로서 고범용성의 효모 및 이들 핵산의 증폭을 위한 고 효율의 세균 시스템을 결합한다. 다수 핵산 단편의 분리, 조작 및 운반을 매개하기 위한 상동성 재조합에 의존하는 재조합 벡터가 구축된다. 또한, 상술한 발명은 다수 핵산을 클로닝, 조작 및 운반하기 위한 상기 재조합 클로닝 벡터를 이용하기 위한 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 생화학 경로 분석, 세포소기관 분석 및 합성 엽록체 구성의 증강제로서 상기 재조합 클로닝 시스템을 이용하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 벡터는 효모에 도입될 수도 있다. 효모는 S. 세레비시아의 적정 가닥일 수도 있다; 그러나, 그 밖의 효모 모델이 이용될 수도 있다. 효모 내에 벡터의 도입은 벡터의 유전자 조작을 위해 허용될 수 있다. 효모 벡터는 문헌에서 광범위하게 인용되고 있으며, 또한 이와 같은 조작 방법은 이후에 논의함으로써 널리 알려져 있다(예컨대, 케트너 등(1994)Proc.Natl.Acad. Sci.(미국) 91: 6186 6190).
다음의 유전자 조작, 클로닝 시스템은 많은 양의 핵산을 준비하기에 적절한 세균 환경에서 운반을 위하여 허용될 수도 있다. 세균 타입 벡터의 대표적인 실시예는 한정되진 않으나, P1 인공 엽색체, 세균 인공 엽색체(BAC) 및 단일복제 플라스미드 F 인자 (Shizuya et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:8794 8797)를 포함한다. 마찬가지로, 세균 벡터는 해당 분야에서 널리 알려져 있다 (예를 들어, Ioannou et al. (1994) Nature 6:84 89). 또한, 본 발명은 효모 선별 마커, 세균 선별 마커, 텔로미어, 센트로미어,효모 복제 원점 및/또는 세균 복제 원점을 포함하는 셔틀 벡터를 제공한다.
본 발명의 셔틀 벡터는 관심 있는 표적 핵산을 포획하고 관심 있는 벡터 내로 통합하기 위한 효모에서 상동성 재조합을 가능하게 할 수 있다. 셔틀은 벡터가 도입될 수 있는 임의의 숙주에 표적 DNA 조작을 위해 허용될 수 있다. 몇몇 구체예에 의하면, 원하는 조작 이후에, 셔틀 벡터 요소는 변형된 표적 DNA만 남기고 제거될 수도 있다. 벡터 서열의 이들 추출물은 표준 기법을 이용하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 관심 있는 표적 핵산은 거대 핵산일 수 있으며 예컨대, 상술한 관심 외래 유전자를 포함하는 바이러스성 벡터 등과 같은 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 표적 핵산은 세균 (고세균 및 진정 세균), 바이러스, 균류, 원생 생물, 식물 또는 동물 게놈 또는 이들의 부분일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 일 실시예의 표적 핵산은 전체 원핵 생물 게놈으로 이루어진다. 부가적 실시예로서, 본 발명의 표적 핵산은 진핵 생물의 엽록체 게놈으로 이루어질 수도 있다.
본 발명에 따른 셔틀 벡터는 효모에서 텔로미어 및 센트로미어로서 기능하는 적절히 배향된 DNA를 포함할 수 있다. 임의의 적절한 텔로미어가 이용될 수도 있다. 적절한 텔로미어는 제한 없이 효모에서 텔로미어 기능을 제공할 수 있는 다수의 생물로부터의 텔로미어 반복을 포함한다. 인간의 최종 반복 서열(TTAGGG)N은 트리파노소마 서열과 동일하며 효모((TG)1-3)N 및 테트라히메나(TTGGG)N 서열과 유사하다(Szostak & Blackburn (1982) Cell 29:245 255; Brown (1988) EMBO J. 7:2377 2385; 및 Moyzis et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:6622 6626).
본 발명에서 "센트로미어"는 안정적 복제 및 본 발명의 감수 분열 및 체세포 분열에서 벡터의 정확한 분할, 이에 의해 딸세포로 적절히 분리할 수 있도록 매개하는 핵산과 동일한 의미로 사용된다. 적절한 센트로미어는 한정되진 않으나, 거대 선형 플라스미드에서 체세포 분열 및 감수 분열의 안정성을 부여하는 효모 센트로미어, CEN4를 포함한다(Murray & Szostak (1983) Nature 305:189 193; Carbon (1984) Cell 37:351 353; 및 Clark et al. (1990) Nature 287:504 509)).
몇몇 구체예에 의하면, 본 발명에 따른 원형 벡터의 두 개의 분절 중 적어도 하나는 선택되는 숙주 세포/입자에서 기능 하는 적어도 하나의 복제 시스템을 포함한다. 후술하는 바와 같이, 당업자는 선택되는 표적 핵산의 조작, 증폭 및/또는 운반이 하나 이상의 숙주 세포/입자의 이용을 수반할 수 있다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 선택되는 각 숙주 세포/입자에서 기능적인 하나 이상의 복제 시스템이 포함될 수도 있다.
숙주 세포가 원핵 생물 특히, 대장균인 경우, 복제 시스템은 예컨대, P1 플라스미드 레플리콘, 오리, P1 용균성 레플리콘, ColEl, BAC, 단일 복제 플라스미드 F인자 등과 같은 원핵 생물에서 기능하는 것을 포함한다. 하나 또는 양쪽 분절 및/또는 원형 벡터는 거대 핵산의 복제를 지지할 수 있는 효모 복제 원점을 더 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 복제 영역의 한정 없는 예로는 WKKR 복제 서열 또는 "ARS 요소"를 포함한다. ARS 요소는 고빈도 형질전환을 부여하는 효모 서열과 동일하다. 테트라하이메나 DNA 말단은 ARS1 및 ARS4와 더불어 효모에서 ARS 요소로 이용되었다 (Kiss et al. (1981) Mol. Cell Biol. 1:535 543; Stinchcomb et al. (1979) Nature 282:39; 및 Barton & Smith (1986) Mol. Cell Biol. 6:2354). 각 단편(예컨대, 갭-필링 셔틀 벡터의 효모 및 세균 요소와 일치하는 것)에서 두 개 이상의 복제 원점을 가질 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 제 1 및/또는 제 2 단편은 원형의 벡터 형식(예컨대, 플라스미드 형식)으로 연결될 수도 있다. 원형은 관심 단편을 이용하여 생체 내 또는 시험관 내에서 생성될 수 있다. 선택적으로, 관심의 원형 벡터가 이용될 수 있다. 상술한 바와 같이, "벡터"는 플라스미드 또는 파지 DNA 또는 DNA 또는 다른 핵산분자가 클로닝될 수 있는 다른 핵산을 의미한다. 벡터는 숙주 세포에서 자발적으로 복제될 수 있고, 그러한 핵산이 결정 가능한 방식으로 절단되고 핵산 단편이 삽입될 수 있는 하나 또는 몇몇의 제한 효소 인식 부위로 더 특징지어질 수 있다. 또한, 벡터는 벡터로 형질 전환되는 세포의 동일화를 위해 적절한 선별 마커를 포함할 수도 있다.
본 발명의 표적 핵산은 매우 복잡할 수도 있다. 표적 핵산은 바이러스성, 원핵 세포성 또는 진핵 세포성 DNA, cDNA, 엑손(코딩), 및/또는 인트론(비코딩) 서열을 포함할 수 있다. 표적 핵산은 엽색체, 게놈, 또는 오페론 및/또는 엽색체, 게놈, 또는 오페론의 부분일 수 있다. 표적 핵산은 경로, 세포소기관의 생존에 필수적인 유전자의 최소 성분, 및/또는 생물의 생존에 필수적인 유전자의 최소 성분에서 모든 유전자를 위한 코딩 서열을 포함한다. 표적 핵산은 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) DNA 서열을 포함할 수 있으나 게놈 DNA 및/또는 cDNA에 한정되진 않는다. 표적 핵산은 진핵 생물 엽록체 DNA 서열을 포함할 수 있으나 엽록체 게놈 DNA 및/또는 cDNA에 한정되진 않는다. 표적 핵산은 시아노세균 DNA를 포함할 수 있으며, 게놈 DNA 및/또는 cDNA에 한정되진 않는다. 또한, 표적 핵산은 임의의 기원 및/또는 자연적인 것일 수도 있다.
유전자는 또한 효율적인 프로모터 전사를 위해 코딩 서열에 실시 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 인핸서, 억제물질 및 다른 제어 서열은 당해 분야에서 널리 알려진 바와 같이, 유전자 활동을 조절하기 위하여 포함될 수 있다. 상술한 유전자는 개개 숙주 세포(예컨대, 내생적)의 게놈에서 발견되는 유전자 또는 개개 숙주 세포(예컨대, 외래성 또는 "외래 유전자")의 게놈에서 발견되지 않는 유전자를 언급할 수 있다. 외래 유전자는 숙주로서 동일한 종으로부터 또는 다른 종으로부터 기원할 수 있다. 세포에서 발현될 유전자를 포함하는 DNA을 사용하여 세포의 형질 감염을 위하여, DNA는 발현을 위해 요구된 배향에서 유전자의 발현에 필수적인 임의의 제어 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "인트론"은 단백질로 해독되지 않고 일반적으로 엑손 사이에서 발견되는 주어진 유전자에 현존하는 DNA 서열을 말한다.
유전적 요소는 폴리펩티드를 코딩하는 지역 또는 전사 또는 번역 또는 숙주 세포에서 폴리펩티드의 발현에 중요한 다른 공정을 조절하는 지역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 영역과 발현을 조절하는 것에 작동가능하게 연결된 영역을 모두 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 유전적 요소는 에피솜 요소로서 숙주 세포 게놈과 물질적으로 독립된 분자로서 복제하는 벡터 내에 포함될 수 있다. 이들은 진핵 세포 내 메토트레세이트 선별에 의해 감염된 DNA가 증폭되는 동안 발생하는 것과 같이 최소 염색체 내에 포함될 수 있다. 또한 유전적 요소는 자연 상태가 아닌 분리, 클로닝 및 정제된 DNA 또는 벡터, 그들 사이의 정제된 형태로 숙주 세포에 도입 등과 같은 다음의 조작으로 숙주 세포 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 벡터는 표적 핵산의 부분과 혼성화되는 능력을 갖기에 충분한 선형 동일성 또는 유사성(상동성)을 포함할 수 있거나, 전사 조절 요소 또는 유전자간 DNA인 유전자와 같은 단일 가닥이다. 이론이 뒷받침되지 않는다면, 이런 잡종화는 보통 상보적 가닥 사이에 염-특이 수소 결합의 결과이고, 바람직하게는 왓슨-클락 염 쌍을 형성한다. 실질적 문제로서, 이런 상동 관계는 상동성 재조합 경우의 관찰로부터 추론될 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 이런 상동 관계는 선형 핵산의 약 8로부터 약 1000 염기까지이다. 다른 실시예에 의하면, 이런 상동 관계는 약 12로부터 약 500 염기까지이다. 당업자는 상동 관계가 핵산의 더 긴 구간으로 연장될 수 있음을 이해할 것이다.
상동성 재조합은 두 가닥의 DNA 사이에 나타나는 물리적인 재배열 과정인 유전자 재조합의 일 유형이다. 상동성 재조합은 유사한 서열의 정렬, 정렬된 DNA 가닥 사이 교차 및 가닥 사이 물질의 교환을 생산하기 위한 DNA의 파괴 및 복구를 포함한다. 상동성 재조합 과정은 생물에서 자연적으로 발생되며 또한, 유전자 변화를 생물에 도입하기 위한 분자 생물 기술로서 이용된다.
본 발명의 벡터는 숙주 세포 및 적용가능하다면, 숙주 세포 내 통합을 위하여 숙주 세포의 구축, 증폭, 형질 전화 또는 형질 감염에 대비하여 사용될 수 있는 표적 서열과는 다른 기능적 독립체를 포함하기 위하여 더 변형될 수 있다. 예컨대, 벡터는 숙주 DNA로 통합을 위한 영역을 포함할 수 있다. 통합은 숙주 세포의 핵 DNA 내에서 이루어질 수 있다. 몇몇 구체예에 의하면, 통합은 엽록체 DNA 등과 같은 비-핵 DNA에서 이루어질 수 있다. 벡터의 다른 기능 독립체는 한정되진 않으나, 마커, 링커 및 제한 부위를 포함할 수 있다.
표적 핵산은 제어 핵산을 포함할 수 있다. 이는 임의의 서열 또는 이에 의해 조절되는 핵산의 복제,전사 및/또는 발현을 조절(직접적으로, 간접적으로, 및 상하로)하는 핵산을 말한다. 이런 제어 핵산에 의한 조절은 핵산을 필수적 또는 의도적으로 전사 및/또는 해독되게 할 수 있다. 상기 임의의 뉴클레오티드 서열은 제어 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 제어 조절 서열의 예로는 한정되진 않으나, 다음의 하나 이상을 포함할 수 있다: 프로모터, 인트론, 엑손, 프로세싱 요소, 3' 비번역 영역, 5' 비번역 영역, RNA 안정 요소, 또는 번역 인핸서. 프로모터는 다음의 하나 이상을 포함할 수 있다: 생물에서 발현을 위해 조작된 프로모터(예컨대, 세균, 균류, 바이러스, 식물, 포유류, 또는 원생 생물), 조류 프로모터, 엽록체(또는 다른 플라스미드) 프로모터, 미토콘드리아 프로모터, 및 핵 프로모터, 이들 중 일부는 자연 또는 합성 프로모터일 수 있다. 제어 조절 서열은 의도되거나 자가 조절가능할 수 있다. 제어 조절 서열은 자가 및/또는 이종 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에 의하면, 조절 서열은 제 1 동종 서열 및 제 2 동종 서열 측면에 배치될 수 있다. 제 1 및 제 2 동종 서열은 적어도 길이가 각각 500 뉴클레오티드가 될 수 있다. 동종 서열은 양쪽 상동성 재조합을 허용할 수 있고 또한, 유전자 발현을 촉진하기 위하여 이종 서열을 분리할 수 있다.
몇몇 실시예에 의하면, 본 발명의 셔틀 벡터에 존재하는 표적 DNA 또는 벡터 DNA 또는 다른 DNA는 폴리펩티드 생산물을 생산하는 것이라기보다는 세포로부터 생산물을 분비하게 하는 것이다. 이런 경우, 뉴클레오티드 서열은 생물로부터 외부 환경으로 생산물의 분비율을 증강, 개시 또는 증가시키는 단백질을 암호화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 벡터 및/또는 벡터의 단편은 예컨대, 전사 개시 영역 등과 같은 전사 제어 영역을 포함할 수 있다. 당업자는 티미딘 키나아제 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 메탈로치오네인 프로모터, 사람 세포거대바이러스 프로모터 및 SV40 프로모터를 포함하는 다수의 전사 개시 서열을 격리하고 이용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 일 구체예는 갭-필링 벡터를 생산하는 방법을 제공한다. 갭-필링 벡터는 상동성 재조합 표적 핵산의 5' 및 3'에 서열 상동 사이 영역을 필링함으로써 본 발명에 따른 표적 핵산을 삽입할 수 있다. 이런 이유로, 몇몇 구체예에서, 한가지 방법은 상동성 재조합이 허용되는 상태에서 인스턴트 클로닝 시스템을 표적 핵산과 접촉시키는 것이다.
또 다른 방법은 (ⅰ) 표적 핵산, 제 1 선별 마커 및 제 1 순환화 요소의 5'말단에 제 1 핵산 상동성을 포함하는 제 1 단편; (ⅱ) 표적 핵산; 및 (ⅲ) 상동성 재조합이 허용되는 상태에서 표적 핵산, 제 2 선별 마커 및 제 2 순환화 요소의 3'말단에 제 2 핵산 상동성을 포함하는 제 2 단편을 결합한다. 본 발명의 구체예는 두 개의 과 표적 핵산 사이에 상동성 재조합에 의해 갭-필링 벡터를 생산한다. 팔과 표적 핵산 사이에서 발견되는 상동 영역 사이의 교환은 상동 핵산 사이의 어느 지점에서든 상동성 재조합에 영향을 미친다. 본 발명의 원형 벡터에 관하여, "갭-필링"은 벡터 내에 표적 서열의 삽입(예컨대, 서브 클로닝)은 필수적이다.
해당 분야에서 널리 알려진 방법론에 따르면, 상동성 재조합은 체외에서 효과가 나타난다. 예컨대, 본 발명의 방법은 효모 용해물 배양에 사용하여 실행될 수 있다. 상동성 재조합은 체내에서 발생할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 예컨대, 세균, 효모 및 포유류 세포 등과 같은 상동성 재조합을 지지할 수 있는 임의의 숙주 세포를 사용하여 실행될 수 있다. 당업자는 적적한 숙주의 선택이 상기 방법의 클로닝 시스템에서 사용되는 선별 마커의 특별한 결합에 의존한다는 것을 이해할 것이다.
벡터를 관심 있는 숙주 세포에 도입하는데 사용될 수 있는 기술은 인산칼슘/DNA 동반 침전(coprecipitation), 전기 천공법, 세균-원형질체 융합, DNA의 미량 주사를 핵 등에 포함한다. 당업자는 예컨대 Keown 등에서 알려진 바와 같이 예를 들면, 몇몇 프로토콜은 포유류 세포를 감염시키기 위해 실질적으로 상호 교환가능하게 사용될 수 있다(Meth. Enzymol. 185:527 537, 1990).
형질 전환은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 등과 같은 토양세균을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 아그로박테리움 투메파시엔스는 가공된 플라스미드 벡터, 또는 선별된 초과 유전자의 운반자를 운반할 수 있다. 잎 등과 같은 식물 조직은 예를 들면 10×10mm의 작은 조각으로 절단하고 현탁된 아그로박테리움을 포함하는 용액에 10분 동안 담근다. 절단에 따라 몇몇 세포는 세균의 DNA를 상기 세포에 삽입하는 세균에 의해 형질 전환된다. 선택가능한 루팅(rooting)과 슈팅(shooting) 배지상에 두었을 때, 식물은 재성장할 것이다. 몇몇 식물 종은 아그로박테리움 현탁액에 꽃을 담그는 것만으로 형질 전환될 수 있으며, 그 다음 선택 배지에 씨를 심는다.
또 다른 방법은 "유전자 총" 접근법을 사용하는 것이다. 유전자 총은 바이오리스틱 (또한 바이오볼리스틱으로 알려짐)이라고 하는 방법의 일부이며, 일정한 조건에서 DNA (또는 RNA)은 금속 원자(일반적으로 텅스텐 또는 금) 등과 같은 생물학적으로 활성이 없는 입자를 고정하는 "스티키(sticky)"가 된다. 부분 진공에서 이런 DNA 입자 복합체를 가속시키고, 가속 경로에 표적 조직을 위치시킴으로써, DNA가 효율적으로 도입된다. 또한 코팅되지 않은 금속 입자는 세포 주위 DNA를 포함하는 용액에 스며들어서, 유전 물질을 가져와서 살아있는 세포로 진행할 수 있다. 다공판은 셀 카트리지를 중단하지만, 금속의 은을 살아있는 세포 다른 면으로 관통시키도록한다. 다음으로, 마커 유전자 (식물에서 GUS의 사용은 가장 흔함)를 사용하여 동일시되는, 원하는 DNA를 받아들인 세포는 유전자를 복제하도록 배양하고, 가능하게 클로닝한다. 바이오리스틱 방법은 유전자를 살충제 또는 제초제 저항성 작물 등과 같은 식물 세포에 삽입하는데 가장 유용하다. 다른 방법으로는 입자를 가속시키는데 사용된다: 이 방법은 유압 장치를 포함한다. 기계적 충격 또는 미세주입을 이용하는 기구; 구심성, 자기적 또는 정전기적 힘; 스프레이 또는 백신 총; 및 방전 등과 같은 충격파에 의한 가속에 기초한 기구 (예를 들어, Christou and McCabe, 1992, Agracetus, Inc. Particle Gun Transformation of Crop Plants Using Electric Discharge (ACCELL™ Technology) 참고).
예컨대, 형질 전환은 숙주가 세균 (대장균, 바실러스 서브틸리스 및 이러한 종류)인 경우, Cohen 등의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972)), 원형질 방법 (Mol. Gen. Genet., 168:111 (1979)), 또는 컴피턴트 방법 (J. Mol. Biol., 56:209 (1971)), 숙주가 S. 세레비시아인 경우 Hinnen et al.의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1927 (1978)), 또는 리듐 방법 (J. Bacteriol., 153:163 (1983)), 숙주가 동물인 경우, Graham의 방법 (Virology, 52:456 (1973)), 및 숙주가 곤충인 경우 Summers et al. 방법 (Mol. Cell. Biol., 3:2156-2165 (1983))에 따라 수행될 수 있다. 전형적으로, 형질전환 이루에, 포텐셜한 형질전환체는 선별 및/또는 경작을 위하여 영양 배지에 플레이팅된다.
영양 배지는 우선 숙주 세포의 성장에 필요한 탄소원, 무기 질소원 또는 유기 질소원을 우선적으로 포함한다(형질 전환). 탄소원의 예로는 당, 덱스트린, 가용성 녹말 및 수크로오스가 있으며, 무기 또는 유기 질소원의 예로는 암모늄 소금, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 카세인, 육즙(meat extract), 콩 케이크(soy bean cake), 및 감자 추출물이 있다. 원한다면, 배지는 다른 영양소(예컨대, 무기염(예를 들면, 염화 칼슘, 중크롬산 나트륨, 및 마그네슘 염화물), 비타민, 항생제 (예를 들면, 테트라시클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신,등)를 포함할 수 있다. 몇몇 광합성 생물에 대한 배지는 탄소원을 요구하지 않을 수 있으며, 이는 이러한 생물이 이들 자체가 탄소원을 생산할 수 있기 때문이다.
배양 및/또는 선별은 당해 분야에서 알려진 방법에 의해 수행된다. 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등과 같은 상태에서 배양 및 선별은 벡터, 숙주 세포 및 본 발명의 방법에 대하여 적절히 선별된다. 당업자는 다양한 특이 배지 및 숙주 세포(형질 전환)의 유형 및 벡터의 속성 (예컨대, 선별 가능 마커는 존재함)에 의존하여 사용될 수 있는 배양/선별 상태가 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명에서 배지는 단지 실시예로서만 설명될 뿐이고, 이에 한정되진 않는다.
숙주가 세균, 방선균, 효모 또는 곰팡이인 경우, 상술한 영양원을 포함하는 배지가 적절하다. 숙주가 대장균인 경우, 더 바람직한 배지의 예는 LB 배지, M9 배지(Miller et al. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, p.431 (1972)) 등이다. 숙주가 효모인 경우, 배지의 예는 Burkhoter 최소 배지 (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4505 (1980))이다.
효모에서 벡터의 선택은 효모 선별 마커의 사용에 의해 이루어질 수 있다. 한정되진 않지만 예로는 HIS3, TRP1, URA3, LEU2 및 ADE 마커를 포함한다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 이들의 벡터 또는 단편은 둘 이상의 선별 가능 마커를 포함할 수 있다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 벡터의 분절은 상동성 재조합시 표적 핵산과 함께 소실되는 ADE 마커 및 HIS3 마커를 포함할 수 있다. 다른 단편은 TRP 1 마커를 포함할 수 있다. 선택은 적절한 드롭 아웃(drop-out) 선별 배지에서 형질전환된 세포를 성장시킴으로 이루어진다 (예를 들어, Watson et al. (1992) Recombinant DNA, 2.sup.nd ed., Freeman and Co., New York, N.Y. 참고). 예컨대, HIS3은 제 1 단편을 포함하는 세포의 선택을 위해 허용된다. TRP1은 제 2 단편을 포함하는 세포의 선택을 위해 허용된다. ADE는 상동성 재조합이 발생하는 클론의 스크리닝 및 선택을 허용한다. ADE는 컬러(빨강) 선택을 할 수 있다.
재조합 효모 세포는 당업자에게 널리 알려진 방법에 따라 상술된 선별 마커를 사용하여 선택될 수 있다. 따라서, 당업자는 본 발명의 갭-필링 벡터를 갖는 재조합 효모 세포가 본 발명에 포함된 선별 가능 마커에 기초하여 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 예컨대, HIS3 및 TRP1을 운반하는 재조합 벡터는 히스티딘 및 트립토판이 부족한 드롭 아웃 선별 배지에서 형질 전화된 효모 세포를 성장시킴으로써 선택될 수 있다. 분리된 양성 클론은 더 정제될 수 있고, 본 발명의 재조합 벡터의 존재 및 구조를 확인하기 위해 예컨대, 제한 분석, 전기 이동, 서든 블랏 분석, 폴리머라아제 연쇄 반응 등에 의해 분석될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 가공된 갭-필링 벡터를 제공한다. 이런 벡터는 단편 또는 본 발명의 벡터와 선택되는 표적 핵산 사이에 상동성 재조합의 생산물이다. 또한, 본 발명은 원핵 생물 세포 및/또는 본 발명에 따른 클로닝 시스템 또는 벡터를 갖는 진핵 숙주 세포를 제공한다. 생물은 단세포 또는 다세포일 수 있다. 생물은 자연적으로 광합성을 하거나 비광합성할 수 있다. 형질 전환될 수 있는 생물의 다른 실시예는 관다발 및 비관다발 생물을 포함한다. 식물, 효모, 동물, 조류 또는 곤충 세포와 같은 숙주가 사용되는 경우, 본 발명의 벡터는 적어도 프로모터, 개시 코돈, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 요구한다면, 흔히 사용되는 유전자 증폭 (마커)을 위한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
생산물
본 발명의 벡터는 벡터를 포함하는 생물에서 자연적 또는 비자연적으로 생산되는 생산물의 생산으로 결과되는 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 벡터에서 하나 이상의 서열에 의해 암호화된 생산물은 폴리펩티드 예컨대, 효소이다. 본 발명을 실시하는데 이용되는 효소는 세균, 식물, 균류 및 동물로부터 추출된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 또한, 벡터는 생물로부터 생산물의 생산 또는 분비에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 이런 뉴클레오티드 서열은 이소프레노이드 생합성 경로에서 기능하는 하나 이상의 효소를 암호화한다. 이소프레노이드 생합성 경로에서 폴리펩타이드의 예는 C5, C10, C15, C20, C30, 및 C40 합성효소와 같은 효소를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 효소는 효소를 생산하는 이소프레노이드이다. 몇몇 실시예에서, 효소를 생산하는 이소프레노이드는 두 개의 인산염 그룹을 갖는 이소프레노이드를 생산한다 (예컨대, GPP 합성효소, FPP 합성효소, DMAPP 합성효소). 다른 실시예에서, 효소를 생산하는 이소프레노이드는 0, 1, 3 이상 인산염을 갖는 이소프레노이드를 생산하거나,다른 기능적인 그룹을 갖는 이소프레노이드를 생산할 수 있다. 본 발명에서 유용한 효소 및 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당해 분야에서 알려진, 한정되진 않으나, 서브-클로닝 및 PCR을 포함하는 임의의 수단에 의해 분리 및/또는 합성될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하기 위한 이소프레노이드 생산 효소는 보트리오콕센 합성효소(botryococcene synthase), β-카리요필렌 합성효소(β-caryophyllene synthase), 게르마크렌 A 합성효소(germacrene A synthase), 8-에피세드롤 합성효소(8-epicedrol synthase), 발렌센 합성효소(valencene synthase), (+)-δ-카디넨 합성효소((+)-δ-cadinene synthase), 제르마크렌 C 합성효소(germacrene C synthase), (E)-β-파르네센 합성효소((E)-β-farnesene synthase), 카스벤 합성효소(casbene synthase), 비티스피라디엔 합성효소(vetispiradiene synthase), 5-에피-아리스톨로센 합성효소(5-epi-aristolochene synthase), 아리스톨센 합성효소(aristolchene synthase), α-후물렌(α-humulene), (E,E)-α-파르네센 합성효소((E,E)-α-farnesene synthase), (-)-β-피넨 합성효소((-)-β-pinene synthase), γ-테르피넨 합성효소(γ-terpinene synthase), 리모넨 사이클라아제(limonene cyclase), 리날룰 합성효소(linalool synthase), (+)-보르닐 디포스페이트 합성효소((+)-bornyl diphosphate synthase), 레보피마라딘 합성효소(levopimaradiene synthase), 이소피마라딘 합성효소(isopimaradiene synthase), (E)-γ-비사볼렌 합성효소((E)-γ-bisabolene synthase), 코팔릴 피로포스페이트 합성효소(copalyl pyrophosphate synthase), 카우렌 합성효소(kaurene synthase), 롱기폴렌 합성효소(longifolene synthase), γ-후물렌 합성효소(γ-humulene synthase), δ-셀리넨 합성효소(δ-selinene synthase), β-펠란드렌 합성효소(β-phellandrene synthase), 테르피놀렌 합성효소(terpinolene synthase), (+)-3-카렌 합성효소((+)-3-carene synthase), 신-코파릴 디포스페이트 합성효소(syn-copalyl diphosphate synthase), α-테르피네올 합성효소(α-terpineol synthase), 신-피마라-7,15-디엔 합성효소(syn-pimara-7,15-diene synthase), 엔트-산다라코피마라디엔 합성효소(ent-sandaaracopimaradiene synthase), 스테르네르-13-엔 합성효소(sterner-13-ene synthase), E-β-오시멘(E-β-ocimene), S-리날롤 합성효소(S-linalool synthase), 제라니올 합성효소(geraniol synthase), γ-테르피넨 합성효소(γ-terpinene synthase), 리날롤 합성효소(linalool synthase), E-β-오시멘 합성효소(E-β-ocimene synthase), 에피-세드롤 합성효소(epi-cedrol synthase), α-징기베렌 합성효소(α-zingiberene synthase), 구아이아디엔 합성효소(guaiadiene synthase), 카스카릴라디엔 합성효소(cascarilladiene synthase), 시스-무롤라디엔 합성효소(cis-muuroladiene synthase), 아피디콜란-16b-올 합성효소(aphidicolan-16b-ol synthase), 엘리자베스아트리엔 합성효소(elizabethatriene synthase), 산달롤 합성효소(sandalol synthase), 페초롤 합성효소(patchoulol synthase), 진자놀 합성효소(zinzanol synthase), 세드롤 합성효소(cedrol synthase), 스카레올 합성효소(scareol synthase), 코파롤 합성효소(copalol synthase), 또는 마놀 합성효서(manool synthase)일 수 있다.
본 발명의 벡터에 의해 생산될 수 있는 다른 효소는 바이오매스-분해 효소를 포함한다. 바이오매스-분해효소의 제한되지 않는 예는 셀룰로오스 분해효소, 헤미셀룰로오스 분해효소, 펙틴 분해 효소(pectinolytic enzymes), 자일라나아제(xylanases), 리그닌 분해 효소(ligninolytic enzymes), 셀룰라아제, 셀로비오스(cellobiases), 소프트닝 효소(softening enzymes) (예컨대, 엔도폴리갈락투로나아제(endopolygalacturonase)), 아밀라아제, 리파아제, 프로테아제, RNases, DNases, 이눌리나아제(inulinase), 용균 효소(lysing enzymes), 포스포리파아제(phospholipases), 펙티나아제, 플루라나아제, 포도당 이성화효소, 엔도자일라나아제(endoxylanase), 베타-자일로시다아제(beta-xylosidase), 알파-L-아라비노프라노시다아제(alpha-L-arabinofuranosidase), 알파-글루코로니다아제(alpha-glucoronidase), 알파-갈락토시다아제(alpha-galactosidase), 아세틸자일란 에스테라아제, 및 페룰로일 에스테라아제를 포함한다. 이들 효소를 암호화하는 유전자의 예는 한정되진 않으나, 아밀라아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 (예컨대, β-글루코시다아제, 엔도셀룰라아제, 엑소셀룰라아제), 엑소-β-글루카나아제, 엔도-β-글루카나아제 및 자일라나아제 (엔도자일라나아제 및 엑소자일라나아제)를 포함한다. 리그닌 분해 효소(ligninolytic enzymes)의 예는 한정되진 않으나, 파네로체테 크리요소스포리움(Phanerochaete chryososporium) 기원의 리그닌 퍼옥시다아제(lignin peroxidase) 및 마그네슘 퍼옥시다아제(manganese peroxidase)를 포함한다. 당업자는 상기 효소가 본 발명에서 사용되는 효소의 일부 리스트임을 이해할 것이다.
본 발명은 숙주 세포(예를 들어, C. 레인하르티, D. 살리나, H. 플루발리스 및 시아노박테리아 세포와 같은 조류 세포) 및/또는 하나 이상의 다른 효소를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주 세포를 포함하는 생물을 형질 전환함으로써 지방산, 지질 또는 오일의 생산에 기여하는 효소를 만드는 것을 고려한다. 몇몇 구체예에서, 지방산, 지질 또는 오일의 생산에 기여하는 효소는 동화 효소이다. 지방산 합성에 기여하는 동화 효소의 몇몇 예는 한정되진 않으나, 아세틸-CoA 카르복실라아제, 케토리덕타아제(ketoreductase), 티오에스트라아제(thioesterase), 말로닐트렌스페라아제(malonyltransferase), 데하이드라타아제(dehydratase), 아세틸-CoA 리가아제, 케토아세틸신타아제(ketoacylsynthase), 에노일리덕타아제(enoylreductase) 및 디세투라아제(desaturase)를 포함한다. 몇몇 구체예에서 효소는 생물 분배 효소이다. 몇몇 구체예에서, 단일 효소를 생산한다.
몇몇 숙주 세포는 하나 이상의 효소를 암호화하는 다수 유전자로 형질전환될 수 있다. 예컨대, 단일 형질 전환된 세포는 전제 지방산 합성 경로를 구성하는 효소를 암호화하는 외래성 핵산을 포함할 수 있다. 경로의 일례는 아세틸-CoA 카르복실라아제, 말로닐트렌스페라아제(malonyltransferase), 케토리덕타아제(ketoreductase), 및 티오에스트라아제(thioesterase)를 암호화하는 유전자를 포함한다. 전체 경로로 형질 전환된 세포 및/또는 세포로부터 추출된 효소는 완전 지방산을 합성하거나, 지방산 합성 경로를 매개할 수 있다. 몇몇 구체예에서 구축물은 동일 유전자 및/또는 다른 생물로부터 동일 효소를 암호화하는 다수 유전자 및/또는 하나 이상 부분의 코딩 서열에서 돌연 변이된 다수 유전자를 포함할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 생산물(예컨대, 연료, 향수, 살충제)은 탄화수소가 풍부한 분자, 예컨대 테르펜이다. 테르펜(이소프렌 단위의 수로 분류됨)은 헤미테르펜, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 디테르펜, 트리테르펜, 또는 테트라테르펜일 수 있다. 특정 실시예에서, 테르펜은 스테로이드 또는 카로테노이드와 같은 테르페노이드 (이소프레노이드라고 알려짐)이다. 카로테노이드의 하위 분류는 카로틴과 크산토필을 포함한다. 특정 구체예에서, 연료 생산물은 리모넨, 1,8-시네올(1,8-cineole), α-피넨, 캄펜, (+)-사비넨, 미르센, 아비에타디엔(abietadiene), 텍사디엔(taxadiene), 파르네실 피로포스페이트(farnesyl pyrophosphate), 아테미시닌 전구체(amorphadiene), (E)-알파-비사볼렌, 베타 카로틴, 알파 카로틴, 리코펜, 또는 디아포피토엔(diapophytoene)을 포함한다. 이들 테르펜 중 몇몇은 순수 탄화수소(예컨대, 리모넨)이고, 다른 몇몇은 탄화수소 유도체(예컨대, 시네올)이다.
연료 생산물의 예는 석유 화학 제품 및 그들의 유도체 및 석유 화학 산업에 유용하게 사용될 수 있는 모든 다른 성분이 포함된다. 연료 생산물은 예를 들어, 석유 화학 및 이들의 유도체뿐만 아니라, 석유 제품 및 석유의 유도체를 포함한다. 연료 생산물은 석유 제품 및 석유 화학 제품을 포함하여 석유 화학 산업에 유용한물질 또는 재료를 생성하도록 사용될 수 있다. 연료 또는 연료 생산물은 보일러, 가마, 건조기 또는 용광로와 같은 연소기에서 사용될 수 있다. 연소기의 다른 예는 가솔린 엔진, 디젤 엔진, 제트 엔진, 및 그 밖의 것을 포함하여 자동차 엔진 또는 발전기와 같은 내연 기관 엔진이다. 또한, 연료 생산물은 플라스틱, 수지, 섬유,탄성체, 윤활제, 및 젤을 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 고려된 생산물의 예는 탄화 수소 제품 및 탄화 수소 유도 제품을 포함한다. 탄화 수소 생산물은 오직 수소 분자와 탄소 분자로 구성된다. 탄화 수소 유도 생산물은 수소 또는 탄소가 아닌 임의의 원자인 하나 이상의 이원자(heteroatoms)을 갖는 탄화수소 생산물이다. 이원자의 예는 한정되진 않지만, 질소, 산소, 황 및 인을 포함한다. 몇몇 생산물은 탄소 및 수소로 구성되는 생산물 중량의 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 또는 95 %로 탄화수소가 풍부하다.
탄화 수소와 같은 연료 생산물은 유도체 또는 한정되진 않으나, 액체 석유 가스, 나프타(리그로인), 휘발유, 등유, 경유, 윤활 오일, 중유(heavy gas), 콜라, 아스팔트, 타르, 및 왁스와 같은 원유 또는 석유로부터 전통적으로 추출된 생산물일 수 있다. 예를 들어, 연료 생산물은 가열 (요리와 같은)에 사용되거나 또는 플라스틱을 만드는데 사용될 수 있는 메탄, 에탄, 프로판 또는 부탄과 같은 작은 알칸(예컨대, 1에서 약 4 탄소)을 포함할 수 있다. 또한, 연료 생산물은 타프타 또는 리그로인, 또는 그들의 유도체와 같은 약 5에서 약 9 탄소 원자의 탄소 골격을 갖는 분자를 포함할 수 있다. 기타 연료 생산물은 약 5에서 약 12 탄소 원자 또는 가솔린이나 모터를 연료로 사용되는 시클로알칸일 수 있다. 분자 및 등유 또는 등유 유도체와 같은 약 10에서 약 18 탄소의 방향족은 연료 생산물이 될 수 있다. 또한, 연료 생산물은 윤활 오일에 사용되는 등 12 이상의 탄소를 갖는 분자, 또는 그들의 유도체를 포함할 수 있다. 기타 연료 생산물은 중유 또는 연료 오일, 또는 일반적으로 알칸, 시클로알칸, 및 약 20에서 약 70 탄소의 방향족을 포함하는 이들의 유도체를 포함한다. 또한, 연료 생산물은 콜라, 아스팔트, 타르 및 일반적으로 약 70 개 이상의 탄소를 포함하는 다수의 고리를 포함하는 왁스 및 이들의 유도체로부터 기타 잔유(residual)를 포함한다.
숙주 세포 및 생물
벡터를 사용하여 형질 전환될 수 있는 생물의 예 및 상술한 방법은 관다발 및 비관다발 생물을 포함한다. 생물은 원핵 또는 진핵 생물이다. 생물은 단세포 또는 다세포일 수 있다.
진균 세포(예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis))와 같은 진핵 세포는 본 발명의 방법 및 구성을 이용하여 형질전환될 수 있다. 균류/효모 세포에 핵산을 도입하는 방법은 당업계에서 널리 알려져 있다. 따라서, 이런 단계는 전형적인 형질 전환 방법론에 의해 이루어질 수 있다. 적절한 방법론의 비제한적 예는 전기 천공, 알칼리 양이온 프로토콜, 및 스페로플라스트 형질 전환을 포함한다.
비관다발 광합성 생물의 예는 마르칸티오파이트(marchantiophytes) 또는 안토세로토파이트(anthocerotophytes)와 같은 브리오파이트(bryophtyes)를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 생물은 시아노박테리아이다. 몇몇 실시예에서, 생물은 조류(예컨대, 거대조류 또는 미세조류)이다. 조류는 단세포 또는 다세포 조류일 수 있다. 몇몇 실시예에서 생물은 로도파아트(rhodophyte), 클로로파이트(chlorophyte), 헤테로콘토파이트(heterokontophyte), 트리보파이트(tribophyte), 글라우코파이트(glaucophyte), 클로라라크니오파이트(chlorarachniophyte), 유글레노이드(euglenoid), 햅토파이트(haptophyte), 크립토모나드(cryptomonad), 디노플라겔룸(dinoflagellum), 또는 파이토플랑크톤(phytoplankton)이다.
본 발명의 방법은 거대 조류, C. 레인하르티를 이용하여 증폭한다. 본 발명의 방법에 따라 폴리펩티드 또는 단백질 복합체를 발현시키기 위한 미세 조류의 사용은 통상적(Cyanotech Corp.; Kailua-Kona HI)인 것을 포함하여 많은 개체수의 미세 조류가 성장할 수 있고, 따라서, 생산물 및 원한다면 많은 양의 원하는 생산물의 분리가 허용된다는 장점을 제공한다. 그러나, 임의 식물의 엽록체에서 예컨대, 단백질 복합체를 포함하는 기능적 폴리펩티드의 발현 및/또는 엽록체 또는 임의 식물의 변형 능력은 이들 식물 작물의 생산 및 일반적으로 많은 양의 폴리펩타이드를 생산하는 능력을 허용한다. 따라서, 본 발명의 방법은 토양에서 자라는 식물 예컨대, 제아 마이스(Zea mays), 브라시카 종(Brassica sp.) (예컨대, B. 나프스(B. napus), B. 라파(B. rapa ), B. wnstpdk(B. juncea)), 특히 씨유(seed oil)의 원료로 유용한 배추속 식물, 알팔파(Medicago sativa), 쌀 (Oryza sativa), 호밀 (Secale cereale), 사탕수수 (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), 기장 (예를 들어, 진주 기장(pearl millet) (Pennisetum glaucum), 기장(proso millet) (Panicum miliaceum), 조 (Setaria italica), 손가락 기장(finger millet) (Eleusine coracana)), 해바라기 (Helianthus annuus), 잇꽃 (Carthamus tinctorius), 밀 (Triticum aestivum), 콩 (Glycine max), 담배 (Nicotiana tabacum), 감자 (Solanum tuberosum), 땅콩 (Arachis hypogaea), 면 (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), 고구마 (Ipomoea batatus), 카사바(Manihot esculenta), 커피 (Cofea spp.), 코코넛 (Cocos nucifera), 파인애플 (Ananas comosus), 감귤류 나무 (Citrus spp.), 코코아 (Theobroma cacao), 차 (Camellia sinensis), 바나나 (Musa spp.), 아보카도 (Persea ultilane), 무화과 (Ficus casica), 구아바(Psidium guajava), 망고 (Mangifera indica), 올리브 (Olea europaea), 파파야 (Carica papaya), 캐슈 (Anacardium occidentale), 마카다미아 (Macadamia integrifolia), 아몬드 (Prunus amygdalus), 사탕무 (Beta vulgaris), 사탕수수(Saccharum spp.), 귀리, 좀개구리밥 (Lemna), 보리, 토마토(Lycopersicon esculentum), 상추 (예컨대, Lactuca sativa), 껍질콩 (Phaseolus vulgaris), 리마콩 (Phaseolus limensis), 완두콩 (Lathyrus spp.) 및 오이(C. sativus), 칸탈루프 (C. cantalupensis), 및 머스크 메론 (C. melo)과 같은 오이(Cucumis ) 과 식물뿐만 아니라 엽록체를 갖는 임의의 식물 예컨대, 해양 조류 및 해조, 거대조류를 이용하여 실시할 수 있다. 또한, 진달래(Rhododendron spp.), 수국(Macrophylla hydrangea), 하비스쿠스(Hibiscus rosasanensis), 장미(Rosa spp.), 튤립(Tulipa spp.), 수선화(Narcissus spp.), 피튜니아(Petunia hybrida), 카네이션(Dianthus caryophyllus), 포인세티아(Euphorbia pulcherrima), 및 국화와 같은 장식물도 포함된다. 본 발명의 방법을 실행하기 유용한 부가적인 장식물은 봉선화, 베고니아, 양아욱속, 바이올라, 시클라멘, 버베나, 얼룩매일초(Vinca), 천수국(Tagetes), 프리뮬러, 세인트폴리아, 불로화(Agertum), 비름(Amaranthus), 미어초(Antihirrhinum), 아퀼레지아, 시네라리아, 클로버, 코스모, 동부콩, 달리아, 흰독말풀, 참제비 고깔, 거베라, 글라디올러스, 글록시니아, 아마릴리스(Hippeastrum), 사철채송화(Mesembryanthemum), 샐피글로시스(Salpiglossos), 및 백일초를 포함한다. 본 발명을 수행하는데 쓰이는 침엽수는 예컨대, 미송(Pinus taeda), 슬래쉬 소나무(Pinus elliotii), 폰데로사 소나무(Pinus ponderosa), 로지폴 파인(Pinus contorta), 및 몬테레이 파인(Pinus radiata), 더글러스-전나무(Pseudotsuga menziesii); 서양 독당근(Tsuga ultilane); 가문비나무(Sitka spruce)(Picea glauca); 미국 삼나무(Sequoia sempervirens);와 같은 소나무, 전나무 (Abies amabilis) 및 발삼 전나무(Abies balsamea)와 같은 트루 퍼(true firs); 및 웨스턴 레드시다(Thuja plicata) 및 알래스카 노란색 삼나무 (Chamaecyparis nootkatensis)와 같은 삼나무를 포함한다.
본 발명의 방법을 수행하기 유용한 콩과 식물은 콩 및 완두콩을 포함한다. 콩은 구아(guar), 메뚜기 콩, 호로파, 콩, 정원 콩, 동부(cowpea), 녹두, 리마 콩, 잠두(fava bean), 렌즈콩, 병아리콩(chickpea) 등을 포함한다. 레구메(Legumes)는 제한되지 않지만 아라키스(Arachis ), 예를 들어, 땅콩(peanuts), 비시아(Vicia ), 예를 들어, 크라운 베치(crown vetch), 헤어리 베치(hairy vetch), 아드주키 빈(adzuki bean), 멍빈(mung bean), 및 치크피(chickpea), 루피너스(Lupinus ), 예를 들어,루핀(lupine), 트리폴리움(trifolium), 파세올러스(Phaseolus ), 예를 들어, 일반콩 및 리마콩, 피숨(Pisum ), 예를 들어, 필드빈(field bean), 멜리오투스(Melilotus ), 예를 들어, 클로버, 메디카고(Medicago ), 예를 들어, 알팔파, 로투스(Lotus ), 예를 들어, 트레포일(trefoil), 렌스(lens), 예를 들어, 렌틸, 및 폴스 인디고(false indigo)를 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 선호하는 마초 및 잔디는 알팔파, 새말풀, 큰 감의털, 다년생 독보리, 크리핑 벤트그래스 (creeping bent grass), 및 외겨이삭을 포함한다. 본 발명에서 유용한 기타 식물은 아카시아, 아네테(anethe), 아티코케(artichoke), 아루굴라(arugula), 블랙베리, 카놀라, 실란트로, 클레멘틴(clementines), 에스카롤(escarole), 유칼리 나무, 회향, 자몽, 꿀, 이슬, 지카마(jicama), 키위, 레몬, 라임, 버섯, 견과류, 오크라, 오렌지, 파슬리, 감, 질경이, 석류, 포플러, 라디, 라디치오(radicchio), 남부 소나무, 소합향(sweetgum), 텐저린 , 라이밀(triticale), 포도나무, 참마, 사과, 배, 모과, 체리, 살구, 메론, 대마, 메밀, 포도, 라스베리, 명아주, 블루베리, 넥타린, 복숭아, 자두, 딸기, 수박, 가지, 고추, 컬리플라워, 브라시카, 예를 들어, 브로콜리, 양배추, 울티란 스프라우트(ultilan sprouts), 양파, 당근, 부추, 무우, 잠두, 셀러리, 무, 호박, 꽃 상추, 조롱박, 마늘, 스넵빈(snapbean), 시금치, 호박, 순무, 울티란, 치코리, 땅콩과 서양호박을 포함한다. 따라서, 본 발명에서 언급된 구성은 상기 임의의 핵산을 포함하는 숙주 생물을 포함한다. 상기 숙주 생물은 임의의 엽록체를 포함하는 생물일 수 있다.
본 발명에서는 "식물"이란 용어는 어떤 발전 단계의 어떤 생물을 포함하는, 플라스티드 특히 엽록체를 포함하는 진핵 생물을 널리 의미하는데 사용되며, 식물 절단, 식물 세포, 식물 세포 배양, 식물 기관, 식물 씨앗, 묘목을 포함하는 식물의 부분을 나타내는데 사용된다. 식물 세포는 원형질과 세포벽으로 구성된 식물의 구조 및 생리적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태로 될 수 있고, 또한, 예컨대 식물 조직, 식물 기관 또는 식물로 고도로 조직화된 단위의 부분일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질, 배우자를 생산하는 세포, 또는 세포 또는 전체 식물로 재생할 수 있는 세포의 모임일 수 있다. 이와 같이 다수의 식물 세포를 포함하고 전체 세포로 재생될 수 있는 씨는 본 발명에서 개시된 목적의 식물 세포로 여겨진다. 식물 조직 또는 식물 기관은 씨, 원형질, 캘러스 또는 구조적 또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 다른 그룹일 수 있다. 특히 식물에 유용한 부분은 수확 가능한 부분 및 자손 식물의 번식에 유용한 부분을 포함한다. 식물의 수확 가능한 부분은 예컨대, 꽃, 화분, 묘목, 덩이줄기, 나뭇잎, 줄기, 과일, 씨앗 등 식물의 유용한 부분일 수 있다. 번식을 위해 유용한 식물의 부분은 예컨대, 씨앗, 과일, 커팅(cutting), 묘목, 덩이줄기, 뿌리 줄기 등을 포함한다.
진핵 숙주 세포는 진균 세포(예를 들어, S. 세레비시아 , S. 폼베 또는 U. 마이디스)일 수 있다. 원핵 숙주 세포의 예는 대장균 및 바실러스 서브틸리스, 시아노박테리아 및 광합성 세균(예를 들어, 시네코시스티스(Synechocystis) 속 또는 시네코코커스(Synechococcus) 속 또는 아트로스피라( Athrospira) 속의 종)을 포함한다. 숙주 세포(또는 표적 DNA의 근원)에 기원할 있는 비관다발 식물의 예는 우산 이끼 또는 각태 식물과 같은 선태 식물을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 생물은 조류(예컨대, 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii), 코렐라 불가리스(Chorella vulgaris ), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 헤마토코커스 플루발리스(Haematococcus pluvalis), 세네데스무스 종(Scenedesmus ssp.)과 같은 거대 조류 또는 미세 조류)이다. 조류는 단세포 또는 다세포 조류일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 생물은 홍조류(rhodophyte), 녹조류(chlorophyte), 이형편모 조류(heterokontophyte), 트리보파이트(tribophyte), 글라우코파이트(glaucophyte), 크로라라크니오파이트(chlorarachniophyte), 유글레나 무리(euglenoid), 햅토파이트(haptophyte), 암색편모충류(cryptomonad), 디노플라젤룸(dinoflagellum), 또는 식물성 플랑크톤이다. 기타 실시예에서, 당업자는 상기 생물은 단지 실시예로서 주어진 것이며, 적절한 양성 및 음성 선별 가능 마커를 사용하여 다른 생물로 대신할 수 있음을 이해할 것이다.
앞서 발명이 명확한 이해를 목적으로 도면 및 실시예로 상세하게 서술했음에도 불구하고, 부가된 청구항의 범위와 정신으로부터 벗어나지 않는다면 본 발명이 나타내는 관점에서 일정 변화 및 변형을 할 수 있다는 것은 당업자에서 이미 자명하다.
실시예
실시예 1: DNA 정제 및 분석
DNA는 종래 기술에서 공지된 방법에 따라 분리하고, 분석하였다.
PCR용 기질로 사용할 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii) 기원의 DNA를 준비하기 위하여, (한천 플레이트 또는 액체 배지로부터) 106 조류 세포를 10mM EDTA에 부유시키고, 95℃에서 10분 동안 가열하고, 다음으로 23℃ 근처로 냉각시켰다. 상기 용액을 직접 PCR 혼합물에 첨가하였다.
C. 레인하르티 기원의 정제된 엽록체 DNA를 준비하기 위하여, 5×108 조류 세포를 3000×g에서 10분 동안 원심분리로 액체 배지로 수거하고, 물로 한번 세척한 후, 3000×g에서 10분 동안 원심분리하고, 세포용해액(lysis solution)(10mM Tris pH=8.0, 10mM EDTA, 150mM NaCl, 2% SDS, 2% 사르코실, 및 25μg/mL Pronase(Roche)) 10mL에 재현탁시키고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트시켰다. 상기 용해물은 다음으로 페놀/클로로포름으로 추출하고, 클로로포름으로 두 번 세척하였다. 총 DNA를 에탄올 침전으로 분리하고, 재현탁 완충액 (10 mM Tris pH=7.4, 1 mM EDTA, 및 0.1 mg/mL RNase)에 재현탁시켰다. 변성 용액(200 mM NaOH 및 1% SDS (w/v))의 첨가에 의하여 정제될 수 있는 엽록체 DNA를 상기 재현탁된 DNA에 첨가하고, 몇 회 혼합하였다. 중화 용액 (3.0 M potassium acetate, pH=5.5)을 첨가하고, 혼합하고, 아이스 상에서 10분 동안 인큐베이트시키고, 15000rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버리고, QIAGEN-tip 500에 적용시키고, DNA를 QIAGEN Plasmid Maxi Kit에 따라 분리하였다.
C. 레인하르티로부터 분리된 엽록체 DNA를 준비하는 또 다른 방법은 DNA의 절단을 방지하기 위하여 로우-멜트 아가로오스 플러그에 조류 세포 또는 정제된 엽록체를 끼워넣는 것과 관련된다. 엽록체는 질소 충전 챔버에서 전체 세포를 용해시키고, 퍼콜 밀도 구배 원심분리에 의하여 엽록체로부터 온전한 세포와 데브리(debris)를 분리함으로써 분리된다. 상기 세포 및/또는 엽록체를 용해시키기 위하여, 상기 플러그를 세포용해 완충액 (0.5 M EDTA, 1% 사르코실, 0.2 mg/mL 프로테이나아제 K)에 55℃에서 36시간 동안 인큐베이션시킨다. 세포용해가 완성되면, 플러그는 TE로 3회 세척하고, 다음으로 저장 완충액 (10 mM Tris pH=7.4, 1 mM EDTA)에 저장하였다. 엽록체 DNA를 용액으로 유출시키기 위하여, 상기 플러그를 30 mM NaCl로 3회 세척하고, 65℃에서 10 분 동안 용융시켰다. 용융된 플러그를 42℃로 전환시키고, β-아가로오스 (New England Biolabs)로 1시간 동안 처리하였다. DNA 용액은 아래 단계에 직접 사용될 수 있거나, 샘플을 농축하기 위하여 에탄올 침전할 수 있다.
PCR용 기질로서 사용하기 위한 효모 기원의 DNA를 준비하기 위하여, 106 효모 세포(한천 플레이트 또는 액체 배지 기원)를 세포용해 완충액 (6 mM KHPO4, pH=7.5, 6 mM NaCl, 3% glycerol, 1U/mL zymolyase)에 현탁시키고, 37℃에서 30분, 95℃에서 10분 동안 가열하고, 23℃ 근처로 냉각시켰다. 상기 용액을 PCR 혼합물로 직접 첨가하였다.
효모로부터 플라스미드 DNA를 얻기 위하여, 원하는 클론을 30℃의 선택 액체 배지(예를 들어, CSM-Trp)에 상태로 성장시켰다. 세포를 3000 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 수거하고, 세포용해 완충액(1 M sorbitol, 0.1 M sodium citrate, 0.06 M EDTA pH=7.0, 100 mM beta-mercaptoethanol, 및 2.5 mg/mL zymolyase) 150μL에 재현탁시켰다. 상기 용액을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트시켰다. 변성 용액 (1% SDS 및 0.2N NaOH) 300μL를 첨가하고, 용액을 60℃에서 15분 동안 인큐베이트시켰다. 중화용액 (3M potassium acetate, pH=4.8) 150μL를 첨가하고, 상기 용액을 아이스에서 10분 동안 인큐베이트시켰다. 상기 용액을 14,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 다른 튜브로 옮겼다. 이소프로판올 1mL를 첨가하고, 혼합물을 약하게 섞고, 14,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하였다. 펠릿을 70% 에탄올 1mL로 한번 세척하고, 14,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하였다. DNA 펠릿을 공기 건조시키고, 재현탁 완충액 (10 mM Tris pH=7.4, 1 mM EDTA, 및 0.1 mg/mL RNase) 60μL에 재현탁시켰다.
세균으로부터 플라스미드 DNA를 얻기 위하여, 세포를 적절한 항생제(Kan 또는 Amp)를 함유하는 LB에 37℃에서 포화 상태로 성장시켰다. 만약 흥미로운 DNA가 표준 복제 성분을 포함한다면, 세포는 원심분리로 수거되었다. 만약 흥미로운 DNA가 P1 복제 성분을 포함한다면, 포화 세포 배양물을 LB+Kan+IPTG에서 1:20으로 희석하고, 37℃에서 4시간 동안 성장시킨 후, 수거하였다. Plasmid Maxi kit (QIAGEN)이 세포 펠릿으로부터 플라스미드 DNA를 얻기 위하여 사용되었다.
설명을 위하여, 본 발명을 특정 설명된 방법으로 제한함이 없이, (플러그 또는 용액으로) 조류, 효모, 또는 세균으로부터 얻어진 DNA 샘플은 펄스-필드 겔 전기영동(PFGE)로 분석되거나, 적절한 제한 효소(예를 들어, Sma Ⅰ)으로 절단된 후, PFGE, 종래의 아가로오스 겔 전기영동, 및/또는 서든 블랏으로 분석된다. 이러한 목적에 유용한 표준 프로토콜은 Gemmill et al. ("Advances in Genome Biology", Vol. 1, "Unfolding The Genome," pp 217 251, edited by Ram S. Verma)에 잘 설명되어 있다.
당업자는 특별히 설명되거나 인용되는 것을 대신하여 종래에 알려진 많은 다양한 방법들로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 2: 형질전환 방법
E. coli 종 DH10B 또는 Genehog는 세포를 OD600 0.7로 성장시켜 일렉트로컴피턴트화시키고, 다음으로 수거 및 아이스-콜드 10% 글리세롤로 2 회 세척하고, 드라이아이스 에탄올 조에서 잠시 동결시키고, -80℃로 유지시켰다. 효모 또는 조류의 총 DNA를 얻고, 1800V, 200ohm 및 25mF로 0.1cm 큐벳을 사용하여 대장균으로 일렉트로포레이션시켰다. 세포가 회복되게 두고, 클론을 카나마이신(50 mg/mL), 암피실린(100 mg/mL), 젠타마이신(50 mg/mL), 테트라사이클린(51 mg/mL), 또는 클로람페니콜(34 mg/mL)과 같은 하나 또는 그 이상의 항생물질을 함유하는 한천 성장 배지 상에서 선별하였다.
효모 종 YPH857, YPH858 또는 AB1380는 Sheistl & Geitz (Curr. Genet. 16:339 346, 1989)와 Sherman et al., "Laboratory Course Manual Methods in Yeast Genetics" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)에서 설명된 리튬 아세테이트 방법 또는 Sipiczki et al., Curr. Microbiol., 12(3):169-173 (1985)에 의하여 설명된 것과 같은 스페로플라스트 방법으로 형질전환할 수 있다. 효모 형질전환체를 트립토판, 류신, 또는 우라실과 같은 아미노산 및/또는 핵산을 결핍한 한천 배지에서 선별 및 스크리닝하였다. 효모 성장 및 표현형 테스트를 위한 표준 방법은 상기 Sherman et al.에서 설명된 것을 적용하였다.
조류 종 csc137c (mt+), W1.1, 또는 W1-1는 입자 총으로 형질전환할 수 있다. 세포를 100rpm으로 세팅된 회전 혼합기 상에서 450Lux의 일정한 조명하에 23℃에서 0.5 mM 5-fluorodeoxyuridine (Gorman and Levine, Proc . Natl . Acad . Sci., USA 54:1665-1669, 1965, 참고문헌으로 본 명세서에 통합됨)의 존재 또는 부재하에 TAP 배지에서 후기 로그 페이스(약 7일)로 성장시켰다. 50mL의 세포를 4,000 x g, 23℃에서 5분 동안 원심분리로 수거하였다. 상등액을 버리고, 세포를 입자총(Cohen et al., supra, 1998)에 의한 이어지는 엽록체 형질전환을 위한 TAP 배지 4ml에 재현탁시켰다.
당업자는 특별히 설명되거나 인용되는 것을 대신하여 종래에 알려진 많은 다양한 방법들로 치환될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 3: 엽록체 게놈을 포획하기 위한 잡종 갭-필링 벡터
본 실시예에서, 시스템은 엽록체 DNA를 포획하기 위한 잡종 갭-필링 벡터를 사용하여 확립될 수 있다(도 1). 상기 잡종 갭-필링 벡터 골격은 효모 인공 플라스미드(YAP)으로 작용하는 것이 가능한 효모 요소 및 플라스미드 인공 엽색체(PAC)으로 작용하는 것이 가능한 세균성 요소를 포함한다. 상기 효모 요소는 효모 선별 마커 서열(예를 들어, TRP1 또는 LEU2), 효모 센트로미어 서열(CEN), 및 효모 자가 복제 뉴클레오티드 서열(ARS)을 포함한다. 세균성 요소는 P1 또는 복제 서열의 세균성 기원 및 세균성 선별 마커 서열(예를 들어, Kanr).
잡종 갭-필링 벡터를 조작하기 위하여, 벡터 pDOCI(서열번호: 1)를 생산하였다. pTRP-AU(도 2)의 부분은 TEL, ADE2, 및 URA3을 포함하는 영역 주변의 위치와 어닐링하는 PCR 프라이머쌍을 사용하여 증폭시켰다. 한쌍은 효모 요소(서열번호: 21 및 22) 내의 영역을 증폭하고, 다른 쌍은 세균 요소(서열번호: 23 및 24) 내의 영역을 증폭하였다. PCR 생산물을 단일 프라이머 쌍(서열번호: 21 및 24)을 사용하여 PCR 에셈블리에 의하여 단일 DNA 단편으로 조립하였다. 조립된 생산물을 NotⅠ으로 절단하고, pDOCI(서열번호: 1)을 형성시키기 위하여 NotⅠ-절단된 pUC-SE(서열번호: 2)에 연결시켰다.
엽록체 DNA를 포획하기 위한 잡종 갭-필링 벡터를 조작하기 위하여, 벡터 PDOCI-10(서열번호: 3)를 생산하였다. C. 레인하르티 엽록체 게놈의 부분을 psbD 유전자좌 부근의 두 인접한 영역(서열번호: 25 및 26 및 서열번호: 27 및 28)에 특이적인 두 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭하였다(도 3; 박스 의 숫자 10으로 나타냄). 각 PCR 생성물은 NotⅠ 및 I-SceⅠ으로 절단하고, PDOCI-10(서열번호: 10)을 생성하기 위한 I-SceⅠ으로 절단된 pDOCI(서열번호: 1)에 연결시켰다.
조류에 항생제 저항성을 부여하기 위한 pDOCI-10을 조작하기 위하여, 선별 마커를 클로닝하였다. 카나마이신 저항성을 코딩하는 세균으로부터의 유전자를 함유하고, C. 레인하르티 기원의 atpA 유전자에 대한 5' UTR 및 프로모터 서열 및 C. 레인하르티 기원의 rbcL 유전자에 대한 3' UTR 서열에 의하여 조절되는 pSE-3HB-Kan(서열번호: 4)를 카나마이신 저항성 카세트를 자유롭게 하는 SnaBⅠ으로 절단하였다. 상기 카세트를 pDOCI-10-Kan(서열번호: 5)를 형성하기 위하여 SnaBⅠ-절단된 pDOCI-10에 연결하였다.
엽록체 DNA를 포획하기 위한 잡종 갭-필링 벡터 pTRP-10-Kan (서열번호: 6)을 효모에서 재조합을 사용하여 구축하였다 (도 2). 요약하면, pDOCI-10-Kan을 엽록체 게놈-특이적 요소를 잡종 갭-필링 벡터로 도입하는 카세트를 자유롭게 하기 위하여 PacI 및 AscI으로 절단하였다. 이 카세트를 pTRP-AU와 함께 리튬 아세테이트법에 의하여 효모 종 YPH858로 형질전환시켰다. 상동성 재조합이 형질전환된 효모 세포의 생체 내에서 발생하였다. 카세트가 정확하게 통합된 형질전환체를 5-플루오로오라트산(5-FOA)을 함유하는 CSM-Trp 한천 배지상에서 붉은 색으로 성장한 것에 기초하여 분리하였다. 5-FOA는 기능성 URA3 유전자를 결한 클론을 선택하고, 붉은 색은 ADE2 유전자가 제거된 경우에 나타난다. 플라스미드 DNA를 CSM-Trp 액체 배지에서 성장된 효모 클론으로부터 분리하고, 대장균(DH10B)으로 형질전환시켰다. 다량의 pTRP-10-Kan를 생산하기 위하여, pTRP-10-Kan를 갖는 DH10B 세포를 LB+Kan (50 μg/mL)에서 37℃에서 포화로 성장시키고, LB+Kan+IPTG에서 1:20으로 희석한 후, 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. DNA를 Plasmid Maxi kit (QIAGEN)를 사용하여 세균성 배양으로부터 얻었다.
상기 벡터의 구성은 완전한 플라스미드의 DNA 서열에 의하여 다양화된다.
실시예 4: 외생 숙주에서 엽록체 게놈 DNA 의 안정화 및/또는 변형을 위한 벡터
빈번하게, 다수의 이종 DNA는 효모 또는 세균과 같은 숙주 생물에서 불안정하다. 이것은 제한되지 않지만 독성 유전자 생산물 또는 코돈 편견 및/또는 선택적 압력의 결핍의 존재를 포함하는 다중 인자에 기인할 수 있다. 그러므로, 셔틀 벡터 내의 표적 DNA는 효모 또는 세균에서 변경될 수 있다. 예를 들어, 표적 DNA의 어떤 부분(예를 들어, 코딩 영역 또는 프로모터)이 숙주 생물에서 재조합에 의하여 결실 또는 이동될 수 있다. 유사한 방식으로, 표적 DNA를 운반하는 셔틀 벡터가 표적 DNA를 제공하는 생물 (또는 밀접하게 관련된 종)으로 되돌아 전달되면, 표적 DNA는 불안정하게 될 수 있다.
이러한 불안정 위치 및 감수성 서열은 게놈 DNA의 조각이 포획을 피하거나 시간 경과로 사라지는 것을 결정함으로써 쉽게 발견된다. 이러한 위치는 초기에 분리된 갭-필링 표적 DNA 플라스미드를 플라스미드-코딩된 선별가능 마커(예를 들어, TRP1)의 존재를 위하여 선택하는 조건하에서 실험실에서 순차적으로 통과된 형질전환 종으로부터 분리된 플라스미드와의 비교 또는 원 표적 DNA(예를 들어, C. 레인하르티 엽록체 DNA)와의 비교를 통하여 검출할 수 있다. 이러한 비교는 예를 들어, 제한 단편 길이 다형형(RFLP) 분석 또는 직접 시퀸싱으로 수행될 수 있다. 당업자는 이러한 차이를 결정할 수 있는 다양한 다른 프로토콜 및 방법이 있음을 이해할 것이다.
확인될 때, 이러한 위치 및 서열은 마커의 선택을 통하여 유지되게 할 수 있다. 도 4는 벡터의 다중 클로닝 위치 내의 선별 가능 마커의 배열의 예를 보여준다.
효모 및 조류 안정성 요소를 함유하는 안정성 벡터를 생산하기 위하여, ADE2 및 URA3 유전자를 포함하는 pTrp-AU의 DNA 영역을 SfiI으로 절단하여 자유롭게 한 후, 원하는 단편의 겔 정제로 이어졌다. 상기 단편을 블런트 말단을 얻기 위하여 클레노우 단편으로 처리하고, PmlI-절단된 pSE-3HB-Strep (서열번호: 7)로 연결하여 pSE-3HB-Strep-AU를 얻었다(도 4B). pSE-3HB-Strep은 C. 레인하르티 엽록체 게놈으로 C. 레인하르티 기원의 atpA 유전자에 대한 5' UTR 및 프로모터 서열 및 C. 레인하르티 기원의 rbcL 유전자에 대한 3' UTR 서열에 의하여 조절되는 세균 기원의 스트렙토마이신 저항성 코딩 유전자를 표적화하는 벡터이다.
엽록체 게놈의 다른 영역을 표적하는 벡터를 생산하기 위하여, 800~1000 bp 영역을 도 3에서 원으로 숫자가 표시된 위치에 인접하는 5' 및 3' 영역에 어닐링하는 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하였다(위치 1-5' 서열번호: 29 및 30; 위치 1-3' 서열번호: 31 및 32; 위치 3-5' 서열번호: 33 및 34; 위치 3-3' 서열번호: 35 및 36; 위치 4-5' 서열번호: 37 및 38; 위치 4-3' 서열번호 39 및 40; 위치 5-5' 서열번호 41 및 42; 위치 5-3' 서열번호: 43 및 44; 및 위치 7-5' 서열번호: 45 및 46; 위치 7-3' 서열번호; 47 및 48). PCR 생산물의 각 쌍을 NotI 및 I-SceI으로 절단하고, 혼합하고, 그리고 NotI-절단된 pUC-SE (서열번호: 2)에 연결하여 플라스미드 pUC1, pUC3, pUC4, pUC5 및 pUC7 (통합의 위치에 따라 명명)를 얻었다.
효모 선별 마커의 쌍이 구축되면 다중 안정성 위치가 동시에 적용될 수 있을 것이다(도 4B). 각 마커 쌍은 pRS416로부터 PCR 증폭된 URA3 유전자 (서열번호: 8)을 포함한다. 또한, 각 마커 쌍은 pRS415로부터 증폭된 LEU2 유전자 (서열번호: 9), pRS413으로부터 증폭된 HIS3 유전자 (서열번호: 10), pTrp-AU로부터 증폭된 ADE2 유전자 (서열번호: 11), 효모 게놈 DNA로부터 증폭된 LYS2 유전자 (서열번호: 12), 또는 항진균제 G418에 대한 저항성을 부여하는 pFA6a-kanMX6로부터의 kanMX6 유전자 (서열번호: 13)를 포함한다. URA3 유전자를 위하여 사용된 프라이머는 XmaⅠ 제한 위치를 5' 말단(서열번호: 49)에 첨가하고, SalⅠ 및 SacⅡ를 3' 말단(서열번호: 50)에 첨가한다. LEU2 , HIS3 , ADE2 , LYS2 , 및 G418 r 유전자를 위한 프라이머는 XmaI 제한 위치를 5' 말단(LEU2에 대하여 서열번호: 51, HIS3에 대하여 서열번호: 52, ADE2에 대하여 서열번호: 53, LYS2에 대하여 서열번호: 54, 및 G418 r 에 대하여 서열번호: 55)에 첨가하고, SalⅠ, FseⅠ, 및 SpeⅠ 위치를 3' 말단(LEU2에 대하여 서열번호: 56, HIS3에 대하여 서열번호: 57, ADE2에 대하여 서열번호: 58, LYS2에 대하여 서열번호: 59, 및 G418 r 에 대하여 서열번호:60)에 첨가하였다. 각 PCR 생산물을 XmaI과 SalI으로 절단하고, 페어와이즈(pairwise)로 혼합하고, 원하는 통합 벡터에 연결하여, pUC1-URA3 / ADE2, pUC3-URA3 / LEU2, pUC4-URA3 / HIS3, pUC5-URA3/ADE2, 및 pUC7-URA3 / LYS2를 얻었다. URA3는 각 경우에 사용되었는데, 이는 그것이 양성적 및 음성적 선별이 가능하기 때문이다. 도입될 수 있는 마커 쌍은 (단일 변형의 경우에서) 어떤 유전자, 2 이상의 변형의 경우에는 비-URA3 유전자에 대한 선택성에 기초한다. 다음으로 상기 마커들은 상기 마커 쌍을 둘러싸는 것들과 상동성인 말단 서열을 갖는 DNA를 도입하고, 5-FOA를 함유하는 최소 배지 상에서 성장에 대한 선별로 제거될 수 있다.
세균에서 서열 안정성을 촉진시키기 위하여, 항생제 저항성 마커를 효모 선별 마커 쌍으로 클로닝하였다. 세균성 안정성 마커는 제한되지 않지만 pET-21a로부터 증폭된 암피실린 저항성 유전자(Ampr, 서열번호: 14), pBR322로부터 증폭된 테트라사이클린 저항성 유전자(Tetr, 서열번호: 15), pETcoco-1으로부터 증폭된 클로람페니콜 저항성 유전자(Camr, 서열번호: 16), 및 pJQ200으로부터 증폭된 젠타마이신 저항성 유전자(Gentr, 서열번호:17)을 포함한다. 각 유전자에 대하여, 5' 및 3' 말단 양쪽에 XmaI을 첨가한 프라이머쌍(Ampr에 대하여 서열번호: 61 및 62, Tetr에 대하여 서열번호: 63 및 64, Camr에 대하여 서열번호: 65 및 66 및 Gentr에 대하여 서열번호: 67 및 68)이 항생제 저항성 단편을 PCR 증폭하기 위하여 사용되었다. 각 PCR 생산물을 XmaI으로 절단하고, XmaI-절단된 pUC1-URA3/ADE2, pUC3-URA3 / LEU2, pUC4-URA3 / HIS3, pUC5-URA3 / ADE2, 및 pUC7-URA3/LYS2로 연결하였다. 도 4C는 효모 및 세균성 안정성 마커의 배열을 나타낸다.
실시예 5: 엽록체 게놈으로의 잡종 및 안정성 벡터의 도입
안정성 벡터와 함께 또는 없이 잡종 벡터를 함유하는 C. 레인하르티 엽록체 게놈을 생산하기 위하여, pTRP-10-Kan와 pSE-3HB-Strep-AU를 조류 세포로 형질전환시켰다. pTRP-10-Kan를 엽록체 표적 요소들이 각 말단 상에 있게 하기 위하여 NotI으로 절단하여 벡터를 선형화시켰다(도 5). pSE-3HB-Strep-AU를 원형 DNA로 형질전환시켰다.
이러한 실험에 대하여, 모든 형질전환은 C. 레인하르티 종 137c (mt+)에서 수행하였다. 세포를 TAP 배지 (Gorman and Levine, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 54:1665-1669, 1965, 상기 문헌은 참조로 본 발명에 통합됨) 내에 0.5mM 5-플루오로데옥시피리딘의 존재하에 100rpm으로 세팅된 회전 혼합기 상에서 450Lux의 일정한 조명으로 23℃에서 후기 로그 페이스(약 7일)까지 성장시켰다. 50ml 세포를 4,000 x g에서 23℃로 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. 상등액을 버리고, 세포를 입자 총(Cohen et al., supra, 1998)에 의한 형질전환을 위하여 4 ml TAP 배지에 재현탁시켰다. 모든 형질전환은 카나마이신 선별(100μg/ml)하에서 수행되며, 저항성은 "Kan"으로 표시된 도 5의 단편에 의하여 코딩되는 유전자에 의하여 전달된다(Chlamydomonas Stock Center, Duke University).
PCR을 형질전환 종의 확인하기 위하여 사용하였다. PCR 분석을 위하여, 106 조류 세포(한천 플레이트 또는 액체 배지 기원)를 10 mM EDTA에 현탁시키고, 95℃에서 10분 동안 가열한 후, 약 23℃로 냉각시켰다. 반응 완충액, MgCl2, dNTPs, PCR 프라이머 쌍(들), DNA 폴리머라아제, 및 물로 이루어지는 PCR 칵테일을 준비하였다. EDTA 내의 조류 용해물을 반응의 주형으로 제공하기 위하여 첨가하였다. 마그네슘 농도를 조류 용해물과 첨가된 EDTA의 양 및 농도를 보상하기 위하여 다양하게 하였다. 어닐링 온도 그래디언트(gradients)를 특정 프라이머 쌍에 대한 최적 어닐링 온도를 결정하기 위하여 적용하였다.
도 6은 pSE-3HB-Strep-AU와 함께 또는 없는 pTRP-10-Kan을 함유하는 분리된 조류 종의 예를 보여준다. pTRP-10-Kan를 통합한 종을 벡터 골격의 다른 영역을 증폭하는 프라이머 쌍(레인 1, 서열번호: 69 및 70; 레인 2, 서열번호: 71 및 72; 레인 3, 서열번호: 73 및 74; 레인 4, 서열번호: 75 및 76; 레인 5, 서열번호: 77 및 78; 레인 6, 서열번호: 79 및 80; 레인 7, 서열번호: 81 및 82; 레인 8, 서열번호: 83 및 84; 및 레인 9, 서열번호: 85 및 86) 또는 pTrp-10-Kan DNA와 엽록체 게놈 DNA 간의 연결에 걸친 프라이머 쌍(레인 10, 서열번호: 87 및 88; 레인 11, 서열번호: 89 및 90)의 어떤 세트를 사용하여 확인하였다. pSE-3HB-Strep-AU를 통합한 종을 확인하기 위하여, 프라이머 쌍(서열번호: 91 및 92)이 ADE2 유전자 내의 영역을 증폭하는데 사용되었다. 원하는 클론은 기대되는 크기의 PCR 생산물을 얻은 것이다.
실시예 6: 외래성 숙주로의 엽록체 게놈의 포획
이 실시예에서, C. 레인하르티 엽록체 DNA를 상기 설명된 표준 기술을 사용하여 분리하였다. pSE-3HB-Strep-AU와 함께 또는 없이 pTRP-10-Kan 벡터를 포함하는 C. 레인하르티 엽록체 DNA를 세균을 형질전환하기 위하여 사용하였다. 일렉트로컴피턴트 대장균 종 DH10B 또는 Genehog를 형질전화시키고, 카나마이신(50mg/l)을 함유하는 LB 한천 배지에서 선별하였다. 개별적 클론으로부터의 DNA를 카나마이신(50 mg/l)를 함유하는 LB 액체 배지에서 37℃로 포화되게 세포를 성장시켜 분리하였다. 포화된 세포 배양물을 LB+Kan+IPTG에서 1:20으로 희석하고, 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. Plasmid Maxi kit (QIAGEN)을 사용하여 분리된 클론으로부터 플라스미드 DNA를 얻었다.
도 7A는 부모 잡종 벡터(클론 C)에 비교되는 세균성 형질전환으로부터 얻어진 두 타입의 클론(클론 1 및 클론 2)의 제한 분석을 보여준다. 클론 1과 클론 2는 >100 kb의 DNA로 구성되나, 부모 잡종 벡터는 단지 23 kb의 DNA로 구성되는데, 이는 거대한 부분의 DNA가 잡종 벡터에 의하여 확실히 포획되었음을 나타낸다. 제한 맴핑은 클론 1이 엽록체 게놈의 약 절반을 포함하는 것을 보여준다(도 8A). 잡종 벡터에 인접한 영역의 DNA 서열 분석은 재조합이 C. 레인하르티 카나마이신 저항성 카세트의 3' UTR(C. 레인하르티의 rbcL 유전자로부터의 3' UTR)과 C. 레인하르티 스트렙토마이신 저항성 카세트의 3' UTR(C. 레인하르티의 rbcL 유전자로부터의 3' UTR) 사이에서 일어남을 보여준다. 클론 1은 C. 레인하르티 카나마이신 저항성 카세트를 보유하였으나, C. 레인하르티 스트렙토마이신 저항성 카세트를 잃었다. 제한 맴핑은 클론 2는 엽록체 게놈의 약 절반을 포함하는 것을 보여주었다(도 8B). 그러나, 잡종 벡터에 인접한 영역의 DNA 서열 분석은 다른 재조합이 발생하여 클론 2가 얻어졌음을 보여준다. C. 레인하르티의 카나마이신 저항성 카세트의 5' UTR(C. 레인하르티의 atpA 유전자로부터의 5' UTR)은 C. 레인하르티 엽록체 게놈의 atpA 유전자의 5' UTR과 재조합되고, 역반복 B(도 8의 IR-B)는 역반복 A(eh 8의 IR-A)와 재조합되었다. 클론 2는 C. 레인하르티 카나마이신 저항성 카세트 및 C. 레인하르티 스트렙토마이신 저항성 카세트를 잃었다.
잡종 벡터가 효모에서 안정한 복제를 보조한다는 것을 보여주기 위하여, 클론 1을 리튬 아세테이트 방법으로 효모 종 AB1380으로 형질전환시키고, 형질전환체를 CSM-Trp 한천 배지상에서 선별하였다. 형질전환체를 클론 1의 엽록체 게놈 DNA를 갖는 영역을 증폭하는 프라이머 쌍(서열번호: 97 및 98)을 사용하여 PCR 검정하였다. 원하는 클론은 기대되는 크기의 PCR 생산물을 나타내는 것이다. 각각의 PCR 양성 클론을 분리물 당 다중 클론을 생산하기 위하여 스트리킹하였다. DNA를 분리된 효모 클론으로부터 준비하고, 세균으로 형질전환시켰다. 세균을 클론 1의 엽록체 게놈 DNA 내의 영역을 증폭하는 프라이머 쌍(서열번호: 97 및 98)을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 원하는 클론은 기대되는 크기의 PCR 생산물을 나타내는 것이다. DNA를 분리된 세균 클론으로부터 분리하고, EcoRI으로 절단하여 분석하였다. 도 7B는 모든 분리된 클론들이 원래 분리된 클론 1과 동일한 제한 맴을 갖는 것을 보여준다. 따라서, 잡종 벡터는 효모에서 안정된 복제를 돕는다.
포획된 DNA가 진정한 엽록체 게놈 DNA인지를 확인하기 위하여, 서든 블랏을 수행하였다. 세균으로부터 얻어진 클론 1과 2를 EcoRI으로 절단하고, 겔 전기영동으로 분리하여, 멤브레인에 트랜스퍼하고, C. 레인하르티로부터의 방사성 HindIII-절단된 총 DNA로 탐침하였다. 도 7C는 클론 1과 2의 DNA는 신호의 증가를 나타내었으며, 이는 포획된 DNA가 엽록체 게놈 DNA임을 보여주는 것이다.
실시예 7: 조류 내에 엽록체 게놈의 재도입
본 실험을 위하여, 모든 형질전환을 내생적 psbA 유전자좌로부터 SAA를 발현하는 C. 레인하르티 종 W1.1, 또는 내생적 psbA 유전자좌로부터 LuxAB를 발현하는 W1-1에서 수행하였다. W1.1와 W1-1는 16S rRNA에 돌연변이를 도입하는 p228의 형질전환으로 인하여 스펙티노마이신에 저항성이다. 세포는 100rpm으로 세팅된 로터리 쉐이커에서 450Lux의 일정한 빛으로 23℃에서 TAP 배지 (Gorman and Levine, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 54:1665-1669, 1965, 참고문헌으로 본 발명에 통합됨)에서 후기 로그 페이스(약 7일)까지 성장되었다. 50ml의 세포를 23℃에서 4,000xg, 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. 상등액을 버리고, 세포를 입자 총으로 순차적인 엽록체 형질전환을 위하여 HSM 배지에 재현탁시켰다(Cohen et al., supra, 1998). 모든 형질전환을 HSM 한천 배지에서 수행하였다.
형질전환체를 HSM에서 성장하는 것으로 선별하였으며, 이는 psbA 유전자의 유전자좌의 기능이 회복되었음을 말한다. 또한, 클론을 TAP, 스펙티노마이신(150μg/ml)를 함유하는 TAP, 카나마이신(100μg/ml)을 함유하는 TAP, HSM, 및 카나마이신(100μg/ml)을 함유하는 HSM 상의 성장을 순차적으로 확인하였다. 도 9는 클론 1로 형질전환된 W1-1은 모든 배지 형태에서 성장할 수 있다는 것을 보여준다. 도 9는 클론 2로 형질전환된 W1-1은 카나마이신을 함유하는 배지에서 성장할 수 없다는 것을 보여주는데, 이는 클론 2가 Kan 저항성 마커를 함유하지 않기 때문이다.
실시예 8: 바이오매스 -분해 효소를 생산하기 위한 엽록체의 변형
자일라나아제의 생산을 위한 포획된 엽록체 게놈 DNA를 변형시키기 위하여, 조류 발현 카세트를 실시예 4에서 설명된 효모 마커 벡터로 클로닝하였다. 요약하면, C. 레인하르티 엽록체 발현 벡터를 psbD 유전자에 대한 5' UTR 및 C. 레인하르티로부터의 psbA 유전자에 대한 3' UTR에 의하여 조절되는 T. 리세이로부터의 자일라나아제를 갖는 DNA (서열번호: 18)의 단편을 절단하기 위하여 SpeI 으로 절단하였다. 블런트 말단을 형성시키기 위하여 클레노우 단편으로 상기 단편을 처리하고, pUC1-URA3 / ADE2, pUC3-URA3 / LEU2, 및 pUC4-URA3/HIS3 내의 효모 마커 사이의 SmaI (XmaI)으로 클로닝하였다. 도 10A는 새로운 벡터 내의 여러가지 요소의 배열을 보여준다.
엽록체 게놈 DNA를 상기 변형 벡터를 포획된 DNA를 갖는 효모 내로 형질전환시킴으로써 변형시켰다. 형질전환을 위하여, 모든 변형 벡터를 NotI으로 절단하여 선형화하였다. (실시예 6으로부터의) 클론 1을 갖는 효모를 CSM-Trp 배지에서 30℃로 포화될 때까지 성장시키고, YPAD에서 1:20으로 희석시키고, 30℃에서 4시간 동안 성장시켰다. 효모를 리튬 아세테이트법으로 형질전환시키고, 형질전환체를 CSM-Ura 배지에서 성장시킴으로써 선별하였다. 형질전환체를 CSM-Trp-Ura 배지에서 전파시키고, 다음으로 자일라나아제 발현 카세트(서열번호: 95 및 96) 및 염록체 게놈 DNA(서열번호: 97 및 98)에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 스크리닝하였다. 원하는 클론은 양 반응에서 기대되는 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이었다. DNA를 분리된 효모 클론으로부터 준비하고, 세균으로 형질전환시켰다. 세균을 자일라나아제 발현 카세트(서열번호: 95 및 96) 및 염록체 게놈 DNA(서열번호: 97 및 98)에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 스크리닝하였다. 원하는 클론은 양 반응에서 기대되는 크리의 PCR 생산물을 제공하는 것들이었다. DNA를 분리된 세균 클론으로부터 준비하고, EcoRI으로 절단하여 분석하였다. 도 10B는 분리된 클론들이 원하는 위치에 자일라나아제 발현 카세트의 통합과 일치하는 제한 지도를 갖는 것을 보여준다.
본 실험을 위하여, 모든 형질전환을 내생적 psbA 유전자좌로부터 SAA를 발현하는 C. 레인하르티 종 W1.1, 또는 내생적 psbA 유전자좌로부터 LuxAB를 발현하는 W1-1에서 수행하였다. W1.1와 W1-1는 16S rRNA에 돌연변이를 도입하는 p228의 형질전환으로 인하여 스펙티노마이신에 저항성이다. 세포는 100rpm으로 세팅된 로터리 쉐이커에서 450Lux의 일정한 빛으로 23℃에서 TAP 배지 (Gorman and Levine, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 54:1665-1669, 1965, 참고문헌으로 본 발명에 통합됨)에서 후기 로그 페이스(약 7일)까지 성장되었다. 50ml의 세포를 23℃에서 4,000xg, 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. 상등액을 버리고, 세포를 입자 총으로 순차적인 엽록체 형질전환을 위하여 HSM 배지에 재현탁시켰다(Cohen et al., supra, 1998). 모든 형질전환을 HSM 한천 배지에서 수행하였다.
형질전환체를 HSM에서 성장하는 것으로 선별하였으며, 이는 psbA 유전자의 유전자좌의 기능이 회복되었음을 말한다. PCR을 엔도자일라나아제 발현 카세트를 포함하는 형질전환체를 확인하기 위하여 사용하였다. PCR 분석을 위하여, 106 조류 세포(한천 플레이트 또는 액체배양액 기원)를 10 mM EDTA에 현탁시키고, 95℃에서 10분 동안 가열하고, 다음으로 약 23℃로 식혔다. 반응 완충액, MgCl2, dNTPs, PCR 프라이머 쌍(들)(표 2), DNA 중합효소, 및 물로 이루어지는 PCR 칵테일을 준비하였다. EDTA 내의 조류 세포용해물을 반응을 위한 기질로 제공하기 위하여 첨가하였다. 마그네슘 농도를 조류 세포 용해물과 첨가된 EDTA의 양 및 농도와 상쇄되게 변화되었다. 어닐링 온도 경사를 특정 프라이머 쌍에 대한 최적 어닐링 온도를 결정하기 위하여 적용하였다.
엔도자일라나아제 발현 카세트를 갖는 종을 확인하기 위하여, 프라이머 쌍(서열번호: 95 및 96)을 사용하여 엔도자일라나아제 발현 카세트 내의 영역을 증폭하였다. 원하는 클론은 기대되는 크기의 PCR 생산물을 얻는 것들이다. 도 11A는 다수의 조류 종들이 획득되었으며, 엔도자일라나아제 발현 카세트를 포함함을 보여준다(PCR 생산물은 별표로 나타내었다).
작용 자일라나아제가 발현되는지를 결정하기 위하여, 효소 활성을 시험하였다. 카나마이신(100μg/mL)을 함유하는 TAP 한천 플레이트로부터 세포 패치(패치 당 약 2mg)를 둥근 바닥 96 웰 플레이트(Corning)의 100mM 소듐아세테이트 pH 4.8 50μl에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 20μl의 BugBuster Protein Extraction Reagent (Novagen)를 첨가하여 용해시키고, 실온에서 5분 동안 흔들어주었다. 세포용해물(50μl)을 블랙 96 웰 플레이트로 트랜스퍼하고, 결과의 웰의 클로로필 형광을 695nm 컷오프 필터를 갖는 440nm의 여기파장 및 740nm의 방출 파장으로 SpectraMax M2 microplate reader (Molecular Devices)에서 측정하였다. RFUs (상대적 형광 단위)로 측정된 클로로필 신호를 반응에 첨가된 바이오매스의 양으로 자일라나아제 활성 신호를 정상화시키기 위하여 사용하였다.
클로로필 형광의 측정 후, 자일라나아제 기질을 첨가하였다. EnzCheck Ultra Xylanase substrate (Invitrogen)을 50μg/ml의 농도로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.8에 녹이고, 50μl의 기질을 마이크로 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 형광 신호를 컷오프 필터 없이, 여기 파장 360nm 방출 파장 460nm로 42℃로 세팅된 플레이트 챔버의 SpectraMax M2 microplate reader (Molecular Devices)로 측정하였다. 형광 신호를 15분 동안 측정하였고, 효소 속도를 Softmax Pro v5.2 (Molecular Devices)로 계산하였다. 효소 속도는 RFU/분로 기록하였다. 효소 특이적 활성을 클로로필 형광의 RFU 당 분당 밀리RFU로 계산하였다. 도 11B는 위치 1, 3, 및 4에서 자일라나아제 발현 카세트를 함유하는 다수 조류 종(도 3 및 10 참고)이 작용 자일라나아제 효소를 생산한다는 것을 보여준다.
실시예 9: 테르펜을 생산하기 위한 엽록체 게놈의 변형
FPP 합성효소의 생산을 위한 포획된 엽록체 게놈 DNA를 변형시키기 위하여, 조류 발현 카세트를 실시예 4에서 설명된 효모 마커 벡터로 클로닝하였다. 요약하면, C. 레인하르티로부터의 psbD 유전자에 대한 5' UTR 및 C. 레인하르티로부터의 psbA 유전자에 대한 3' UTR에 의하여 조절되는 G. 갈러스로부터의 FPP 합성효소를 갖는 DNA (서열번호: 19)의 단편을 절단하기 위하여 SpeI 으로 절단하였다. 블런트 말단을 형성시키기 위하여 클레노우 단편으로 상기 단편을 처리하고, pUC1-URA3 / ADE2, pUC3-URA3 / LEU2, 및 pUC4-URA3/HIS3 내의 효모 마커 사이의 SmaI (XmaI)으로 클로닝하였다. 도 10A는 새로운 벡터 내의 여러가지 요소의 배열을 보여준다.
엽록체 게놈 DNA를 상기 변형 벡터를 포획된 DNA를 갖는 효모 내로 형질전환시킴으로써 변형시켰다. 형질전환을 위하여, 모든 변형 벡터를 NotI으로 절단하여 선형화하였다. (실시예 6으로부터의) 클론 1을 갖는 효모를 CSM-Trp 배지에서 30℃로 포화될 때까지 성장시키고, YPAD에서 1:20으로 희석시키고, 30℃에서 4시간 동안 성장시켰다. 효모를 리튬 아세테이트법으로 형질전환시키고, 형질전환체를 CSM-Ura 배지에서 성장시킴으로써 선별하였다. 형질전환체를 CSM-Trp-Ura 배지에서 전파시키고, 다음으로 FPP 합성효소 발현 카세트(서열번호: 95 및 99) 및 염록체 게놈 DNA(서열번호: 97 및 98)에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 스크리닝하였다. 원하는 클론은 양 반응에서 기대되는 크리의 PCR 생산물을 제공하는 것들이었다. DNA를 분리된 효모 클론으로부터 준비하고, 세균으로 형질전환시켰다. 세균을 FPP 합성효소 발현 카세트(서열번호: 95 및 99) 및 엽록체 게놈 DNA(서열번호: 97 및 98)에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 스크리닝하였다. 원하는 클론은 양 반응에서 기대되는 크리의 PCR 생산물을 제공하는 것들이었다. DNA를 분리된 세균 클론으로부터 준비하고, 제한 효소 절단하여 분석하였다. 도 10C는 분리된 클론들이 원하는 위치에 FPP 합성 효소 발현 카세트의 통합과 일치하는 제한 지도를 갖는 것을 보여준다.
본 실험을 위하여, 모든 형질전환을 내생적 psbA 유전자좌로부터 SAA를 발현하는 C. 레인하르티 종 W1.1, 또는 내생적 psbA 유전자좌로부터 LuxAB를 발현하는 W1-1에서 수행하였다. W1.1와 W1-1는 16S rRNA에 돌연변이를 도입하는 p228의 형질전환으로 인하여 스펙티노마이신에 저항성이다. 세포는 100rpm으로 세팅된 로터리 쉐이커에서 450Lux의 일정한 빛으로 23℃에서 TAP 배지 (Gorman and Levine, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 54:1665-1669, 1965, 참고문헌으로 본 발명에 통합됨)에서 후기 로그 페이스(약 7일)까지 성장되었다. 50ml의 세포를 23℃에서 4,000xg, 5분 동안 원심분리하여 수거하였다. 상등액을 버리고, 세포를 입자 총으로 순차적인 엽록체 형질전환을 위하여 HSM 배지에 재현탁시켰다(Cohen et al., supra, 1998). 모든 형질전환을 HSM 한천 배지에서 수행하였다.
형질전환체를 HSM에서 성장하는 것으로 선별하였으며, 이는 psbA 유전자의 유전자좌의 기능이 회복되었음을 말한다. PCR을 FPP 합성효소 발현 카세트를 포함하는 형질전환체를 확인하기 위하여 사용하였다. PCR 분석을 위하여, 106 조류 세포(한천 플레이트 또는 액체배양액 기원)를 10 mM EDTA에 현탁시키고, 95℃에서 10분 동안 가열하고, 다음으로 약 23℃로 식혔다. 반응 완충액, MgCl2, dNTPs, PCR 프라이머 쌍(들), DNA 중합효소, 및 물로 이루어지는 PCR 칵테일을 준비하였다. EDTA 내의 조류 세포용해물을 반응을 위한 기질로 제공하기 위하여 첨가하였다. 마그네슘 농도를 조류 세포 용해물과 첨가된 EDTA의 양 및 농도와 상쇄되게 변화되었다. 어닐링 온도 경사를 특정 프라이머 쌍에 대한 최적 어닐링 온도를 결정하기 위하여 적용하였다.
FPP 합성효소 발현 카세트를 갖는 종을 확인하기 위하여, 프라이머 쌍을 사용하여 엔도자일라나아제 발현 카세트 내의 영역을 증폭하였다. 원하는 클론은 기대되는 크기의 PCR 생산물을 얻는 것들이다. 다수의 조류 종들이 획득되었으며, FPP 합성효소 발현 카세트를 포함함을 보여준다(도 12, PCR 생산물은 별표로 나타내었다).
실시예 11: 부분적 엽록체 게놈 갭-필링
본 실시예에서, 시스템은 효모에서의 재조합에 의하여 엽록체 DNA를 포획하기 위한 잡종 갭-필링 벡터를 사용하여 확립된다(도 13). 엽록체 DNA를 포획하기 위한 잡종 갭-필링 벡터를 조작하기 위하여, 벡터 PDOCI-B5A10(서열번호: 20)를 생산하였다. C. 레인하르티 엽록체 게놈의 부분을 psbD 유전자(A10, 서열번호: 27 및 28)에 인접한 영역 및 psbH 유전자(B5, 서열번호: 787 및 788)에 인접한 영역에 특이적인 두 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭하였다. 각 PCR 생성물은 NotⅠ 및 I-SceⅠ으로 절단하고, PDOCI-B5A10(서열번호: 20)을 생성하기 위한 I-SceⅠ으로 절단된 pDOCI(서열번호: 1)에 연결시켰다.
엽록체 DNA, pTRP-B5A10을 포획하기 위한 잡종 갭 필링을 효모에서 재조합을 사용하여 구축하였다. 요약하면, pDOCI-B5A10(서열번호: 20)을 엽록체 게놈-특이적 요소를 잡종 갭-필링 벡터로 도입하는 카세트를 자유롭게 하기 위하여 PacI 및 AscI으로 절단하였다. 이 카세트를 pTRP-AU와 함께 리튬 아세테이트법에 의하여 효모 종 YPH858로 형질전환시켰다. 상동성 재조합이 형질전환된 효모 세포의 생체 내에서 발생하였다. 카세트가 정확하게 통합된 형질전환체를 5-플루오로오라트산(5-FOA)을 함유하는 CSM-Trp 한천 배지상에서 붉은 색으로 성장한 것에 기초하여 분리하였다. 5-FOA는 기능성 URA3 유전자를 결한 클론을 선택하고, 붉은 색은 ADE2 유전자가 제거된 경우에 나타난다. 플라스미드 DNA를 CSM-Trp 액체 배지에서 성장된 효모 클론으로부터 분리하고, 대장균(DH10B)으로 형질전환시켰다. 다량의 pTRP-10-Kan를 생산하기 위하여, pTRP-10-Kan를 갖는 DH10B 세포를 LB+Kan (50 μg/mL), 37℃에서 포화로 성장시키고, LB+Kan+IPTG에서 1:20으로 희석한 후, 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. DNA를 Plasmid Maxi kit (QIAGEN)를 사용하여 세균성 배양으로부터 얻었다.
원하는 게놈 DNA를 표적 게놈 DNA(도 13에서 A10 및 B5로 나타냄)의 영역에 높은 상동성을 갖는 갭 필링 벡터에서 상기 위치를 사용하여 포획하였다. 선형화된 갭 필링 벡터 DNA 및 엽록체 게놈 DNA를 실시예 2에서 설명된 리튬 아세테이트 또는 스페로플라스트 법을 사용하여 효모로 형질전환하기 위하여 사용하였다. 상동성 재조합이 형질전환된 효모 세포의 생체 내에서 일어났다. 표적 DNA가 상동성 재조합을 통하여 벡터에 의하여 포획되면, 상기 DNA는 효모 및 세균 시스템에서 안정적으로 복제될 수 있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 갭 필링 벡터는 선별 가능한 마커 TRP1을 함유한다. 그러므로, 효모 세포를 양성 형질전환체를 스크리닝하기 위하여 트립토판 없는 배지에 플레이팅하였다. 트립토판 없는 배지에서 성장하는 형질전환된 종은 갭 필링 플라스미드에서 표적 DNA 삽입물의 존재에 대하여 스크리닝되었다. 이러한 스크리닝은 예를 들어, 제한효소 절단, PCR 및/또는 겔 전기영동과 같은 공지 기술에 의할 수 있다.
효모 형질전환체를 엽록체 게놈 DNA에 특이적 프라이머(서열번호: 89 및 90)을 사용하여 PCR로 스크리닝되었다. 원하는 클론은 기대된 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA를 분리된 효모 클론으로부터 준비하고, 세균에 형질전환시켰다. 세균 형질전환체는 엽록체 게놈 DNA에 특이적인 프라이머(서열번호: 89 및 90)을 사용하여 PCR 스크리닝되었다. 원하는 클론은 기대된 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA가 분리된 세균 클론으로부터 준비되고, EcoRI 한 효소로 분석되었다.
실시예 12: 완전한 엽록체 게놈 갭 필링
본 실시예에서, 시스템은 효모에서의 재조합에 의하여 완전한 엽록체 게놈을 포획하기 위한 잡종 갭-필링 벡터를 사용하여 확립된다(도 14). 엽록체 DNA, pTRP-10을 포획하기 위한 잡종 갭 필링을 효모에서 재조합을 사용하여 구축하였다. 요약하면, pDOCI-10(실시예 3에서 설명됨, 서열번호: 3)을 엽록체 게놈-특이적 요소를 잡종 갭-필링 벡터로 도입하는 카세트를 자유롭게 하기 위하여 PacI 및 AscI으로 절단하였다. 이 카세트를 pTRP-AU와 함께 리튬 아세테이트법에 의하여 효모 종 YPH858로 형질전환시켰다. 상동성 재조합이 형질전환된 효모 세포의 생체 내에서 발생하였다. 카세트가 정확하게 통합된 형질전환체를 5-플루오로오라트산(5-FOA)을 함유하는 CSM-Trp 한천 배지상에서 붉은 색으로 성장한 것에 기초하여 분리하였다. 5-FOA는 기능성 URA3 유전자를 결한 클론을 선택하고, 붉은 색은 ADE2 유전자가 제거된 경우에 나타난다. 플라스미드 DNA를 CSM-Trp 액체 배지에서 성장된 효모 클론으로부터 분리하고, 대장균(DH10B)으로 형질전환시켰다. 다량의 pTRP-10-Kan를 생산하기 위하여, pTRP-10-Kan를 갖는 DH10B 세포를 LB+Kan (50 μg/mL), 37℃에서 포화로 성장시키고, LB+Kan+IPTG에서 1:20으로 희석한 후, 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. DNA를 Plasmid Maxi kit (QIAGEN)를 사용하여 세균성 배양으로부터 얻었다.
원하는 게놈 DNA를 표적 게놈 DNA(도 14에서 A10 및 B10으로 나타냄)의 영역에 높은 상동성을 갖는 갭 필링 벡터에서 상기 위치를 사용하여 포획하였다. 선형화된 갭 필링 벡터 DNA 및 엽록체 게놈 DNA를 실시예 2에서 설명된 리튬 아세테이트 또는 스페로플라스트 법을 사용하여 효모로 형질전환하기 위하여 사용하였다. 상동성 재조합이 형질전환된 효모 세포의 생체 내에서 일어났다. 표적 DNA가 상동성 재조합을 통하여 벡터에 의하여 포획되면, 상기 DNA는 효모 및 세균 시스템에서 안정적으로 복제될 수 있다. 도 1에 나타난 바와 같이, 갭 필링 벡터는 선별 가능한 마커 TRP1을 함유한다. 그러므로, 효모 세포를 양성 형질전환체를 스크리닝하기 위하여 트립토판 없는 배지에 플레이팅하였다. 트립토판 없는 배지에서 성장하는 형질전환된 종은 갭 필링 플라스미드에서 표적 DNA 삽입물의 존재에 대하여 스크리닝되었다. 이러한 스크리닝은 예를 들어, 제한효소 절단, PCR 및/또는 겔 전기영동과 같은 공지 기술에 의할 수 있다.
효모 형질전환체를 엽록체 게놈 DNA에 특이적 프라이머(서열번호: 89 및 90)을 사용하여 PCR로 스크리닝되었다. 원하는 클론은 기대된 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA를 분리된 효모 클론으로부터 준비하고, 세균에 형질전환시켰다. 세균 형질전환체는 엽록체 게놈 DNA에 특이적인 프라이머(서열번호: 89 및 90)을 사용하여 PCR 스크리닝되었다. 원하는 클론은 기대된 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA가 분리된 세균 클론으로부터 준비되고, EcoRI 한 효소로 분석되었다.
실시예 13: 완전한 엽록체 게놈 상에서 재조립
어떤 경우에 있어서, 엽록체 게놈은 다른 플라스미드로 나누어질 수 있으며, 전체로서 전체 게놈을 포함한다(도 15). 이러한 예에서, 더 작은 부분의 포획은 게놈 내의 다중 위치의 빠르고 복잡한 변형을 촉진시킬 수 있다. 엽록체 게놈 단편은 다음으로 완전 (및 가능하게 변형된) 엽록체 게놈을 재형성하기 위하여 결합된다.
본 실시예에서, 엽록체는 두 벡터로 나누어졌다. 하나의 벡터는 B5로부터 A10까지의 엽록체 게놈 DNA, 또는 뉴클레오티드 76400에서 176500(NCBI, NC_005353으로부터 이용가능한 서열에 따름)로 각각 이루어진다. 이 벡터는 실시예 11에서 설명된 과정으로 얻어질 수 있다. 다른 벡터는 B10으로부터 A5까지의 엽록체 게놈 DNA, 또는 뉴클레오티드 176500에서 76400(NCBI, NC_005353으로부터 이용가능한 서열에 따름)로 각각 이루어진다. 이 벡터는 실시예 6에서 설명된 과정으로 얻어질 수 있는 클론 1과 동일한 것이다. 양 벡터는 잡종 벡터 서열을 공유하고, 재조합을 위한 상동성의 영역으로서 사용될 수 있다. 본 실시예에서, 재조합은 영역 A10 및 B10 사이의 잡종 벡터 서열에 삽입된다(도 5). 그러나, 영역 A5 및 B5를 연결하는 재조합을 촉진시키기에 충분한 상동성은 없다(도 5). 그러므로, A5 및B5에 상동성인 서열 사이에 선별가능한 마커를 갖는 세번째 벡터가 첨가된다.
엽록체 게놈을 모든 세가지 벡터를 결합하고, 실시예 2에서 설명된 리튬 아세테이트 또는 스페로플라스트 법을 사용하여 효모로 형질전환하여 재조립하였다. 상동성 재조합이 형질전환된 효모 세포의 생체 내에서 일어났다. 표적 DNA가 상동성 재조합을 통하여 얻어지면, 상기 DNA는 효모 및 세균 시스템에서 안정적으로 복제될 수 있다. 도 15에 나타난 바와 같이, 세번째 벡터는 선별가능한 마커 URA3 및 ADE2를 포함한다. 그러므로, 효모 세포를 양성 형질전환체를 스크리닝하기 위하여 트립토판 없는 배지에 플레이팅하였다. 우라실 및/또는 아데닌 없는 배지에서 성장하는 형질전환된 종은 갭 필링 플라스미드에서 표적 DNA 삽입물의 존재에 대하여 스크리닝되었다. 이러한 스크리닝은 예를 들어, 제한효소 절단, PCR 및/또는 겔 전기영동과 같은 공지 기술에 의할 수 있다.
효모 형질전환체를 엽록체 게놈 DNA에 특이적 프라이머(서열번호: 89 및 90)을 사용하여 PCR로 스크리닝되었다. 원하는 클론은 기대된 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA를 분리된 효모 클론으로부터 준비하고, 세균에 형질전환시켰다. 세균 형질전환체는 엽록체 게놈 DNA에 특이적인 프라이머(서열번호: 89 및 90)을 사용하여 PCR 스크리닝되었다. 원하는 클론은 기대된 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA가 분리된 세균 클론으로부터 준비되고, EcoRI 한 효소로 분석되었다.
실시예 14: 외래성 숙주에서 엽록체 게놈 DNA 영역을 제거하기 위한 벡터 및 방법
엽록체 게놈 DNA의 영역을 제거하기 위한 벡터를 생산하기 위하여, 엽록체 DNA의 800-1000 bp 영역을 도 4에 나타낸 위치에 인접한 5' 및 3' 영역에 어닐링하는 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하였다.(위치 1-5' 서열번호: 1079 및 1080; 위치 1-3' 서열번호: 1125 및 1126; 위치 3-5' 서열번호: 1083 및 1084; 위치 3-3' 서열번호: 1129 및 1130; 위치 4-5' 서열번호: 1087 및 1088; 위치 4-3' 서열번호: 1133 및 1134; 위치 5-5' 서열번호: 789 및 790; 위치 5-3' 서열번호: 787 및 788; 및 위치 7-5' 서열번호: 1091 및 1092; 위치 7-3' 서열번호: 1089 및 1090). 다른 위치에 대한 5' 및 3' 영역으로부터의 PCR 생산물의 쌍을 NotI 및 I-SceI으로 절단하고, 혼합하고, NotI-절단된 pUC-SE (서열번호: 2)에 연결하였다. 효모 선별 마커의 쌍(실시예 4에서 설명됨)을 SalI을 사용하여 5' 및 3' 단편 사이에 클로닝하였다.
엽록체 게놈 DNA의 영역을 포획된 DNA를 갖는 효모 내로 결실 벡터를 형질전환시킴으로써 제거하였다. 형질전환을 위하여, 모든 변형 벡터를 NotI으로 절단하여 선형화하였다. 원하는 클론을 갖는 효모를 CSM-Trp 배지에서 30℃로 포화될 때까지 성장시키고, YPAD에서 1:20으로 희석시키고, 30℃에서 4시간 동안 성장시켰다. 효모를 리튬 아세테이트법으로 형질전환시키고, 형질전환체를 CSM-Ura 배지에서 성장시킴으로써 선별하였다. 형질전환체를 CSM-Trp-Ura 배지에서 전파시키고, 표적 영역 및 결실 벡터에 의하여 표적되지 않은 엽록체 게놈 DNA의 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 스크리닝하였다. 원하는 클론은 표적 영역에 대한 생산물을 제공하지 않지만, 표적되지 않은 지역에 기대되는 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA를 분리된 효모 클론으로부터 준비하고, 세균으로 형질전환시켰다. 세균을 표적된 영역 및 결실 벡터에 의하여 표적되지 않는 엽록체 게놈 DNA의 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 스크리닝하였다. 원하는 클론은 표적 영역에 대한 생산물을 제공하지 않지만, 표적되지 않은 지역에 기대되는 크기의 PCR 생산물을 제공하는 것들이다. DNA를 분리된 세균 클론으로부터 준비하고, 제한 효소 절단하여 분석하였다.
본 발명에서 적용가능한 다양한 구성뿐만 아니라 여러가지 변형, 공정이 분명하게 될 것이다. 여러가지 관점, 특징 또는 구체예들이 이해, 신뢰, 이론, 수행 시도, 및/또는 실시 또는 예시적 실시예와 관련하여 설명되거나 서술될 수 있지만, 어떠한 특정 이해, 신뢰, 이론, 수행 시도, 및/또는 실시 또는 예시적 실시예에 한정되지 않음을 이해하여야 한다. 여러가지 측면 및 특징이 여러가지 구체예 및 특정 실시예에 의하여 설명되었지만, 그것이 첨부된 청구항 및 본 출원과 관련된 다른 청구항의 완전한 범위에 관하여 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
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Claims (143)

  1. 원형 엽록체 게놈을 조립하기 위한 다수개의 벡터이며,
    상기 다수개의 벡터는 각각 적어도 20 kb의 엽록체 DNA를 포함하고, 광합성을 수행하는데 필수적인 모든 엽록체 유전자를 집합적으로 포함하고;
    상기 다수개의 벡터 중 각각의 벡터는 상기 다수개의 벡터 중 1 또는 2개의 다른 벡터와의 상동성 재조합을 위한 2개의 영역을 포함하고,
    상기 다수개의 벡터 중 적어도 하나의 벡터는 효모 DNA 복제 성분을 포함하고, 상기 다수개의 벡터 중 적어도 하나의 벡터는 세균 DNA 복제 성분을 포함하고, 상기 효모 및 세균 DNA 복제 성분을 포함하는 상기 벡터는 동일하거나 상이할 수 있고,
    상기 다수개의 벡터 중 적어도 하나의 벡터는 적어도 하나의 효모 선별 마커를 포함하는 효모 안정성 성분을 포함하고, 안정성 성분을 포함하는 상기 적어도 하나의 벡터는 효모 DNA 복제 성분을 함유하지 않는 것인, 원형 엽록체 게놈을 조립하기 위한 다수개의 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다수개의 벡터가 2개의 벡터를 포함하고, 상기 각각의 벡터는 서로와의 상동성 재조합을 위한 2개의 영역을 포함하는 것인 다수개의 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효모 DNA 복제 성분이 효모 센트로미어, 효모 자가 복제 서열, 또는 이들 둘 다인 다수개의 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세균 DNA 복제 성분이 P1 복제 서열 또는 F 인자 복제 서열인 다수개의 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 다수개의 벡터가 단일 효모 DNA 복제 성분을 포함하는 것인 다수개의 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 효모 DNA 복제 성분 및 상기 세균 DNA 복제 성분이 동일한 벡터에 함유된 것인 다수개의 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 원형 엽록체 게놈 내로 조립될 때 상기 엽록체 DNA가 적어도 140 kb의 DNA를 함유하는 것인 다수개의 벡터.　
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 벡터가 화학 합성 DNA를 포함하는 것인 다수개의 벡터.　
  9. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 벡터가 광합성 생물로부터의 게놈 엽록체 DNA를 포함하는 것인 다수개의 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 광합성 생물로부터의 상기 게놈 엽록체 DNA가 적어도 하나의 변형을 포함하는 것인 다수개의 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형이 이종 또는 동종 폴리뉴클레오티드의 삽입, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 결실, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 삽입, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 돌연변이, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 재배열, 또는 이들이 조합인　다수개의 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 상기 효모 안정성 성분이 효모 선별 마커의 쌍을 포함하는 것인 다수개의 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 효모 선별 마커의 쌍이 URA3 유전자 및 추가적인 효모 선별 마커인 다수개의 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 추가적인 효모 선별 마커가 ADE 유전자, LEU 유전자, HIS 유전자, LYS 유전자 또는 G418 유전자인 다수개의 벡터.　
  15. 제12항에 있어서, 각각의 벡터가 효모 안정성 성분을 포함하고, 상기 효모 안정성 성분이 다른 효모 선별 마커의 쌍을 포함하는 것인 다수개의 벡터.
  16. 제1항의 다수개의 벡터를 포함하는 진균 또는 세균 숙주 생물.
  17. 각각의 벡터가 적어도 20 kb의 엽록체 DNA를 포함하고, 광합성을 수행하는데 필수적인 모든 엽록체 유전자를 집합적으로 포함하는 다수개의 벡터를 수득하는 단계이며,
    상기 다수개의 벡터 중 각각의 벡터는 상기 다수개의 벡터 중 1 또는 2개의 다른 벡터와의 상동성 재조합을 위한 2개의 영역을 포함하고,
    상기 다수개의 벡터 중 적어도 하나의 벡터는 효모 DNA 복제 성분을 포함하고, 상기 다수개의 벡터 중 적어도 하나의 벡터는 세균 DNA 복제 성분을 포함하고, 상기 효모 및 세균 DNA 복제 성분을 포함하는 상기 벡터는 동일하거나 상이할 수 있고,
    상기 다수개의 벡터 중 적어도 하나의 벡터는 적어도 하나의 효모 선별 마커를 포함하는 효모 안정성 성분을 포함하고, 안정성 성분을 포함하는 상기 적어도 하나의 벡터는 효모 DNA 복제 성분을 함유하지 않는 것인 단계;
    상기 다수개의 벡터를 효모 내로 도입하여 상기 다수개의 벡터를 상동성 재조합에 의해 조립함으로써, 조립된 원형 엽록체 게놈을 생산하는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 안정성 성분의 존재에 대해 선별함으로써 상기 원형 엽록체 게놈의 완전한 조립에 대해 선별하는 단계
    를 포함하는, 원형 엽록체 게놈의 조립 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 다수개의 벡터가 2개의 벡터를 포함하고, 상기 각각의 벡터는 서로와의 상동성 재조합을 위한 2개의 영역을 포함하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 효모 DNA 복제 성분이 효모 센트로미어, 효모 자가 복제 서열, 또는 이들 둘 다인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 세균 DNA 복제 성분이 P1 복제 서열 또는 F 인자 복제 서열인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 상기 다수개의 벡터가 단일 효모 DNA 복제 성분을 포함하는 것인 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 효모 DNA 복제 성분 및 상기 세균 DNA 복제 성분이 동일한 벡터에 함유된 것인 방법.
  23. 제17항에 있어서, 원형 엽록체 게놈 내로 조립될 때 상기 엽록체 DNA가 적어도 140 kb의 DNA를 함유하는 것인 방법.　
  24. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 상기 벡터가 화학 합성 DNA를 포함하는 것인 방법.　
  25. 제17항에 있어서, 적어도 하나의 상기 벡터가 광합성 생물로부터의 게놈 엽록체 DNA를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 광합성 생물이 조류인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 광합성 생물로부터의 상기 게놈 엽록체 DNA가 적어도 하나의 변형을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형이 이종 또는 동종 폴리뉴클레오티드의 삽입, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 결실, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 삽입, 하나 또는 그 이상의 핵산 염기의 돌연변이, 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드의 재배열, 또는 이들이 조합인　방법.
  29. 제17항에 있어서, 상기 효모 안정성 성분이 효모 선별 마커의 쌍을 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 효모 선별 마커의 쌍이 URA3 유전자 및 추가적인 효모 선별 마커인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 추가적인 효모 선별 마커가 ADE 유전자, LEU 유전자, HIS 유전자, LYS 유전자 또는 G418 유전자인 방법.　
  32. 제29항에 있어서, 각각의 벡터가 효모 안정성 성분을 포함하고, 상기 효모 안정성 성분이 다른 효모 선별 마커의 쌍을 포함하는 것인 방법.
  33. 제17항에 있어서, 상기 조립된 원형 엽록체 게놈을 조류, 식물 또는 시아노박테리아 숙주 생물 내로 도입하는 단계를 더 포함하는 방법.
  34. 제17항에 있어서, 상기 원형 엽록체 게놈의 완전한 조립에 대한 선별 후에 상기 적어도 하나의 안정성 성분을 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
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