JP2010512737A - 選択方法 - Google Patents
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-
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Abstract
Description
(i)遺伝子構築物を用いて植物細胞を形質転換する工程であって、この遺伝子構築物は、形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含み、第1及び第2の相同組み換えエレメントは、形質転換カセットの、植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
この形質転換カセットは、以下:
(a)当該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
この切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び/又は、抗生物質に対する抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはリコンビナーゼにより認識され得る、
工程を含む。
(a)当該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)以下を含む、切り出しカセット:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
ここで、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントは、リコンビナーゼにより認識され得る;
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を、5’−3’方向で上記において特定した順番で機能し得るように連結して含む。
(a)当該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、ここで(a)、(b)、(c)及び(d)は、5’−3’方向で上記において特定した順番で機能し得るように連結しており、
切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)第2のプロモーター、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、ここで、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントは、リコンビナーゼにより認識され得;かつ、
切り出しカセットの部分は機能し得るように連結しており、切り出しカセットは、(a)、(c)及び(d)に対して逆方向である。
(iii)植物細胞中に存在するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と機能し得るように連結した誘導性プロモーターから、植物細胞中でリコンビナーゼの発現を誘導する工程であって、リコンビナーゼが、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントを認識するものである工程、を含む。
(iii)プロモーター、プラスチドを標的とする輸送ペプチド及びリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むリコンビナーゼベクターによって植物細胞を形質転換する工程であって、リコンビナーゼが、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントを認識するものである工程、を含む。
(iii)プロモーター、プラスチドを標的とする輸送ペプチド及びリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むリコンビナーゼベクターによって植物細胞を形質転換する工程であって、プロモーターが、植物細胞中で、プラスチドを標的とする輸送ペプチド及びリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列の発現を促進することができ、植物細胞中で発現した際、リコンビナーゼポリペプチドが輸送ペプチドによりプラスチドを標的とする工程、を含む。
(i)遺伝子構築物を用いて植物細胞を形質転換する工程であって、この遺伝子構築物が、形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含み、第1及び第2の相同組み換えエレメントは、形質転換カセットの、植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
形質転換カセットは、以下:
(a)当該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはリコンビナーゼにより認識され得、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはlox部位であり、リコンビナーゼはCreである工程、を含む。
(i)遺伝子構築物を用いて植物細胞を形質転換する工程であって、この遺伝子構築物が、形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含み、第1及び第2の相同組み換えエレメントは、形質転換カセットの、植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
形質転換カセットは、以下:
(a)当該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)ポリペプチドがIPTである植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントがリコンビナーゼにより認識され得る工程、を含む。
(i)遺伝子構築物を用いて植物細胞を形質転換する工程であって、この遺伝子構築物が、形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含み、第1及び第2の相同組み換えエレメントは、形質転換カセットの、植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
形質転換カセットは、以下:
(a)当該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)ポリペプチドがIPTである植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはリコンビナーゼにより認識され得、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはlox部位であり、リコンビナーゼはCreである工程、を含む。
(i)遺伝子構築物を用いて植物細胞を形質転換する工程であって、この遺伝子構築物が、形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含み、第1及び第2の相同組み換えエレメントは、形質転換カセットの、植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
形質転換カセットは、以下:
(a)当該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)ポリペプチドがIPTである植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはリコンビナーゼにより認識され得、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはlox部位であり、リコンビナーゼはCreである工程、
(ii)IPTを欠く培地において形質転換植物細胞を選択する工程、及び
(iii)プラスチドゲノムから切り出しカセットの切り出しをもたらすレベルで、植物細胞中でCreリコンビナーゼを発現させる工程、を含む。
植物中の外来タンパク質の高レベルな発現は、毒性効果によって植物の発達に有害な影響を及ぼし得る。記載されるシステムは、プラスチドゲノム中にトランスジーンの挿入を組み合わせることにより、これを克服し、有害な効果は、CRE/loxに介在される組み換えによってIPT選択可能マーカー遺伝子が除去されるまでは休止状態にある。
プラスチドは、植物の発達の間に不可欠な役割を果たし、従って、植物体の生長、発達における正の効果を有し、及び/又は全体として植物に対し修飾された特性を与えるであろうプラスチド内のタンパク質(植物の又は非植物の)を発現することには関心が持たれている。選択可能なマーカー遺伝子としてのIPTが(一般的なスペクチノマイシン選択可能マーカー遺伝子と同様に)自然発生的なリボソーム変異体の生成を導かないという事実とあわせ、プラスチド中のトランスジーンの高い発現レベルによって、本発明はこの適用に関し理想的なシステムを提供する。
不溶性及び/又は翻訳後修飾の欠如に起因して、バクテリアの系における真核生物タンパク質の発現に伴う課題がしばしば存在する。同様に、哺乳動物細胞中で真核生物タンパク質を発現することは、高い費用及び大きな労働力を要する。本システムは、IPTマーカー遺伝子による選択及びトランスジーンの活性化を用いて、プラスチド中で真核生物タンパク質を発現させるために使用され得る。実施例2及び3に記載する通り、上述のような形質転換、選択及び再生によって、真核生物のタンパク質をコードする任意の遺伝子を、pPTI001シリーズ又はpPTI002シリーズの1つ又は全部のベクターへと挿入してもよい。再生に次いで、下流の適用のため、発現されたタンパク質を、図4及び図6中に示される親和性タグを用いて精製してもよい。
発現されるであろう可能性を有する真核生物タンパク質ファミリーの非限定的なリストには、抗体、酵素、酵素阻害剤及びデザインペプチドを含む。
プラスチドの内部共生的な起源により、プラスチド中で真核生物のタンパク質を発現することが可能である。実施例2及び3に記載するように、上述のような形質転換、選択及び再生によって、原核タンパク質をコードする任意の遺伝子をpPTI001シリーズ又はpPTI002シリーズの1つ又は全部のベクターへと挿入してもよい。再生に次いで、下流の適用のため、発現されたタンパク質を、図4及び図6中に示される親和性タグを用いて精製してもよい。
プラスチドの内部共生的な起源により、プラスチド中でオペロン様の遺伝子構造を発現することが可能である。実施例2及び3に記載するように、上述のような形質転換、選択及び再生によって、原核タンパク質をコードする任意の遺伝子をpPTI001シリーズ又はpPTI002シリーズの1つ又は全部のベクターへと挿入してもよい。再生に次いで、下流の適用のため、発現されたタンパク質を、図4及び図6中に示される親和性タグを用いて精製してもよい。
このことは、単独のプロモーターの制御下での、複数のタンパク質の協調的かつ同時の発現をもたらす。実施例2及び3に記載する通り、先に記載するような形質転換、選択及び再生によって、原核生物起源及び真核生物起源(又はそれらの混合)の両方のタンパク質をコードする複数の遺伝子を、pPTI001シリーズ又はpPTI002シリーズの1つ又は全部のベクターへと挿入してもよい。
pPTI001/YFPベクターをタバコ葉細胞中へとボンダードメントし、オーキシンのみを含む培地、及び全てのホルモンを欠く培地上で再生体を選択した。再生体が得られ(図8)、土壌へと移植する前に根の形成を誘導するために、オーキシンを含む2次選択培地へと移された。タバコプラスチドゲノム中の形質転換カセットの取り込みを、ベクター特異的なプライマー及びタバコ葉緑体ゲノムの隣接領域におけるプライマーを用いたPCRにより確認した(図9)。再生された植物体から得た葉に、誘導にひき次いでTP.CRE融合体を発現するバイナリーベクターであるpER10/TP.CREを浸潤させた。72時間後、GFP蛍光葉緑体を含む細胞を蛍光顕微鏡で示すことにより、浸潤された組織を分析した(図10)。
選択及び再生システムを最適化するために、さらなる新規なシリーズのプラスチド形質転換ベクターが構築されている。以下の修飾及び付加がなされている:
1)二重選択の目的のためのIPT遺伝子に加えたaadA遺伝子の包含
2)より効率的な相同組み換え及びトランスジーンの挿入を増加させ得る、新たな相同組み換え部位(HOM3及びHOM4)の包含
3)IPTG誘導性プロモーターの包含
4)より高い発現レベルのための、修飾Prrnプロモーターの包含
ベクターの詳細を図11〜16に示す。例示された全てのベクターは、IPT選択可能なマーカー遺伝子を含む。
葉緑体の形質転換のためのプロトコール
標準的手順により、3〜5ヶ月間で形質転換植物が作製される。
・最初のシュート(first shoot)へのボンバードメント(bombardment):3〜8週間
・同種植物体の二次培養作製:3〜4週間
・分析に先立ち、土壌において生育:1〜2週間
ヘリウムガン Biorad PDS 1000
・破壊ディスクPSI:1100
・キャップ部を保持する破壊ディスクと、カバー部上のマクロキャリアとの間のギャップ:1/4’’
・停止スクリーン支持部下のスペーサーリング:2
・マクロキャリア起動アセンブリのレベル:1(上部から)
・ペトリ皿ホルダーのレベル:4(上部から)
・真空流入速度:最大
・真空開放速度:真空流入速度を近似するように開放を弱める。
・2.5M CaCl2 オートクレーブ又はフィルターで滅菌する
・滅菌水中の1M スペルミジン遊離塩基
・dH2O
・dH2O又は1X TE中、1μg/μlのDNA
・100%エタノール
・70%エタノール
・1100 psi 破壊ディスク
・停止スクリーン
・マクロキャリア
・金粒子
・ストック用として、50mgの金粒子を1mlの無水エタノール中に懸濁する。
・0.25mlの金ストック懸濁液を取り、5秒間微小遠心を行う。エタノールを除去してから、無菌の蒸留水で3回洗浄し、洗浄の間に3分間微小遠心を行う。
・金を0.25mlのdH2O中に再懸濁する。
・50μlの一定分量の金−H2O懸濁液をエッペンドルフチューブ中に入れる。
・各エッペンドルフ中に以下を連続して添加する:
1μg/μlの10μlのDNA
50μlの2.5M CaCl2
20μlの0.1M スペルミジン遊離塩基
・最大スピードで5分間ボルテックスする。
・200μlの無水エタノールを各チューブに添加する。
・微小遠心管中で、3000rpm、2秒間回転させる。
・出来る限り上清を除去し、沈殿物を無水エタノール中で洗浄してから、3000rpmにて2秒間微小遠心を行う。
・沈殿物を30μlの無水エタノール中に再懸濁させる(4〜5回分のボンバードメント用となる)。混合物を氷上で保存する。
・70%エタノール又は70%イソプロパノールを用いて、銃の真空チャンバ及び表面を滅菌する。
・70%エタノール中で10分間、破壊ディスク及びマクロキャリアホルダーを滅菌する。フード内で風乾させる。
・微量の水を全て除去するために、マクロキャリアを無水エタノール中に浸漬させる。フード内で風乾させる。
・ヘリウムタンクを開放する。ヘリウムタンク調節装置を1300psiに設定する(又は、破壊ディスクの出力に関しては200psiに設定する)。
・マクロキャリアをそのホルダー中に固定する。
・マクロキャリアの中心上に、5μlの金−DNA混合物をピペットで載せる。混合物は、大きな塊を少なくして、均等に広げる必要がある。
・破壊ディスクをホルダーリング内に配置し、リングをヘリウムバレルに締め付ける。
・停止スクリーンと、金−DNAを含むマクロキャリア(ホルダー内)を、保持アセンブリ内に配置し、圧下させる。
・アセンブリを真空チャンバ内のレベル1(上部から1番目)に配置する。
・サンプルをレベル4に配置する。ペトリ皿の蓋を取る。
・真空ポンプを開ける。
・Hgで27〜29まで真空で引く。
・破壊ディスクが破壊するまで、発射ボタンを押し続ける。
・真空を開放し、サンプルを取り出す。
・破壊ディスク、マクロキャリア及び停止スクリーンを取り出す。
・所望である場合、繰り返す。
・実験の終わりに、ヘリウムタンクを止める。銃の中を真空にし、残っているヘリウムを銃から開放させ、次に、ヘリウム調節装置を止める。
MS: MS塩類及びビタミン類(1X)
30g/l ショ糖
6g/l フィトアガー
pH5.8 オートクレーブ
RMOP:MS塩類(1X)
1mg/l BAP
0.1mg/l NAA
1mg/l チアミン
100mg/l イノシトール
30g/l ショ糖
6g/l フィトアガー
pH5.8 オートクレーブ
RMOP−BAP
pH5.8 オートクレーブ
MS+ MS培地
1mg/l IBA(インドール−3−酪酸)
2μM 17−β−エストラジオール
pH5.8 オートクレーブ
・タバコ植物は、MS培地を含むマゼンタ箱中において、無菌技法を用いて大量増殖させられる。
・広げられた葉を切り取り、葉の裏側を上にしてワットマン紙上に置き、RMOP培地上に置く。ろ紙の上で、ボンバードメント前に葉をわずかに乾燥させる(1〜2時間)。各ボンバードメントにより、9cmペトリ皿の約1/3を覆っている1〜3枚の葉を処理することができる。
・ボンバードメント後、プレートを密閉し、葉を、12:12の光周期、24℃の条件の下に、2日間置く。
・2日後、葉を約5mm2の小片に細かく切り、BAPを欠くRMOP培地上に、葉の裏側を上にして置く。
・3〜8週間で、退色した外植片から緑色のシュートを回収することができる。
・これらのシュートからの葉を細かく切り(2mm2)、同じ選択培地中で約4週間二次培養する。
・最初に二次培養したシュートから、典型的には4つのシュートが回収される。これらを、MS培地+1mg/l IBA及び2μM 17−β−エストラジオールを含むチューブ中に植え付ける。
・植え付けたシュートを、単離後約3〜5週間後に土壌に移す。植物体を標準的なタバコの条件(16:8の光周期、25℃)において生育させる。
1.タバコの葉を、ボンバードメントのために、完全に平らに置く必要はない。
2.タバコの葉は、ろ紙上で2日後にその膨圧を失う。これで良い。
3.最少量の移送を行う。実施の必要がある最大量の移送は、以下の通りである:
a.MS中で生育させた植物から葉を切り取る。葉をRMOP上のろ紙上に置く。
b.ボンバードメントしてから2日後、葉移植片をRMOP−BAP上に置く。
c.3〜8週間後、緑色のシュート(green shoot)から葉を除去し、切断し、次に、RMOP−BAPに移す。
d.4つの芽を回収し、個々のチューブに入ったMS+1mg/l IBA+2μM 17−β−エストラジオール中に移す。
4.平均的実験に関する形質転換頻度は、1回のボンバードメントあたり、1.5個の安定的に形質転換された植物から0.3個の安定的に形質転換された植物までのどこかである。
名称 組成 容器 時間4
MSS: MS塩及びビタミン類(1X) マゼンタ箱
30g/l ショ糖
6g/l フィトアガー
pH5.8
オートクレーブ
MFB1 MS塩(1X) ペトリ皿(9cm) 2日間
1mg/l BAP
0.1mg/l NAA
1mg/l チアミン
100mg/l イノシトール
30g/l ショ糖
6g/l フィトアガー
pH5.8
オートクレーブ
MTS2 MFB(BAP欠如) 深いペトリ皿 3〜10週間5
MFR3 MSS マゼンタ箱 3〜5週間
1mg/l IBA(インドール−3−酪酸)
2μM 17−β−エストラジオール
注記: 1.MFB:ボンバードメント用培地
2.MTS:トランスジェニック選択用培地
3.MFR:発根用培地
4.時間:タバコの葉を培地中に入れておく時間
5.この時間は2回目の選択時間を含む
Claims (44)
- 形質転換された植物細胞の作製方法であって、以下の工程:
(i)遺伝子構築物を用いて植物細胞を形質転換する工程であって、該遺伝子構築物は、形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含み、該第1及び第2の相同組み換えエレメントは、該形質転換カセットの、該植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
該形質転換カセットは、以下:
(a)該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
該切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
該第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはリコンビナーゼにより認識され得る、
前記工程、を含む前記作製方法。 - 以下の工程:
(ii)植物ホルモン生合成ポリペプチドを欠く培地において形質転換された植物細胞を選択する工程、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 以下の工程:
(iii)植物細胞中でリコンビナーゼを発現させる工程であって、該リコンビナーゼは、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントを認識するものである工程、
をさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントがlox部位である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼがCreリコンビナーゼである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物ホルモン生合成ポリペプチドが、植物サイトカイニン若しくはオーキシン若しくはその他の植物成長調節因子の合成に関与するか、又は、植物サイトカイニン若しくはオーキシン若しくはその他の植物成長調節因子の産生若しくは代謝を調節するポリペプチドである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物ホルモン生合成ポリペプチドがIPT(イソペンテニルトランスフェラーゼ)である、請求項6に記載の方法。
- 前記1つ又はそれ以上のトランスジーンのうちの少なくとも1つが、抗体、抗生物質、除草剤、ワクチン抗原、酵素、酵素阻害剤又はデザインペプチドをコードする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記形質転換カセットが、1つ又はそれ以上の選択されたプラスチドを特異的に標的とするように、前記相同組み換えエレメントのヌクレオチド配列が選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物の核ゲノム中に形質転換カセットが組み込まれない又は実質的に組み込まれないように、前記相同組み換えエレメントのヌクレオチド配列が選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(iii)が、前記植物細胞中に存在するリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と機能し得るように連結した誘導性プロモーターから、植物細胞中でのリコンビナーゼの発現を誘導する工程、を含み、該リコンビナーゼが、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントを認識する、請求項3〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(iii)が、工程(i)の前、工程(i)と同時、又は工程(i)の後;又は工程(ii)の前、工程(ii)と同時、又は工程(ii)の後のいずれかにおいて、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と機能し得るように連結したプロモーターを含むリコンビナーゼベクターにより前記植物細胞を形質転換する工程を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リコンビナーゼベクターが、プラスチドを標的とする輸送ペプチド及びリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列と機能し得るように連結しているプロモーターを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記プラスチドを標的とする輸送ペプチドが、前記リコンビナーゼを葉緑体へと標的化させ得るものである、請求項13に記載の方法。
- 前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と第2のターミネーターエレメントが第1のプロモーターの下流に存在し、該第1のプロモーターは、該植物ホルモン生合成ポリペプチドの発現を促進し得る、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記形質転換カセットが、以下:
(a)前記植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)以下を含む、切り出しカセット:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
ここで、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントは、リコンビナーゼにより
認識され得る;
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を、5’−3’方向で上記において特定した順番で機能し得るように連結して含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。 - 前記切り出しカセットが、第1のプロモーター、トランスジーン及び第1のターミネーターエレメントに対して逆方向であり、該切り出しカセットが、前記植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を促進し得る第2のプロモーターを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記形質転換カセットが、以下:
(a)前記植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、ここで(a)、(b)、(c)及び(d)は、5’−3’方向で上記において
特定した順番で機能し得るように連結されており、
該切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)第2のプロモーター、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、ここで、第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントは、
リコンビナーゼにより認識され得;かつ、
該切り出しカセットの部分(b1)〜(b5)は機能し得るように連結しており、該切り出しカセットは、(a)、(c)及び(d)に対して逆方向である、
請求項18に記載の方法。 - 形質転換された植物細胞の作製方法であって、以下の工程:
(i)遺伝子構築物を用いて植物細胞を形質転換する工程であって、該遺伝子構築物は、形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含み、該第1及び第2の相同組み換えエレメントは、該形質転換カセットの、該植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
該形質転換カセットは、以下:
(a)該植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
該切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)ポリペプチドがIPTである植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
該第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはリコンビナーゼにより認識され得、該第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはlox部位であり、該リコンビナーゼはCreである、
前記工程、を含む前記作製方法。 - 工程(ii)IPTを欠く培地において形質転換された植物細胞を選択する工程、及び工程(iii)プラスチドゲノムから切り出しカセットの切り出しをもたらすレベルで、植物細胞中でCreリコンビナーゼを発現させる工程、をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記形質転換カセットが、抗生物質に対する抵抗性を付与するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗生物質がスペクチノマイシンである、請求項22に記載の方法。
- 前記植物が単子葉植物又は双子葉植物である、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物が、穀類(イネ、コムギ、オオムギ、オートムギ、ソルガム、トウモロコシ)、マメ科植物(アルファルファ、レンティル、ピーナッツ、エンドウ、ダイズ)、油糧作物(ヤシ、ヒマワリ、ココナッツ、カノーラ、オリーブ)、市場用作物(綿、サトウキビ、キャッサバ)、野菜作物(ジャガイモ、トマト、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、カボチャ、キュウリ、レタス、ブロッコリー、カリフラワー、サヤインゲン、キャベツ、セロリ、タマネギ、ニンニク)、果実類/樹木及びナッツ類(バナナ、ブドウ、メロン、マスクメロン、スイカ、イチゴ、オレンジ、リンゴ、マンゴー、アボカド、モモ、グレープフルーツ、パイナップル、メープル、アーモンド)、飲料用作物(コーヒー、茶、カカオ)、及び材木用樹木(オーク、クログルミ、スズカケノキ)からなる群より選択される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物がタバコ又はレタスである、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物細胞が、個々の細胞、解離した形態若しくは解離していない形態の細胞群、又は植物組織の部分又は植物の部分である、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記植物細胞が植物の葉中に存在する、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プラスチドが、葉緑体、白色体、アミロプラスト、エチオプラスト、クロモプラスト、エライオプラスト及びジェロントプラストから選択される、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プラスチドが緑色プラスチドである、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プラスチドが葉緑体である、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1及び/又は第2のプロモーターが、PsbA、RbcL又はPrrnプロモーターである、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 前記第1及び/又は第2のターミネーターが、rrn、psbA、rbcL又はT7ターミネーターである、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法により得られた又は得ることができる形質転換された植物細胞。
- 請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法を含み、前記トランスジーン産物を精製又は単離、及び任意にパッケージングする工程をさらに含む、トランスジーン産物の作製方法。
- 請求項35に記載の方法により得られた又は得ることができる精製された又は単離されたトランスジーン産物。
- 形質転換カセットに隣接する第1及び第2の相同組み換えエレメントを含む遺伝子構築物であって、該第1及び第2の相同組み換えエレメントは、形質転換カセットの、植物細胞中に存在する少なくとも1つのプラスチドのゲノムへの組み込みが指示可能であり、
該形質転換カセットは、以下:
(a)植物細胞中で機能し得る第1のプロモーター、
(b)切り出しカセット、
(c)1つ又はそれ以上のトランスジーン、
(d)第1のターミネーターエレメント、
を含み、
該切り出しカセットは、以下:
(bl)第1の部位特異的組み換えエレメント、
(b2)任意の第2のプロモーター、
(b3)植物ホルモン生合成ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
(b4)第2のターミネーターエレメント、
(b5)第2の部位特異的組み換えエレメント、
を含み、
該第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントはリコンビナーゼにより認識され得る、
前記遺伝子構築物。 - 前記第1及び第2の部位特異的組み換えエレメントがlox部位である、請求項37に記載の遺伝子構築物。
- 前記リコンビナーゼがCreリコンビナーゼである、請求項37又は38に記載の遺伝子構築物。
- 前記植物ホルモン生合成ポリペプチドが、植物サイトカイン若しくはオーキシン若しくはその他の植物成長調節因子の合成に関与するか、又は、植物サイトカイン若しくはオーキシン若しくはその他の植物成長調節因子の産生若しくは代謝を調節するポリペプチドである、請求項37〜39のいずれか1項に記載の遺伝子構築物。
- 前記植物ホルモン生合成ポリペプチドがIPT(イソペンテニルトランスフェラーゼ)である、請求項40に記載の遺伝子構築物。
- 請求項37〜41のいずれか1項に記載の遺伝子構築物を含む植物細胞。
- 請求項37〜41のいずれか1項に記載の遺伝子構築物を含む植物体。
- 請求項37〜41のいずれか1項に記載の遺伝子構築物を含む植物種子。
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