发明内容
为了克服现有植物基因工程技术的不足,同时为深入研究分泌型和非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控,本发明提供一种在植物分泌型和非分泌型腺毛中优势表达的启动子,能引导基因在转基因植物分泌型和非分泌型腺毛中优势表达。
本启动子是诱导型启动子,含有分生组织表达、厌氧诱导、光响应、赤霉素响应、干旱诱导、黄酮基因调控、胚乳表达、水杨酸响应和生理调控等调控元件,可广泛响应激素和非生物胁迫等多种刺激。研究表明,对青蒿植株外施赤霉素和水杨酸都可以提高青蒿素的含量,另有研究证实对青蒿植株进行不同的光照或单色光处理,以及进行干旱处理都可以提高青蒿素的产量。由于本启动子中存在这些诱导元件,使得转基因青蒿植株及时响应外界环境,从而诱导基因在分泌型和非分泌型腺毛中优势表达。
本发明公开了一种青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,或者与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列。进一步地,青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,或者为与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列。
从另一个方面来说,本发明公开的一种青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子具有如下表(表1)的第一和第二列所示的顺式作用元件:
表1
进一步地,上述顺式作用元件在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中的位置和/或作用如表1所示。
本发明还公开了如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子的获得方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一、培养青蒿无菌苗;
步骤二、PCR克隆AaTCP14基因启动子基因序列;
步骤三、分析AaTCP14基因启动子上面的顺式作用元件,确定AaTCP14基因启动子类型;
步骤四、将克隆到的AaTCP14基因启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中;
步骤五、将构建好的载体pCAMBIA1391z-AaTCP14转化根癌农杆菌;
步骤六、将带有pCAMBIA1391z-AaTCP14载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿;
步骤七、PCR检测转基因植株;
步骤八、启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位的确定。
进一步地,步骤二中的PCR引物对为:
PTCP14-F(如SEQ ID NO:2所示)
ACAAACAACACAGTTGGACAGGC;
PTCP14-R(如SEQ ID NO:3所示)
TTGCTGCTCAATGTCGTAGTG。
进一步地,步骤二中的PCR条件为:95℃预变性5min;94℃变性30s,50℃退火30s,68℃延伸2min,35个循环;68℃延伸10min。
进一步地,步骤七中的PCR引物对为:
1391z-proTCP14-F(如SEQ ID NO:4所示)
CCAAGCTTGGCTGCAGGCATTGACCACTGAGATGACAGT;
1391z-proTCP14-R(如SEQ ID NO:5所示)
GAATTCCCGGGGATCCAGAGAGATAACTAGGCGTGATTG。
本发明还涉及如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子在利用植物组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
进一步地,植物组织为植物腺毛组织。
进一步地,植物为青蒿。
本发明还涉及一种表达载体和试剂盒。该表达载体含有如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子。
该试剂盒含有如上所述的青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明利用有效的青蒿腺毛组织优势性启动子(AaTCP14)代替组成型启动子可以用于构建在分子生物学中在青蒿分泌型和非分泌型腺毛优势表达目的基因的融合基因。利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中,从而实现目的基因的定向操作来获得转基因植物,并且不会对植物的生长发育造成危害,能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
实施例
本实施例涉及AaTCP14基因启动子的获得,具体包括如下步骤:
步骤一、培养青蒿无菌苗
青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡2-3min,无菌水冲洗1次,再用20%(w/v)的NaClO浸泡20min后,无菌水冲洗3次~4次,用无菌吸水纸吸干表面水分,接种于无激素的MS固体培养基(采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基,该固体培养基可以通过商业渠道获得)上,25℃、16h/8h(日光/黑暗)培养,14天后即可获得青蒿无菌苗;
步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆
1、基因组DNA的提取
在2.0mL离心管中加入2粒钢珠,在其中放一片青蒿叶片(1cm2左右大小,用冰盒盛取);加入650μL CTAB buffer(通风橱内操作,CTAB中含有2%巯基乙醇),55-60Hz,震荡90秒;65℃水浴1h(每隔10min摇一摇),可适当延长时间,最长1.5h;冷却至室温,加入650μL三氯甲烷,轻柔上下颠倒10min,12000rpm离心10min;取400μL-500μL上清液于一新1.5mL离心管中,等体积加入400μL-500μL三氯甲烷;轻柔上下颠倒10min,12000rpm离心10min;取300μL-400μL上清液于一新1.5mL离心管中,等体积加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷);轻柔上下颠倒后在-20℃冰箱中放置1-2h。取出后4℃12000rpm离心10min,弃去上清,加入75%乙醇600-700μL,将沉淀吹打起或用手指弹起,放在摇床上摇15-20min,重复一次。吸干液体,放在37℃中烘干,直到沉淀变为透明。加入40-60μL ddH2O回溶,4℃保存。
2、PCR扩增
以基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增分泌型和非分泌型腺毛优势启动子序列。根据本实验室基因组测序拼接得到AaTCP14基因启动子的预测电子序列设计PCR引物如表2所示,PCR反应体系如表3所示。PCR条件为:95℃预变性5min;94℃变性30s;50℃退火30s;68℃延伸2min,35个循环;68℃延伸10min。在1%的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物,切胶回收目的片段,纯化DNA。然后连接到PLB(购自天根公司)载体用于测序,将该片段的序列与AaTCP14的基因编码序列进行拼接,获得AaTCP14基因编码序列上游约1.8k bp的片段(该约1.8k bp的片段是根据AaTCP14基因启动子的预测电子序列扩增出来的PCR产物片段与已知的AaTCP14基因编码序列进行比较得出的AaTCP14的ATG上游约1.8k bp的启动子片段)。
表2 PCR引物设计
表3 PCR反应体系
步骤三、分析得到的AaTCP14基因启动子的顺式作用元件,确定AaTCP14基因启动子的类型
本发明中得到的AaTCP14基因启动子序列长度为1828bp。为了寻找启动子上面的顺式作用元件,用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaTCP14基因的启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具有除了TATA box和CAAT box,还具有很多顺式作用元件:CAT-box、ARE、BOX 4、BOXⅠ、GATA-motif、Sp1、ATCT-motif、MNF1、G-box、CCAAT-box、GARE-motif、P-box、TATC-box、MBS、MBSⅡ、Skn-1motif、TCA-element、Circadian等;其中,CAT-box响应分生组织表达,ARE响应厌氧胁迫,BOX 4、BOXⅠ、GATA-motif、Sp1、ATCT-motif、MNF1和G-box在植物对光响应中起到重要作用,GARE-motif、P-box和TATC-box元件都受到赤霉素的诱导,受到干旱胁迫时MYB蛋白会结合MBS元件,MBSⅡ为黄酮基因的调控元件,Skn-1motif与胚乳表达相关,TCA-element响应激素水杨酸,Circadian元件表明启动子受生理节律调控(表1)。以上结果分析表明,AaTCP14基因启动子是一个诱导型的启动子,能受多种因素诱导。
步骤四、将得到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体,融合GUS报告基因。
为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达,将AaTCP14基因的启动子proTCP14连接pCAMBIA-1391z载体融合gus报告基因,为了实现对表达载体的构建,正向引物中引入PstI酶切位点,反向引物中引入BamHI酶切位点,引物序列如表4所示:
表4 pCAMBIA1391z-proFDS1载体构建PCR引物
步骤五、将构建好的pCAMBIA1391z-proTCP14载体转化根癌农杆菌并检测。
将含有构建完成的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(EHA105),并进行PCR验证。结果表明:含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中,从而获得含基因启动子和gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proTCP14的根癌农杆菌菌株中。
步骤六、将带有pCAMBIA1391z-proTCP14载体的根癌农杆菌转化青蒿
1)外植体的预培养
青蒿种子用体积分数为75%的乙醇浸泡2~3min;无菌水冲洗1次;再用20%(w/v)的NaClO浸泡20min;无菌水冲洗3~4次;用无菌吸水纸吸干表面水分;接种于无激素的MS,该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基,该固体培养基可以通过商业渠道获得;25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养,即可获得青蒿无菌苗,待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化;
2)农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体,转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中,滴加含活化好的所述含TCP14基因启动子的植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液,使外植体与菌液充分接触,28℃暗培养3d,以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照;
3)抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/LKan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上,于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养,每两周继代培养一次,经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽,将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根,从而获得Kan抗性再生青蒿植株;
步骤七,PCR检测转基因植株
根据目的基因所在表达盒promoter-GUS序列promoter和GUS分别设计正向引物(proTCP14:GGTGTTATCATTCATTTATT)和反向引物(GUSR:GTCATTGTAACTGCTTGGGA)对gus基因进行检测;结果表明,利用所设计的PCR特异引物,能扩增出特异DNA片段,而以非转化青蒿基因组DNA为模板时,没有扩增出任何片段,如图1所示;
步骤八,启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定
对PCR检测为阳性的青蒿植株,取其幼嫩的叶片和茎部进行GUS组织染色,结果如图2所示,结果表明,染色部位主要在青蒿的分泌型和非分泌型腺毛中,说明AaTCP14基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达,由此可见,本发明所克隆的proTCP14基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 青蒿腺毛优势表达AaTCP14基因启动子及其获得方法与应用
<130> 01335-17217PIX
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1828
<212> DNA
<213> 青蒿(Artemisia annua L.)
<400> 1
gcattgacca ctgagatgac agtaagtact tattaatcaa actaatcatt aaacagtgat 60
agtgagtgag tatttttagt tgggtatttt gtgagaccca ataacatgtt agtggtgtgt 120
tatgagggaa agtatttgat tgattggtgt gttattggga ggagtatgat gtggcgttga 180
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tatattcgcg ttcacttagg taaaatatcc caaatgatta gattcatgaa ttttagttat 1800
gtaatgatgg cagatagttt actcgtgc 1828
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acaaacaaca cagttggaca ggc 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgctgctca atgtcgtagt g 21
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccaagcttgg ctgcaggcat tgaccactga gatgacagt 39
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaattcccgg ggatccagag agataactag gcgtgattg 39