CN107937398A

CN107937398A - 青蒿腺毛优势表达AaTCP15基因启动子及应用

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Publication number: CN107937398A
Application number: CN201711156427.0A
Authority: CN
Inventors: 唐克轩; 马亚男; 徐东北; 付雪晴; 沈乾; 石璞; 黎凌; 陈明慧; 谢利辉; 孙小芬
Original assignee: SUZHOU TANGJI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SUZHOU TANGJI BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-11-20
Filing date: 2017-11-20
Publication date: 2018-04-20
Anticipated expiration: 2037-11-20
Also published as: CN107937398B

Abstract

一种植物生物技术领域的基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；AaTCP15基因启动子能够调控目的基因在植物各组织中表达，尤其是分泌型腺毛和非分泌型腺毛中优势表达。同时本发明还涉及前述AaTCP15基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的用途。由于腺毛优势表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

青蒿腺毛优势表达AaTCP15基因启动子及应用

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物学领域的技术，具体是一种青蒿腺毛优势表达AaTCP15 基因启动子及应用。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科(Asteraceae)蒿属的一年生草本植物，又名黄花蒿，植株高约30-150cm。1972年屠呦呦及其团队从青蒿中分离得到抗疟有效单体青蒿素(Artemisinin)。青蒿素是一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)的主要有效成分。近年来，青蒿素及其衍生物被报道具有治疗红斑狼疮、阿兹海默症、抗癌症和降血脂等功效。目前生产上的青蒿素主要来源于青蒿植株叶片的提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，只占叶片干重的 (0.1％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。

青蒿素的生物合成由细胞质的MVA途径和质体的MEP途径组成。青蒿素的生物合成由四个酶催化，既ADS(紫穗槐-4,11-二烯合酶)、CYP71AV1(细胞色素P450单加氧酶)、DBR2(青蒿醛双键还原酶)和ALDH1(二氢青蒿醛△11(13)还原酶)。值得注意的是中间前体物质青蒿醛既可以被DBR2催化形成二氢青蒿醛而最终形成青蒿酸，也可以被ALDH1和CYP71AV1催化形成青蒿酸而最终形成青蒿素B。因此青蒿醛是否可以有效地被DBR2催化形成二氢青蒿醛是得到高含量的青蒿素的关键，即DBR2酶的活性十分重要。

AaTCP15是从青蒿中分离得到的一个TCP家族的转录因子，该家族具有典型的螺旋-环- 螺旋(bHLH)结构。在拟南芥中，TCP3可以通过与MYB互作来调控黄酮合成，TCP15通过高光强来调控花青素的积累。在青蒿植株中提高或者抑制AaTCP15可以有效增加或者降低青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸的含量，表明该基因在青蒿素生物合成途径中具有重要的调节作用。AaTCP15 在不同组织部位和叶序中的表达模式与青蒿素合成途径中腺毛特异性表达的合成酶基因ADS、 CYP71AV1、DBR2和ALDH1均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在腺毛中优势表达。此基因还可特异结合并且激活DBR2和ALDH1启动子，从而激活青蒿素合成代谢通路，并且推动代谢流流向青蒿醛转化为二轻青蒿醛方向，最终提高青蒿素的含量。由于青蒿素是在分泌型腺毛中合成，因此克隆腺毛优势表达启动子对青蒿素代谢工程具有十分重要的意义。

青蒿的叶片、花蕾和茎秆组织表面有两种腺毛。一种是多细胞结构的分泌型腺毛(glandular secretory trichomes,GSTs)，另一种是T型的非分泌型腺毛(T-shapetrichomes,TSTs)。植物腺毛在抵抗昆虫、传播花粉、降低紫外线伤害、减少蒸腾等方面都起到至关重要的作用。启动子是位于结构基因5′端上游的特定核酸序列，与RNA聚合酶特异识别。启动子能够调控下游基因表达的起始和表达程度。启动子像“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子(转录因子) 的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于以腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，克隆AaTCP15基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。克隆其启动子将为研究AaTCP15基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。

发明内容

本发明针对现有植物基因工程技术的不足，提出一种植物生物技术领域的基因启动子，提供了深入研究分泌型和非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控的渠道，在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种过程中，本发明提供的启动子能够优势在腺毛组织启动并高效表达外源基因，而且不会对植物的生长发育造成危害。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明涉及一种AaTCP15基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型和非分泌型腺毛中特异表达。

本发明涉及的AaTCP15基因启动子的获得步骤具体如下：

步骤一，培养青蒿无菌苗；

步骤二，用PCR(Polymerase Chain Reaction)法克隆启动子基因组序列；

步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaTCP15基因启动子的类型；

步骤四，AaTCP15基因启动子连入pCAMBIA-1391z载体；

步骤五，将构建好的载体pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体转化根癌农杆菌；

步骤六，将带有pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体的根癌农杆菌转化青蒿；

步骤七，PCR检测转基因植株；

步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定。

技术效果

与现有技术相比，本发明AaTCP15基因启动子可用于构建在分子生物学中融合外源目的基因，在分泌型和非分泌型腺毛组织中启动并高效表达，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。

附图说明

图1为转基因青蒿植株的PCR阳性检测，泳道1：DNA marker 2000；泳道2：阳性质粒对照；泳道3：非转基因青蒿对照；泳道4～12：pCAMBIA-1391z-AaTCP15转基因青蒿的9 个不同株系；

图2为利用AaTCP15基因启动子与GUS基因融合的载体pCAMBIA-1391z-AaTCP15转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图，主要分布于幼嫩叶片的分泌型和非分泌型腺毛中。

具体实施方式

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105,质粒pCAMBIA-1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

本实施例涉及AaTCP15基因启动子的获得，具体包括如下步骤：

步骤一，培养青蒿无菌苗

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡3min，无菌水冲洗1次，再用25％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；

步骤二，基因组DNA中启动子序列的克隆

基因组DNA的提取

在2.0mL离心管中加入2粒钢珠，在其中放一片青蒿叶片(1cm²左右大小，用冰盒盛取)；加入650μL CTAB buffer(通风橱内操作，CTAB中含有2％巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒；65℃水浴1h(每隔10min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h；冷却至室温，加入650 μL三氯甲烷，轻柔上下颠倒10min，12000rpm离心10min；取400μL-500μL上清液于一新1.5mL离心管中，等体积加入400μL-500μL三氯甲烷；轻柔上下颠倒10min，12000rpm 离心10min；取300μL-400μL上清液于一新1.5mL离心管中，等体积加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)；轻柔上下颠倒后在-20℃冰箱中放置1-2h。取出后4℃12000rpm 离心10min，弃去上清，加入75％乙醇600-700μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入40-60μL ddH₂O回溶，4℃保存。

PCR扩增

以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增分泌型和非分泌型腺毛优势表达AaTCP15基因的启动子序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR(Nested PCR)扩增，根据本实验室基因组测序得到的AaTCP15基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表1所示，首轮PCR反应体系如表2所示。PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s；50℃退火40s；68℃延伸2min，35个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。

表1巢式PCR引物设计

表2第一轮PCR反应体系

将首轮PCR的产物稀释100倍，作为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR反应体系见表3。PCR条件为：95℃预变性5min；95℃变性40s；55℃退火40s；68℃延伸2min，35个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，切胶回收目的片段，纯化DNA。然后连接到PLB(购自天根公司)载体用于测序，将该片段的序列与基因序列进行拼接，

获得AaTCP15基因上游约2.1k bp的片段。

表3第二轮PCR反应体系

步骤三，分析AaTCP15启动子上的顺式作用元件，确定AaTCP15基因启动子的类型

本发明中得到的AaTCP15基因启动子的序列长2104bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对 AaTCP15基因的启动子进行分析。分析发现克隆到的启动子上面具有除了TATAbox和CAAT box 外，还具有很多顺式作用元件：ABRE、ARE、ATCT-motif、BoxⅢ、Box-W1、CCGTCC-box、 CGTCA-motif、G-box、GATA-motif、GT1-motif、I-box、Sp1、GCN4-motif、MBS、LTR、Skn-1 motif、P-box、HSE、TGA-element、TGACG-motif和Circadian；ABRE元件在很多植物启动子中都有发现，可响应ABA信号；ARE元件可受厌氧诱导；ATCT-motif、G-box、GATA-motif、 GT1-motif、I-box和Sp1在植物中可响应光；Box-W1可响应真菌诱导子；CCGTCC-box可被分生组织激活；CGTCA-motif和TGACG-motif可响应茉莉酸信号；GCN4-motif和Skn-1motif与胚乳表达相关；MBS是MYB的结合位点；LTR元件参与低温响应；P-box元件可参与赤霉素响应；HSE元件与热激响应有关；此外，TGA-element在植物中能够响应生长素；Circadian元件表明启动子受生理节律调控(表4)。

以上结果分析表明，AaTCP15基因启动子是一个诱导型的启动子，能够响应多种非生物胁迫和受多种激素诱导。

表4：启动子序列中调控元件分析

步骤四、将得到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因。

为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaTCP15基因的启动子proTCP15连接pCAMBIA-1391z载体融合gus报告基因，为了实现对表达载体的构建，利用同源重组酶在正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，引物序列如下表所示：

表5 pCAMBIA-1391z-proTCP1载体构建PCR引物

步骤五，将构建好的载体pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体转化根癌农杆菌并检测。

将含AaTCP15基因启动子片段和gus基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(EHA105)，并进行PCR验证，结果表明，含AaTCP15基因启动子片段的植物双元表达载体成功构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含AaTCP15基因启动子和gus基因融合的植物表达载体 pCAMBIA-1391z-AaTCP15的根癌农杆菌工程菌；

步骤六，将带有pCAMBIA-1391z-AaTCP15载体的根癌农杆菌转化青蒿

1)外植体的预培养

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡3min，无菌水冲洗3～4次；再用25％(w/v)的NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的 MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化；

2)农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含AaTCP15基因启动子pCAMBIA-1391z-AaTCP15植物表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；

3)抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/LKan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得 Kan抗性再生青蒿植株；

步骤七，PCR检测转基因植株

根据目的基因所在表达盒pAaTCP15promoter-GUS序列AaTCP15promoter和GUS分别设计正向引物(AaTCP15F:TGGATACTTGTTCTGGTTGC)和反向引物(GUSR:GTCATTGTAACTGCTTGGGA)对gus基因进行检测，转基因青蒿植株的PCR阳性检测如图2所示，结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段；

步骤八，启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定

对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果表明，染色部位在青蒿的分泌型、非分泌型性腺毛以及叶肉细胞中表达，说明AaTCP15基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在分泌型和非分泌型性腺毛中优势表达，由此可见，本发明所克隆的 AaTCP15基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110> 苏州唐基生物科技有限公司

<120> 青蒿腺毛优势表达AaTCP15基因启动子及应用

<130> f-b015e

<141> 2017-11-20

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2104

<212> DNA

<213> 青蒿(Artemisia annua L.)

<400> 1

gagtcaagag ctgtaacaat caagtggttt ttcttttttt tttttttttt tttttttttt 60

tcctttcatt ttcttgatta ttttaaagaa aaggttaaaa caaaaatgat atcaatatct 120

ggaaaaaaaa attctttttt gatacatttc aatcaaattt aaagatacca gcaaagatgt 180

caacaaagtc atttgtttct tttttgttgt gaattgtgct ttgctgtttc acccattaac 240

tttttccaac atacgttatg gtccctacac ttaaaacgtc atgcttttaa ggtaagcttg 300

tgttcttgac tacgtttatt taaatttcta attcgatttg agttttttga tgtgactaat 360

gtggttgtcg acccccaagt tgcatgcaag ttacatgcat tatgatcata tcgggaagta 420

tagtaattgc atgtagtata gtgaatgata tgccatctac ataacattct taattatcct 480

actacttata tgatcataac atgtgttaaa ctaatagttt aaagaaaaag agatcatgag 540

tgaaaacaca tgttatattt ttgtgtggtt agcaggatga ataggcacaa agtgtagagg 600

aatgaaatat gtaatactct atttattata tctgagtttc gactcttcaa atgtggttgc 660

aagtagctat agacaaaagc tagctgtcac agtttgtggt taatttctcg ttcaccatat 720

atgttaagca attctattgc atttataaga tagatggagt ataacaaatt gatatatgag 780

cctaagaggt acggaactga ccgagatgat acagaaagtc gtttaacaca aatgatgttg 840

tgcattatat atgcgtcatt caaaagactt tatcgaaatc ggatactatg tacatacact 900

gactatagtg atatcacacc tcaccccctg ttagaaattt cggcaacaaa actttggtaa 960

gtcatagagt tttgacatag tcttatagct tttcaccact accttttgtt gatcttcgcg 1020

ttttcttttt gctagtataa agaagacatt agaatttata aagtaggcat atatatttga 1080

tcttatttca caattcatta tactgattat aagttagagt tagtgatccc cccctataag 1140

ttattagtcg tggtccctgt atacaggttg aaaacgatct taagttctaa aagagtcgtc 1200

gtacttgtgt gctagaattt ttcaatatca agtacaaatc tcattaagct ttgccaggaa 1260

tatatctcaa aaactagaga aaaactgact caaacaatgg atacttgttc tggttgctcg 1320

ttctaattat tgctagaatt gcagcccttt ttctatctag ttcaaatcaa tcataaatga 1380

tactttttaa taatgaaatg acatcattta cgcaagaacc gaagttaatt ctatagtatg 1440

gaaccaaagc ggtccagtac atcgatctgg tttgagaccg aactggtatg gtaaatgctt 1500

cgctttgagg ccaaacacga caatatgggg ttgttcttga ttccaatatt attattcttg 1560

agtacataat ctagtcccgt ccaattttgt ttcatatggt cgcactaccc tagtttattt 1620

tttttgtaga tatgataaaa ctgtaccgta agtagctaga tgtcgactag aaatatatgt 1680

gcgtcaatta cgtgtttgtg tataccaaca tcaatcgttt tctagtagaa ggactaaaac 1740

tgtaggttga ccaatacttt atacaccaaa caaatacttt aaccttcttt ctttttctca 1800

ttgtttccat ttacatttct ttttgttttt gctttttaaa gctcacccat ataattccca 1860

ctcattatct ttgttgctta aagctagctt gctctccttc cttatcctcc cacatcaaat 1920

gggtaactat ttcatttcgt gagagagact gtttatatgc tcttgaaaaa gaaataaatc 1980

aagtcccaca aagtaaaacc ctaattcagt tcaagtaaac tttatacata tatagagaaa 2040

gtgaactaga ttgtgtgtgt tccttgaagt gtttttagtg tgtgtattat tatttcatgt 2100

gatc 2104

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物序列1(p15-f1)

<400> 2

catgcatgta actttggtta cagtgg 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物序列2(p15-r1)

<400> 3

tggaagaggt agtggcttca tcgtc 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物序列3(p15-f2)

<400> 4

gagtcaagag ctgtaacaat caagtggt 28

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物序列4(p15-r2)

<400> 5

ggaaatgatc attaccacca tccat 25

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物序列5( 1391z-protcp15-f)

<400> 6

ccaagcttgg ctgcagcctt tcattttctt gattat 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物序列6( 1391z-protcp15-r)

<400> 7

gaattcccgg ggatccgatc acatgaaata ataata 36

Claims

1.一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子，其特征在于，所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征是，所述的启动子为诱导型启动子。

3.根据权利要求1所述的启动子在植物分泌型和非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

4.一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子的用途，其特征在于，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物分泌型和非分泌型腺毛中特异表达。

5.一种载体，其特征在于，其连接有如权利要求1所述的调控基因在分泌型和非分泌型腺毛中表达的启动子。

6.一种调控基因在植物腺毛中表达的启动子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，培养青蒿无菌苗；

步骤二，通过PCR克隆启动子基因组序列；

步骤四，AaTCP15基因启动子连入pCAMBIA-1391z载体；

步骤七，PCR检测转基因植株；

7.根据权利要求5所述的方法，其特征是，采用两轮巢式PCR(Nested PCR)扩增分泌型和非分泌型腺毛优势表达AaTCP15基因的启动子序列。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征是，两轮巢式PCR中采用的引物序列包括：

P15-F1：CATGCATGTAACTTTGGTTACAGTGG

P15-R1：TGGAAGAGGTAGTGGCTTCATCGTC

P15-F2：GAGTCAAGAGCTGTAACAATCAAGTGGT

P15-R2：GGAAATGATCATTACCACCATCCAT。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的顺式作用元件包括：ABRE、ARE、ATCT-motif、BoxⅢ、Box-W1、CCGTCC-box、CGTCA-motif、G-box、GATA-motif、GT1-motif、I-box、Sp1、GCN4-motif、MBS、LTR、Skn-1motif、P-box、HSE、TGA-element、TGACG-motif、TATA box、CAAT box或Circadian。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征是，利用同源重组酶在正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点，实现pCAMBIA-1391z-AaTCP15的构建；

所述的引物序列包括:

1391z-proTCP15-F：CCAAGCTTGGCTGCAGCCTTTCATTTTCTTGATTAT

1391z-proTCP15-R：GAATTCCCGGGGATCCGATCACATGAAATAATAATA。