JPH06510198A - カルス特異性プロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カルス特異性プロモータ一 本発明は、植物および植物細胞培養の組換えＤＮＡ技術の応用に関する。特に、 本発明は、形質転換系を改良するおよび形質転換した植物の好ましくない標識遺 伝子の発現を縮小する目的での遺伝形質転換標識遺伝子の発現の制御に関する。

したがって、本発明は、より環境および栄養物摂取に好適な遺伝学的に進展を誘 導された穀物（ｃｒｏｐｓ）および食料品の準備を可能にする。植物細胞培養中 で遺伝子発現を高めることにより、さらに、本発明は、植物細胞培養中の化合物 の生成を可能にできまたは改良する。

穀物植物遺伝子工学の目的は、原型植物から成り立つ望ましい遺伝を保Ｈする間 にすでに先端で行われている植物変化を改良する遺伝子を挿入することである。

この技術は、伝統的な植物増殖プログラムに統合することができ、通常の遺伝子 プールの外部の遺伝子を含む穀物から成り立つ潜在する遺伝を評価する事は別と し、で、あるいは、合成遺伝子、新しい遺伝情報の差込用プログラムは、迅速で 、極めて正確であり、かつ通常、性的な交雑を経て遺伝子の遺伝質浸透と関連し た長い戻し交雑プログラムを避けるものである。

遺伝形質転換は、相対的に稀有な出来事であり、植物内の遺伝子転移に関し非常 に良い戦略（ｓ＋ｒａｔｅｇｉｅｓ）は、形質転換植物物質に関する「選択」ま たは「選抜」のために形質転換「標識」遺伝子の使用を必要とする。通常の標識 遺伝子は、一般に由来は微生物であり、かつ抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺 伝子および容易に選抜可能な酵素用遺伝子コードを包含する。形質転換植物物質 は、すなわち、特異的な抗生物質または除草剤の通常の有毒レベルの存在下で成 育するための能力により「選択された（ｓｅｌｅｃｔｅｄ）Ｊあるいは、より高 度な植物組織では通常発見し得ない新規な酵素活性の発現に関し分析することで 「選抜された（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）Ｊものである。

標識遺伝子の発現は、形質転換した細胞、組織、器官または全植物が選択されま たは選抜されてなるものである場合、遺伝子転移プロセスの段階でのみ決定的で ある。しかしながら、これらの標識遺伝子は、常に、植物のライフサイクルを通 じて高レベルでほとんど全ての組織タイプに標識遺伝子発現を運転する（ｄｒｉ ｖｅ）強く、重要な遺伝子プロモーター（たとえば、カリフラワーモザイクウィ ルス３５Ｓプロモーター）の制御下でなされる。けれども、多くの努力は、新し い標識遺伝子の開発に注がれており、十分な注意が、標識遺伝子発現の特異的な 制御に払われていない。

１９８３年にこうした着想から、標識遺伝子の有用性の改良は、非常に軽視され てきており、かつこれらの発現のレベルを増加する試みと主に関係してきている 。

多くの標識遺伝子の第１の欠点は、通常、単子葉植物細胞タイプ、特に、穀物類 で不十分な発現を示すことであるので、本発明の第１の目的は、単子葉植物細胞 に有効に作用する標識遺伝子の特異的な開発である。

本発明は、遺伝子転移に関する標的である細胞タイプに特にこれらの強い発現に 関する標識遺伝子工学による形質転換ベクターの改良および形質転換手順に関す る。また、本発明は、選択を適用した場合に、形質転換プロセスの段階で形質転 換した細胞に確実に強い遺伝子発現の保証または助力に関する。

さらに、本発明は、植物細胞培養中の遺伝子の強い発現の権能付与または改良、 さらに、遺伝子の直接的または間接的な生産物の質または量を高めることに関す る。遺伝子の直接的な生産物は、（ここでは、糖タンパク質を含む）タンパク質 であり、遺伝子の間接的な生産物は、該直接的な生産物が酵素である場合には、 非タンパク質を含む。

さらにまた、本発明は、より厳重な選択条件の適用を許容すべき、およびこれら のライフサイクルの段階で確立した形質転換成長または形質転換植物に瞬間的に 誘導可能な形質転換標識表現型用に選抜を許容すべき形質転換植物物質の標識遺 伝子の誘導可能な発現に関する。

植物増殖ストラテジイーを簡単にするためには、着生した遺伝子および随伴選択 標識遺伝子の１コピーのみで形質転換植物を得ることが望ましい。多くの種にお いて、形質転換植物は、単に選択的な薬剤の高濃度使用を認めることができる。

現行の問題は、選択的な薬剤の高濃度使用する形質転換プロセスから再生した形 質転換植物が、移転ＤＮＡの複数のコピーを包含しであることである。高レベル の標識遺伝子発現は、この状態での形質転換を得るために要求されることが仮定 されてなるものである。さらに、本発明の目的は、移転ＤＮＡの最小限度の複数 のコピーで発生すべき形質転換細胞を与える形質転換植物細胞に高発現レベルで 運転すべき標識遺伝子の特異的な工学に関する。

形質転換標識遺伝子の発現は、必要とされずあるいは、改良された植物変種の望 ましい特色が必要とされる。高レベルの標識遺伝子の発現は、形質転換植物に共 通である。

商業上成長した穀物では、この遺伝子発現は、好ましくないタンパク質の製造の ために植物資源の枯渇をもたらすことを意味し、かつ収穫の低下に帰着するもの である。さ・らに、ヒトおよび動物の感染の処理に通常用いられる抗生物質を不 活性にする特に酵素を含有する大量の植物物質の存在は、遺伝子学的に作り出さ れた植物から一般に誘導された最多数の食料品の確かに望ましくない特色である 。すなわち、さらに本発明の目的は、商業上成長した穀物で標識遺伝子生成物を できるだけ多く最小限度にするための標識遺伝子発現の巧妙な取扱いである。

最も広くには、本発明は、適当な特異性プロモーターを選択することによって実 現の基礎を形成するものであり、標識遺伝子の有している欠点が、形質転換植物 の一生を通じて発現されるべく存続することなく植物形質転換プロセスのモニタ ーのために標識遺伝子を用いることが可能である。天然に存在する適当なプロモ ーターもまた実現することができる。

本発明の第一の目的としては、単子葉植物のまたは単子葉植物からカルス細胞に プロモーターとして作用することのできる配列からなる分離または組換えＤＮＡ 分子を提供するものである。

カルスは、本発明の目的のために、植物上のまたは周囲の傷によって形成される 細胞の塊として定義されているものである。前記細胞は、一般に柔細胞である。

それは、本発明の当該目的に有用なものである単子葉植物の前記細胞で活性なも のであるプロモーターであり、意外に、それらが単子葉植物と双子葉植物細胞の 双方に遺伝子発現させるのにａ用であるらしい。該プロモーターはまた、培養で の植物細胞、特にカルス誘導細胞の強烈な遺伝子発現に有用であり、該培養は、 組織培養または細胞培養である。

本発明にａ用なプロモーターは、カルス細胞に活性であり、かつ一般にカルス細 胞に優先的である。さらに、これらは、カルス細胞に対し十分にまたは本質的に 特異的なものであるが、植物の他の細胞での幾つかの発現は、幾つかの目的のた めに黙許されまたは好ましくさえある。しかしながら、一般に、発現は、植物の 他の細胞によりも、植物中かまたは培養中のカルス細胞により多くある。

本発明に関連がある重要な研究は、標識遺伝子発現が、植物に遺伝子転移の目的 を達成すべく要求される細胞型の明細であり、すなわち、本発明の実用向きの２ つの主要な目的は、前記細胞型に本質的に強い標識遺伝子発現を達成すること、 および実際にこれらの細胞型に主に標識遺伝子発現を制限することである。本発 明によって、脱分化した組織での遺伝子の発現はまた、植物細胞培養から生成物 の回収率を高めるために開発することができる。植物または植物組織の遺伝子工 学は、植物細胞の核ゲノムの中に安定して外生の遺伝子（遺伝子群（ｇｅｎｅｓ ）　）を統合し、そして、その後、形質転換植物細胞または原型形質転換細胞か ら誘導された細胞をもぎ取り、全植物中に再生すべき能力を当テニスル。この方 法は、遺伝形質変換（またはトランスフェクション）と呼ばれており、一般的で はあるが排他的でなく、外植片と呼ばれる傷付けられた植物物質上の細胞／組織 培養技術を使用して無菌条件下で実行される。

外植片は、本明細書で用いられる場合には、単細胞または原形質体から大きな器 官（例えば、葉、双子葉（ｈＹｐｅｒｃ。

１ｙ１）または根）切片または全体の実生の範囲にわたる。適当な組織培養培地 で、カルス形成は、培地の適当な操作によって（通常、培地中にオーキシンおよ びサイトカイニンの適当な相対的濃度を含有することによって）傷部位で外植片 から続いて起こることができ、そして、カルス誘導細胞から植物を再生すること が可能である。植物再生は、発芽の器官形成によって、あるいはまた体細胞の胚 形成によって達成される。器官形成の場合に、再生した発芽は、通常、目的のた めに設計された異なる培地上で、親カルスおよび発芽の基部に誘導された外来根 生成物から標準的に切り離さなければならない。また、外来の細胞分裂および発 芽または体細胞胚の誘導は、原型傷部位と必ずしも会合されていない部位で幾つ かの組織培養された外植片に生じることができ、かつ、それらの植物再生は、識 別できるカルス相によっていつも生じるものでないことに留意しなければならな い。例えば、全ての植物を誘導することができる数種の未熟の花粉穀物から直接 に全ての植物を誘導することが可能である。外来の発芽および体細胞胚の由来は 明らかでないが、これらの構造のもとである原基は、単「全能性」細胞から誘導 されると考えられている。

全能性細胞は、胚形成または器官形成によってすべての新規な植物のもとである 細胞にすぐに再生し得るまたは該細胞を生成し得る受容力を有する細胞として定 義されている。前記細胞は、変種の技術により植物中に遺伝子転移に関する標的 を表わす。外植片で標的植物細胞になる遺伝子の移転は、任意の適当な方法によ って起こすことができ、そして、微小投射物衝撃（ｍｉｃｔｏｐｒｏｊｅｃ目１ ｅ　ｂｏｍｂａｔｄｍｅｎｆ）、顕微注射またはエレクトロポレーションのよう な受渡し技術をアグロバクテリウムベクターかまたは物理的ＤＮＡを伴う方法が 記載されているものにより一般に達成される。

形質転換植物の生産を成し遂げるため、該標的植物細胞は、形質転換のみならず また再生植物を起こすことができるために「有能な」ものでなければならない。

さらに、前記細胞は、形質転換伝達体（例えば、アグロバクテリウム）に物理的 に得られる、あるいは任意の物理的形質転換技術によって得られるものでなけれ ばならない。得られやすさの問題は、通常、外植片の傷付けられた部分を表わす ものである外植片の表面に近い標的細胞に遺伝子移転を限定する。また、形質転 換および全能性に関する両方の能力を示す形質転換技術で得られる細胞は、任意 の外植片でむしろ稀有であり、任意の外植片のほとんど切断表面（傷部位）部分 と最も一般に関連がある。

遺伝形質転換および全能性に関する細胞質能力の制御は、理解されていない。し かしながら、機械的な傷を付けることおよび脱分化、並びに傷部位での細胞の局 部的な細胞分裂への誘導は、アグロバクテリウムによって形質転換に重要な役割 を果たすことを示唆するための多くの情況証拠である。同様に、植物原形質体に よって外因性ＤＮＡの組込みは、おそらく、類似の脱分化および再活性化の細胞 周期を受けている細胞にのみ生じる。特に、微小投射物衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏ ｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｌ）　、アグロバクテリウムまたは顕微注 射によって、形質転換に関する他の全能性標的細胞型は、通常、すでに脱分化さ れ、かつ（通常、原形質体から誘導された）区分的な単細胞、カルスまたは定着 した懸濁培養された細胞である。幾つかの場合に、未熟な植物器官の細胞（例え ば、肝組織、胚、種子、発芽種子、頂端発芽分裂組織および葉液芽分裂組織）は 、十分に記載された技術によって形質転換することができる。前記細胞は、関連 している器官の正常な発育を通じて、脱分化およびカルス形成を受けることなく 、分裂され、そして、多くの十分な定着技術によって全ての形質転換植物を救う ことが可能であることから形質転換細胞系統に対してキメラ植物を定着すること ができる。例えば、形質転換細胞系統が配偶子を生ずるならば、その後形質転換 した実生は、次世代に再生ずることができる。

形質転換植物物質は、選択薬剤を含む培地で培養できることにより、通常、選択 される。例えば、選択抗生物質または除草剤の共存下で培養することを継続して いる、形質転換カルス、または単細胞もしくは原形質体から誘導される細胞コロ ニーは、最初にカルス培地に定着され、その後、形質転換発芽が、発芽再生培地 への転移によって前記カルスから誘導される。もしくは、ニンジンにおいて、例 えば、形質転換胚は、形質転換穀物植物質および選択薬剤の共存するときに直接 的に発育させた全ての植物から直接的に再生される。多くの植物種（例えば、タ バコ）において、カルス形成の非常に限られた量のみ入れる発芽再生培地に器官 外植片の傷部位から直接的に形質転換発芽を生成することができる。キメラ形質 転換植物（例えば、発芽原基の微小投射物衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃ目Ｉｓ 　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）　、葉液または頂端分裂組織、接合子または体細胞 の胚または胚形成細胞系）を生ずる形質転換の実験の観察記録（ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ）において、形質転換細胞系統を含む組織から全形質転換植物を再生するこ とができ、あるいは、選択薬剤を含有する培地で培養すべきこれらの能力によっ て、最初のキメラ形質転換細胞から誘導される実生の第２世代に完全に形質転換 した実生を選択することが可能である。任意の実験の観察記録（ｐｒｏｊｏｃｏ ｌ）によって生ずる発芽、胚または実生の形質転換しら性質は、選択薬剤の共存 するとき定着しかつ生長すべきこれらの能力によって、あるいは任意な特別の標 識遺伝子の発現から選抜することによって、通常、確かめることができる。

本発明の目的のために、標識遺伝子の発現は、選択が適用され、あるいは、標識 遺伝子の存在のために選抜が必要とされる場合、以下に示す概括された細胞型（ 表１に示す）が望ましいものであるが、これは、余す所のないリストでないこと は認められる。

表１ 遺伝子転移および選択に関する標的細胞１）事実上カルスを生じ、あるいは直接 的に器官形成または胚形成を行うところの細胞脱分化をなす細胞。

２）カルス内部に、あるいは単細胞または原形質体から誘導される細胞コロニー 内部に含まれた細胞、あるいは細胞懸濁培養内の細胞。

３）形質転換発芽または根の原基あるいは体細胞胚で生ずる細胞。

４）発育している根、発芽、胚または選択薬剤の共存するとき生長する実生内部 に含まれた細胞。

５）また、ライフサイクルの任意の段階で得られた僅かな組織外植片に形質変換 植物に関して選抜を認めるために一時的な、誘導できる標識遺伝子発現を考慮に 入れることが望ましい。

プロモーターは、例えば、発現の回数または場所を指定することによる発現、あ るいは傷付けることまたは病原体の攻撃のような特別の刺激に応じて遺伝子発現 を統制する遺伝子の領域である。プロモーターは、遺伝子の解読領域から切り離 すこと、および異なる解読領域の発現を誘導するために用いること、すなわち、 異なる生成物の発現を与えることができる。プロモーターは、原則として、任意 の遺伝子の発現を制御するために用いることができる、かつ生長を通じて特異的 細胞型にそれの遺伝子生成物の生産を制限することができ、あるいは特異的環境 誘導条件下または加えられた刺激に応じて遺伝子生産物の生産を与えることがで きる。

本発明は、一部分は、適当な遺伝子が形質転換手順の改良と形質転換穀物植物の 品質の改良との両方を植物組織培養の遺伝子および上記に定義された細胞型の標 識遺伝の目的の制御可能な発現を与えるプロモーターの原料として分離すること ができるとする現実に基づくものである。適当な遺伝子を分離した後、プロモー ター領域は、同種と認めることができ、非常に制御可能な発現プロフィルを伴う 以外には、目的の細胞型に強く発現される新規な標識遺伝子を生長するために用 いられる。前記プロモーターの望ましい特徴は、形質転換に関して適当な標的細 胞型におよび形質転換物質に関する選択が適用される場合には、適当な細胞型に 任意の植物種にインビトロで高い発現をさせるとする事実を含む。前記プロモー ターの第２の望ましい特徴は、組織培養の外部の生長した植物物質の大部分の細 胞型に遺伝子発現が認められないことである。前記プロモーターの第３の望まし い特徴は、選抜するときまたは選択のために要求されるときの一般の標識遺伝子 の発現を与えるために外因性の刺激によって任意の細胞型に誘導できるものとす ることである。本発明の実施例として紹介された標識遺伝子は、徹底的なリスト でなく、かつ選抜または選択標識の多くの別の型を用いることができることが認 められている。

前記プロモーターの第４の望ましい特徴は、単子葉植物細胞の標識遺伝子の強い 発現を認めることができることである。本発明の何月なプロモーターは、これら の特徴の、少なくとも幾つか、そして好ましくは全てを有するものであまた、記 載されるプロモーターは、記載される細胞型に任意の他の遺伝子の発現を制御す るために、あるいは適当な刺激を加えた後に、多くの他の考えられる方法で穀物 植物を改良するために、用いることができることは明らかである。例えば、植物 傷部位で特異的な遺伝子発現の誘導は、病原体に対する植物耐性を処理するため に向けられた細心のストラテジイーに用いることができる。また、化学的エリジ ター（ｅｌｉｃ目ｏｒｓ）によって遺伝子発現の系に関する誘導は、制御可能な 方法で特定の商業上高価なタンパク質生成物の穀物植物の生産を与えるものであ る。

また、組織培養での遺伝子の発現は、植物細胞培養から生産物の回復を高めるた めに利用することができる。化合物の生産に関連する遺伝子は、前記の強いプロ モーターによって誘導される場合、高い生成物レベルに関する細胞系の選択によ ってかまたは培養で強く発現された他のプロモーターにより誘導される遺伝子の 採用によって達成可能な前記レベルの生成物の回復を高めることが期待されてい る。

傷部位での細胞分裂およびカルス形成の誘導は、主に双子葉植物の植物組織の模 式的なものであり、リリアセアエ（Ｌｉｌｉａｃｅａｅｌ科（例えば、アルパラ ガス）のある種の構成員を除いては、著しく最多数の単子葉植物（たとえば、穀 物）によって示されない。大多数の植物では、傷カルスは、カルス細胞が、素早 く該傷部位を閉じ、かつ「傷境界層」を形成するコルク質、リグニンおよび他の 水不浸透性物質で充満される場合には、短命である。機械的に傷付けることに対 する植物反応の１つの構成要素は、「防御」と関連している遺伝子の範囲の転写 の素早い誘導である。これらの遺伝子は、傷部位に非常に接近した細胞を活性化 し、あるいは、傷付けの激しさに従って、傷付いた／感染した植物（または幾つ かの場合には双方）を全身的に活性化する。

また、これらの「防御」と関連している遺伝子の多くの転写は、生物学的由来（ 例えば、菌類細胞壁フラグメント）および非生物学的由来（例えば、サリチル酸 、アラキドン酸またはグルタチオン）の［エリジター（ｅｌｉｃｉｌｏｒｓ）　 Ｊで、植物または植物の部分の手当てによって高統制（ｕｐｒｅｇｕｌ［ｅｄ） することができる。該傷部位に接近した生育する能力のある細胞に、前記細胞か ら次のカルス形成までの間に発現した前記遺伝子は、本発明に有用であるプロモ ーターを供給するものであり、そして、形質転換を生ずるところの外植片植物組 織での部位に遺伝子発現を制限することができる。さらに、前記プロモーターが 化学的なエリジターによって誘導可能になるようにすることが可能である。

植物傷表面で成育する能力のある細胞、あるいは前記細胞が傷付いていない組織 に取り巻かれている場合、会合したカルスの傷を生じている細胞を研究すること は非常に困難である。この問題を迂回するために、「防御」と関連している遺伝 子のクローン化に導〈従来の大多数の研究は、長期間懸濁培養された細胞を「エ リジター」処理によって特に誘導されたｍＲＮＡに同層と認めるｃＤＮＡクロー ン種によって企てられている。しかしながら、すでに脱分化され、分裂し、エリ ジターで処理された培養細胞が、植物および組織培養中の配置からの切除に次い で外植片の傷表面での遺伝子の習性に関する優秀なモデルを表わすとしても、実 際には、明確ではない。植物外植片は、傷付けた後２〜４０アグロバクテリウム による形質転換で十分であることが良く認められているとき、当該優秀性を生じ させることが重要であり、および形質転換細胞について選択は、単に、この時期 の期間後にのみ強制され、その結果、任意の標識遺伝子は、この期間の時期の間 に傷部位で活性化しなけれならない。

従来研究されている多くの「防御」と関連している遺伝子は、傷付け／引き出す こと（ｅｌｉｃｉ…１ｏｎ）　／感染後２０〜３０分以内に誘導され、そして、 それらの発現は、むしろ一時的に、最初の誘導後、数時間（６〜８）でピークに 達するだけである。例えば、幾つかの「防御」と関連している遺伝子のプロモー ター（例えば、パセリのＰＨ１、豆のＣｈｓ−８およびＰＡＬ、およびタバコの ＰＲＩ）は、同層と認められており、形質転換植物（先駆者ロク・ン（Ｌｏｃｂ ｌ）、メイヤーｔＭｅｉｅ＋）　、””ルブロック（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ）およ びソミシッチ（Ｓｏｍｓｓｉｃｈ）　（１９９０）　：Ａ　１２５　ｂｐ　プロ モーターフラグメントは、パセリでの強いエリジター仲介遺伝子活性化のために 十分である。ザ　エンボ（ＥＭＢＯ）　ジャーナル、９：２９２５−２９５０； ｏイス（ＬｏｉＳ）、ディトリッチ（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ）、ハハルブロック（Ｈ ａｈｌｂｒｏｃｋ）およびシュルツ（Ｓｃｈｕｌｘ）　（１９８９）　パセリか らフェニルアラニンアンモニアリアーゼ遺伝子：エリシタ−および光反応性ンス ー作用する成分の構造、規則および同定。

ザ　エンボ　ジェイ、（Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、）　８：１６４１−１６４８；ド エルナ−（Ｄｏｅｒｎｅｒ）　、ステル７−　（Ｓｔｅｒｎｅｒ）、シュミット （Ｓｃｈｍｉｄ）、ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）およびラム（Ｌａｍｂ）（１９９ ０）　形質転換植物における植物防御遺伝子とプロモーター遺伝子融合：新規な 誘発物質の同定用の道具。

バイオ／テクノロジ４−　（Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、８：８４５−８ ４８；リー（Ｒｈｅｅ）、カン０：ａｎ）　、ゴンザレス（Ｇｏｎｘａｌｅｘ） およびポル（Ｂｏｌ）　（１９９０）。サリチル酸塩処理およびウィルス感染に よって２種のタバコ遺伝子の誘導に関係する規定する成分の分析。ザ　プラント 　セル（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃａ１ｌ）　２　：　３５７−３６６）での傷部 位（または病原体侵入部位）で迅速に配置された遺伝子発現を誘導することがで きることを示している。他の遺伝子（例えば、キチナーゼ（Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｌ　）は、よりゆっくり誘導され、か０２〜３日後にピークの発現レベルを示す 供給プロモーターを有する（ロビイｆＲｏｂｙ）、プログリ−（Ｂｒｏｇｌｉｅ ）　、クレスマン（Ｃｒｅｓｓｍａｎ）、ビードルｆＢｉｄｄｌｅ）、チェット （Ｃｈｅｔ）およびブログリ−（Ｂｒｏｇｌｉｅ）　（’］、　９９０）　植物 中病原生物の菌類の菌によって形質転換下タバコ植物中の豆キチナーゼ（Ｃｈｉ ｌｉｎａｓｅ）プロモーターの活性化。ザ　プラント　セル（Ｔｈｅ　Ｐｌａｎ ｌ　Ｃｅ１ｌ）　２　：　９９９−１００７）　、また、これらのプロモーター の多くは、化学的な「エリジター」によって誘導可能である。これらのプロモー ターの活性に関してのデータは、通常、遺伝子発現を監視するためのガス（ＧＵ Ｓ）のような「リポータ−」遺伝子を用いて得られている。

傷付ける」二での、並びに植物「防御」遺伝子およびそれらのプロモーターの分 離上での上記研究は、双子葉植物に集中されている。前記プロモーターは、単子 葉植物（例えば、穀物）中で活性化されるとする証拠はわずかあるいは全くなく 、かつこの群の植物種は、任意の技術を用いて、遺伝学的に処理することは非常 に困難であることがデータで判明されていることが広く認められている。

植物形質転換走査に有用であるためには、プロモーターは、双子葉植物および単 子葉植物の両方の傷部位で迅速に誘導されることが必要であり、前記プロモータ ーからの発現は、形質転換用標的であり、かつ形質転換のための選択が課せられ た、細胞内で傷付いた後数口間生き残るべきである。また、前記プロモーターが 、活性に分裂し、器官形成／胚形成培養された細胞に、並びに直接ＤＮＡ転移技 術によって形質転換用標的を表わす（上記表１に同定された）胚および器官原基 での他の細胞型に有用であるならば、前記プロモーターの効用は、大いに高めら れるであろう。

また記載されたような選択可能な方法システムの成分として有用なプロモーター の示す特性は、植物細胞培養中の生産に有用なプロモーターを示す。

本発明の第１の目的の大いに好適な具体的表現によれば、７スパラガス　オフィ シアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉ＋）内の傷付いたおよ び／またはカルス形成の後およびまたは間に予測される１６．９２ｋＤａのタン パク質を、あるいは他の多くのりリアセアエ（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）またはアマ リリダセアエ（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｃ）内の同等のタンパク質をエンコ ードする遺伝子の発現を自然に押し進める（ｄｒｉｖｅｓ）プロモーターからな る組換えまたは分離されたＤＮＡ分子を提供するものである。

本明細書において、アスパラガス　オフィシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏ ｌｆｉｃｉｎａｌｉ＋）内の１６．９２ｋＤａのタンパク質および他の多くのり リアセアエ（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）またはアマリリダセアエ（Ａｍａｒｙｌｌｉ ｄａｃｅａｃ）内の遺伝子と同等のエンコードする遺伝子は、ＡｏＰＲ１遺伝子 として表わすものである。該ＡｏＰＲ１遺伝子は、科学文献に記載された他の傷 付は誘導または病原体誘導またはエリジター誘導、またはカルス特異性遺伝子か らの発現の配列およびパターンが異なっている。ＡｏＰＲ１遺伝子は、双子葉植 物中で発現されたＰＲ−１型タンパク質の網（ｃｌａｓｓ）に対する相同に限定 されている。幾つかのこうしたタンパク質は、傷部位に接近して発現されている ことが知られており、幾つかの場合には、エリジター処理によって誘導可能であ ることが示されている。しかしながら、本発明に記載したＡｏＰＲ１遺伝ｒは、 早急に高統制され、かつ傷付けた実生中および組織培養された外植片中の双方の 傷付けた植物物質中で大いに活性であるところの他のＰＲ−１型遺伝子からのそ の転写プロフィールと著しく相違し、そして、それの高発現は、外植片またはカ ルス細胞中の傷部位および最初の傷付けた組織から誘導された懸濁培養細胞中で 傷（＝ｊけた後多数日間生き残る。

ＡｏＰＲ１遺伝子発現は、アグロバクテリウムを基礎とした方法による、かつ直 接ＤＮＡ配達方法による形質転換に関する第１の部位であり、主としてアスパラ ガス実生中および組織培養細胞中の（Ｍ部位の場所に限定される。記載されてい る異なった他の傷付いた誘導プロモーターであるＡ　ｏ　Ｐ　Ｒ１遺伝子は、形 質転換プロセスの間に選択処理を受ける細胞型に発現され、さらにＡｏＰＲ１遺 伝子は、サリチル酸によって誘導することができる。特別の注意力は、生長植物 中の細胞型の大多数が、ＡｏＰＲ１遺伝子を発現しないという事実を引き出させ 、標識遺伝子発現を押し進めるために用いられるＡｏＰＲ１遺伝子から任意に分 離されたプロモーターが、形質転換植物中に最小量の欠陥のある標識遺伝子生成 物のみを確保するような場合に、これは重要な特徴である。

ＡｏＰＲ１遺伝子生成物の分子量は、推定上のものであり、かつＤＮＡ配列から 演鐸されるとして存在すべきと考えられるアミノ酸の数から推論される。Ａ　ｏ 　Ｐ　Ｒ１遺伝子によってエンコードされた１６．２９ｋＤａのタンパク質は、 １５８個のアミノ酸を何する。したがって、分子量は、変更されていないタンパ ク質に関係し、部分的な加水分解のような転移処理後の任意の効果は無視される ことが認識されるものである。しかしながら、当該技術分野で周知であるアスパ ラガス　オフィシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｌ（ｉｃｉｎａｌｉｓ）の タンパク質にのみ関係して、上記に与えられた算術は、ただちに、リリアセア工 科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ　ｆａｍｉｌｙ）または関連したアマリリダセアエ群（ Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ　ｇｒｏｕｐ）の他のメンバーから同等なタンパ ク質を同定することができる。これらの同等な遺伝子は、核酸ノλイブリ・ノド 形成の研究、制限断片長条型（ＲＦＬＰ）マツピング（ｍａｐｐｉｎｇ）、ＰＣ Ｒクローニングおよび当該技術分野において知られた他の方法によって分離され 得るものである。厳密に同等なタンパク質をエンコードする遺伝子および他のＤ ＮＡは、ＡｏＰＲ１遺伝子、または、例えば、１０．２０．５０または１００ヌ クレオチドのそれらのフラグメントに、例えば、（約０．９モルの塩溶液中で約 ３５〜６５℃とする）厳正な条件下で雑種を生ずる。１５〜２０ヌクレオチドプ ローブが多くの環境下、適当である、例えば、ＡｏＰＲ１遺伝子配列に対してデ ザインされたＰＣＲプライマーは、リリアセアエ（Ｌｉｌｉａｃｅｉｅ）および アマリリダセアエ（Ａｍａｒ７！１ｉｄａｃｅａｅ）の他のメンバーからのｍ　 ＲＮ　Ａから遺伝子を増大するために用いられる。

本明細書中に記載された好適なＡｏＰＲ１プロモーターは、アスパラガス　オフ ィシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｌｆｉｃｉｎａ１目）からであり、そし て、当該技術分野において知られた方法によって、例えば、（ａ）アスパラガス 　オフィシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｌｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の機械的 に傷付けたおよびカルスを形成した細胞から分離されたｍＲＮＡからの合成ｃＤ ＮＡ、（ｂ）当該ｃＤＮＡの分離、（ｃ）当該遺伝子をエンコードするアスパラ ガス　オフィシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓｌ　の 植物ゲノムの領域で同定するためにプローブとしての当該ｃＤＮＡの使用、およ び（ｄ）当該ＤＮＡを包含する上流にある（５′）に規定する部分の同定によっ て分離することができる。また、リリアセアエ（Ｌｉｌｉａｃｅａｅｌ　および アマリリダセアエ（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）の他のメンバーからのＡｏ ＰＲ１プロモーターは、本発明の範囲に包含される。

ステップ（ａ）の目的のために、成育する能力のある細胞が、単１葉植物と双子 葉植物の双方に含まれる植物種の範囲から機械的に剪断することによって分離す ることができる。アスパラガス　オフィシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆ ｆｉｅｉｎλｌ１ｓ）のような植物では、機械的に分離された細胞は、非常に大 きな数に分離することができ、特異的な生長培地に置かれた場合には、細胞の脱 分化を受け、細胞分裂を再活性化し、ついにカルスを形成する。アスパラガス細 胞は、傷部位の分裂のために好適な選択であり、そしてアスパラガスのようなカ ルスを形成する特異的な遺伝子は、単子葉植物であり、そして通常、双子葉植物 と関連される多数の偽応答現象（すなわち、細胞脱分化および細胞分裂の誘導） を、なお表示する。すなわち、当該種から分離されたプロモーターは、双子葉植 物および単子葉植物の双方に良く機能することが期待されている。

培養された機械的に分離された細胞は、脱分化およびカルス形成を受ける傷表面 細胞の多くの特徴を示す。本発明は、前記細胞集団が、傷付けられかつ組織培養 された細胞に特異的に誘導された遺伝子転写物の実際の富化源を表わすことの証 拠となる。ｃＤＮＡライブラリーは、細胞分裂の後で異なる代に機械的に引き離 された細胞から抽出されるｍＲＮＡから作ることができる。該ライブラリーの分 画スクリーニングおよびランダム組換えクローンのテスティングは、該ライブラ リー中のｃＤＮＡクローンの大きな割合が傷誘導されかつ細胞培養特異性遺伝子 の富化源として機械的に分離された細胞の有効性を実証することで再度傷誘導可 能であることを示す。前記遺伝子の発現の詳細な分析は、発現プロフィールの幾 つかの異なる型がインビトロで培養された機械的に分離されたアスパラガス細胞 および傷付けられたアスパラガス外植片（図１参照）中に発見されるてあろうこ とを示す。詳しい注意力は、ある遺伝子が傷付いた／細胞分離後に迅速に誘導さ れ、かつ傷付いた後７０より以上の間、大いに発現されていることが継続される という事実を引き出させる。また、これらの遺伝子の１種は、サリチル酸による アルパラガス実生外植片の処理によって誘導可能であり、かつ形質転換のための 新規な標識遺伝子の生長においてプロモーターの分離に関し好適に選特に好適な プロモーターは、後に実施例で記載されるような図５に示すコーディング（ｃｏ ｄｉｎｇ）領域のこれらを包含する配列の上流にあるものである。当該技術分野 における当業者は、コーディング領域およびそれらを含む分離および／または組 換えＤＮＡで、押し進める十分で正確なプロモーターで同定することができる。

本発明に従って、ＤＮＡを含むプロモーターは、以下に記載するような多様な方 法で、植物形質転換に使用するために改良された標識遺伝子を用いることができ る。（これに関連して、「遺伝子」という言葉の使用は、単に天然遺伝子のみが 本発明のプロモーターによって押し進めることができることを意味することと取 るべきでなく、むしろ、任意の適当なタンパク質エンコーディングＤＮＡが「遺 伝子」という言葉の中に包含されているとすべきである。）。

本発明の重要な目的によれば、上記ゆえに、発現された場合に、形質転換した植 物物質、または特定の化合物を生産する植物細胞培養の選択および／または選抜 を認めるＤＮＡに操作上で連結されているカルス活性プロモーターを提供するこ とである。

本発明の当該目的に従って、カルス活性プロモーターは、単子葉植物中で活性で あるこれらに制限されるものでない、しかしながら、前記プロモーター（包含し ている、特に、ＡｏＰＲ１プロモーター）が、望ましいものである。他の安定な プロモーターは、パセリのＰＨ１、豆のＣｈｓ−８およびＰＡＬおよびタバコ内 のＰＲＩを含んでいる、双子葉植物中のそれらの防御関連遺伝子を含む。おそら く、当該技術は、前記環境に強く、重要なプロモーターの使用に集中しているか ら、ドライビング（ｄｒｉｖｉｎｇ）標識遺伝子中の任意のこれらのプロモータ ーの使用が、文献に提案されていることはありそうにない。

本発明のもう１つの重要な目的に従って、植物細胞または組織培養から再生する ために探求された物質の生産に関係するＤＮＡに操作上、連結されているカルス 活性プロモーターが提案されている。該物質は、運転された（ｄｒｉｖｅｎ）Ｄ ＮＡがそれに関して（またはそれの前駆体に関して）コードしてもよい場合には 、タンパク質であってもよいだろう。もしくは、該物質は、１つの酵素の形成が 、運転された（ｄＩｉｖｅｎ）　Ｄ　Ｎ　Ａが酵素に関する性質、形状をもった ちの（ｏｄｅｌである、そのような場合に、関係するものであるところの、もう １つの化合物または化合物の群（ｇｒｏｕｐ）であってもよいだろう。概して言 えば、再生するために探求された物質は、商業上の重要性があるであろう。

再び、本発明の当該目的では、適当なプロモーターは、好適なものであるけれど も、単子葉植物に活性であるものに限定されるものでない。

特に、排他的でないが、植物細胞および組織の培養の目的に関して、本発明にＨ 用なりＮＡは、高められた遺伝子発現を与えるように超誘導（ｓｕｐｅｒ−ｉｎ ｄｕｃｉｂｌｅ）　してもよい。

もしくは、またはさらに、ＤＮＡは、より強い発現を与えるためにＤＮＡ配列の 追加によって修飾されていてもよい。

有効な形質転換系が必要であるから、ベクター標識遺伝子は、アクロバタテリウ ムに基づくベクターに結合され、形質転換ＤＮＡの直接配達、例えば、当該技術 分野の当業者に周知の技術を用いたエレクトロポレーション、微小投射物（ｍｉ ｃｒｏｐｒｏｉｅｃｔｉｌｅ）または顕微注射を用いる形質転換方法に用いられ るベクターに結合される。本発明に従い、かつＡｏＰＲ１プロモーターと結合す るＤＮＡは、形質転換の要求に適う細胞中の、および形質転換細胞が植物形質転 換プロセスの間に選択される細胞型上の形質転換標識遺伝子の強い発現を標的に することができる。また、前記ＤＮＡは、培養容器中の化合物の製造に有用な脱 分化細胞型−ヒの細胞培養生成物の強い発現を標的にすることができる。

運搬ペプチド配列のプロモーターの添加によって細胞の外部の分泌に関する生成 物を標的にすることができる。

本発明の独特の特徴は、傷付いた組織／細胞および単子葉植物および双子葉植物 の双方から誘導された培養された外植片におけるプロモーターの強い発現である 。これは、一般に単子葉植物組織にまたは組織培養された細胞に非常に高く発現 されるものでない標識遺伝子発現を運転する（ｄｒｉｖｅ）ために通常用いられ るしばしば重要なプロモーターに対するものである。この特徴は、周知な方法に よって特にタバコに有効に形質転換の改良が認められ、そして、それら自身に周 知である方法によって他の種（単子葉植物を含む）を含めるべく拡張することが できる。こうした標識遺伝子の使用は、形質転換方法が、相対的に有用でなく、 かつあらかじめ手に負えないまたは今までのところ試験されていない植物種に形 質転換技術を広げる場合、植物種に有効な形質転換技術の発達の速度を上げるも のであることがｒ想させるものである。

本発明のプロモーターは、高い傷部位および細胞培養／カルスに特異的である。

発現の制御は、非常に強いものであり、そしてＡｏＰＲ１プロモーターによって 運転された（ｄｒｉｖｅｎ）任意の標識または池の遺伝子は、傷付けた、培養し たおよび病原体侵入の部位でのそれの発現は別として、プランタ（ｐｌａｎｆａ ）における完全な形質転換した植物に非常に限定された発現だけを示す。例えば 、ＡｏＰＲ１プロモーターの非常に少ない量の発現は、成熟した花粉におよびア ンサシアニン（ａｎｌｈａｃｙａｎｉｎ）　ａ有範囲の花に認められる。

相対的な期間では、ＡｏＰＲ１プロモーターは、組織培養された外植片での標識 遺伝子生成物と比較した場合、全ての採収された形質転換植物（例えば、タバコ 、図１３）に見られる標識遺伝子生成物の１０００倍の還元より大きいことを示 す。植物の形質転換した性質を確認することが必要とされる場合、組織サンプル は、副圧され、かつＡｏＰＲ１プロモーターを誘導するためにサリチル酸で処理 され、その結果、任意の組織型（図１３）に観察されるべき標識遺伝子発現を認 めることができる。この特徴は、形質転換した細胞での標識遺伝子生成物の製造 に制限されず、かつ形質転換した細胞での任意のタンパク質を誘導できる製造を 包含することができることに留意すべきである。

従って、本発明の重要な利点は、Ａ　ｏ　Ｐ　Ｒ１プロモーターによって推進さ れる標識遺伝子が、通常、形質転換植物中の細胞の大部分に発現されず、かつそ の結果、好ましくない標識遺伝子生成物の製造の大部分は避けられるとする点に ある。本発明のこの特徴は、本質的に高レベルのこうした好ましくない遺伝子生 成物の発現が原因であるところの幾らかの収率低下を示しそうなさほど重要でな いＡｏＰＲ１プロモーターによって運転された（ｄｒｉｖｅｎｌ標識遺伝子を用 いて生ぜられる形質転換した植物を作ることである。

採収した穀類植物中の標識遺伝子生成物の量は、因襲的に推進された標識遺伝子 を用いて形質転換された植物に比べた場合、実質上、非常に減少される。この特 徴は、実質上、任意に起こり得る現実または形質転換した植物の想像される有害 な環境の影響を少なくすべきで、一般の農業実施に解放し、かつ好ましくないタ ンパク質生成物の蓄積および／または植物誘導された食料品での酵素活性化を回 避するであろう。こうした特徴は、形質転換した種子および穀物の市場性を改良 するであろう、そして、形質転換した穀物植物から推進される食料品の品質を改 良するであろう。

本発明は、運転された（ｄｒｉｖｅｎ）特殊な標識遺伝子によって制限されるも のではなく、多くのプロモーター運転可能な（ｄｒｉｖａｂｌｅ）標識遺伝子配 列が望ましいものである。例えば、該標識遺伝子は、抗生物質または除草剤耐性 遺伝子をエンコードするだろう。

該抗生物質または除草剤耐性遺伝子の生成は、抗生物質または除草剤の特定の網 （ｃｌａｓｓ）を限定し、または退化させ、そしてその結果、植物細胞上のそれ らの通常有毒な効果を無効にする、すなわち、選択培地上で生長するために形質 転換された植物物質を与えるであろう。

ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ（ＮＰＴ−ＩＩ）は、ネオマイシン、カ ナマイシンおよびＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質の幾つかの型に耐 性を与えることができる酵素の一例である。これは、多くの形質転換系に用いら れる良く知られた一般的な抗生物質耐性遺伝子である。ホスフィノスリンンアセ チルトラスフエラーゼ（ｐｈ。

５ｐｈｉｎｏｊｂｒｉｃｉｎ　ａｃｅｔｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｔａｓｅ）　（ｂ 　ａ　ｒ）は、除苧剤ホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ ）　（取引名称；バスタ（ＢＡＳＴＡ）またはビアロホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ ）　）に耐性を与え、かつ多くの単子葉植物種の形質転換における優れた効果の ために用いられる標識遺伝子である。

β−グルクロニダーゼは、該ＡｏＰＲ１プロモーターが、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼのような同種の標 識遺伝子の発現を運転するために容易に適合させることができたとはいえ、選抜 可能な標識遺伝子として特定の有用性が発見されている酵素である。

選択または選抜可能な標識中の多くの他のコーディング配列がＡｏＰＲ１プロモ ーターによって運転されることができ、かつ上記リストが徹底的なものでないこ とを認識すべきである。

上記記載の場合、本発明の重要な実施態様としては、選択可能なおよび／または 選抜可能な植物標識をエンコードするＤＮＡ５ＡｏＰＲ１プロモーターに機能的 に作用して連結されてなる該植物標識ＤＮＡが提供されることである。

本発明のＤＮＡ配列の特に好適な実施態様としては、ポリアデニル化シグナルの ような、３′末端転写調節シグナルが、任意の他の調節配列と同様に、提供され るでもよい。

好適な３′末端転写調節シグナルは、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝 子から誘導される。また、他の３′末端転写調節シグナルも使用することができ ることは認識すべきである。ＡｏＰＲ１プロモーターは、カリフラワーモザイク ウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子（図１１）から、例えば、３′末端ポリアデ ニル化シグナルの追加で単純転写遺伝子融合の生成を与えることを制限させるで あろう。

本発明に係る組換えＤＮＡは、ベクターの形成によるものである。該ベクターは 、例えば、プラスミド、コスミドまたはファージであってもよい。ベクターは、 しばしば、それらと形質転換された（または移入された：この言葉は、本明細書 内で交換できるように用いられている。）微生物の細胞の選択を可能にするため に、およびむしろ異種構造ＤＮＡを結合させるベクターが潜んでいる細胞の選択 を可能にするために１またはそれ以上の選択可能な標識を包含するであろう。適 当な開始および停止シグナルは、一般に存在するであろう。さらに、該ベクター が、発現を意図したものであるならば、発現を運転すべき十分な調節配列が包含 されるであろうが、しかしながら、本発明に係るＤＮＡは、主として、植物細胞 に発現されるものであり、従って、微生物寄宿発現は、本発明の本来の目的の中 に入らないものであるけれども、規定などによって除外されるものではない。調 節配列を含んでいないベクターは、クローニングベクターとしてａ用である。

クローニングベクターは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）またはそれらの取扱いを促進 する任意の他の適当な宿主に差し込むことができる。本発明の他の目的によれば 、上記に記載されたＤＮＡで移入されたまたは形質転換された宿主細胞を提供す るものである。

本発明に係るＤＮＡは、互いに共役してなる連続するヌクレオチドを伴ってなる 、および／またはオリゴ−および／またはポリ−ヌクレオチドを結合してなる、 インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）プロセスを含んでなる、任意な便利な方法によ って合成することができるが、組換えＤＮＡ技術が、えり抜きの方法を形成する 。

むしろ、ＤＮＡは、無力にされたＴｉ−プラスミドベクターを用いる植物細胞内 で形質転換され、そして、当該技術分野で公知であるところの方法によるアグロ バクテリウムによって運搬される。もしくは、外来のＤＮＡは、微小投射物（ｍ ｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｊｉｌｅ）装置または他のそのような物理学上の配達シス テムを用いて植物細胞内に直接に差し込むことができる。この方法は、アグロバ クテリウムが、安定した形質転換に関して無力である、例えば、受容体植物が穀 物である場合に好適なものである。むしろ、形質転換ベクターは、植物細胞に転 移させるために遺伝子または他のＤＮＡ配列（これらは、本発明におけるパラセ ンジャー遺伝ｒ−を意味するものである。）の挿入のためのクローニング部位ま ｔ：はマルチクローニング部位をａ白゛する。該パラセンジャー遺伝子または遺 伝子群（ｇｅｎｅｓ）は、ＡｏＰＲ１プロモーターから異なる発現特性を有する プロモーターの制御を受けているだろう。また、任意の種の任意の植物細胞の核 ＤＮＡの範囲内で該ＤＮＡの安定した結合のために提供される任意の他の方法は 、適当なものである。これは、遺伝子形質転換操作がまだ利用できないものであ る植物種を包含する。

結局、本発明に係るＤＮＡは、任意の手段によって植物細胞内に差し込まれる。

さらに本発明の目的によれば、例えば、微小投射物衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅ ｃｊｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎ＋）を用いてなる、形質転換した（単子葉植 物または双子葉植物の）形質転換細胞培養、またはＡｏＰＲ１プロモーターに連 結された機能的に作用する標識ＤＮＡで、アグロバクテリウム形質転換技術に用 いられるようなベクターを提供するものである。全ての植物は、単に形質転換さ れた植物細胞から再生させることができ、そして、その結果、本発明は、記載さ れた発明に係るＤＮＡを含有する形質転換植物（またはそれらの一部分）を提供 するものである。それゆえ、さらに本発明の他の目的によれば、ＡｏＰＲ１プロ モーターによって運転された植物標識遺伝子を含有する形質転換した植物、種子 および増殖された発芽を提供するものである。

本発明によれば、任意の適当な遺伝子は、例えば、当該技術分野において当業者 に周知な技術を用いて、前記ベクターのクローニング部位内に挿入されてもよい 。任意の適当な遺伝子（または遺伝子群）は、その後、Ａ、　ｏ　Ｐ　Ｒ１プロ モーターによ・ってホ制御される標識遺伝子を結合させる適当なベクターを用い て植物細胞に転移されてもよい。それゆえ、さらに本発明の他の目的は、ＡｏＰ Ｒ１プロモーターによって運転された標識遺伝子を含有する形質転換した植物を 提供するものである。さらに、前記植物は、選択されたパラセンジャー遺伝子を 含有してもよい。これらの植物は、大部分の植物組織に標識遺伝子の岐小限度の 発現、および適当な細胞型内にパラセンジャー遺伝子の予想された発現を示す。

さらに、本発明を以下の実施例よって説明する。以下の制限酵素および他の略称 を使用する： ＤＮＡ　デオキシリボ核酸 ＰＲ病原に関連した（Ｐａｊｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｒｅ１ａｔｅｄ）Ｃｈｓ　カ ルコンシンターゼ（Ｃａｌｃｏｎｅ　ｓｙｎ＋ｈａｓｅ）ＰＡＬ　フェニルアラ ニンアンモニアリアーゼＧＵＳ　β−グルクロニダーセ ｋＤａ　キロダルトン ｃ　ＤＮＡ　ＤピーＤ　Ｎ　Ａ　（Ｃｏｐｙ　ＤＮＡ）ｍ　ＲＮ　Ａ　メツセン ジャーリボ核酸ＡｏＰＲ１アスパラガス　オフィシアナリスのＰＲ１遺伝子（Ａ ｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｌｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＰＲＩｅｎｅｌ ＲＦＬＰ　制限断片長条型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎ ｇｔｈ　Ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｈｉｓｍ）ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応 （Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）ＣａＭＶ　カリフラ ワーモザイクウィルスＮＰＴ−ＩＩ　ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ酵 素 ｎｐｔ−１１ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子 Ｇ４１８　ゲンタマイシン４１８ Ｂａｒ　バスタ（ＢＡＳＴＡ）耐性遺伝子（ホスフィノトリシン　アセチル　ト ランスフェラーゼ（ＰｈｏｇｐｈｉＩＩｏｊｈｒｉｃｉｎ　ａｃｅｔｙｌ　ｒｔ ａｎｇｆｅｒａｓｅ）　） ＦＡＴ　ホスフィノトリシン　アセチル　トランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｉ ｎｏｌｈｒｉｃｉｎ　ａｃｅｌｙｌ＋ｒａｎｓｌｅｒａｓｅ） ｐａｔ　ホスフィノトリシン　アセデル　トランスフェラーゼ遺伝子（Ｐｈｏｓ ｐｈｉｎｏｊｈｒｉｃｉｎａｃｅｔｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ） ＣＡＴ　クロラムフェニコール　アセチル　トランスフェラーゼ（Ｃｈｌｏｒａ ｍｐｈｅｎｉｃｏｌ　ａｃｅｊｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ） ＯＲＦ　読み取り枠（Ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）Ｉ　ＰＣＲ逆ポ リメラーゼ連鎖反応（Ｉｎｖｅｒｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒ ｅａｃｔｉｏｎ）Ｘ−Ｇｌｕｃ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル　グル クロニド（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ　ｇｌｕｃ ｕｒｏｎｉｄｅ）Ｐｆｕｓ　プラーク形成ユニット （ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）ＳＤＳ　ドデシル硫酸ナトリウム ｂｐ　塩基対 ｄＮＴＰ　デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　 ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＣａＭＶ　Ｐｏ１ｙ　Ａ　カリフラワーモザイクウ ィルスポリＡシグナル ＦＲＯＭ　プロモーター ＣａＭＶ３５Ｓ　カリフラワーモザイクウィルス３５３転写物 Ｓ／Ｄ　シャイン・ダルガーノ配列 ＲＶ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＶ Ｋｐｎ　Ｋｐｎｌ Ｂｃ　Ｉ　Ｂｃ　Ｉ　Ｉ Ｂｇｌ　Ｂｇｌｌｌ Ａｃｃ　ＡｃｃＩ Ｈ３ＨｉｎｄＩＩｌ Ｘｈｏ　Ｘｈｏｌ ＲＩ　ＥｃｏＲＩ Ｓａｃ　５ａｃｌ Ｅｃｏ　ＥｃｏＲＩ Ｓｍａ　Ｓｍａ　Ｉ Ｂａｍ　ＢａｍＨＩ Ｐｓ　ｔ　Ｐｓ　ｔ　Ｉ Ｎｏｔ　Ｎｏｔｌ Ｓｐｅ　Ｓｐｅ　Ｉ Ｄｒａ　Ｄｒａｌ　Ｉ Ｃ１ａ　Ｃ１ａｌ Ｓａ　Ｉ　Ｓａ冊 Ｘｂａ　Ｘｂａｌ Ｎｏｓ　ツバリンシンターゼ （Ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ）Ｐｏｌｙ（Ａ）　ポリアデニル化シグ ナル配列（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｌｉｏｎ　ｓｉｇｎａＩ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ）実施例を以下の添附した図を参照する：図１は、物理的に単離したアスパラガ ス細胞から精製したｍ　ＲＮ　Ａから調製したライブラリーにおける傷部位／カ ルスに特異的なｃＤＮＡクローンの頻度に関するデータを　□表わす表を示すも のである。クローン番号３から３９は、標識された葉状茎（ｃｌａｄｏｄｅ）の 第一のＤＮＡ鎖を用いてプレスクリーニングした後ｃＤＮＡライブラリーから無 作為に選ばれた「放射性同位元素を含まない」クローン（’ｃｏｌｄ’　ｃｌｏ ｎｅ）である；クローン番号Ａ５からＡ１７は、ｃＤＮＡライブラリーから無作 為に単離されたクローンである。

様々なりローン番号に関する説明は以下の通りであるニー３：　低い存在量、ピ ーク　１〜３日目；５：　細胞、高い存在量、ピーク　３日目；植物、高い存在 量、ピーク１〜３日目； ２２：　低い存在量、ピーク　１０目；２８：　細胞、低い存在量、ピーク　３ 〜５日目量目；植物い存在量、ビー２１００； ３０：　培養液の存在′ｇｋ（ｍｅｄｉｕｍ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、ビー２３ 日目； ３４：　培養液の存在量（ｍｅｄｉｕｍ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、ビー２３日目 ； ３７：　培養液の存在量（ｍｅｄｉｕｍ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、構成性、ピー ク　細胞中で３日目および植物中で１日目；３９：　細胞、高い存在量、ピーク 　１〜３日目；植物、培養液の存在量（ｍｅｄｉｕｍ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、 ビー２３日目； Ａ１１：細胞、低い存在量、ピーク　１〜３日目；植物、低い存在量、ビー２１ ００； Ａ１２：培養液の存在量（ｍｅｄｉｕｍ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、ピーク１０口 ； Ａ１６：培養液の存在量（ｍｅｄｉｕｍ　ａｂｕｎｄｉｎｃｅ）、１日目のみ存 在。

注意二葉状茎の第一のｃＤＮＡ鎖を用いてスクリーニングした際に１７％のプラ ークがポジティブなシグナルを示した。約３０％の無作為に選ばれたクローンが 傷によって誘導または細胞培養によって誘導された。

図２ａおよび２ｂは、アスパラガス組織からの外植片におけるＡｏＰＲ１遺伝子 の誘導のプロフィルを説明するＲＮＡハイブリッド形成（ノーザン）実験を示す ものである。

図２ａは、細胞を単離および傷を付けた後の転写物のノーザン分析を示すもので ある。全ＲＮＡを、傷の付いていない実生（レーン１）、単離してから１日経っ た細胞懸濁液（レーン２）、傷を付けてから１日経った実生を２ｍｍの長さに切 断した片（レーン３）、傷を付けてから１日経った実生を１０ｍｍの長さに切断 した片（レーン４）、単離してから２日経った細胞懸濁液（レーン５）、傷を付 けてから２日経った実生を２ｍｍの長さに切断した片（レーン６）、傷を付けて から２日経った実生を１０ｍｍの長さに切断した片（レーン７）、単離してから ３日経った細胞懸濁液（レーン８）、傷を付けてから３日経った実生を２ｍｍの 長さに切断した片（レーン９）、傷を付けてから３０経った実生を１０ｍｍの長 さに切断した片（レーン１０）から抽出し、変性したゲル上で泳動し、プロッテ ィング（ｂｌｏｔ）Ｌ、さらにＡｏＰＲｌ　ｃＤＮＡから作製されたプローブと ハイブリッドを形成させた。

図２ｂは、傷を付けた部位での転写産物量のノーザン分析を示すものである。傷 の付いていない実生からおよび傷を付けてから１．２及び３日経った５ｃｍの傷 の付いた中胚軸（ｍｅｓｏｃｏｆ７１）の外植片を以下のように分けたものから 全ＲＮＡを抽出した：（ａ）、傷を付けた部位から１２゜５ｍｍ離れた２５ｍｍ 長の部分；　（ｂ）傷を付けた部位から２．５ｍｍ離れた１０ｍｍ長の部分；　 （Ｃ）傷を付けた部位を自む２．５ｍｍ長の部分。全ＲＮＡを変性したゲル上で 泳動し、プロッティング（ｂｌｏｔ）Ｌ、、さらにＷ　ｉ　ｐ　−１ｃＤＮＡを 用いて調べた。

図３は、ＡｏＰＲｌ　ｃＤＮＡのＤＮ配列およびアスパラガス　オフィシアナリ スのＡｏＰＲｌ　ｃＤＮＡ（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　 ＡｏＰＲｌ　ｃＤＮＡ）に含まれるＯＲＦの推定されたタンパク質配列を示すも のである。下線部分は、逆ＰＣＨに用いられるＥＸＴＩ及びＩＰＣＲ１プライマ ーの位置を示す。

図４は、逆ポリメラーゼ連鎖反応（Ｉｎｖｓｒｓｅ　ＰｏｌＹｍｅｒａｓｅＣｈ ａｉｎ　ＲｅａＮｉｏｎ）　（Ｉ　Ｐ　ＣＲ）技術を基礎とした方法を用いてア スパラガス　オフィシアナリスのＡｏＰＲ１遺伝子（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆ ｌｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ　ｇｅｎｅ）およびその上流調節配列（ｕｐ ｓｔｒｅａｍ　ｒｅｇｕｌａｆｏｒｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）をクローニングする のに使用したストラテジーを示すものである。

図５は、ＩＰＣＲによって得られたアスパラガス　オフィシアナリスのＡｏＰＲ １遺伝子（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ　ｇｅ ｎｅ）のプロモーターのヌクレオチド配列、および予想されるコーディング配列 （ｃｏｄｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を示すものである。推定のＴＡＴＡボック スには下線を引いた。

ヌクレアーゼ−８１マツピング（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−５１ｍａｐｐｉｎｇ）によ って決定された転写開始部位を強調された下線部分として示す。

図６は、アスパラガス　オフィシアナリスのＡｏＰＲｌｃ　ＤＮＡ　（Ａｓｐａ ｒａｇｕｓ　ｏｌｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ　ｃＤＮＡ）およびＡｏＰ Ｒ１遺伝子のＦＲＯＭ断片を並記して示すものである。一致率（％）：９８．９ ０％。

図７ａは、アスパラガス　オフィシアナリスのＡｏＰＲｌ　（Ａｇｐａｒａｇｕ ｓｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ）プロモーターとアグロバクテリウム （Ａｇｒｏｂａｃｊｅｔｉｕｍ）のバイナリ−ベクターのβ−グルクロニダーゼ をエンコードする大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝子との転写融合物（ｊｒａｎｓｃ ｒｉｐｊｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を含むキメラ遺伝子の構築を示すものであ る。

図７ｂは、アスパラガス　オフィシアナリスのＡｏＰＲｌ　ｆＡｓｐａｒａｇｕ ｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ）プロモーターと直接遺伝子転移形 質転換技術（ｄｉｒｅｃｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｆｒａｎｓｆｏｒｍ ａｆｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）に適した小さなコピー数の高いプラスミドの β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をエンコードする大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝 子との転写融合物（ｔｒａｎｓｃ＋１ｐｌｉｏｎａｌ　Ｉｕｓｉｏｎｌを含むキ メラ遺伝子の構築を示すものである。

図８は、形質転換タバコ植物組織を傷付けた後の、（（ａ）フル、１　（Ｆｔｌ ＬＬ、　１）、（ｂ）フル、３　（ＦＵＬＬ、　３）及び（Ｃ）フル、１４　ｆ ＦｌｌＬＬ、　１４）からの）アスパラガス　オフインアナリスのＡ　ｏ　Ｐ　 Ｒ１（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ）プロモー ターとβ−グルクロニダーゼをエンコードする大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝子と の転写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｆｕｓｉｏｎ）を含むキメラ遺 伝子の誘導を示すものである。

図９は、植物組織を４ｍＭサリチル酸で処理した後の、アスパラガス　オフイン アナリスのＡ　ｏ　Ｐ　Ｒｌ　（Ａｓｐａｒａｇｕｓｏｌｆｉｃｉａｎａｌｉｓ 　ＡｏＰＲｌ）プロモーターとβ−グルクロニダーゼをエンコードする大腸菌（ Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝子との転写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｌｉｏｎａｌ　ｆｕ ｓｉｏｎ）をＳむキメラ遺伝子の誘導に関するデータを示すヒストグラムである 。

図１０は、遺伝子が様々なプロモーターによって誘導された際のタバコの葉のデ ィスクの形質転換中のＧＵＳマーカー遺伝子の発現を示すものである。ヴアンカ ンネット（ＶａｎｃｘｎｎｅｙｌＪら、（１９９０年）、（コンストラクション オフ　アン　イントロン−コンテイニング　マーカー　ジーン（Ｃｏｎｓｔｒｕ ｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　ａｎ　ｉｎｌｒｏｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍａｒｋｅｒ 　ｇｅｎｅ）、モレキュラー　アンド　ジェネラル　ジエネティックス（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓｌ、２２０．２４５ 〜２５０）に記載されているｐ３５Ｓ　ＧＵＳ　ＩＮＴ以外のプラスミドに関し ては、テキストを参照。

図１１は、アスパラガス　オフインアナリスのＡｏＰＲｌ　（Ａｓｐａｒａｇｕ ｓ　ｏｆｌｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ）プロモーターとの転写融合物（ｌ ｒａｎｉｃ＋１ｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）からなるキメラ遺伝子を作製す るのに使用する発現カセットの構築を示すものである。

図１．２Ａは、アスパラガス　オフインアナリスのＡｏＰＲ１（Ａｓｐａｒａｇ ｕｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ）プロモーターとβ−グルクロニ ダーゼをエンコードする大腸ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝子との転写融合物（ｊｒａ ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）　（Ａ　ｏ　Ｐ　Ｒ１−ＧＵＳ遺伝 子）の構築を示すものである。

図１２Ｂは、ＡｏＰＲｌ−ＧＵＳ−ＩＮＴの形質転換ベクターの構築を示すもの である。

図１３は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって誘導されたＧＵＳの発現と比べ た際の、成熟したタバコの葉におけるＰＣＲによって得られたアスパラガス　オ フインアナリスのＡｏＰＲＩ　ＧＵＳ遺伝子（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｌｌｉｃ ｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲＩ　ＧＵＳ　ｇｅｎｅ）の発現に関するデータを示す ものである。ＰＲＩ−１、ＰＲＩ−２、ＰＲＩ−３、ＰＲＩ−７及びＰＲＩ−１ ４はＡｏＰＲＩ　ＧＵＳ遺伝子を含む独立した形質転換体であるが、ｐＥ３１− １３及びｐＢＩ−８５はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって誘導されるＧＵＳ 遺伝子を有するｐＢ１１２１によって形質転換された植物の２例である。

図１４は、アスパラガス　オフインアナリスのＡｏＰＲｌ　（Ａｓｐａｒａｇｕ ｓ　ｏ［ｌ１ｃｉａｎａｌｉｔ　ＡｏＰＲｌ）プロモーターとトランスポゾン５ （Ｔｎ５）から誘導されるネオマイシンホスホトランスフエラーセをエンコード する大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）遺伝子との転写融合物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ ｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）の構築を示すものである。

図１５は、アスパラガス　オフインアナリスのＡｏＰＲｌ　（Ａｓｐａｒａｇｕ ｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　ＡｏＰＲｌ）プロモーターとホスフィノトリシ ン　アセチル　トランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎ。

ｔｈｒｉｃｉｎ　ａｃｅｔｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）　をエンコードする ストレプトマイセス（ｓｆｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）遺伝子との転写融合物（ｊｒ ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）の構築を示すものである。

実施例１−イン　ビトロ（ｉ　ｎ　ｖ　ｉ　ｔ　ｒ　ｏ）における傷の付いた部 位でかつカルス形成中に強く発現する遺伝子を代表するＣＤＮＡの多く含むライ ブラリーの構築 生存している単一の細胞を多数アスパラガス　オフインアナリス（Ａｓｐａｒａ ｇｕｓ　ｏｆ［１ｃｉａｎａｌｉｓ）から物理的に単離でき、このようにして得 られた細胞は正しい培地を与えると脱分化し、さらに細胞分裂を始めることがで きることが知られている。また、細胞培養の環境下に置かれると、これらの単離 された細胞では遺伝子の発現が大きく変化することを指摘するデータがある［ハ リクリシュナ　ケ−（Ｈａｒｉｋｒｉｓｈｎａ、　Ｋ、　）、ダービー　アール （Ｄａｒｂｙ、　Ｒ，）、ポール　イー（ｐａｕ＋、　Ｅ、　）およびトレーパ ー　ジエ−（Ｄｒａｐｅｒ、Ｊ、）　（１９９１年）：ウーンド　レスポンス　 アンド　セル　サイクルリアクチベーション　イン　メカニカリー　アイソレー テッド　アスパラガス　メソフィル　セルズ：ア　モデルモノコチレドン　シス テム（Ｗｏｕｎｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｃｙｃｌｅ　＋ｅａ ｃｌｉｖａ目ｏｎ　ｉｎ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ　１ｓｏｌａｔｅｄ　Ａｓ ｐａ「ａｇｕｓ　ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ　ｃｅｌｌｓ：　Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｍｏｎ ｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎ　ｓ７ｓｔｅｍ、）、印刷中、ジェー　イーエックス　ホ ト（Ｊ、　ＥＸ、　Ｂａｔ、）　］。多くの遺伝子がこのようにして得られた物 理的に単離された細胞に中で調節され（ｕｐｒｅｇｕｌａｊｅ）、これらの細胞 から単離されたｍＲＮＡは植物の傷の付いた部位でさらにはカルスの形成中に特 異的に誘導される遺伝子が非常に多く含まれていることが本発明において示され る。

材料および方法 植物の成長および細胞の単離 アスパラガス　オフインアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌ ｉｓ）　（一般訳　コノヴアーズ　コロツサル（ｃ、ｖ、　Ｃｏｎｎｏｖｅｒ’ 　ｈ　ｃｏｌｏｓｇａｌ））の種をニッカーソン　シーズ　リミテッド（Ｎｉｃ ｋｅｒｓｏｎ　５ｅｅｄｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）より購入した。温室で生育した植 物を以下に記載したように細胞の単離に使用した［ポール　イー（Ｐａｕｌ、Ｅ 、）　、ハリクリシュナ　ケー（Ｈａｒｉｋｒｉｓｈｎａ　Ｋ）　、フィオロー ニ　オー（Ｆｉｏｒｏｎｉ　Ｏ）　、トレーパージニー（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊ）　 ；デディファレンシエーンヨン　オフアスパラガス　オフインアナリス　エル　 メソフィル　セルス　デユアリング　イニシェーション　オフ　セル　カルチャ ース（Ｄｅｄｉｌｆｓｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｐａｒｘｇｕｓ　ｏｆ ｆｉｃｉａｎａｌｉｓ　Ｌ、ｍｅｓｏｐｂｙｌｌ　ｃｅｌｌｓ　ｄｕｒｉｎｇ　 １ｎｉｔｉａｊｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｓｓ）　、プラント　サ イ（ｐｌａｎｊ　Ｓｃｉ、）、６５：１１１〜１１７　（１９８９年）コ。暗室 で生育した実生を滅菌したバーミキュライト中で生育させ、発芽後２遇間で刈り 入れた。

さらに、実生を様々な長さに切断し、適当な時間、暗室でベトリ皿中の湿らせた 濾紙上で培養した。

ＲＮＡの抽出およびポリ（Ａ）ＲＮＡの抽出単離した細胞および傷の付いた実生 の全ＲＮＡおよびポリ（Ａ）ＲＮＡを以下に記載したようにして単離した［トレ ーパー　ジエ−（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊ）、スコツト　アール（Ｓｃｏｆｆ　Ｒ）、 アーミテージ　ピー（Ａｒｍｉｔａｇｅ　Ｐ）、ワルデンアール（Ｗａｌｄｅｎ 　Ｒ）　：　“プラント　ジエネティック　トランスフォーメーション　アンド 　ジーン　エックスプレッションーア　ラボラトリ−マニュアル（Ｐｌａｌ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ目ｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓ ｓｌｏｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｒｏｒ７　Ｍａｎｕａｌ）″、ブラックウェル　 サイエンティフィック　パブリケーション（Ｂｒａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）　（ １９８８年）］。

プラスミド操作および一般的なりローニングサンプルック　ジエー（Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ　Ｊ）、フリッシュ　イーエフ（Ｆｒ白ｓｃｈ　ＥＦ）、マニアティス　 ティ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ）　：“モレキュラー　クローニングーア　ラボラ トリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　’　。

第二版、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ７　Ｐｒｅｓｓ）　（１９８９年 ）に記載されているようにして、プラスミドの構築および操作を行った。特記し ていない限り、すべての組換えＤＮＡ方法および核酸の合成および分析方法はこ のマニュアルに概説されたプロトコールを用いて行った。

ｃＤＮＡライブラリーの構築 物理的に分離した後に１から３日培養した細胞からの２μｇの蓄えられたポリ（ Ａ）ＲＮＡを用いて、ラムダザップーＩ　Ｉ　（ｌｉｍｄａ　２ａｐ−１１）の ライブラリーを構築した。ギュブラーｆＧｕｂｌｅｒ）およびホフマン（Ｈｏｆ ｆｍａｎ）の方法［ギュブラー　−ｘ−−（Ｇｕｂｌｅｒ　Ｕ）、ホフマン　ピ ーシニー　（Ｈｏｆｌｍａｎ　ＢＪ）ニア　シンプル　アンド　ベーリー　エフ ィシエントメソッド　フォー　ジェネレイティング　ｃ　ＤＮＡ　ライブラリー ズ（Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｖｅｒ７　ｅｆｆｉｃｉｅｎｌ　ｍｅｌｈｏｄ 　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｃＤＮＡ　１ｉｂｒａｒｉｅｓ）、ジーン（ Ｇｅｎｅ）、２５　：　２６３〜２６９　（１９８３年）コを変更して、ファル マシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製のｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡの合成 を行った。このようにして得られたｃＤＮＡをラムダザップＩ　Ｉ　（ｌａｎｄ ｓ　ｌａｐ　Ｉｆ）　（ストラタジーン（Ｓｌｒａ（ａｇｅｎｅ）製）中に連結 し、アマジャム製のパッケジングエクストラクト（Ａｍｅ＋ｓｈａｍ’　ｓ　ｐ ａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒ＋ｃｔ）を用いてファージをパッケージングした（ ｐａｃｋａｇｅ）。このようにして得られたライブラリーは１．２Ｘ１０６ｐｆ ｕｓを含んでいた。

傷および細胞培養によって誘導されるｃＤＮＡクローンを得るためのｃＤＮＡラ イブラリーの分画スクリーニング（ｄｉｆｆｅｒＣｒ＋ｆｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎ ｉｎｇ）１０．０００個のプラークを低濃度（１５ｃｍのプレート当たり２，０ ００個のプラーク）で播き、２重のハイボンドーエフフィルター（ｄｕｐｌｉｃ ａｔｅ　ＩＹＢＯＮＤ−Ｎ　ｆｉｌｔｅｒ）をプレートからリフトした（ＩｉＮ ）。（［ハイボンドーエフ（ＩＹＢＯＮＤ−ＮＩ　Ｊという表現は登録商標であ る。）１セツトのフィルターをライブラリーを構築するのに用いた同様のｍＲＮ Ａから合成した３２Ｐで標識した第一のｃＤＮＡ鎖を用いて調べ、もう一つのセ ットを傷の付いていない実生から合成した３２Ｐで標識した第一のｃＤＮＡ鎖の 集団を用いて調べた。［サンプルツク　ジエ−（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ）、フリ ッシュイーエフ（Ｆｒｉｌｓｃｈ　ＥＦＩ、マニアティス　ティ（Ｍａｎｉａｆ ｉｓ　Ｔｌ　：“モレキュラー　クローニングーア　ラボラトリ−マニュアルｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ７　Ｍａｎｕａｌ ）　”　。

第二版、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）　（１９８９年 ）］に記載されたようにして、標識および取り込まなかったヌクレオチドの除去 を行った。基本的には〔サンプルツク　ジエ−ＩＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ）、フリ ッシュ　イーエフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ　ＥＦ）、マニアティス　ティ（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ　Ｔ）　：　“モレキュラー　クローニングーア　ラボラトリ−マニュア ル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ）　”　、第二版、コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−プレ ス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｌｏｒ７　Ｐｒｅｓ ｓ）　（１９８９年）］に記載されたようにして、５ｘＳＳＰＥ、５Ｘデンハー ト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ　５ｏｌｕ日ｏｎ）　、０．５％ＳＤＳ及び１ ００Ｉｉ　ｇ　／　ｍ　Ｉの変性したサケの精液のＤＮＡにおいて６５で一晩ハ イブリッド形成を行い、０．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で６５°Ｃでフィル ターを最終的に洗浄した。オートラジオグラフィーをアマジャムβ−マックスハ イパーフィルム（ＡＭＥＲ５ＨＡＭβ−ＭＡＸ　ＩＹＰＥＲＦＩＬＭ）上で一晩 行った。（［アマジャムβ−マックスハイパーフィルム（ＡＭＥＲ３ＨＡＭβ− ＭＡＸ　ＩＩＹＰＥＲＦＩＬＭ）Ｊという表現は登録商標である。）分画してハ イブリッド形成した（＋Ｉｉｆｆｅｒｅｎｊｉａｌｌｙｈ７ｂｒｉｄｉｓｉｎｇ ）プラークを取り、再度分画スクリーニング（ｄｉｆｆｅｒｅｒｕｉａｌ　ｓｃ ｒｅｅｎｉｎｇ）　して再精製した。次に、ストラタジーン（ＳＩｒａｔａｇｅ ｎｅ）のプロトコールに従ってラムダザップ（Ｉａｍｄａ　２ＡＰ）に感染した 宿主細胞をＶＣ８−Ｍ１３のへルバーファージで重感染した後自動切除（ａｕｔ ｏｍａｔｉｃ　ｅｘｃｉｓｉｏｎ）することによって、目的とするクローンをサ ブクローニングした。

傷および細胞培養によって誘導されるｃＤＮＡクローンを得るためのｃＤＮＡラ イブラリーのランダムスクリーニング −，０００個のプラークを低濃度（１５ｃｍのプレート当たり２００個のプラー ク）で播き、組換えプラークをライブラリーから無作為に選び、ラムダザップー Ｉ　Ｉ　ｆｌａｍｄａ２ａｐ−Ｉｆ）中のクローニング部位に隣接するように設 計されたＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡの挿入物をラムダサップ（ｌａｍ ｄａ　ＸＡＰ）ベクターから増幅し、さらにオリゴポリスト方法（ｏｌｉｇｏｐ ｏｌｉｓｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって３２Ｐで放射線標識した。培養され たアスパラガス細胞（単離後１〜３０）、（２ｃｍに）切断された成長しきった アスパラガスの実生片およびアスパラガスの新鮮な葉状茎材料から単離したｍ　 ＲＮ　Ａに対して、標識されたｃＤＮＡプローブをハイブリッド形成（ノーザン プロット）させた。基本的には以下に記載したようにして、ノーザンプロットを 行った［トレーパー　ジェ−（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊ）、スコツト　アール（Ｓｃ。

ｕ　Ｒ）　、アーミテージ　ビー（Ａｒｍｉｔａｇｅ　Ｐ）、ワルデン　アール （Ｗａｌｄｅｎ　Ｒ）　：　“プラント　ジエネテイツク　トランスフォーメー ション　アンド　ジーン　エックスプレツションーア　ラボラトリ−マニュアル （Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓ１ｏ＋ｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅ ｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｔｏｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）” 、ブラックウェル　サイエンティフィック　パブリケーション（Ｂｒａｃｋｗｅ ｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、オックスフォード（ Ｏｘｆｏｒｄ）　（１９８８年）コ。全ＲＮＡをホルムアルデヒドＲＮＡ変性ゲ ル（篩「ｍａｌｄｅｈｙｄｅ　ＲＮＡ　ｄｅｎａｔｕｔｉｎｇ　ｇｅｌ）上で泳 動した。このようにして得られたゲルをエチジウムプロミド（ｅｌｉｄｉｕｍ　 ｂ＋ｏｍｉｄｅｌ　で染色し、ブロッティングした（ｂｌｏｔ）。溶液が５０％ の脱イオン化ホルムアミドを含む以外はプラークのリフト（ｌｉｆｔ）に使用し たのと同様のハイブリッド形成用溶液において、プレハイブリッド形成およびハ イブリッド形成を行った。傷の付いた実生及び培養細胞のｍＲＮＡにはハイブリ ッドを形成するが葉状茎のｍＲＮＡにはハイブリッドを形成しないクローンを同 定した。

単離後１〜３日の物理的に分離されたアスパラガス細胞由来のメツセージからラ ムダサップ−Ｉ　Ｉ　（Ｉａｍｄａ　２ａｐ−ＩＩＪ中に構築されたライブラリ ーは１．２Ｘ１０６ｐｆｕｓを含んでいた。このライブラリーのランダムスクリ ーニングによって、多くの割合のｃＤＮＡクローンが傷の付いた組織中でおよび ／またはカルス形成を行っている細胞中で調節されて（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ） いることが示された（図１）。非常に発現している、傷によって誘導される遺伝 子もまた、アスパラガス　オフイシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｌｌｉｃ ｉａｎａｌｉｓ）のｃＤＮＡライブラリーを分画スクリーニング（ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔｉａｌ　５ｃｒｅｅｎｉＢ）することによって単離された。

これらのデータから、物理的に単離した細胞は傷によって誘導されるおよび細胞 培養に特異的なｍ　ＲＮ　Ａに非常に富んでいることが明らかに示される。

実施例２−アスパラガスｃＡｏＰＲ１１のｃＤＮＡの単離および特性評価 一つの特殊な分化して発現するｃＤＮＡクローン（Ａ。

ＰＲＩと称する）は、ｃＤＮＡライブラリーの１．５％までを表わしていること が分かり、さらにこの特性を調べたところ、外植片の傷の付いた部位で活性を有 し、さらに培養植物材料におけるカルスの形成過程中に活性を有する遺伝子のプ ロモーターの源としての効果が評価された。

さらなる材料および方法 特記しない限り、使用した材料および方法は実施例１に示したものと同様である 。

ＤＮＡの配列決定法 ジデオキシ鎖−終結方法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ ｎ　ｍｅｆｈｏｄｌ　［サンガー　エフ（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ）、ニックレン　ニ ス（Ｎｉｃｋｌｅｎ　Ｓ）　、クールソン　ニーアール（Ｃｏｕｌｓｏｎ　ＡＲ ）　：　ＤＮＡ　シーフェンシング　ウィズ　チェーン　ターミネイティング　 インヒビタース（ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ　ｌｅ ｒｍｉｎａｌｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｆｏｒｓ）、ブロック　ナンヨル　アカデ　 サイ　ニーニス−ｒ−−ｆＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、 ７４：５４６３〜５４６７　（１９７７年）コを用いて、シークエナーゼバージ ョン（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ　Ｖｅｒｓｉｏｎ）　２．　０キツト（ニーエスピー 製（ＵＳＢ）　）による組換ｐＳＫ（−）クローンのＤＮＡの配列を決定した。

（ンークエナーゼ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）という言葉は登録商標である。）ファ ージミドレスキュー（ｐｈａｇｅｍｉｄ　ｒｅｓｃｕｅ）によってまたはニーエ スピー（ＵＳＢ）のンークエナーセ（ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ）のパンフレットに推 奨されているようにしてプラスミドＤＮＡを変性させることによって、１本鎖の 鋳型を調製した。ブイニーエックス（ＶＡＸ）に関してライスコンシン大学（Ｕ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）が考案したプログラム［デウ ゛エルックス　ジエ−（Ｄｅｖｅｒｅｕｘｊ）、ヘバーリ　ピー（Ｈａｅｂｅｒ ｌｉ　Ｐ）、スミシーズ　オ（ＳｍＮｈｉｅｓ　Ｏ）　ニア　コンプレヘンシブ 　セット　オブ　シーフェンス　アナリシス　プログラム文　フォー　ザ　ブイ ニーエックス（Ａ　ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｓｅｊ　ｏｌ　５ｅｑｕｅｎ ｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｐ「ｏｇｒａｍ＋　ｆｏｒｔｈｅ　ＶＡＸ）　、ヌク レ　アシッド　レス（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）　、１２　＋　３８７ 〜３９５　（１９８３年）］を用いて、コンピューターが補助した配列分析およ び配列のデーターベース検索を行った。

ａ）ＡｏＰＲｌのｃＤＮＡの単離および発現のプロフィルの特性評価 ｃＤＮＡライブラリーを分画スクリーニング（ｄｉｆｌｅｒｅｎｊｉａｌ　ｓｃ ｒｅｅｎｉｎｇ）　した後、ｃＡｏＰＲｌ　１　ｃＤＮＡを単離した。物理的に 単離したアスパラガス細胞および切断された実生から単離したＲＮＡを用いたノ ーザンハイブリッド形成分析によって、相当する転写物は初期に細胞の単離があ った後迅速にかつ永久に調節される（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）ことが示される（ 図２ａ）。ＡｏＰＲｌの転写物は、暗室で生育したアスパラガスの実生中で細胞 に傷害を与えてから６時間から数日にかけて検出できた（図２ｂ）。ノーザン分 析によってまた、傷の付いた部位のすぐ付近の部位でのみ転写物の誘導が検出さ れることからＡｏＰＲ１遺伝子の発現は空間的な様式（＋ｐａｔｉａｌ　ｍａｎ ｎｅｒ）で調節されることも示された（図２ｂ）、ＡｏＰＲｌのｃＤＮＡを用い て、アスパラガス科の他の種（例えば、アスパラガス　スペレンガイ（Ａｓｐａ ｒａｇｕｓ　ｓｐｓｒｅｎｇｅｉ）　）およびリリアセア工科（Ｌ　ｉ　Ｉ　Ｉ 　１ａｃｃｉｅ）の他の植物（例えば、ラスカス　アキュレアタス（Ｒｕｓｃｕ ｓ　ａｃｕｌｅｉｌｕｓ）の［ブッチャーズ　ブルーム（ＢｕｔｃｈｅｒｓＢｒ ｏｏｍ）Ｊやマスカリ　ネグレクタム（Ｍｕｓｃａｒｉ　ｎｅｇｌｅｃｌｕｍ） の［グレー１　ヒアシンス（Ｇｒａｐｅ　Ｈｙａｃｉｒｕｈ）　Ｊ　）及びアマ リリダセア工科（Ａｍａｒｙ１１ｉｄｉｃ６ｉｅ）より調製されたＤＮＡにおけ るサザンハイブリッド形成によって相同性のある遺伝子の位置を決定できる。Ａ ｏＰＲ１遺伝子をＡｏＰＲ１遺伝子配列に対して設計されたプライマーを用いた ＰＣＨによって単離できる。ノーザンプロット分析によってまた、ＡｏＰＲ１遺 伝子はアスパラガス科の他の種（例えば、アスパラガス　スペレンガイ（Ａｓｐ ａｒａｇｕｓ　ｓｐｅｒｅｎｇｅｉ）　）やりリアセア工科（Ｌｉｌｌｉａｃｅ ａｅ）の関連した植物（例えば、ラスカス　アキュレアタス（ＲＨ（ＨＢｕｌｅ ａｔｕｓ）の「ブッチャーズ　ブルーム（ＢｕｔｃｈｅＩｓ　Ｂｒｏｏｍ）　Ｊ やマスカリ　ネグレクタム（Ｍｕｓｃａｒｉ　ｎｅｇｌｅｃｆｕｍ）の［グレー １　ヒアシンス（ＧｒａｐｅＨｙａｃｉｎｔｈ）　Ｊ　）及びアマリリダセア工 科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）中で発現することも示される。

これらのデータによって、ＡｏＰＲｌ−１遺伝子は傷の付いた部位や細胞培養に よって誘導されうるプロモーターの源として理想的な候補であることが確認され たため、このｃＤＮＡについて詳細に特性を調べた。さらに、ＡｏＰＲ１遺伝子 がサリチル酸処理によって実生中で６倍誘導されることがノーザンハイブリッド 形成分析によって示された。

ｂ）ｃＡｏＰＲｌ　１　ｃＤＮＡの配列決定ＡｏＰＲ１のｃＤＮＡは７３７ｂｐ 長であり、１から４７５番目の位置に読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　 ｆｒａｍｅ）　（ＯＲＦ）を有する（図３）。これによって、このｃＤＮＡは全 長でないことが示唆される。以下に記載されるプロモータ断片の分析のうち配列 分析によって、ＡｏＰＲ１クローンは遺伝子のコーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ）をすべて念んでいるが転写物の５′非翻訳領域に相当する 配列は含んでいないことが示される。ｃＤＮＡによってエンコードされた推定の １６．９ＫＤａのタンパク質は、以下に記載したようにタンパク質ファミリーの ものに対しである配列レベルで限られた相同性を有する［ウオルター　エムエッ チ（Ｗａｌｔｅｔ　Ｍｌｌ）　、ジアン−ウェイ　エル（Ｊｉａｎ−Ｗｅｉ　Ｌ ）、グランド　シー（Ｇｒａｎｄ　Ｃ）　、ラム　シージエ（Ｌａｍｂ　ＣＪ） 、ヘス　ディ（ｌｅｓｓ　Ｊ）　：ビーン　パソゲネシスーリレイテツド（ピー アール）　プロテインズ　デデュースド　フロムエリジター−インデユースト　 トランスクリプツ　アーメンバーズ　オブ　ア　ユビキトウス　ニュー　クラス オブ　コンザーブド　ピーアール　プロテインズ　インクルーディング　ポレン 　アケルゲンズ（Ｂｅａｎ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｒｅｌａｔｅｄ　（Ｐ Ｒ）　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　ｅｌｉｃｉｌｏｒ−ｉｎ ｄｕｅｅｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ　ａｒｅ　ｍｅｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ａ　ｕ ｂｉｑｕｉｔｏｕｓ　ｎｅｗ　ｃｌａｓｓｏｆ　ｃｏｎｓｅＩｖｅｄ　ＰＲｐｒ ｏｔｅｉｎｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｐｏｌｌｅｎ　ａｌｌｅｒｇｅｎｓ）、モ ル　ジーン　ジエネット（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｌ、　）、２２２　：　 ３５３〜３６０　（１９９０年）］。上記一致は、さらにＡｏＰＲｌのｃＤＮＡ は傷よって誘導される遺伝子に関する良好なターゲットであるという証拠であり 、さらにこのｃＤＮＡはサリチル酸等のエリジターで処理することによって誘導 されるという観察結果を説明できる。

実施例３−逆ポリメラーゼ連鎖反応（Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣ ｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）　（Ｉ　Ｐ　ＣＲ）によるＡｏＰＲ１遺伝子のＬ 流プロモーター領域の単離および上記ＤＮＡの分析サザンブロッティング分析に よって、ＡｏＰＲ１クローンとハイブリッドを形成する多数のアスパラガスのゲ ノム配列が明らかになり、アスパラガスのゲノムＤＮＡライブラリーのスクリー ニングによって目的とするＡｏＰＲ１転写物をコードするＤＮＡ配列を含まない ゲノムクローンのみが単離された。したがって、この技術はＡｏＰＲ１遺伝子の 転写を誘導するプロモーターを単離しクローニングする方法としては棄却し、そ の代わりに逆ポリメラーゼ連鎖反応（Ｉｎｖｅｒｓｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　 Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）　（Ｉ　ＰＣＲ）として既知の方法によって、 ＡｏＰＲ１遺伝子を単離した。

逆ＰＣＲを目的として、１μｇのゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した。次 に、このＤＮＡをフェノールクロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた後 、１×ライゲーシヨンバツフｙ　（５０ｍＭ）−リス−ＣＩ　ｐＨ７゜４．１０ ｍＭ　ＭｇＣｌ　、１０ｍＭ　ジチオトレイトール及び１ｍＭ　ＡＴＰ）におい て１〜２ｎｇ／μｌの濃度で再懸濁し、Ｔ４　ＤＮＡリガーセを０．０２ワイス （Ｗｅｉｓｓ）ユニット／μｍまで加え、１５℃、−晩で環状化させた。次に、 このＤＮＡをエタノールで沈殿させ、乾燥し、２０μｌの２回蒸留した水に再懸 濁し、この懸濁液の１１５をＰＣＲに用いた。反応液を以下のようにして作製し た＝４μｍの環状ＤＮＡ ５μｍのｌ０ＸＰＣＲバツフアー ５μｍの１０ＸｄＮＴＰストツク ５μｍの１０×プライマー１　（２，５μＭ）５μｍのＩＯＸプライマー２　（ ２，５μＭ）２回蒸留した水で最終容積を５０μｍにする２、５ユニツトのＴａ ｑ　ＤＮＡ　ポリメラーゼさらに、この反応混合物を数滴の鉱油で塗布し、パー キン−エルマー　セタス　サーモサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｔＣｅｊ ｕｓ　Ｔｈｅｒｍｏｃ７ｃｌｅｒ）を用いて増幅した。９５℃で３０秒間の変性 、５５°Ｃで３０秒間のプライマーのアニーリング、７２℃で３分間の拡張を３ ０サイクル（ただし、最終の拡張は７２℃で５分間）を行った。次に、鉱油をク ロロホルムで抽出し、ＰＣＲによる生成物のアリコートをアガロースゲルで分析 した。

標準的ＰＣＲ反応に対して、上記のＰＣＲのプロトコールはサイクル数やアニー リング温度を若干調節しながら行われた。

ａ）ＩＰＣＲストラテジー ＡｏＰＲＩ　ＤＮＡの配列分析をした後、逆ポリメラーゼ連鎖反応に使用した際 に得られた増幅ＤＮＡがプライマーの」二流配列を含んでいるような、２０ｂｐ の２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計した（図３）。図３に示され る７１から９１番目の間の位置のｃＤＮＡのセンス鎖にハイブリッドを形成する ＥＸＴ、１プライマーは、５−　ＣＧＡ、ＧＧＴＴＧＴＧＣＣＡＧＴＣＧＡＧＣ ３−を読取り、図３で１０４から１２４２４番目の位置のｃＤＮＡのアンチセン ス鎖にハイブリッドを形成するＩＰＣＲ１プライマーは、 ５−　ＧＣＣＴＧＡＣＴＴＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＧ　３−を読み取る。

ｂ）ＡｏＰＲ１遺伝子のＩＰＣＲ断片 制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｌを用いてアスパラガスのゲノムＤＮＡを 消化する予備実験において、ＩＰＣＲによる生成物を得た。これらの生成物をビ ーブルースクリプト（ｐＢｌｕｅ＋ｃｒｉｐｔ）中にクローニングし、図４に示 される遺伝子地図の構築に使用した。制限酵素ＥｃｏＲＩは、ＡｏＰＲｌのｃＤ ＮＡのほとんどの５′領域とハイブリッドを形成する１、３ｋｂのＤＮＡ断片を 増幅させる逆ＰＣＲ技術において有用であることが分かった。このＰＣＲによる 生成物を１−分量得て、ＥｃｏＲＩの制限酵素で制限しくｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏ ｎ）　、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩとＨｉｎｃ　Ｉ　Ｉで消化したｐＳＫ（−）プラスミ ド中に１１４６ｂｐの断片をクローニングした。このようにして得られたプラス ミド（ｐＳＫ（−）ＩＰＣＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ　１．１ｋｂ　Ｅｃｏ　ＲＩ 　Ｋｐｎと称する）（図７ａ参照）をＸｈｏＩで消化し、このようにして生じた １本鎖の突出部分をＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片を用いて埋めた。さら に、この挿入物をＥｃｏＲＩで消化した後ベクターから切り出し、ＥｃｏＲＩ及 びＳｍａＩで消化したｐｓＫ（−）中に連結した。このようにして得られた断片 をｐＳＫ（−）ＩＰＣＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ　１．１ｋｂ　Ｅｃ。

Ｓｍａと称した（図７ａ参照）。このＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列分析によって、 目的とする上流配列としての断片が確実に確認でき、目的とする読み取り枠（ｏ ｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を構築する翻訳融合物（ｔｒａｎｓｌａ ｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）について決定することができた（図５および６） 。

Ｃ）転写開始部位の決定 ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターの転写開始部位を同定するために、ヌクレアー ゼ−８１転写物マツピング（Ｎｕｃｌｅａ＋ｅ−５１ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ　ｍ ａｐｐｉｎｇ）を以下に記載したようにして用いた［サンプルツク　ジエ−（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ）、フリッシュ　イーエフ（Ｆ＋１ｔｓｃｈ　ＥＦ）、マニ アティス　テ（（ｌＪａｎｉａｔｉｓ　Ｔｌ　：　“モレキュラー　クローニン グーア　ラボ゛ラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ＋　Ｃｌｏｎｉｎｇ　− Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）”、第二板、コールド　スプリング 　ハーバ−ラボラトリ−プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ「ｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）Ｃ１９８９年）コ。１１８０ｂｐのＩＰＣＲＡ ｏＰＲＩＰＲＯＭ　精製ＤＮＡ断片を用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼに よる反応を行った後末端標識した８４６ｂｐのＴａｑｌ断片からプローブを調製 した。次に、これをＸｂａｌで切断し、５′末端を標識したアンチセンス鎖末端 のみを有する４０３Ｍのプローブを滉た。このプローブを傷の付いたアスパラガ ス細胞のＲＮＡに対してハイブリッドを形成させ、さらにヌクレアーゼ−８１で 消化した。

このようにして得られた生成物を同様のＤＮＡのＤＮＡ配列決定用ラダーを側に おいて配列決定用ゲル上で泳動することによって、保護された断片の大きさを決 定する手段を得た。１３２ｂｐの保護された断片が観察された。これによって、 ＡｏＰＲ１転写物の転写は９８３８３番目クレオチド（上記は図５の強調された 下線部分によって示されている）で開始することが示される。この知見を以下の 実施例における転写リポータ−遺伝子融合物（Ｈａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒ ｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ）の構築に使用した。

る外来タンパク質の発現を誘導する能力を示す、ＧＵＳリポータ−転写融合物（ ＧＩＩＳ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉＱｌ ｌ）の構築 ａ）ＡｏＰＲ１プロモーターとＧＵＳマーカー遺伝子との転写融合物（ｔｒａｎ ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｕｓｉｏｎＪの構築ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモータ ー（ＩＰＣＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ）の転写融合物（Ｈａｎｓｃｒｉｐ目ａｎａ ｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を以下のようになるように大腸菌の（１：、ｃｏｌｉ）のβ −グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子に作製した：　（ｉ）融合タンパク質の最 初の３０アミノ酸がＡｏＰＲ１遺伝子によってエンコードされる、（ｉ　ｉ）次 の１１アミノ酸がポリリンカーＤＮＡによってエンコードされる、および（ｉ　 ｉ　ｉ）残りのタンパク質がＧＵＳの読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　 ｆｒａｍｅ）由来である（図７ａ）。上記は、ＢａｍＨＩ／Ｓａｌ■による二重 消化を用いてＩＰＣＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ断片をｐＳＫ　（−）　ＩＰＣＲＡ ｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ１、ｌｋｂ　Ｅｃｏ　、Ｓｍａよりサブクローニングし、こ の１１８０ｂｐの断片をＢａｍＨＩ及び５ａｌＩで予め消化したｐＢＩＨｌｏｌ 、１のバイナリ−ベクター［ジェファーソン（Ｊｅｌｆｅ＋５ｏｎ）　ら、エン ボ　ジエ−（ＥＭＢＯハ、６：３９０１　（１９８７年）コ中にクローニングす ることによって行った。このようして形成されたプラスミドはｐＢＩＨＩＯｌ、 Ｉ　ＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ　ＦＵＬＬ　１．１ｋｂとして記載される。次に、こ のプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、再環状化にし、末端から転写開始部位 への７０３ｂｐの断片を除去した。このようにして得られたプラスミドをｐＢＩ Ｈｌｏｌ、１　ＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ５＝Ｄ　０．４ｋｂと称した。ｐＳＫ（− ）　ＩＰＣＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ　１．１ｋｂ　Ｅｃｏ　ＳｍａのＸｂａｌ／ ＥｃｏＲＩの７１０ｂｐの断片をＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化したｐＢＩＨｌｏ ｌ、１中にクローニングすることによって、ｐＢＩＨｌｏｌ、Ｉ　ＡｏＰＲＩ　 ＰＲＯＭ　ＩＤ　０．７ｋｂが得られた。この構築物は、プロモーターの近位部 分を有し、転写開始部位を欠損し、ＧＵＳ活性をＨさないと考えられる（図７ａ ）。

ｂ）形質転換タバコ植物におけるＡｏＰＲ１プロモーターによって誘導されるＧ ＵＳマーカー遺伝子の発現以下に記載した標準的なアグロバクテリウム（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の形質転換技術を用いて、ｐＢＩＨｌｏｌ、１　ＡｏＰ ＲＩ　ＦＲＯＭ構築物をニコチアナ　タバカム（Ｎ　ｉ　ｃ　ｏ　ｊｉａｎａ　 Ｉａｂａｃｕｍ）中に形質転換した［トレーパー　ジエ−（Ｄｔａｐｅｒ　Ｊ） 、スコツト　アール（ＳｃｏＨＲＪ　、アーミテージビ−（Ａｒｍｉｊａｇｅ　 Ｐ）、ワルデン　アール（Ｗａｌｄｅｎ　Ｒ）　：　“プラント　ジェネティッ ク　トランスフォーメーション　アンド　ジーン　エックスプレッションーア　 ラボラトリ−マニュアル（Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）”　、ブラックウェル　サイエンティフィック　パブリケ ーション（Ｂｒａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎ＋１ｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）　（１９８８年）］。ＩＰＣＲＡｏＰ Ｒ１プロモーターによって誘導されるＧＵＳ遺伝子の発現を、以下に記載したア ッセイを用いて検出した［トレーパー　ジエ−（ＤｒａｐｅｔＤら、上記参照コ 。様々な形質転換された植物の組織化学的な分析によって、１．１ｋｂ　ＩＰＣ ＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭ（Ｉ　ＰＣＲＡｏＰＲｌ）は傷の付いた部位および傷の 付いた部位付近で形質転換タバコにおいてＧＵＳリポータ−酵素（ＧＵＳ　ｒｅ ｐｏｒＩｅｒ　ｅｎＢｍｅ）の発現を十分誘導することが示される。これは、マ ーカー遺伝子の発現を誘導するのに一般的に用いられ、すべての植物組織におい て強力に発現することができる構成性の（ｃｏｎｓｊｉｔｕｌｉｖｅ）　Ｃａ　 ＭＶ　３５　Ｓプロモーターとは対照的である。発現はまた、成熟した花粉粒に おいておよび花の着色領域においても観察される。

５−Ｄプロモーターは、リポータ−の傷によって誘導される発現を誘導すること はできないが、成熟した花粉粒においては発現を十分誘導することができる。３ −Ｄプロモーターを有する形質転換植物中ではリポータ−の発現は検出されない 。

Ｃ）細胞懸濁系統（ｃｅｌｌ　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　１ｉｎｅ）の形質転換の 後にＡｏＰＲ１プロモーターによって誘導されたＧＵＳマーカー遺伝子の発現 １．１ｋｂ　ＩＰｃＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭをＢａｍＨＩ及び５ａｌｌで消化す ることによってｐＢｌｌｏｌ。

１から切り出し、高いコピー数を有するベクターであるｐＵＣ−を基礎としたベ クター（ｐＵＣＧＵＳ　４．８）中にクローニングし、ＧＵＳ遺伝子との転写融 合物（ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）を得る（図７ｂ）。こ の小さいプラスミド（ｐＡｏＰＲＧＵＳ　５．９ｋｂ）を大量に調製し、クライ ン、ティ（Ｋｌｅｉｎ、Ｔ）　、コーンスタイン、エル（Ｋｏｒｎｓ＋ｅｉｎ、 Ｌ）　、サンフォード、ジエーシ−（Ｓａｎｌｏｒｄ、　Ｊ、　Ｃ，）およびフ ロム、エムイー（Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ、　Ｅ、　）、（１９８９年）ジエネティッ ク　トランスフォーメーション　オブ　メイラ　セルズ　バイ　パーティクル　 ボンバードメント（Ｇｅｎｅｊｉｃ　ｔｒａｎｓｌｏｒｍａ目ｏｎ　ｏｆ　ｍａ ｉｚｅ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｐａＮｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｌ）、プラン ト　フィシオル（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、９１：４４０〜４４４に記 載されたマイクロプロジェクティル技術（ｍｉｃｒｏｐｒｏｉｅｃｊｉｌｅ　ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたもの等の直接遺伝子転移形質転換技術（ｄｉｒｅ ｃｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｊｒａｎｓｆｏｒｍａｊｉｏｎｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅ）　に使用できる。

１．１ｋｂ　ＩＰＣＲＡｏＰＲＩ　ＰＲＯＭは、クライン（Ｋｌｅｉｎ）　ら、 上記参照に記載されたマイクロプロジエクティル装置（ｍｉｃｒｏｐｒｏｉｅｃ 目１ｅ　ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いたタバコの細胞懸濁系統（ｃｅｌｌ　５ｕ ｓｐｅｎｓｉｏｎ　１ｉｎｅ）の形質転換の後にＧＵＳマーカー遺伝子の強力な 発現を誘導する。穀類（トウモロコシ及びロリウム科ｆｍａｉｚｅ　＆　Ｌｏｌ ｌｉｕｍ）　）を含む、他の双子葉植物にンジン、タバコ、エントウ）や単子葉 植物（アスパラガス）の細胞懸濁液（ｃｅｌｌ　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）でも同 様の結果が得られる。

上記データから以下のことが示される：　（ａ）ＡｏＰＲ１遺伝子プロモーター の１．１ｋｂの領域（ｒＦＵＬＬプロモーター」）は傷付いた植物組織の傷のあ る部位中でマーカー遺伝子の強力な発現を十分誘導でき、したがってアグロバク テリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を基礎とした植物の形質転換システム においてマーカー遺伝子を誘導するのに理想的に適している；　（ｂ）ＡｏＰＲ １プロモーターは発育段階上の発現が非常に限られている（例えば、成熟した花 粉および花の着色領域、木組織の二次木部の柔組織の舌状孔（ｐａｒｅｎｃｈｙ ｍａ　ｒａｙ）、種皮（一時的））ため、マーカー遺伝子の発現は実生や成熟し た植物組織では最小限である；（ｃ）ＡｏＰＲ１プロモーターは懸濁培養細胞中 で安定して発現し、このため直接ＤＮＡデリバリ−技術（ｄｉｒｅｃｔ　ＤＮＡ 　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）に使用する形質転換ベクターのマー カー遺伝子の発現を誘導するのに理想的に適している。

実施例５−ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターは傷の付いた部位で迅速に誘導され 、その発現は数日間続き、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに対する強さと同等また はそれ以上である ＧＵＳとのＦＵＬＬ　１．１ｋｂ　ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーター融合物を有 する３植物から直径１ｃｍの葉のディクスを単離した。これらのディスクを２０ ゲージの針で８回、無作為に傷付けた後、２５°Ｃ１暗室中で湿った濾紙上で数 日間生育させた。日単位の間隔をあけて、ＧＵＳ酵素活性を蛍光定量的にアッセ イした。ＧＵＳとのＦＵＬＬ　ｌ　ｌｋｂ　ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーター融 合物を有する３植物の傷の付いた葉のディスクにおける発現プロフィル例を図８ に示す。発現のパターンを切断されたアスパラガスの実生中に観察されたものに 反映させたところ、酵素活性の調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が傷をつけ た後に迅速にかつ不変的に観察された。ＧＵＳの発現を誘導する構成性の（ｃｏ ｎｓｌｉｆｕｔｉｖｅ）　Ｃａ　ＭＶ　３５　Ｓプロモーターを有する２つの形 質転換植物体を比較例として用いたところ、３つの異なる形質転換植物体に認め られる発現は観察された発現量の全範囲を示した。

これらのデータによって、ＧＵＳ活性は傷をつけた後６時間後に検出てき、６０ まではピークが認められなかった。

形質転換植物における発現のプロフィルはＰＲｌａ、ｃｈｓ　３　ｐａｌ等の懸 濁培養細胞またはそのままの植物組織のエリジター処理によって単離された他の プロモーターや前記したキチナーゼのプロモーターとは異なるものである。迅速 に誘導され、ＧＵＳマーカー遺伝子の一定の発現を誘導することとは別に、ＩＰ ＣＲＡｏＰＲ１プロモーターによって他の傷によって誘導されるまたは「防御」 遺伝子のプロモーターを用いることによって得られるものより高い発現量が得ら れる。

これらのデータによって、ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターは、アグロバクテリ ウム（Ａｇｒｏｂａｃｌｅｒｉｕｍ）による形質転換が行われる期間中に、形質 転換実験において選択が適用された時点で外植組織において傷の付いた部位で強 力な発現を誘導することが示される。ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターの活性を 示すために選ばれた形質転換植物によって、発現の範囲はＣａＭＶ　３５Ｓプロ モーターに匹敵するものであることが示される。傷をつけた後の後期では、ＩＰ ＣＲＡｏＰＲ１プロモーターによって、構成性の（ｃｏｎｓｊｉｔｕｔｉｖｅ） 　Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓプロモーターと比較した場合より高い遺伝子の発現量 がルーチンに得られる（図８）実施例６−サリチル酸添加後の遺伝子の発現を行 うＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターの超誘導 ＧＵＳリポーター酵素の傷によって誘導される発現に関してアッセイしたのと同 様の植物を、無生命性の化学誘導物質であるサリチル酸を用いた研究に使用した 。傷を付けたおよび傷を付けない葉のディスクを４ｒｎＭサリチル酸の存在下お よびこれを存在させずにインキュベートした。データーによって、４ｍＭサリチ ル酸の存在下で葉のディスクを２日間インキュベートシた後にＧＵＳの発現の超 誘導が観察された（図９）。ＡｏＰＲ１プロモーターの発現は、傷とサリチル酸 塩とを組み合わせることによってＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いた際のＧＵ Ｓ活性よりかなり高いＧＵＳ活性量の誘導が可能である。

これらのデータによって、ＡｏＰＲ１プロモーターはサリチル酸によって超誘導 され、このため苗条、実生及び成熟した植物器官における形質転換組織の同定が 容易になることが明らかに示される。

実施例７−傷の付いた部位のカルス及び再生した苗条プリモルディア（ｓｈｏｏ ｔ　ｐｒｉｍｏｒｄｉａ）及びニコチアナ　タバカム（Ｎｉｃｏｌｉａｎａ　Ｉ ａｂａｃｕｍ）の確立した懸濁細胞培養物におけるＧＵＳ遺伝子の発現を誘導す るＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターの発現 ［トレーパー　ジエ−（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊ）、スコツト　アール（Ｓｃｏｌｔ　 Ｒ）　、アーミテージ　ピー（Ａｒｍｉｌａｇｅ　Ｐ）、ワルデンアール（Ｗａ ｌｄｅｎ　Ｒ１：　“プラント　ジエネティック　トランスフォーメーション　 アンド　ジーン　エックスプレッションーア　ラボラトリ−７−ユアル（Ｐｌａ ｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｌｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｅ ｘｐｒｅｌＩａｉｏｎ　−Ａ　ＬａｂｏｒａｌｏＢ　Ｍａｎｕａｌ）”、ブラッ クウェル　ザイエンティフィック　パブリケーンヨン（Ｂｒａｃｋｗｅｌｌ　５ ｃｉｅｎｔｉｌｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏ ｒｄ）　（１９８８年）］に記載されたようにして、傷を付けたカルスからの迅 速な苗条プリモルディア（Ｓｈｏｏｔ　ｐｒｉｍｏｒｄｉａ）の形成を促進する 培地上で傷のイ・ｊいた部位でアクロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｆｅｒｉｕ ｍ）によってタバコの葉の外植ｊ４を形質転換した。このＩＰＣＲＡｏＰＲＩＧ ＵＳの発現をカルス形成中モニターし、ＧＵＳ活性に関する組織化学的な染色方 法［トレーパー　ジエ−（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊ）ら、上記参照］及びＩＰＣＲＡｏ ＰＲ１プロモーターによって誘導されるＧＵＳ活性の蛍光定量分析を用いた苗条 の再生によって、傷の付いた部位で誘導されるカルス中でおよび苗条の再生用培 地であるＭＳＤＸ２上に置かれたタバコの葉の外植片の苗条プリモルディア（ｓ ｈｏｏｔ　ｐｒｉｍ。

＋ｄｉａ）を再生するカルス中でおよび形質転換されたカルスから出発した確立 された懸濁培養細胞中で強く発現することが示された。これらのデータによって 、ＩＰＣＲＡ。

ＰＲＩプロモーターは大部分の植物形質転換プロトコールに必要である細胞のタ イプ中でマーカー遺伝子を発現するのに理想的であることが分かる。

実施例８−植物の形質転換実験におけるマーカー遺伝子であるβ−グルクロニダ ーゼ（ＧＵＳ）の発現を制御するためのＡｏＰＲ１プロモーターの使用 実施例７のデータによって、ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターは、マーカー遺伝 子の発現がアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｆｅｒｉｕｍ）による植物の形 質転換プロセス中に必要であるターゲット細胞として上記同定された適当な植物 細胞中で活性を有することが示唆される。したがって、アクロバクテリウム（Ａ ｇｒｏｂａｃｆｅｒｉｕｍ）のバイナリ−形質転換ベクターは、ＩＰＣＲＡｏＰ Ｒ１プロモーターがタバコの葉の外植片のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ ｆｅｒｉｕｍ）が仲介した形質転換の目的とする段階中にマーカー遺伝子を発現 を誘導できるように構築された。このベクターは、リポーター遺伝子であるＧＵ Ｓに融合したＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターを含んだ。使用されたＧＵＳ遺伝 子の５′の非コーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）は、細菌のリポ ソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｕｅ）を欠損するよう に変更されているため、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に おける発現が最小限になり、これによって形質転換した植物細胞の認識が容易に できる。

この遺伝子融合物は細菌細胞において低い量で発現するので、細菌細胞中ではま ったく発現しない、ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターとイントロンを含むＧＵＳ 遺伝子との遺伝子融合物をさらに構築した。

ａ）ＡｏＰＲ１転写融合中間ベクターの構築２つのＰＣＲプライマー、以下の配 列を有するＰＡｏＰＲｌ　１ ５’　ＣＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＡＧＡＣＣ３’および以下の配列を 何するＰＡｏＰＲｌ　２３’　ＧＴＡＧＣＣＡＣＧＡＴＧＴＡＴＴＧＧＣＧＣＣ ＧＡＣＧＴＣＧＧ　５’を合成した。これらのプライマーは、ＡｏＰＲ１プロモ ーター配列とｔ口開性を有するが便利な制限部位を含む非相同性配列（イタリッ クで示す）をさらに有するように設計された（図５）。これらの制限部位によっ て、転写開始部位は含むがコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）は 欠損するＡｏＰＲ１プロモーターをクローニングすることが容易になる（図１１ ）。標準的なＰＣＲ反応（実施例３を参照）をこれらのプライマー及び鋳型とし てベクター　ｐＳＫ（−）ＩＰＣＲＡｏＰＲｌを用いて行った。このようにして 得られた９００ｂｐのＰＣＲ生成物（ＰＣＲ−ＡｏＰＲｌ）をＫｐｎｌとＰｓｔ で消化し、ＫｐｎＩ／Ｐｓｔｌで切断したｐＪＩＴ６０中にクローニングしてベ クターｐＪ　ＩＴ−ＡｏＰＲｌを得た（図１１）。

ｂ）ＰＣＲ−ＡｏＰＲ１プロモーターと細菌のリポソーム結合部位（ｒｉｂｏｓ ｏｍｅ　ｂｉｎ＋ｌｉｎｇ　５ｉＩｅ）を欠損したＧＵＳマーカー遺伝子との転 写融合物（ｌｒａｎｓｃｒｉｐ目ｏｎａｌ　ｆｕｓｉｏｎ）の構築 ベクターｐＫＩＷ１１０５　（ビーージエー　ジャンセン（Ｂ−Ｊ、Ｊａｎｓｓ ｅｎ）およびアールシー　ガードナー（Ｒ，Ｃ，Ｇａｒｄｎｅｒ）（１９９０年 ）、ロカライズド　トランジェント　エックスプレッション　オブ　ジ−ニーニ ス　イン　リーフディスクス　フオロイング　コカルティベーション　ウィズ　 アグロバクテリウム（Ｌｏｃａｌｉｓｅｄ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧＵＳ　ｉｎ　１ｅａｆ　ｄｉｓｃｓ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　 ｃｏｃｕｌｌｉｖａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ａｇｒｏｂａｃｊｅｒｉｕｍ、）　、 プラント　モレキュラー　バイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ）　、１４巻、６１〜７２）を５ａｌＩとＥｃｏＲＩで消化するこ とによって、細菌のリポソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　 ５ｉｔｅ）を欠損したＧＵＳ遺伝子（ＧＵＳマイナスＳ／Ｄ）を得た。

次に、２ｋｂの５ａｉｌ−ＥｃｏＲＩ　ＧＵＳをエンニーＡｏＰＲ１中にクロー ニングすることによって、ｐＪＩＴ−ＡｏＰＲｌ−ＧＵＳを得た（図１２Ａ）。

全発現カセット（つまり、ＰＣＲ−ＡｏＰＲ１プロモーター、ＧＵＳ遺伝子及び ＣａＭＶポリアデニル化シグナル）を、ＫｐｎＩとＸｈｏｌで消化することによ ってｐＪＩＴ−ＡｏＰＲｌ−ＧＵＳから単離した。さらに、この３．７ｋｂのＫ ｐｎｌ−ＸｈｏＩ断片をＫｐｎｌ／５ａｌｌで切断したｐＢＩＮ１９　［トレー パー　ジエ−（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊ）ら、上記参照］中にクローニングすることに よって、形質転換の研究に使用するバイナリ−ベクターであるｐＢＩＮ−ＡｏＰ Ｒｌ−ＧＵＳを得た（図１２Ａ）。

ｃ）Ｉ　ＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターとイントロンを含むＧＵＳ遺伝子との遺 伝子融合物の構築プラスミドｐ３５８　ＧＵＳ　ＩＮＴをロタ−ライルミチャー 教授（Ｐｒｏｆ、　Ｌｏｆｈａｒ　ＷｉｌｌｍｉＨｅｒ）　（ベルリン）より得 たが、これはＧＵＳ遺伝子のコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ） 内の植物のイントロンを含む（ヴアンカンネット（ＶａｎｃａｎｎＢｔ）ら、（ １９９０年）コンストラクションオブ　アン　イントロン−コンテイニング　マ ーカー　ジーン（Ｃｏｎｓｊｒｕｃｌｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　ｉｎｔｒｏｎ−ｃｏ ｎｔａｉｎｉｎｇ　ｍａｒｋＣｒ　ｇｅｎｅ）、モレキュラー　アンド　ジェネ ラル　ジエネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａ「ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ）、２２０．２４５〜２５０）　。ＡｏＰＲ１プロモーターの下流に あるＧＵＳＩＮＴ遺伝子をクローニングするために、ｐ３５Ｓ　ｃｔｙＳ　ＩＮ Ｔを５ｓｔｌで消化し、Ｔ４　ＤＮＡ　ポリメラーゼＩによって末端を埋め、最 終的にＢａｍＨＩで消化した。次に、２ｋｂのＢａｍＨＩ−８ｓ　ｔ　Ｉの末端 を埋めたＧＵＳ　ＩＮＴをエンコードする断片をＢａｍＨＩ−８ｍａＩで消化し たピーブルースクリプト　ＳＫ　（−）　（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ（− ））中にクローニングした。さらに、このようにして得られたプラスミドをＢａ ｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＧＵＳ　ＩＮＴ遺伝子をＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ で消化したｐＪ　ＩＴ−ＡＯＰＲ１中にクローニングすることによって、ｐＪＩ Ｔ−ＡｏＰＲｌ−ＧＵＳ　ＩＮＴを得た（図１２Ｂ）。さらに、全発現カセット （つまり、ＩＰＣＲ−ＡｏＰＲ１プロモーター、ＧＵＳ遺伝子及びＣａＭＶポリ アデニル化シグナル）を、ＫｐｎＩとＸｈｏｌで消化することによってｐＪＩＴ −ＡｏＰＲｌ−ＧＵＳ　ＩＮＴから単離した。さらに、この３，７ｋｂのＫｐｎ ｌ　−ＸｈｏＩ断片をＫｐｎＩ−３ａｌｌで消化したｐＢｉｎ１９［ベブアン（ Ｒｅｖａｎｌ　、１９８４年コ中にクローニングすることによって、形質転換の 研究に使用するバイナリ−ベクターであるｐＢｉｎ−ＡｏＰＲｌ−ＧＵＳ　ＩＮ Ｔを得た。

ｄ）ＰＣＲ−ＡｏＰＲＩ　ＧＵＳ　（フイナスＳ／Ｄ）およびｐＢ　ｉ　ｎ−Ａ ＯＰＲＩ−ＧＵＳ７−カー遺伝子の発現を用いてアグロバクテリウム（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）でタバコの葉の外植片を接種した後の形質転換をモニター できるｐＢ　ＩＮ−ＡｏＰＲｌ−ＧＵＳ及びｐＢｉｎ−ＡｏＰＲ１、−　Ｇ　Ｕ 　Ｓベクターを用いてタバコの葉のディクスの標準的なアグロバクテリウム（Ａ ｇｒｏｂａｃｊｅｒｉｕｍ）が仲介する形質転換中のＡｏＰＲ１プロモーターの 発現を調査した。Ａ。

ＰＲＩプロモーターの存在下のＧＵＳの発現を、形質転換過程中の様々な時間で 組織化学的及び蛍光定量的にアッセイすることによって調査した（図１０）。接 種後３０くらいの初期から、ＧＵＳ活性は外植片の切断された端及び発達したカ ルスに局在化した。それぞれの葉の外植片における形質転換頻度は、ＧＵＳ−ポ ジティブなマイクロカルス（ｍｉ　ｃ　ｒｏｃａ　ｌ　Ｉ　ｉ）の数によって示 したが、ｐ３５Ｓ　ＧＵＳＩＮＴまたはｐＫＩＷ１０５ベクター中に含まれるも の等のプロモーターを用いて得られるものと少なくとも同等またはそれ以」二で あった。ＧＵＳ活性は、カルス組織や小さい苗条中でおよび根を成長させる培地 上で生育した苗条の根中で検出され続けた。根付きが行われた後は、非常に少な いＧＵＳ活性が、小さい植物の生育した葉中でまたはこれら実生から生育したよ り大きな植物中で検出された。定量的な観点においては、ＩＰＣＲＡｏＰＲＩ　 ＧＵＳマーカー遺伝子によって形質転換された植物は、Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５Ｓ（ プラスミドｐＢ１１２１）等の構成性（ｃｏｎｓ目１ｕｔｉｖｅ）プロモーター によって誘導されたマーカー遺伝子を有する形質転換植物中で見られる値より３ から４オーダー倍低い範囲のマーカー遺伝子の発現を示した（図１３）。

これらの実験によって、ＡｏＰＲ１プロモーターは抗生物質による選択がなされ ていなければならない期間である形質転換過程の段階中に活性を有することが示 される。また、ＡｏＰＲ１プロモーターによって誘導されるマーカー遺伝子の極 微な発現が成熟した植物においては認められる換効率を向」ニさせるマーカー遺 伝子を発現できる。形質転換によって選択マーカー遺伝子が最小限で発現し、最 小限のコピー数のＴ−ＤＮＡ挿入物を有する成熟した形質転換植物が得られる 構成性の（ｃｏｎｓｔｉｆｕｔｉｖｅ）　Ｃａ　ＭＶ　３５　Ｓまたはツバリン シンターゼの植物プロモーターの制御下でのネオマイシンホスホトランスフェラ ーゼ遺伝子（ｎｐｔ−ＩＩ）の発現は、一般的に植物の形質転換実験において抗 生物質であるカナマイシンに対する耐性を与えるために用いられる。同様にして 、除草剤であるＢＡＳＴＴＭ（登録商標）に対する耐性をエンコードするｐａｔ 遺伝子の発現は一般的に単子葉植物細胞の形質転換を目的とする選択的な表現型 として使用される。これらの耐性遺伝子によって、耐性株を選択でき、これによ って形質転換された植物組織を形質転換されないものから選択できる。従って、 ＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターを用いることによって抗生物質及び除草剤耐性遺 伝子を発現させ、これによって形質転換植物を選択できる。

ａ）ＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターの制御下でｎｐｔ−１１を発現させるための バイナリ−ベクターの構築ｎｐｔ−ＩＩ遺伝子をエンコードするｌｋｂのＢａｍ Ｈ■断片をベクターｐＣａＭＶＮｅｏから単離し、ｐＪ　ＩＴ−ＡｏＰＲｌのＢ ａｍＨ１部位中に部位−ニングすることによって、中間ベクターｐＪ　ＩＴ−Ａ ｏＰＲｌ−Ｎｅｏを得た（図１４）。次に、このｐＪ　ＩＴ−ＡｏＰＲｌ−Ｎｅ ＯプラスミドをＸｈｏｌて直鎖状にし、発現カセット（つまり、ＡｏＰＲ１プロ モーター、ｎｐｔ−ＩＩ遺伝子及びＣａＭＶポリアデニル化部位）を含む全プラ スミドを５ａＩＩで切断したｐｓｃＶｌ中にクローニングすることによッテ、ｔ ＜イｆ−’Ｊ−べ’）ター　ｐＳＣＶ−ＡｏＰＲｌ−ＮＥＯを得た（図１４）。

ｂ）ＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターの制御下でｐａｔを発現させるためのバイナ リ−ベクターの構築除草剤であるＢＡＳＴＴＭ（登録商標）に対する耐性を与え るｐａｔ遺伝子をエンコードする６００ｂｐのＢａｍＨｌ−ＥｃｏＲＩ断片をベ クターｐＪＩＴ７４から単離し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＪ　ＩＴ −ＡｏＰＲｌ中にクローニングすることによって、ｐ　Ｊ　ＩＴ−ＡｏＰＲｌ− ＰＡＴを得たく図１５）。次に、発現カセ・ノド（つまり、ＡｏＰＲ１プロモー ター、ｐａｔ遺伝子及びＣａＭＶポリアデニル化部位）をエンコードする２、４ ｋｂのｘｈｏｆ−Ｋｐｎｌ断片をｐＪ　ＩＴ−ＡｏＰＲｌ−ＰＡＴから単離し、 Ｋｐｎｌ／５ａｌＩで切断したｐＢＩＮ１９中にクローニングすることによって 、ｐＢ　ＩＮ−ＡｏＰＲｌ−ＦＡＴを得た（図１５）。

ｃ）ＰＣＲＡｏＰＲｌ−ＮＥＯ？−カー遺伝子によってタバコの葉の外植片から 形質転換植物を効率的に回収するトレーパー　ジエ−（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊ）ら、 上記参照によって記載されているようにしてタバコの葉のディスクの標準的なア グロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｊｅｒｉｕｍ）が仲介する形質転換を用いて 、実験を行った。同様の方法を用いて、ポテトの葉のディスクを形質転換した。

それぞれの葉の外植片において観察される形質転換頻度は、ＣａＭＶ３５Ｓプロ モーターまたはマンノピンシンターゼ（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ　５ｙｎｊｈａｓｅ ）のプロモーターのいずれかを用いて得られるものと少なくとも同等またはそれ 以上であった（表１６）。トレーパージニー　（Ｄｒａｐｅｒ　Ｊｌら、上記参 照によって記載されているドツトプロットアッセイ（ｄｏｊ　ｂｌｏｔ　ａｓｓ ａｙ）を用いることによって、成熟したＡｏＰＲｌ−ＮＰＴ−１１を形質転換し たタバコ植物中で非常に少ないＮＰＴ−ＩＩ活性が検出された。

表２ タバコ ３５Ｓ−ＮＴＰ’−Ｉ　Ｉ及びＡｏＰＲｌ−ＮＰＴ−Ｉ　Ｉ構築物を含むアグロ バクテリウム　テユーマファシエンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を接種し たタバコの葉のディスクの外植片からのカナマイシン耐性カルス及び苗条の形成 頻度、およびカナマイシン存在下で再生した苗条における根の発育。

Ｉｆ物　各カルス／ｌのディス　再生Ｌｔｉ条／Ｉのディス　根付いた苗条の割 合３　根／苗条の頻度３３５５−ＮＴＰ−Ｉｆ　１１．４６４０．８　４．８Ｏ ｆ０．５　５０”１７．６　４．８ｔ１．０ＡｏＰＲ１−ＮＰＴ−１１１２，９ ６±１．１　５．３７±０．６　４５±Ｉ３．４　５．６±０．６ＳＥ：標準誤 差 １接種後２週間 ２接種後４週間 ３培養開始後２週間 ポテト １００ｍｇ／ｍｌのカナマイシンによる選択の１力月後の３５Ｓ−ＮＴＰ−Ｉ　 ＩまたはＡｏＰＲｌ−ＮＰＴ−Ｉ　１構築物のいずれかを有するバイナリ−ベク ターを含むアグロバクテリウム　テユーマファシエンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ）を接種したポテトの葉片（ｌｅａｆ　ｐｉｅｃｅ）の外植片からのカナ マイシン耐性苗条の形成頻度。

Ｉｆ物　反応する葉片の割合（％）　再生した苗条７１片の３５５−ＮＴＰ−１ １３３，８±５．６　２．５０±０．２ＡｏＰＲＩ−ＮＰＴ−Ｉｆ　３１．９± ６．７　２．５７±０．３４苗条を再生した葉片から ｄ）ＰＣＲ−ＡＯＰＲＩ−ＮＥＯ７−カー遺伝子を使用することによって双子葉 植物種の範囲内では効率的に形質転換が行える 子葉、葉柄、葉の一部、根、懸濁培養細胞及びプロトプラストを念む様々な外植 片を導入した適当な形質転換システムを用いて、他の植物種（例えば、アラビド プシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）　、ポテト、ブラツシカ　ナプス（Ｂｒａｓ ｇｉｃｉ　ｎａｐｕＳ）、エントウ（ｐｅａ）及びニンジン）で形質転換実験を 繰り返し行うことができる。すべての場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターまたは マンノピンシンターゼのプロモーター等の構成性の（ｃｏｎＮｉｔｕｔｉｖｅｌ プロモーターを用いて得られる値と同等あるいはそれ以りのレベルで形質転換が 行われる。

すべての形質転換体において、構成性で（ｃｏｎｓｊＮｕｊｉｖｅｌｙ）発現す るマーカー遺伝子を用いて誘導される形質転換体と比較すると、マーカー遺伝子 の発現はかなり極微であることが観察される。全ての植物において、マーカー遺 伝子の発現がかなり極微な量であるため、パラセンジャー遺伝子（ｐａｓｓｅｎ ｇｅｒ　ｇｅｎｅ）　（例えば、異なる構成性の（ｃｏｎｓｊｉｔｌｉｖｅ）プ ロモーターによって誘導されるＧＵＳＳＮＰＴ−Ｉ　Ｉ）は発現しない。作製さ れた形質転換植物の集団は、構成性のｆｃｏｎｓｔ口ｕｆｉｖりマーカー遺伝子 によって得られた形質転換体に比べてＴ−ＤＮＡ挿入物のコピー数が少ない。こ のデータによって、ＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターを用いることによって様々な 植物種において形質転換された苗条が効率的に得られることが明らかに示され、 さらに、目的としない遺伝−ｒ情報は成熟した植物や実生中で最小限の量しか発 現せず、Ｔ−ＤＮＡ挿入物も最小限の数しか含まない形質転換された植物が得ら れることも示される。

ｅ）ＰＣＲＡｏＰＲＩ　ＰＡＴ遺伝子を用いることによって単子葉植物細胞培養 物を効率的に形質転換できるクライン、テ（（Ｋｌｅｉｎ、Ｔ）　、コーンスタ イン、エル（Ｋｏｒｎｓｔｅｉｎ、Ｌ）　、サンフォード、ジエーシー（Ｓａｎ ｆｏｔｄ、　Ｊ、　Ｃ，）およびフロム、エムイー（Ｆ　ｒ　ｏｍｍ、　Ｍ、　 Ｅ、　）、（１９８９年）ジエネティック　トランスフォーメーション　オブ　 メイツセルズ　バイ　パーティクル　ボンバードメント（にＨ１ｅｌｉｃｔｒａ ｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｉｚｅ　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ｐａ目１ｃｌ ｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｌ）、プラント　フィシオル（Ｐｌａｎｔ　ＰｈＹｓ ｉｏｌ、）、９１：４４０〜４４４に記載されたマイクロプロジエクティル方法 （ｍｉｃｒｏｐｒｏｉｅｃｌｉｌｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて、トウモロ コシ及びロリウム科（Ｌｏｌｌｉｕｍ）の懸濁細胞培養物を形質転換した。

形質転換効率は、単子葉植物の懸濁培養された細胞及びカルス中で発現するよう に特に設計されていないプロモーターによって誘導された池のマーカー遺伝子を 用いて得られた値より優れているあるいはそれと同等であった。形質転換効率は 、池のプロモーターに関する文献（例えば、ラスト（Ｌａｓｊ）ら、セオリ　ア ップル　ジェネット（Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）　、８１．５ ８１〜５８８（１９９１年））に記載されているように、エンハンサ−要素（ｅ ｎｈａｎｃｅｒ　ｅｌｅｍｃｎｔ）を用いてプロモーターを改良することによっ てされに向上する。

この情報によって、穀物類に対する形質転換システムの発達にＡｏＰＲ１プロモ ーターを利用することができることが示される。

実施例１〇−組織培養におけるＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターの選択的な発現 を利用して、脱分化した植物細胞において工業的あるいは商業的に有用な酵素に 関してコードするＤＮＡを発現できる。多量の生成物が植物細胞の培養物中で得 られる ＩＰＣＲＡｏＰＲ１プロモーターを用いて、その結果直接的にあるいは間接的に 植物の細胞培養物において商業的に有用な化合物が生産できるような遺伝子の発 現を誘導する。この遺伝子産物は、適当なトランジットペプチド（ｌｒａｎｓＮ 　ｐｅｐｔｉｄｅ）を添加することによって細胞外および組織培地中に放出され る。遺伝子の発現量およびそれによる産生物の回収歯は、サリチル酸を添加する ことによって促進できる。この産生物は酵素でもよく、または組織培養物におけ るプロモーターの選択的な発現の効果によって量的にまたは質的に変わるような 産生物でもよい。サリチル酸は、他の安息香酸誘導体または微生物のエリジター 等のＡｏＰＲ１プロモーターを超誘導する他の化合物で置き換えてもよい。

このようにして工業的な応用能が向上した植物細胞培養物や産生物の例を以下に 示す： 植物細胞培養物　産　生　物 ジキタリス　ラナタ　ジゴキシン （Ｄｉｇｉｌａｌｉ＋　１ａｎａｌａ）　（Ｄｉｇｏｘｉｏ）コロイス　ブルメ イ　ローズマリニック　アシッド（Ｃｏｌｅｕｔ　ｂｌｕｍｅｉｌ　ｆＲｏｓｍ ａ＋１ｎｉｃ　ａｃｉｄｌケラニウム亜種　ゲラニオール （Ｇｅｒａｎｉｕｍ　５ｐｐ）　（Ｇｅｒａｎｉｏｌ）ラファナス亜種　ペルオ キシダーゼ ｔＲａｐｂａｎｕｓ　＋ｐｐｌ　（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｓ）コプテイス　ジャポ ニカ　ベルベリン （Ｃｏｐｆｉ＋　１ａｐｏｎｉｃａ）　（Ｂｅ＋ｂｅｒｉｎｅｌアイリス亜種　 イロン ＣＩｒ１ｓ　５ｐｐｌ　（Ｉｒｏｎｓｌパナックス　ギンセン　朝鮮ニンジンの 〕）イオマス（Ｐａｎａｘ　ｇｉｎｓｅｎｇ）　（Ｇｉｎｓｔｎｇ　Ｂｉｏｍａ ｓｓ）タフサス　プレヴイフォリア　タクスオール（Ｔａｘｕｓ　ｈｒｅｖｉｌ ｏｌｉａ）　（Ｔａｒｏｌ）カンタランチン　ロゼウス　カンタランチン（Ｃａ ｎｌｈｕａｎｔｈｕｓ　＋ｏｒｅｕ＋）　（ｃａｎｌｔａ＋ａｎｊｈｉｎｅ）リ トスベルマム　エリトロリシン　シコニン（Ｌｉｔｈｏｓｐｓｒｍｕｍ　ｒｒｙ ｌｈｒｏ＋ｈｉ＋ｏｎ）　（Ｓｈｉｋｏｎｉｎｌさらに、商業的にａ用な酵素に 関してコードするＡｏＰＲｌで誘導された遺伝子は、細胞増殖が最適化されてい る種の植物細胞（例えば、ニコチアナ　タバカム（Ｎ、Ｉ直ｂａｃｕｍ））中に 導入されてもよいため、酵素およびこれらの産生物の改良された生産手段が得ら れる。産生物量はサリチル酸を生育培地に加えることによってさらに向」ニする 。植物細胞中のヒ記生産に適している他のシステム（例えば、細菌、酵母）中で 一般的に生産される化合物の例としては以下のものが挙げられる：ロインンエン ケファリン（Ｌｅｕ−ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ヒト血ｌ古アルブミン、ＩｇＧ 、インターロイキンおよび他の抗癌化合物、Ｂ型肝炎ウィルス抗原、インターフ ェロン、および凝固因子。

！ ！ □ 亀 ［ ［ ［ リｄ 図７ｂ ｅｙ ε＝＝ご＝　ＩＰＣＲＡｏＰＲｌ　ブコモーターｉ−転写開始託イ立二二二二＝ 　ＧＵＳリポータ−遺伝子　＝＝＝＝ＮＯＳポリ（Ａ）ジグアル傷を付けた後の 日数 図８（２／２） 傷を付けた後の日数 図９ ０傷をイ寸けた後２日月 困ｄサリチル酸で 処理し傷を付けた後 ２日目 図１２Ｂ 図１３ 国際膿杏磐失 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＡＯＩＨ５１００Ａ　８ ５０２−２Ｂ Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） Ｉ

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．単子葉植物のまたはこれ由来のカルス細胞においてプロモーターとして作用 することができる配列からなる組換えまたは単離ＤＮＡ分子。
2. ２．傷を付けたおよび／またはカルス形成の間におよび／またはその後にアスパ ラガスオフィシアナリス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ　ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）の 推定１６．９２ｋＤａのタンパク質またはリリアセアエ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ ）若しくはアマリリダセアエ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）の他の植物に おける同様のタンパク質をエンコードする遺伝子の発現をそのまま誘導するプロ モーターからなる組換えまたは単離ＤＮＡ分子。
3. ３．図５に示されるコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｏ）の上流の 配列を有する、請求の範囲第１項または第２項に記載のＤＮＡ分子。
4. ４．発現すると、形質転換された植物材料を選択および／またはスクリーニング できるＤＮＡ（「マーカーＤＮＡ」）に遺伝子操作によって連結（ｏｐｏｒａｔ ｉｖｅｌｙ　ｌｉｎｋ）されたカルス活性プロモーターを有するＤＮＡ分子。
5. ５．該プロモーターが請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載したもので ある、請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ分子。
6. ６．植物細胞または組織培養物から回収されるべき物質の生産に含まれるＤＮＡ に遺伝子操作によって連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ　ｌｉｎｋ）されたカルス 活性プロモーターを有するＤＮＡ分子。
7. ７．該物質がプロモーターに連結したＤＮＡによってエンコードされたタンパク 質である、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ分子。
8. ８．プロモーターに連結したＤＮＡによってエンコードされた酵素が該物質の生 産に含まれるものである、請求の範囲第６項に記載のＤＮＡ分子。
9. ９．該プロモーターが請求の範囲第１項、第２項または第３項に記載したもので ある、請求の範囲第６項、第７項または第８項に記載のＤＮＡ分子。
10. １０．該マーカーＤＮＡが抗生物質の耐性に関してコードするものである、請求 の範囲第４項または第５項に記載のＤＮＡ分子。
11. １１．該マーカーＤＮＡがアミノグリコシド抗生物質の耐性に関してコードする ものである、請求の範囲第１０項に記載のＤＮＡ分子。
12. １２．該マーカーＤＮＡが除草剤の耐性に関してコードするものである、請求の 範囲第４項または第５項に記載のＤＮＡ分子。
13. １３．該マーカーＤＮＡがホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃ ｎ）耐性に関してコードするものである、請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ分 子。
14. １４．該マーカーＤＮＡが酵素に関してコードするものである、請求の範囲第４ 項または第５項に記載のＤＮＡ分子。
15. １５．該マーカーＤＮＡがβ−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）またはルシフェラーゼに関してコードするもの である、請求の範囲第１４項に記載のＤＮＡ分子。
16. １６．３′転写調節配列を有する、請求の範囲第１項から第１２項のいずれかに 記載のＤＮＡ分子。
17. １７．該３′転写調節シグナルがカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子由 来である、請求の範囲第１６項に記載のＤＮＡ分子。
18. １８．ベクターの形態を有する、請求の範囲第１項から第１７項のいずれかに記 載のＤＮＡ分子。
19. １９．植物中で発現する予定のＤＮＡ配列を有する、請求の範囲第１８項に記載 のＤＮＡ分子。
20. ２０．解除された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉ−プラスミドベクターである、請求 の範囲第１８項または第１９項に記載のＤＮＡ分子。
21. ２１．請求の範囲第１８項に記載のＤＮＡで感染または形質転換された宿主細胞 。
22. ２２．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞である、請求の 範囲第２１項に記載の宿主細胞。
23. ２３．連続したヌクレオチドを一緒にカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）および ／またはオリゴーおよび／またはポリーヌクレオチドを連結（ｌｉｇａｔｉｎｇ ）することからなるプロセスである、請求の範囲第１項から第２０項のいずれか に記載のＤＮＡ分子の調製方法。
24. ２４．請求の範囲第１項から第２０項のいずれかに記載のＤＮＡを植物細胞中に 導入することからなるプロセスである、形質転換された植物細胞の調製プロセス 。
25. ２５．請求の範囲第１項から第２０項のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換した 単子葉植物または双子葉植物の細胞または組織培養物。
26. ２６．請求の範囲第１項から第２０項のいずれかに記載のＤＮＡを有する、形質 転換植物、またはその一部。
27. ２７．請求の範囲第２６項に記載の形質転換植物の増殖材料。