CN106282186A - 一种AaADH1基因启动子及其应用与制备方法 - Google Patents

一种AaADH1基因启动子及其应用与制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种AaADH1基因启动子及制备方法，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；同时本发明还涉及该AaADH1基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。本发明提供的启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，由于腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

一种AaADH1基因启动子及其应用与制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基因启动子及其应用与制备方法。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用，与青蒿素含量的高低也密切相关。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。
AaADH1(青蒿醇脱氢酶1)是青蒿素合成途径下游的一个关键酶，青蒿醇可以通过该酶被氧化为相应的青蒿醛。AaADH1在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中腺毛特异性表达基因ADS(紫穗槐-4,11二烯合酶)、CYP71AV1(细胞色素单加氧酶)和DBR2(双键还原酶)均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在腺毛中特异性表达。由于青蒿素是在青蒿的油性腺毛中合成，因此，克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。在目前的青蒿基因工程研究中，多采用组成型的启动子，例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害，而腺毛不是植物生长所必须的，因此，克隆AaADH1基因的启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。克隆其启动子将为研究AaADH1基因的表达调控和分析启动子上的顺式作用元件奠定基础。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaADH1基因启动子序列相关的报道。
发明内容
有鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种AaADH1基因启动子，其能引导基因在植物腺毛中特异表达，在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种过程中，本发明提供的启动子能够特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，而且不会对植物的生长发育造成危害。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种启动子，该启动子为AaADH1基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述AaADH1基因启动子为诱导型启动子。
本发明还提供了含有上述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
进一步地，所述表达盒由上述启动子、由上述启动子启动转录的目的基因和终止子组成。
进一步地，所述重组载体为pCAMBIA1391Z-AaADH1，融合了所述AaADH1基因启动子与GUS报告基因，如SEQ ID NO:1所示的DNA片段通过HindIII和NcoI酶切位点插入pCAMBIA1391Z载体。
进一步地，上述重组菌为经pCAMBIA1391Z-AaADH1载体转化的根癌农杆菌。
本发明还提供了上述启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
进一步地，上述代谢产物为青蒿素。
本发明还提供了一种制备上述启动子的方法，其包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaADH1基因启动子序列，克隆启动子序列；
步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；
步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
步骤五、将步骤四中构建好的带有1391Z-AaADH1pro载体转化根癌农杆菌；
步骤六、将步骤五中带有1391Z-AaADH1pro载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
步骤七、PCR检测转基因植株；
步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增分泌型腺毛特异启动子序列。
进一步地，所述步骤三中调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件包括：ACE、ARE、CAAT-box、G-box、GA-motif或TATA-box启动子序列中调控元件见表1。
表1 启动子序列中调控元件分析
进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391Z载体，正向引物中引入HindIII酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下所示：
HindIII-proADH1-FP:CCCAAGCTTAAAGTATGGAATGTTGGTAAATA
NcoI-proADH1-RP:CATGCCATGGTTTAATCAAATCGTTTAGTTAG。
进一步地，所述步骤六中将所述1391Z-proAaADH1载体的根癌农杆菌工程菌转化青蒿包括以下步骤：
1)外植体的预培养；
2)农杆菌与外植体的共培养；
3)抗性再生植株的筛选。
本发明具有如下有益效果：本发明提供的AaADH1基因启动子，可特异性地在植物腺毛组织启动并高效表达外源基因，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1示出了本发明较优实施例中转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；
图2示出了本发明较优实施例中利用AaADH1基因启动子与GUS基因融合的载体1391Z-AaADH1pro转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。
实施例
本实施例涉及AaADH1基因启动子的获得，具体包括如下步骤：
步骤一，培养青蒿无菌苗
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
步骤二，根据青蒿全基因组中AaADH1基因启动子序列，巢式PCR克隆启动子序列；
为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，使用的引物如表2所示，AaproADH1-FP1(SEQ ID NO:2)和AaproADH1-RP1(SEQ ID NO:3)是根据青蒿全基因组数据库中AaADH1基因序列和其的启动子序列设计的特异引物，首轮PCR反应体系如表3所示，其中PCR反应条件为：94℃预变性10min，94℃40s，55℃40s，68℃1.5min，34个循环；68℃延伸10min。
表2 巢式PCR引物
引物名称 引物序列(5’→3’)
AaproADH1-FP1 ATGTGGAGAAAGTGGCTAAGAGTTGGAT
AaproADH1-RP1 TACGAGGAAACAAAGGCTGTAATGC
AaproADH1-FP2 AAAGTATGGAATGTTGGTAAATAGAGGT
AaproADH1-RP2 CTAACTTCAGATGCTTTTGGCGGAT
表3 PCR的反应体系
青蒿DNA 1μL
10×KOD Plus Buffer 5μL
dNTP 5μL
MgSO4 2μL
AaproADH1-FP1 1μL
AaproADH1-RP1 1μL
KOD Plus 1μL
ddH2O 34μL
总体积 50μL
表4 PCR的反应体系
1:50稀释的第一轮PCR产物 1μL
10×KOD Plus Buffer 5μL
dNTP 5μL
MgSO4 2μL
AaproADH1-FP2 1μL
AaproADH1-RP2 1μL
KOD Plus 1μL
ddH2O 34μL
总体积 50μL
首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是AaproADH1-FP2(SEQ ID NO:4)和AaproADH1-RP2(SEQ ID NO:5)，反应体系如表4所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，55℃40s，68℃1.5min，34个循环；68℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pJET1.2载体用于测序，将该片段的序列与AaADH1基因的序列进行拼接，结果获得了AaADH1基因上游约1.07kbp的序列；
步骤三，分析启动子上的顺式作用元件，确定AaADH1基因启动子的类型本发明中得到的AaADH1基因启动子的序列长1070bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaADH1基因的启动子进行分析。在AaADH1基因启动子上发现有ACE、ARE、CAAT-box、G-box、GA-motif、TATA-box等。其中，G-box发现于很多植物基因的启动子中，它是很多刺激响应启动子行使功能所必需的元件，它在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到重要的作用；GA-motif、ACE受光调控；以上结果分析均表明，AaADH1基因启动子是一个诱导型启动子，能受多种激素和自然因素诱导。
步骤四，AaADH1基因启动子与GUS报告基因的融合并连入1391Z载体
为了分析AaADH1基因启动子上的顺式作用元件，将AaADH1基因启动子连入pCAMBIA1391z载体得到1391Z-AaADH1pro载体，研究该启动子驱动GUS报告基因在不同组织部位中的表达。pCAMBIA1391z载体从澳大利亚CAMBIA公司购得，其本身带有GUS报告基因。为了方便表达载体(1391Z-AaADH1pro载体)的构建，正向引物中引入了HindIII的酶切位点，反向引物中引入了NcoI的酶切位点，引物如表5所示；
表5 AaADH1-1391Z载体构建的PCR引物
步骤五，将构建好的载体1391Z-AaADH1pro载体转化根癌农杆菌
将含AaADH1基因启动子片段和GUS基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌，并进行PCR验证，结果表明，含AaADH1基因启动子片段的植物双元表达载体成功构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含AaADH1基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体1391Z-AaADH1pro的根癌农杆菌工程菌；
步骤六，将带有1391Z-AaADH1pro载体的根癌农杆菌转化青蒿
①外植体的预培养
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化；
②农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L乙酰丁香酮(AS)组成的共培养培养基中，滴加活化好的含有ADH1pro的植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；
③抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、卡那霉素(Kan)、羧苄青霉素(Cb)的发芽筛选培养基(MS、0.5mg/L6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb)上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株；
根据目的基因所在表达盒AaADH1promoter-GUS序列AaADH1promoter和GUS基因分别设计正向引物(proAaADH1F：AGCCTAATAATTCATTAGTTCA，SEQ ID NO:8)和反向引物(GUSR:ATCCACGCCGTATTCGGTGATGAT，SEQ ID NO:9)对GUS基因进行检测，转基因青蒿植株的PCR阳性检测如图1所示，结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段；在图1中，M：分子量标记；泳道1-11：分别是以11株转基因青蒿植株基因组为模版，进行PCR得到的产物；+：阳性对照；—：阴性对照。以带有AaADH1promoter-GUS序列的质粒为阳性对照；以水为阴性对照。
步骤八，启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定
图2中，对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色。结果表明，染色部位为青蒿的分泌型和非分泌型腺毛，其中所述AaADH1基因启动子在青蒿幼叶分泌型腺毛中特异表达，而在青蒿老叶非分泌型腺毛中特异表达，说明ADH1pro在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子为AaADH1基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述AaADH1基因启动子为诱导型启动子。
3.含有根据权利要求1所述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒由根据权利要求1所述的启动子、由根据权利要求1所述的启动子启动转录的目的基因和终止子组成。
5.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pCAMBIA1391Z-AaADH1，融合了所述AaADH1基因启动子与GUS报告基因，如SEQ ID NO:1所示的DNA片段通过HindIII和NcoI酶切位点插入pCAMBIA1391Z载体。
6.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为经pCAMBIA1391Z-AaADH1载体转化的根癌农杆菌。
7.根据权利要求1所述的启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
8.根据权利要求7所述的启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用，其特征在于，所述代谢产物为青蒿素。
9.一种根据权利要求1所述的启动子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaADH1基因启动子序列，克隆启动子序列；
步骤三、分析调控基因在分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；
步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；
步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；
步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；
步骤七、PCR检测转基因植株；
步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入HindIII酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下所示：
HindIII-proADH1-FP:CCCAAGCTTAAAGTATGGAATGTTGGTAAATA
NcoI-proADH1-RP:CATGCCATGGTTTAATCAAATCGTTTAGTTAG。
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