CN105112420B - 一种AaTSW1基因启动子及其应用与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种AaTSW1基因启动子及制备方法，该启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示；同时本发明还涉及该AaTSW1基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。本发明提供的启动子能引导基因在植物腺毛中特异表达，由于腺毛特异表达的启动子对植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

一种AaTSW1基因启动子及其应用与制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基因启动子及其应用与制备方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。

AaTSW1是从青蒿中分离得到的一个WRKY类的转录因子。在青蒿植株中超表达AaTSW1可以显著提高青蒿中青蒿素及二氢青蒿酸的含量，表明该基因在青蒿素生物合成途径中具有重要的调节作用。AaTSW1在叶片发育初期及不同组织部位中的表达谱与青蒿素合成途径中腺毛特异性表达的基因ADS、CYP71AV1和DBR2均具有较高的相似性。因此，该基因的启动子也极有可能在腺毛中特异性表达。由于青蒿素是在青蒿的油性腺毛中合成，因此，克隆得到青蒿腺毛特异性的启动子对青蒿素代谢工程具有较为重要的意义。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子，例如烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35)。这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，因此极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。

发明内容

有鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种AaTSW1基因启动子，其能引导基因在植物腺毛中特异表达，在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种过程中，本发明提供的启动子能够特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，而且不会对植物的生长发育造成危害。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种启动子，为AaTSW1基因启动子，该启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

进一步地，该AaTSW1基因启动子的顺式作用元件如附图1所示。

本发明还提供了含有该AaTSW1基因启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

进一步地，该表达盒由AaTSW1基因启动子、该启动子启动转录的目的基因和终止子组成。

进一步地，该重组载体为pCAMBIA1391Z-AaTSW1，融合了AaTSW1基因启动子与gus报告基因，如序列表中序列1所示的DNA片段通过PstI和BamH1酶切位点插入pCAMBIA1391Z载体。

进一步地，该重组菌为经pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体转化的根癌农杆菌。

本发明还提供了该AaTSW1基因启动子在利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

优选地，所述代谢产物为青蒿素。

本发明还提供了一种AaTSW1基因启动子的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、使用PCR技术克隆启动子基因组序列PAaTSW1；

步骤三、分析该启动子上的顺式作用元件，确定AaTSW1基因启动子的类型；

步骤四、将该AaTSW1基因启动子连入pCAMBIA1391Z载体；

步骤五、将构建好的载体pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体转化根癌农杆菌；

步骤六、将带有pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体的根癌农杆菌转化青蒿；

步骤七、使用PCR技术检测步骤六中获得的转基因植株；

步骤八、确定启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位。

优选地，步骤4中扩增AaTSW1基因启动子的引物为：

上游引物-CCCTGCAGCACGAGGAAAAGGTGCTGAGT，

下游引物-CCGGATCCTTTGGAGAAAAAATGGAGTGG。

本发明的有益效果在于：本发明提供的AaTSW1基因启动子，可特异性地在腺毛组织启动并高效表达外源基因，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1为AaTSW1基因启动子区域的顺式作用元件结构图；

图2为转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；

图3为利用AaTSW1基因启动子与gus基因融合的载体pCAMBIA1391Z-AaTSW1转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105，质粒pCAMBIA1391Z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

本实施例涉及AaTSW1基因启动子的获得，具体包括如下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗。

步骤二、PCR法克隆启动子基因组序列

本实施例采用PCR法克隆AaTSW1基因启动子序列，具体步骤如下：

1、基因组DNA提取

用CTAB法提取青蒿基因组总DNA，取小片青蒿嫩叶于1.5mL离心管中，加入600μLCTAB提取液，60Hz振荡研磨100s；之后于70℃加热40min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔颠倒混匀乳化10min；10000rpm/min离心10min；取上清于新的离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000rpm/min离心10min；弃上清，加入1mL75％乙醇清洗10min，12000rpm/min离心10min；弃上清，吸干乙醇，当乙醇完全挥发后，加入40μL水溶解。

2、PCR扩增

以所提取的总DNA为模板，根据AaTSW1基因启动子序列设计基因特异性引物(表1所示)，通过PCR从总DNA中扩增AaTSW1基因启动子，并测序。

表1 AaTSW1基因启动子引物

引物名称	引物序列(5’→3’)
		AaTSW1-F	CACGAGGAAAAGGTGCTGAGT
AaTSW1-R	TTTGGAGAAAAAATGGAGTGG

步骤三、分析启动子上的顺式作用元件，确定AaORA基因启动子的类型

本发明中得到的AaTSW1基因启动子的序列长2077bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaTSW1基因的启动子进行分析。我们在AaTSW1基因启动子上发现有TATA box，ABRE,GCC-box,MBS,G-box,W box等。G-box发现于很多植物基因的启动子中，它是很多刺激响应启动子行使功能所必需的元件；它在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到重要的作用；另外，AaTSW1基因启动子上的其它元件也可以对一些刺激做出响应，例如ABRE在ABA应答中起作用，W box在植物抗胁迫应答中起作用；以上的分析结果表明，AaTSW1基因的启动子是一个诱导型的启动子，能受几种刺激物的诱导。

步骤四、AaTSW1基因启动子与gus报告基因的融合并连入pCAMBIA1391Z载体

为了分析AaTSW1基因启动子上的顺式作用元件，将AaTSW1基因的启动子启动子与gus报告基因融合，研究该启动子驱动gus基因在不同组织部位中的表达，为了方便表达载体的构建，正向引物中引入了PstI的酶切位点，反向引物中引入了BamH1的酶切位点，引物如表2所示。

表2 pCAMBIA1391Z-AaTSW1-载体构建的PCR引物

步骤五、将构建好的载体pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体转化根癌农杆菌

将含AaTSW1基因启动子片段和gus基因融合的植物双元表达载体转入根癌农杆菌，并进行PCR验证，结果表明，含AaTSW1基因启动子片段的植物双元表达载体成功构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含AaTSW1基因启动子和gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391Z-AaTSW1的根癌农杆菌工程菌。

步骤六、将带有pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体的根癌农杆菌转化青蒿

1、外植体的预培养

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

2、农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含DEL0到DEL8基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

3、抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/LKan和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

步骤七、PCR检测转基因植株

根据目的基因所在表达盒pAaTSW1promoter-GUS序列AaTSW1promoter和GUS分别设计正向引物(AaTSW1:AATAAAAGAAGAAAAGAAAACCATTAC)和反向引物(GUSR:AAAGTCCCGCTAGTGCCTTGT)对gus基因进行检测，转基因青蒿植株的PCR阳性检测如图2所示，结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

步骤八、启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位的确定

对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图3所示，结果表明，染色部位在青蒿的油性腺毛，说明AaTSW1基因启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达，由此可见，本发明所克隆的AaTSW1基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子为AaTSW1基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.含有权利要求1所述启动子的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒由权利要求1所述的启动子、由权利要求1所述的启动子启动转录的目的基因和终止子组成。

4.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为经pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体转化的根癌农杆菌。

5.根据权利要求1所述的启动子在利用青蒿腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的启动子在利用青蒿腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用，其特征在于，所述代谢产物为青蒿素。

7.一种根据权利要求1所述的启动子的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、使用PCR技术克隆启动子基因组序列PAaTSW1；扩增所述PAaTSW1基因启动子的引物为：

上游引物-CACGAGGAAAAGGTGCTGAGT

下游引物-TTTGGAGAAAAAATGGAGTGG；

步骤三、分析所述启动子上的顺式作用元件，确定AaTSW1基因启动子的类型；

步骤四、将所述AaTSW1基因启动子连入pCAMBIA1391Z载体；扩增所述AaTSW1基因启动子的引物为：

上游引物-CCCTGCAGCACGAGGAAAAGGTGCTGAGT，

下游引物-CCGGATCCTTTGGAGAAAAAATGGAGTGG；步骤五、将构建好的载体pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体转化根癌农杆菌；

步骤六、将带有所述pCAMBIA1391Z-AaTSW1载体的所述根癌农杆菌转化青蒿；

步骤七、使用PCR技术检测步骤六中获得的转基因植株；

步骤八、确定启动子所引导的gus报告基因在植株中的表达部位。