CN105779456B - 一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用 - Google Patents

一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用。该AaPDR2基因启动子包括以下顺式作用元件：ABRE、Box I、CAAT‑box、CCAAT‑box、CGTCA‑motif、G‑Box、G‑box、GA‑motif和TATA‑box。进一步地，该AaPDR2基因启动子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。该AaPDR2基因启动子具有在青蒿幼叶分泌型和非分泌型腺毛中优势表达其引导的基因的功能，该功能通过GUS报告基因得到证实。因而本发明对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。

Description

一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种AaPDR2基因启动子及其功能验证方法和应用。
背景技术
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有过氧桥的倍半萜内酯氧化物——青蒿素，是目前应用最广泛，疗效最好的抗疟疾药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹疟疾更加有效。目前，青蒿素联合疗法(ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛(glandular secretory trichome，GST)和非分泌型腺毛(T shape trichome，TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用，与青蒿素含量的高低也密切相关。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。
ATP结合盒式(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。AaPDR2是从青蒿中克隆得到的一个ABC转运蛋白中多药耐药(Pleiotropic drug resistance，PDR)亚家族的转运蛋白。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此，克隆青蒿多药耐药转运蛋白2(AaPDR2)基因启动子对利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种具有重要意义。经对现有技术文献的检索发现，尚未发现有与本发明的AaPDR2基因启动子序列相关的报道。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种青蒿腺毛优势表达的基因(AaPDR2)启动子。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种中青蒿特定部位优势表达的启动子。本发明涉及基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、代谢产物检测。
本发明提供一种AaPDR2基因启动子，所述AaPDR2基因启动子的DNA序列包括以下顺式作用元件：ABRE、Box I、CAAT-box、CCAAT-box、CGTCA-motif、G-Box、G-box、GA-motif和TATA-box。以上顺式作用元件的详细描述见表1。
表1 AaPDR2基因启动子序列中的顺式作用元件分析
进一步地，所述AaPDR2基因启动子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种如上所述的AaPDR2基因启动子的功能验证方法，包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、提取所述步骤一中培养的青蒿无菌苗基因组，以此克隆所述AaPDR2基因启动子；
步骤三、分析调控基因在所述AaPDR2基因启动子上面的顺式作用元件，确定所述AaPDR2基因启动子的类型；
步骤四、将克隆到的所述AaPDR2基因启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中，得到1391Z-proAaPDR2载体；
步骤五、将所述1391Z-proAaPDR2载体转化根癌农杆菌，得到1391Z-proAaPDR2载体的根癌农杆菌工程菌；
步骤六、将所述1391Z-proAaPDR2载体的根癌农杆菌工程菌转化青蒿，得到转基因青蒿植株；
步骤七、PCR检测所述转基因青蒿植株；
步骤八、确定所述AaPDR2基因启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位；
其中，所述pCAMBIA1391z载体上带有GUS报告基因。
进一步地，所述步骤二中克隆所述AaPDR2基因启动子的具体方法是：以所述青蒿无菌苗基因组为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增AaPDR2基因启动子；其中第一轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF1：ATGGTATTAGTCTTCGTGGTCAAC和AaPDR2-PR1：TTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTATTTATG；第二轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF2：ACCCTTCATTATCCTCATCAGCAG和AaPDR2-PR2：CTTTATTCCAGTCAGTTCCATCCATTG。
进一步地，所述步骤四中采用PstI酶切位点和BamHI酶切位点双酶切连接连入pCAMBIA1391z载体，其中在正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点；所述正向引物为：Pro-PDR2-PstI-FP：TGCACTGCAGTTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTAT；所述反向引物为：Pro-PDR2-BamHI-RP：CGGGATCCTGTTACAAAAGATCAATTGATC。
进一步地，所述步骤六中将所述1391Z-proAaPDR2载体的根癌农杆菌工程菌转化青蒿包括以下步骤：
1)外植体的预培养；
2)农杆菌与外植体的共培养；
3)抗性再生植株的筛选。
本发明还提供一种如上所述的AaPDR2基因启动子在植物生产代谢产物的基因工程育种中的应用。
进一步地，所述AaPDR2基因启动子为优势表达启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物腺毛中优势表达；所述AaPDR2基因启动子是诱导型启动子。
本发明还一种如上所述的AaPDR2基因启动子的应用方法，包括以下步骤：
(1)培养青蒿无菌苗；
(2)提取所述步骤一中培养的青蒿无菌苗基因组，以此克隆所述AaPDR2基因启动子；
(3)将克隆到的所述AaPDR2基因启动子和外源基因融合构建表达载体；
(4)将所述表达载体转化根癌农杆菌，得到带有所述表达载体的根癌农杆菌工程菌；
(5)将所述带有所述表达载体的根癌农杆菌工程菌转化青蒿，得到转基因青蒿植株；
(6)PCR检测所述转基因青蒿植株，所述转基因青蒿植株能够在所述AaPDR2基因启动子的引导下载其植物腺毛中优势表达所述外源基因。
进一步地，还包括步骤(7)从所述转基因青蒿植株的叶片中提取所述外源基因的表达产物。
进一步地，所述步骤(2)中克隆所述AaPDR2基因启动子的具体方法是：以所述青蒿无菌苗基因组为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增AaPDR2基因启动子；其中第一轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF1：ATGGTATTAGTCTTCGTGGTCAAC和AaPDR2-PR1：TTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTATTTATG；第二轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF2：ACCCTTCATTATCCTCATCAGCAG和AaPDR2-PR2：CTTTATTCCAGTCAGTTCCATCCATTG。
本发明还提供一种连接有如上所述的AaPDR2基因启动子的载体。
本发明具有如下有益效果：本发明提供的AaPDR2基因启动子，可在青蒿幼叶腺毛组织启动并优势表达外源基因，能广泛应用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。
附图说明
图1是转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图。
图2-3是利用AaPDR2基因启动子与GUS基因融合的1391Z-proAaPDR2载体转化青蒿后，所获得的转基因青蒿植株中的GUS组织染色图。
图4-5是野生型青蒿植株中的GUS组织染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。本发明中所用到的试剂耗材除特别提到的外，均可通过常规商业途径进行购买获得。
实施例
本实施例涉及AaPDR2基因启动子的获得、功能验证，具体包括如下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗；
步骤二、根据青蒿全基因组中AaPDR2基因启动子序列，克隆启动子序列
为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，使用的引物如表2所示，AaPDR2-FP1(SEQ ID NO.2)和AaPDR2-RP1(SEQ ID NO.3)是根据青蒿全基因组数据库中AaPDR2基因序列和其的启动子序列设计的特异引物，首轮PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，50℃40s，68℃3min，34个循环；68℃延伸10min。
表2 巢式PCR引物
表3 PCR的反应体系
青蒿DNA 1μL
10×KOD Plus Buffer 5μL
dNTP 5μL
MgSO4 2μL
AaPDR2-FP1 1μL
AaPDR2-RP1 1μL
KOD Plus 1μL
ddH2O 34μL
总体积 50μL
首轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是AaPDR2-FP2(SEQ ID NO.4)和AaPDR2-RP2(SEQ ID NO.5)，反应体系如表4所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，55℃40s，68℃3min，34个循环；68℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到中间载体pJET1.2载体用于测序。将该片段的序列与AaPDR2基因的序列进行拼接，用于验证克隆基因是否为AaPDR2基因启动子。结果证明该克隆基因是AaPDR2基因上游约2.5kb的序列，为AaPDR2基因启动子。
表4 第二轮PCR反应体系
1:50稀释的第一轮PCR产物 1μL
10×KOD Plus Buffer 5μL
dNTP 5μL
MgSO4 2μL
AaPDR2-FP2 1μL
AaPDR2-RP2 1μL
KOD Plus 1μL
ddH2O 34μL
总体积 50μL
步骤三、分析启动子上的顺式作用元件，确定AaPDR2基因启动子的类型
本发明中得到的AaPDR2基因启动子的序列长2587bp。为了寻找启动子上的顺式作用元件，用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对AaPDR2基因启动子进行分析。在AaPDR2基因启动子上发现有ABRE、Box I、CAAT-box、CCAAT-box、CGTCA-motif、G-Box、G-box、GA-motif和TATA-box等。G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动子行使功能所必须的元件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到很重要的作用；此外，GA-motif、Box I都受光调控；CGTCA-motif是茉莉酸甲酯应答元件；以上结果分析表明，AaPDR2基因启动子是一个诱导型启动子，能受多种激素和自然因素诱导。
步骤四，AaPDR2基因启动子与GUS报告基因的融合并连入pCAMBIA1391z载体
为了分析AaPDR2基因启动子上的顺式作用元件，将AaPDR2基因启动子连入pCAMBIA1391z载体得到1391Z-proAaPDR2载体，研究该启动子驱动GUS报告基因在不同组织部位中的表达。pCAMBIA1391z载体从澳大利亚CAMBIA公司购得，其本身带有GUS报告基因。为了方便表达载体(1391Z-proAaPDR2载体)的构建，正向引物中引入了PstI的酶切位点，反向引物中引入了BamHI的酶切位点，引物如表5所示；
表5 1391Z-proAaPDR2载体构建的PCR引物
步骤五、将构建好的1391Z-proAaPDR2载体转化根癌农杆菌
1391Z-proAaPDR2载体是含AaPDR2基因启动子片段和GUS基因融合的植物双元表达载体。将1391Z-proAaPDR2载体转入根癌农杆菌，并进行PCR验证，结果表明，含AaPDR2基因启动子片段的植物双元表达载体成功构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含AaPDR2基因启动子和GUS基因融合的植物双元表达载体(1391Z-proAaPDR2载体)的根癌农杆菌工程菌；
步骤六，将1391Z-proAaPDR2载体的根癌农杆菌工程菌转化青蒿
①外植体的预培养
青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化；
②农杆菌与外植体的共培养
将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L乙酰丁香酮(AS)组成的共培养培养基中，滴加含活化好的所述含1391Z-proAaPDR2载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照；
③抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到添加6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、卡那霉素(Kan)、羧苄青霉素(Cb)的发芽筛选培养基(MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/L Kan和500mg/L Cb)上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株；
步骤七，PCR检测转基因青蒿植株
根据目的基因所在表达盒pAaPDR2promoter-GUS序列AaPDR2promoter和GUS分别设计正向引物(Pro-PDR2-FP:ACCTGTCTACTACTCTACTACA，SEQ ID NO.8)和反向引物(GUS-RP:CAGCCCGGCTAACGTATCCACG，SEQ ID NO.9)对GUS基因进行检测，转基因青蒿植株的PCR阳性检测如图1所示，结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。在图1中，M：分子量标记；泳道1-11：分别是以11株转基因青蒿植株基因组为模版，进行PCR得到的产物；+：阳性对照；—：阴性对照。以带有pAaPDR2promoter-GUS序列的质粒为阳性对照；以水为阴性对照。
步骤八，启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定
对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图2-5所示，结果表明，染色部位在青蒿幼叶分泌型和非分泌型腺毛优势表达，说明AaPDR2基因启动子在转基因青蒿植株中能够引导外源基因在青蒿幼叶腺毛中优势表达。图2-5均为电镜照片，其中图2是阳性的青蒿幼叶放大10倍；图3是阳性的青蒿幼叶放大20倍；图4是野生型青蒿幼叶放大4倍；图4是野生型青蒿老叶放大4倍。
由此可见，本发明所克隆的AaPDR2基因启动子可用于利用青蒿幼叶腺毛优势表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。其应用方法可以参照前述八个步骤做适当调整，以适应AaPDR2基因启动子引导其他外源基因在青蒿幼叶腺毛中优势表达。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种AaPDR2基因启动子，其特征在于，所述AaPDR2基因启动子的DNA序列包括以下顺式作用元件：ABRE、Box I、CAAT-box、CCAAT-box、CGTCA-motif、G-Box、G-box、GA-motif和TATA-box，所述AaPDR2基因启动子的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的AaPDR2基因启动子的功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、培养青蒿无菌苗；
步骤二、提取所述步骤一中培养的青蒿无菌苗基因组，以此克隆所述AaPDR2基因启动子；
步骤三、分析调控基因在所述AaPDR2基因启动子上面的顺式作用元件，确定所述AaPDR2基因启动子的类型；
步骤四、将克隆到的所述AaPDR2基因启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中，得到1391Z-proAaPDR2载体；
步骤五、将所述1391Z-proAaPDR2载体转化根癌农杆菌，得到1391Z-proAaPDR2载体的根癌农杆菌工程菌；
步骤六、将所述1391Z-proAaPDR2载体的根癌农杆菌工程菌转化青蒿，得到转基因青蒿植株；
步骤七、PCR检测所述转基因青蒿植株；
步骤八、确定所述AaPDR2基因启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位；
其中，所述pCAMBIA1391z载体上带有GUS报告基因。
3.如权利要求2所述的AaPDR2基因启动子的功能验证方法，其特征在于，所述步骤二中克隆所述AaPDR2基因启动子的具体方法是：以所述青蒿无菌苗基因组为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增AaPDR2基因启动子；其中第一轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF1：ATGGTATTAGTCTTCGTGGTCAAC和AaPDR2-PR1：TTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTATTTATG；第二轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF2：ACCCTTCATTATCCTCATCAGCAG和AaPDR2-PR2：CTTTATTCCAGTCAGTTCCATCCATTG。
4.如权利要求2所述的AaPDR2基因启动子的功能验证方法，其特征在于，所述步骤四中采用PstI酶切位点和BamHI酶切位点双酶切连接连入pCAMBIA1391z载体，其中在正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入BamHI酶切位点；所述正向引物为：Pro-PDR2-PstI-FP：TGCACTGCAGTTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTAT；所述反向引物为：Pro-PDR2-BamHI-RP：CGGGATCCTGTTACAAAAGATCAATTGATC。
5.一种如权利要求1所述的AaPDR2基因启动子在青蒿基因工程育种中的应用。
6.如权利要求5所述的AaPDR2基因启动子在青蒿基因工程育种中的应用，其特征在于，所述AaPDR2基因启动子能够代替组成型启动子引导外源基因在植物腺毛中表达；所述AaPDR2基因启动子是诱导型启动子。
7.一种如权利要求1所述的AaPDR2基因启动子的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养青蒿无菌苗；
(2)提取所述步骤一中培养的青蒿无菌苗基因组，以此克隆所述AaPDR2基因启动子；
(3)将克隆到的所述AaPDR2基因启动子和外源基因融合构建表达载体；
(4)将所述表达载体转化根癌农杆菌，得到带有所述表达载体的根癌农杆菌工程菌；
(5)将所述带有所述表达载体的根癌农杆菌工程菌转化青蒿，得到转基因青蒿植株；
(6)PCR检测所述转基因青蒿植株，所述转基因青蒿植株能够在所述AaPDR2基因启动子的引导下在其植物腺毛中表达所述外源基因。
8.如权利要求7所述的AaPDR2基因启动子的应用方法，其特征在于，所述步骤(2)中克隆所述AaPDR2基因启动子的具体方法是：以所述青蒿无菌苗基因组为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增AaPDR2基因启动子；其中第一轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF1：ATGGTATTAGTCTTCGTGGTCAAC和AaPDR2-PR1：TTGGTGTGTTTGTTTTTGCCTATTTATG；第二轮所用到的引物对为：AaPDR2-PF2：ACCCTTCATTATCCTCATCAGCAG和AaPDR2-PR2：CTTTATTCCAGTCAGTTCCATCCATTG。
9.一种连接有如权利要求1所述的AaPDR2基因启动子的载体。
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Molecular Cloning and Characterization of a Trichome-Specific Promoter of Artemisinic Aldehyde Δ11(13) Reductase (DBR2) in Artemisia annua;Weimin Jiang等;《Plant Mol Biol Rep》;20130526;第82页 *

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