CN113308468B

CN113308468B - 一种植物根部特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN113308468B
Application number: CN202110387840.8A
Authority: CN
Inventors: 唐克轩; 付雪晴; 孙小芬; 孙光新
Original assignee: Suzhou Tangji Biological Technology Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Suzhou Tangji Biological Technology Co ltd; Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-04-12
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-04-12
Also published as: CN113308468A

Abstract

本申请公开了一种植物根部特异性启动子及其应用，所述植物根部特异性启动子包括如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。

Description

一种植物根部特异性启动子及其应用

技术领域

本申请涉及植物育种领域，尤其涉及一种植物根部特异性启动子及其应用。

背景技术

启动子是位于结构基因5’端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达。启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子。这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，导致植物体内代谢的浪费，还会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。而植物根部特异表达的启动子只对植物的根系统进行遗传操作，则不会对植物造成代谢的浪费和对生长发育造成危害。

根是植物重要器官，植物依靠根系来固定和支撑，并且依赖根系吸收和运输土壤中的水分及养分，以及合成和贮藏营养物质。根不仅在植物生长发育中起着重要的作用，一些植物的根同时也是具有较高药用价值的中药材，在其中合成大量的次生代谢产物，例如丹参酮，人参皂苷等。根特异表达系统可用于研究开发植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。根特异表达启动子不仅在植物抗病虫害、耐盐碱，以及提高和改善食根性植物产量、营养成分等方面有突出的应用价值，还为根系统中次生代谢工程提供重要分子元件。因此，本领域的技术人员致力于提供一种植物根部特异表达的启动子。

发明内容

有鉴于现有技术的缺陷，本申请所要解决的技术问题是如何提供一种植物根特异表达的启动子。

为实现上述目的，本申请提供了一种植物根部特异性启动子，其特征在于，包括如SEQ ID NO.1所示的核酸序列。

在某些实施方式中，所述植物根部特异性启动子来自于青蒿。

在某些实施方式中，所述植物根部特异性启动子能够启动基因在植物根部表达且不能启动基因在植物叶片表达。

在某些实施方式中，所述植物包括青蒿。

另一方面，本申请还提供了一种载体，其特征在于，所述载体包含本申请所述的植物根部特异性启动子。

在某些实施方式中，所述载体为pCAMBIA-1391z。

另一方面，本申请还提供了宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含本申请所述的植物根部特异性启动子。

在某些实施方式中，所述宿主细胞包含本申请所述的载体。

在某些实施方式中，所述宿主细胞为农杆菌EHA105。

另一方面，本申请还提供了本申请所述的植物根部特异性启动子、本申请所述的载体、本申请所述的宿主细胞在植物育种中的用途。

在某些实施方式中，所述植物育种包括抗病虫害植物育种。

在某些实施方式中，所述植物育种包括耐盐碱植物育种。

在某些实施方式中，所述植物育种包括提高根部次生代谢产物产量的植物育种。

在某些实施方式中，所述次生代谢产物包括丹参酮、人参皂苷或青蒿素。

在某些实施方式中，所述植物包括青蒿。

本申请通过提供一种根部特异表达的启动子，在改善植物根部生理功能的同时不会对植物的生长发育造成危害，克服了传统组成型启动子的种种弊端，在植物育种及生物合成工业具有广泛的应用价值。

以下将结合附图对本申请的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本申请的目的、特征和效果。

附图说明

图1显示的是本申请中转基因青蒿植株的PCR阳性检测结果图；

图2显示的是本申请中启动子与GUS基因融合的载体，通过农杆菌介导稳定转化青蒿后获得的转基因青蒿根中GUS组织染色图。

图3显示的是本申请中启动子与GUS基因融合的载体，通过农杆菌介导稳定转化青蒿后获得的转基因青蒿叶片中GUS组织染色图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，本申请可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本申请的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press的1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105感受态(CAT#:AC1010)购自上海唯地生物技术有限公司；质粒pCAMBIA-1391z可通过公开市售的商业渠道取得，本申请中从澳大利亚CAMBIA公司购得。

实施例1根中特异表达启动子的获得

步骤一、培养青蒿无菌苗

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次～4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，14天后即获得青蒿无菌苗。

步骤二、基因组DNA中启动子序列的克隆

1、基因组DNA的提取

在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm²左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μL TPS buffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒。再加入300μL TPS buffer(通风橱内)，65℃水浴1h(每隔20min摇一摇，可适当延长时间，最长1.5h)。冷却至室温，4℃10000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)。混合后在-20℃冰箱中放置10-15min(可延长至1h)。取出4℃离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75％乙醇500-600μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入50μLdd H₂O回溶，4℃保存。

2、PCR扩增

利用青蒿转录组数据库分析青蒿中根特异性表达的基因序列，根据青蒿基因组数据库，预测根特异表达启动子。以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增根特异启动子序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，第一轮PCR引物如表1所示，首轮PCR反应体系如表2所示。PCR条件为：94℃预变性10min；94℃40s，50℃40s，68℃3min，34个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。

表1第一轮PCR引物设计

引物名称	引物序列(5‘-3’)	SEQ ID NO.
			PF1	CTAGATCCATCCGTTGCGTACTC	2
PR1	GCCTACAAGACAAGTGCCAGAG	3

表2第一轮PCR反应体系

第一轮PCR的产物稀释50倍用作第二轮PCR的模版，第二轮PCR引物如表3所示，反应体系如表4所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，55℃40s，68℃2min，34个循环；68℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pLB载体用于测序，结果获得了该特异性启动子序列约1755bp(SEQ ID NO.1)。

表3第二轮PCR引物设计

引物名称	引物序列(5‘-3’)	SEQ ID NO.
			PF2	CTAGCCGAGTATCGTAATGGTGAC	4
PR2	TCCGAGAAAGTTTGAATGCCTTCC	5

表4第二轮PCR反应体系

1:50稀释的第一轮PCR产物	1μL
		10×KOD Plus Buffer	5μL
dNTP	5μL
		MgSO<sub>4</sub>	2μL
FP2	1μL
		RP2	1μL
KOD Plus	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	34μL
总体积	50μL

步骤三、分析得到的该特异表达启动子的顺式作用元件，确定该特异表达启动子的类型

本申请中得到的该特异表达启动子序列长度为1755bp。为了寻找启动子上面的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant-care/html/)对该特异表达启动子进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具有出了CAAT-box，还具有很多顺式作用元件：ABRE、GT1-motif、GATA-motif、G-box、I-box、LTR、MYB、TATA-box、TCA-element和TGA-element等，如表5所示。

表5启动子序列中调控元件分析

元件名称	序列	功能
			ABRE	ACGTG	脱落酸响应
G-box	CACGTT	光诱导
			GATA-motif	GATAGGA	光诱导
GT1-motif	GGTTAA	光诱导
			I-box	AAGATAAGGCT	光诱导
LTR	CCGAAA	低温响应
			MYB	TAACCA	MYB结合位点
TATA-box	TATAAAT	转录起始位点
			TCA-element	CCATCTTTTT	水杨酸响应
TGA-element	AACGAC	生长素响应
			TGACG-motif	TGACG	甲基茉莉酸响应

其中，G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动子行使功能所必须的元件，在植物启动子对光、低温和植物激素的响应过程中起到很重要的作用；此外，TCT-motif受光调控，TGA-element在植物中能够响应生长素；TGACG-motif在植物中能够响应甲基茉莉酸；以上结果分析表明，该特异表达启动子是一个诱导型的启动子，能受多种因素诱导。

实施例2启动子在植物不同组织部位中的表达分析

步骤一、将得到的启动子连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因

为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将该特异表达启动子连接pCAMBIA-1391z载体融合GUS报告基因，为了实现对表达载体的构建，正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如下表6所示：

表6引入酶切位点的引物序列

步骤二、将构建好的pCAMBIA1391z载体转化根癌农杆菌并检测

将构建完成的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(EHA105)，并利用SEQ ID NO.6和7所示的正向引物和反向引物进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物双元表达载体成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体的根癌农杆菌菌株中。

步骤三、将带有pCAMBIA1391z融合载体的根癌农杆菌转化青蒿

1)外植体的预培养

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3～4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS，该MS培养基采用Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得；25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗，待苗长至5cm左右后,剪取无菌苗叶片外植体用于转化；

2)农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/L AS组成的共培养培养基中，滴加含活化好的本实施例步骤二所得的含特异表达启动子植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d，以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

3)抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L 6-BA、0.05mg/L NAA、50mg/LHyg和500mg/L Cb组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光(light)和8小时的黑暗(dark)中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Hyg抗性丛生芽，将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS0和125mg/L Cb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Hyg抗性再生青蒿植株；

步骤四、PCR检测转基因植株

根据目的基因所在表达盒promoter-GUS序列promoter和GUS分别设计正向引物(引物pro:TTGATTGTGATTGGTTTGAGTGTGT，SEQ ID NO.8所示)和反向引物(引物GUSR:GACATCGGCTTCAAATGGCGTA，SEQ ID NO.9所示)对GUS基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段(阳性结果)，而以对照组非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段，如图1所示。

步骤五、启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定

对步骤四中PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片和根部分别进行GUS组织染色，结果如图2和图3所示，不同染色部位结果表明，GUS基因在转基因青蒿的根中有良好的表达(图2)，而在转基因青蒿叶片组织中没有观察到GUS基因的表达(图3)，说明该启动子在转基因青蒿中能够引导外源基因在根中特异表达。由此可见，本申请所克隆的启动子可用于利用植物根体系表达从而生产代谢产物的基因工程育种和改良植物品质中。

以上详细描述了本申请的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本申请的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本申请的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

苏州唐基生物科技有限公司

<120> 一种植物根部特异性启动子及其应用

<130> CN084-20011PICN

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 根启动子序列

<400> 1

ctagccgagt atcgtaatgg tgacgattta tagcgacata taatgaaatt gaattcttta 60

tacgatgttc catttgatct ttatcacagt accggtgtaa taaataggga ttaagattag 120

aactgagata aatctcaaat gtcaaaaaca aaatataaaa aagtaaagtg attgctaaag 180

cacagaaccg aaatacaaat actataatca atataatgtt gatttacttt aaccttatct 240

tagataggat tgttcagtaa aattggaacg atacaaagaa gattagcatg accctttcgg 300

gatggcacat ataaattgag agatcatgca tcaacaacaa tgagcactta tgctttacaa 360

aacaattcaa taagaatata atttttgata gattgtattg ttatagtagg aatgtgatga 420

atctataata ataaacaatg tcatatatat acattttaaa tgttaatttg aaaatacaag 480

ggtaaaagac ataaaataac aacatacttt tcacatttta tcaacttgaa acacttacta 540

ttttattacc ttattccacc aacgaacttt cataatttat tccgacgtta gccatatgac 600

cggtctatat taaataataa ttgaaatgac tatatcaccc ttgtgtactt taaattttgt 660

tttgatttta ccaacgaatt ttcaaaattt gttccgattt cacccattcg acaaagacaa 720

tatagtcccg aggatgcgac actaactcga gccaacaact aacaactaac atctaacaac 780

taacccgccg ttcacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagtca tttcagttat tattttaata 840

taaccgctca tatgggtgaa ttcataacaa aattgaaagt atgttggtga agtaaggtaa 900

ttaaaaagta agtgtttcaa gtcagcaaaa ttaaaaaatt acattgtcat ataatagctt 960

ttacccaaaa tacaaagcat ttgttgtgta ttaactttag agtttagaaa ataaaataaa 1020

aagcatgtaa aacattaaaa ccaaatttat tttaaaatgt ttaaatcatg catagctgtg 1080

aacatctatt taaccaaatg ttaaaaaaag aaatttgtaa aataccaata aaaatatagt 1140

taacttgttt tgaagtttca aaaatattaa ataaaaaaaa taagggattt gcaaacgaca 1200

acctttaggg ctgtggttaa caagatgtat tttattacat ggttatgaat gaatgattat 1260

gattggttga taatttcgaa aaagatgggc acaatcccga aaaatataaa accacaacaa 1320

agaattgatt gtgattggat gattcaagtc attcaataaa ttgccgtaag aattgattgt 1380

gattggtttg agtgtgtaag tgattttagt ggagattttt gaggttcttg ctttctagat 1440

tcagtgtatt tactatatta tagtgccatt aatttctagc tccgtcctag attaaagaac 1500

ttttccgctc aaaaaaagac ttcaaaaata tataaatgga gtaaagataa atttgtggca 1560

cgtacgtaga caagaccatc acaaaaaacg tgatgaaaac atacttggcc aaaatgatta 1620

ttggggtcta acccgaaact cactgattaa cccgtgatca tagtagataa taaagtctat 1680

aaatagacta gactagttgt agtagtacct cacaacatca taaacaaaca ctttactacc 1740

ttaaataatt tgatc 1755

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物PF1

<400> 2

ctagatccat ccgttgcgta ctc 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物PR1

<400> 3

gcctacaaga caagtgccag ag 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物PF2

<400> 4

ctagccgagt atcgtaatgg tgac 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物PR2

<400> 5

tccgagaaag tttgaatgcc ttcc 24

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物1391-BamHI-In-FP

<400> 6

caggtcgacg gatccctagc cgagtatcgt aatggtg 37

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物1391-NcoI-In-RP

<400> 7

tcagatctac catgggatca aattatttaa ggtagta 37

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物pro

<400> 8

ttgattgtga ttggtttgag tgtgt 25

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence（人工序列）

<220>

<223> 引物GUSR

<400> 9

gacatcggct tcaaatggcg ta 22

Claims

1.一种植物根部特异性启动子，其特征在于，所述植物根部特异性启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的植物根部特异性启动子，其特征在于，所述植物根部特异性启动子来自于青蒿。

3.如权利要求2所述的植物根部特异性启动子，其特征在于，所述植物根部特异性启动子能够启动基因在植物根部表达且不能启动基因在植物叶片表达。

4.如权利要求3所述的植物根部特异性启动子，其特征在于，所述植物包括青蒿。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的植物根部特异性启动子。

6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体为pCAMBIA-1391z。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1-4所述的植物根部特异性启动子，所述宿主细胞为农杆菌EHA105。

8.权利要求1-4所述的植物根部特异性启动子、权利要求5-6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞在植物育种中的用途。