CN109706150A - 一种花生种子特异表达启动子ahssp29及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种花生种子特异表达基因SSCG29的启动子AHSSP29及其应用。该启动子序列具备TATAbox、CAAT box等启动子基本元件，以及常出现于种子或胚胎特异表达启动子序列的RYREPEAT、2S2SSEEDPROTBANAPA和GCN4OSGLUB1等顺式作用元件。经检测发现：其下游SSCG29基因在花生成熟种子中表达，而在被检测的根、茎、叶、入土前果针、成熟种子果壳中不表达，这表明SSCG29基因是种子特异表达基因，暗示其启动子AHSSP29是种子特异启动子。进一步通过实验发现AHSSP29可驱动GUS报告基因在转基因拟南芥种子中特异表达，证明AHSSP29是种子特异表达启动子。本发明获得的特异表达启动子AHSSP29，其克隆鉴定将对种子发育调控、品质遗传改良或以种子作为“生物反应器”异源合成重组蛋白或其它次生代谢物等具有重要的应用价值。

Description

一种花生种子特异表达启动子AHSSP29及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生种子特异表达启动子AHSSP29及其应用。

背景技术

花生是世界重要的油料作物，其种子富含脂肪和蛋白质，是理想的“生物反应器”。启动子可以驱动外源基因在宿主植物中表达，是花生遗传改良重要的分子工具。自1993年获得转基因花生以来，陆续出现了以抗逆、品质改良等为目标的转基因花生的报道。迄今为止，此类研究大都使用植物组成型表达启动子(即目的外源基因在植物整株中表达)，如烟草花叶病毒CamV35S启动子。然而，在植物所有组织中持续高效表达目的基因会给植物生长发育带来不利影响。组织特异启动子作为一类专一性启动子，能驱动外源基因在植物发育过程中某一特定时空表达。它不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，而且也避免了植物营养的浪费。种子特异启动子可以驱动外源基因在种子中特异表达，对花生种子遗传改良具有重要的应用价值。

随着生物技术的快速发展，利用多基因聚合技术，以高等植物种子作为“生物反应器”异源合成营养物质的报道陆续出现。比如，能生产维生素A的金色大米、可产鱼油的油菜籽、能异源合成花青素的紫晶大米以及紫胚玉米等。这些“生物强化”农作物的获得均需要引进外源代谢途径，而异源表达外源代谢途径涉及的基因需借助启动子的驱动。研究报道称：多基因转化过程中，若每个基因使用相同序列的启动子，由于重复序列的大量存在，可能会造成转基因沉默，每个基因表达盒选择应使用不同序列的启动子。因此，若想借助花生种子作为“生物反应器”异源合成营养物质，获得“生物强化”花生，需要克隆鉴定大量种子特异启动子。

然而，目前可以利用的花生种子特异启动子较少，且均克隆自已知种子特异表达基因，花生种子特异启动子资源较为匮乏。

发明内容

本发明提供了一种花生种子特异启动子AHSSP29及其应用。前期，通过比较转录组测序，筛选到一个种子特异表达基因，其命名为SeedSpecific Candidate Gene(SSCG29)。本发明克隆了其起始密码子ATG上游2771bp的启动子片段，将其命名为ArachisHypogeaeSeed Specific Promoter 29(AHSSP29)，经生物信息学分析、半定量RT-PCR以及转基因拟南芥验证，确定AHSSP29是一个能驱动外源基因在种子中特异表达的启动子。本发明丰富了花生种子特异启动子资源，其克隆鉴定将对花生种子品质改良或以花生种子作为“生物反应器”的研究具有重要的应用价值。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种花生种子特异启动子AHSSP29，其具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

进一步的，所述花生种子特异启动子AHSSP29含有RNA聚合酶结合位点TATAbox、CAAT box以及种子特异启动子常见的RYREPEAT、2S2SSEEDPROTBANAPA和GCN4OSGLUB1等顺式作用元件。

进一步的，扩增所述AHSSP29的引物AHSSP29-F和AHSSP29-R序列为：

AHSSP29-F：5’-AAGCTTGTATCATAGATTCAGTCGTCGTCG-3’；

AHSSP29-R：5’-GGATCCCACAAGAAAAGGAGGAGGTGAAAGGAATAC-3’。

进一步的，扩增所述花生种子特异启动子AHSSP29的PCR反应体系为：ddH2O 31μL，含Mg2+的5x HF buffer 10μL；浓度为2.5mM的dNTP 2μL；浓度为5μM的AHSSP29-F和AHSSP29-R各2μL；DMSO 0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因组模板2μL。

进一步的，扩增所述花生种子特异启动子AHSSP29的PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃50s，30个循环；72℃后延伸10min。

一种花生种子特异表达启动子AHSSP29在驱动外源基因在植物种子中特异表达的应用。

进一步的，所述植物种子为拟南芥、花生、大豆、小麦、玉米、油菜、棉花、亚麻种子。

本发明的优点和技术效果是：

本发明首先提取花生叶片总DNA，用启动子特异引物AHSSP29-F和AHSSP29-R进行PCR扩增，将扩增的片段胶回收后，连接到克隆载体pEASY-Blunt simple中。生物信息学分析，该启动子含有重要的RNA聚合酶结合位点TATAbox、CAATbox，以及种子特异启动子常见的RYREPEAT、2S2SSEEDPROTBANAPA和GCN4OSGLUB1等顺式作用元件，初步证明AHSSP29是种子特异启动子。

经RT-PCR对其下游驱动的SSCG29基因进行表达模式分析，发现该基因在花生成熟种子表达，而在根、茎、叶片、入土前果针和成熟种子的果壳中不表达。这表明SSCG29是种子特异表达基因，进一步暗示AHSSP29是种子特异启动子。用HindI和BamHI从pEASY-Bluntsimple载体切下该片段，替换掉植物表达载体pBI121中的35S。将构建好的植物表达载体转入农杆菌GV3101。利用“蘸花法”对拟南芥(Col 0生态型)进行遗传转化，对转基因T₂代拟南芥进行GUS组织化学染色分析发现：转基因拟南芥成熟的种子、以及萌发种子的子叶、下胚轴和胚根均能够被染上蓝色；长出真叶后，子叶和下胚轴仍能被染色，而根及真叶不显示蓝色；成年期转基因拟南芥的叶片不显示蓝色。野生型拟南芥整个生长时期均不能显示蓝色。结果表明花生AHSSP29启动子可以驱动外源报告基因GUS在拟南芥种子种特异表达，证明AHSSP29是种子特异表达启动子。本发明获得了一个新的花生种子特异启动子AHSSP29，其克隆鉴定将对花生种子品质改良或以花生种子作为“生物反应器”异源合成药物蛋白等具有重要的应用价值。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是半定量RT-PCR检测SSCG29基因在花生根、茎、叶、花、入土前果针、成熟种子果壳及成熟种子的表达情况，Actin是内标基因。

图2是GUS组织化学染色，其中A：成熟的转基因拟南芥种子，能染较深的蓝色；B-C：萌发的转基因拟南芥种子；D：转基因拟南芥幼苗，保持种子特性的子叶和下胚轴，仍然能被染色；E:转基因拟南芥的成熟植株；F：转基因拟南芥的茎、花等。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本实施例具体包括以下试验过程：

1.1试验材料

植物材料为花生品种“花育67”和拟南芥(生态型Col0)。大肠杆菌DH5α感受态、DNA分子量标记、PCR mix等购自北京全式金生物有限公司；高保真酶Phusion购自New EnglandBiolabs公司；X-Gluc购自北京索莱宝科技有限公司；限制性内切酶BamHI和HindIII购自Fermentas公司；T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；农杆菌菌株GV3101以及超表达载体pBI121为本实验室保存。

1.2 SSCG29基因内源表达分析

设计基因特异引物SSCG29-F和SSCG29-R(如表1所示)，提取花生栽培种“花育67”根、茎、叶片和成熟种子的RNA，反转录成cDNA。利用半定量RT-PCR方法检测其在根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳和种子中的表达情况，以花生基因Actin作为内参基因(表1)。PCR反应条件：94℃预变性30分钟；94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃30秒，26个循环；72℃后延伸10min，用1％琼脂糖凝胶进行电泳。

图1实验结果显示：该基因只在种子中有很强的表达信号，在根、茎、叶片、入土前果针、成熟种子果壳均不表达。这表明该基因在种子中特异表达。

该启动子DNA序列(SEQ IN NO：1)如下：

GTATCATAGATTCAGTCGTCGTCGTTAAATATTAGTTAAAACAAGAGCATGTTGATATAACTTCCAACGAACACGTAACATTAATCTTATTAAACCATATTTTCTGACAATAGAAATTGTATGTTTCATTGATGGTACTAAATAAATAAGTTATTGTTCGATAAAATACCTTGATGATATGATATTAAAATTTAAAATTTTTATGGCTTAATTATTTTTTATTTGTTTTTGTTATTAAAAAAACCATTAGTTTGAACATTTAATTGAGACGGTCACAAAAATATTCACTGACCCGGTATTCACAAAAACCAAACAAGCCTTATAAATGTAACAAAAAATAATTGGTCCATTGCATTGTAATGCTGTGTTTGTGAATATTTTTTGGTGGGGGGAAGGGTTTTGGTCACAATGACGGGTGGAAGCCCAATATGATATTAGAGGATTGTTTTGATTAACTGATAGTAGAAAATTAATATGTACTTCTTGGCCCGAACCGCTCTTGAGATAGCCAGTATAAGATTGGGCCAACAAGCTTGGGCCAATAACAAAATACTTCTTTAAAATACAAAAAGATAAAGCCCAATTATTCCCTCAACGGGTTTAGTCGTTTAGGTTCCGTTTGGTTAGTGGGTGGTAATACATAAAACATAGTCATAAAGACATAAAATAACATAGACACATTAGGACATAAAGTCTTAAACTTGTTTGGTATTTAAGTACATGACCTTGTATTCAAATTACAATTTTAATAAAATGATACTAATAACCCTACCATCATTATCACTTCTCTATCTCTATCACCATCACCATTATGATGTTAACTCAGATTATCACTATTAATAATTTTTAATGCAATTATAGATTCAATTCAACAAATCAACAAACTAACACAAAATCACTTTAACAATAAGATTAATCAAAATTTAAATAATAAATAAATAAAAAACAGAGAACTCTCTCCTCAATTATCTTCTTCTCATCTTGCATGCAAAAAGCACGATCTAATTATAATCACAAACAAAAAATTGAAATTGAAATTAAAAACAGATAATTATTCTCATCACATAAAAAAACCTCAAAGAACAAGAAAGAAAAAAACAGCAAAATAGATTACCATATGGTGGAAAAGAGGCAGCGACGTGAGAGAGAGACGGAGGCAGATCTAAAAAGAGAGGTGCGAGTTTGATTTGGAAATGCCTCAATATCAAACATGGAAGGAAGCCTCAACAACGACAGTGAGGCAGAGAACGGAGGAGACAACCACGGCGGAGGCGGCGTGACAAAGGAACGCGACAGTGGTTGCGACAACGTATGAAGGAAGAGATGACAGTAGTGGTGACGGCGATGGCAGCGAAGAAGTGCAATGGAGAGAGACTGTGGTTAAATGAAAAAAGAGTAGGAGAAGAAGATGAGAGTGTATGATGGAAGGAGGTGAATCAGAAAAAGAGAAAGGAGAAGATGAGAGGGTAAGGAAAAAAAGATAAAATTGGAATTAAAAAAAAAAGAAGGGATAAGATTAGAAAAGTTTGTGTCTTATAATTTGTGGTTTAGTGTCTTAGGTTAAAGGAGAGACACTAAAGACATATATTTTATGTGTTTCTGTGTGTCACCGTGTCCATCGAAAATTTATGTCTAATGAACCAAACGGTGGACATGTACCACTGTGTCCATCTCTTGATGGACATGTATGACAAAACAAACACTGCCTTATATTCTGAAAAAATACTCTCTCCGAACATCAAAAGAAATTCTCGGATACCAACGCAAATTAGCACAGATAGATGAGAGTCTGTGTCACTTAACTAGGACTAGAAGTGAGTCGAGTTGAGTTGAGTTAGATCAAACTCAGGCTCGGCTCACAAAAATTGAGTTTGGCTCACGGCTCGACTCATTAATAATAGAGTCTATTTTTTAAACTCAAGCTCGACTCATTGAAAGCTCACGAACTAGCTCAAATAATAGAAACATAAATACATAATCTATAATTCTATATCAATAAATTATAACATATATATTTTAAAAAATATTTAAAAAGATCAATTTTATATATTGTTATCTATCAATAAATTATAAATTTTTTATTTATGTCCTACATCAAAATTATATGTAAAAAATAAATATAAAATTTTAAATAATTAAGATCATATATATATATATATAATCGAGTCAGCTCACGAGCTAATAAGTTGAGCTTATCCAAACTCAAATTTGGCTCATTTAATTTATGAGATTAATTTCAAATTCAAGCTTGCCTTACTAGCTCACGAGTTTAGCTTATCAAGCTATTAATGAGTCGAACTCAAGTTAGCTCATAAACTGGCTTGACTCACTTCCAACCCTAACCTTAACCATTTCTCTTTAGTTTGATACTCGCTAAAAGATAAAAATGAAACTTGCTTATTTGAGAGAATTACCTACTTTATCTCTGCAGTATCCAAAAAATTAGTTATTGAGTTTCTAAGCTAAAGAATATCCTAGTACAAAAAAAAAAAAAATTCCCCGGATTACCAAAATTTTCAATGTAATATCTGCTCTCTCTTTTATGTTTTTCCTTTTGTGATCATGGTTTCATAGTGATCTTGATCGAGTCTGAATCCCAAGTGTTTGGAATTTTGTGGTATAGACTTGGACACCTTAATAACTGGCCATCTGTTTAAATAATGCACGTGTCTGAACAAAATTACATGCAGTTTTCGAAAACTACTATATAGAGCCACCTTTCCAATCTTGGGAACTCACTTGTATTCCTTTCACCTCCTCCTTTTCTTGTG

1.3花生幼嫩叶片DNA提取及AHSSP29启动子片段的克隆

本发明用植物DNA提取试剂盒提取“花育67”幼嫩叶片基因组，以此为模板，使用高保真酶Phusion，利用AHSSP29特异引物AHSSP29-F和AHSSP29-R(表1，横线分别是内切酶HindIII和BamHI识别序列)进行PCR扩增。

PCR反应体系：ddH₂O 31μL，5x HF buffer(含Mg²⁺)10μL；dNTP(2.5mM)2μL；AHSSP29-F和AHSSP29-R(5μM)各2μL；DMSO 0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因组模板2μL。

PCR反应条件：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火10sec，72℃50sec，30个循环；72℃后延伸10min。用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后，切取含目的条带的凝胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)回收PCR产物。将其回收产物与pEASY-Blunt simple载体(北京全式金公司)连接、热激法转化大肠杆菌DH5α(北京全式金公司)，将阳性克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序，经测序正确后，命名为pEASY-B-AHSSP29。

表1本发明用到的引物

划线部分是HindIII和BamHI识别位点

1.4AHSSP29启动子序列及顺式作用元件分析

将扩增到的启动子序列经PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析，AHSSP29启动子含有重要的RNA聚合酶结合位点TATAbox、CAATbox，以及种子特异启动子常有的RYREPEAT、2S2SSEEDPROTBANAPA和GCN4OSGLUB1等元件(表2)。这表明：AHSSP29启动子能调控下游基因在种子中特异表达。

表2AHSSP29顺式作用元件情况

1.5AHSSP29启动子的克隆及其驱动GUS报告基因表达载体的构建

用限制性内切酶HindIII和BamHI对pEASY-B-AHSSP29和植物表达载体pBI121分别进行双酶切反应，得到的片段经纯化后，在T4连接酶的作用下连接在一起，得到质粒pBI121-AHSSP29。此时，该载体中原来的烟草花叶病毒CaMV 35S启动子被AHSSP29启动子替代(AHSSP29::GUS)。

1.6农杆菌介导的拟南芥遗传转化、筛选及分子鉴定

利用热激法将构建好的质粒pBI121-AHSSP29转化到农杆菌GV3101，然后利用花絮侵染法转化拟南芥。收集农杆菌侵染后的拟南芥T₀代种子，在无菌超净工作台上操作，用70％酒精处理1min，2.6％次氯酸钠处理10min，再用无菌水冲洗4-5次，分散于含卡那霉素50μg mL^-1的MS培养基上。待T₁代卡那霉素抗性的拟南芥幼苗长出2片子叶后，选取绿色健康的幼苗移栽到蛭石中。待生长大约三周后，随机选取了10株正常生长的拟南芥，提取叶片DNA，以GUS-F和GUS-R为引物(表1)，对GUS基因进行PCR检测，筛选阳性转基因植株。

1.7GUS组织化学染色

配制GUS染色液(0.1M磷酸钠缓冲液；10mM EDTA；0.5mM铁氰化钾；0.5mM亚铁氰化钾；1mM X-Gluc；0.1％Triton X-100)；将试验材料在90％丙酮中(冰浴)固定15-20min；然后在染色液(不含X-Gluc)中漂洗3次；将材料置于GUS染色液中，37℃放置12-16h；先用70％酒精脱色半小时，再用100％酒精脱色；镜检照相。

将T₂代转基因纯合体拟南芥种植于MS培养基，GUS组织化学染色结果发现(图2)：转基因拟南芥成熟的种子(图2A)、以及萌发种子的子叶、下胚轴和胚根均能够被染上蓝色(图2B-C)；长出真叶后，子叶和下胚轴仍能被染色，而根及真叶不显示蓝色(图2D)；成年期转基因拟南芥的叶片、茎、花等不显示蓝色(图2E-F)。野生型拟南芥整个生长时期均不能显示蓝色。结果表明花生AHSSP29启动子可以驱动外源报告基因GUS在拟南芥种子特异表达，是个种子特异表达启动子。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 山东省花生研究所

<120> 一种花生种子特异表达启动子AHSSP29及其应用

<130> 2018

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2771

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtatcataga ttcagtcgtc gtcgttaaat attagttaaa acaagagcat gttgatataa 60

cttccaacga acacgtaaca ttaatcttat taaaccatat tttctgacaa tagaaattgt 120

atgtttcatt gatggtacta aataaataag ttattgttcg ataaaatacc ttgatgatat 180

gatattaaaa tttaaaattt ttatggctta attatttttt atttgttttt gttattaaaa 240

aaaccattag tttgaacatt taattgagac ggtcacaaaa atattcactg acccggtatt 300

cacaaaaacc aaacaagcct tataaatgta acaaaaaata attggtccat tgcattgtaa 360

tgctgtgttt gtgaatattt tttggtgggg ggaagggttt tggtcacaat gacgggtgga 420

agcccaatat gatattagag gattgttttg attaactgat agtagaaaat taatatgtac 480

ttcttggccc gaaccgctct tgagatagcc agtataagat tgggccaaca agcttgggcc 540

aataacaaaa tacttcttta aaatacaaaa agataaagcc caattattcc ctcaacgggt 600

ttagtcgttt aggttccgtt tggttagtgg gtggtaatac ataaaacata gtcataaaga 660

cataaaataa catagacaca ttaggacata aagtcttaaa cttgtttggt atttaagtac 720

atgaccttgt attcaaatta caattttaat aaaatgatac taataaccct accatcatta 780

tcacttctct atctctatca ccatcaccat tatgatgtta actcagatta tcactattaa 840

taatttttaa tgcaattata gattcaattc aacaaatcaa caaactaaca caaaatcact 900

ttaacaataa gattaatcaa aatttaaata ataaataaat aaaaaacaga gaactctctc 960

ctcaattatc ttcttctcat cttgcatgca aaaagcacga tctaattata atcacaaaca 1020

aaaaattgaa attgaaatta aaaacagata attattctca tcacataaaa aaacctcaaa 1080

gaacaagaaa gaaaaaaaca gcaaaataga ttaccatatg gtggaaaaga ggcagcgacg 1140

tgagagagag acggaggcag atctaaaaag agaggtgcga gtttgatttg gaaatgcctc 1200

aatatcaaac atggaaggaa gcctcaacaa cgacagtgag gcagagaacg gaggagacaa 1260

ccacggcgga ggcggcgtga caaaggaacg cgacagtggt tgcgacaacg tatgaaggaa 1320

gagatgacag tagtggtgac ggcgatggca gcgaagaagt gcaatggaga gagactgtgg 1380

ttaaatgaaa aaagagtagg agaagaagat gagagtgtat gatggaagga ggtgaatcag 1440

aaaaagagaa aggagaagat gagagggtaa ggaaaaaaag ataaaattgg aattaaaaaa 1500

aaaagaaggg ataagattag aaaagtttgt gtcttataat ttgtggttta gtgtcttagg 1560

ttaaaggaga gacactaaag acatatattt tatgtgtttc tgtgtgtcac cgtgtccatc 1620

gaaaatttat gtctaatgaa ccaaacggtg gacatgtacc actgtgtcca tctcttgatg 1680

gacatgtatg acaaaacaaa cactgcctta tattctgaaa aaatactctc tccgaacatc 1740

aaaagaaatt ctcggatacc aacgcaaatt agcacagata gatgagagtc tgtgtcactt 1800

aactaggact agaagtgagt cgagttgagt tgagttagat caaactcagg ctcggctcac 1860

aaaaattgag tttggctcac ggctcgactc attaataata gagtctattt tttaaactca 1920

agctcgactc attgaaagct cacgaactag ctcaaataat agaaacataa atacataatc 1980

tataattcta tatcaataaa ttataacata tatattttaa aaaatattta aaaagatcaa 2040

ttttatatat tgttatctat caataaatta taaatttttt atttatgtcc tacatcaaaa 2100

ttatatgtaa aaaataaata taaaatttta aataattaag atcatatata tatatatata 2160

atcgagtcag ctcacgagct aataagttga gcttatccaa actcaaattt ggctcattta 2220

atttatgaga ttaatttcaa attcaagctt gccttactag ctcacgagtt tagcttatca 2280

agctattaat gagtcgaact caagttagct cataaactgg cttgactcac ttccaaccct 2340

aaccttaacc atttctcttt agtttgatac tcgctaaaag ataaaaatga aacttgctta 2400

tttgagagaa ttacctactt tatctctgca gtatccaaaa aattagttat tgagtttcta 2460

agctaaagaa tatcctagta caaaaaaaaa aaaaattccc cggattacca aaattttcaa 2520

tgtaatatct gctctctctt ttatgttttt ccttttgtga tcatggtttc atagtgatct 2580

tgatcgagtc tgaatcccaa gtgtttggaa ttttgtggta tagacttgga caccttaata 2640

actggccatc tgtttaaata atgcacgtgt ctgaacaaaa ttacatgcag ttttcgaaaa 2700

ctactatata gagccacctt tccaatcttg ggaactcact tgtattcctt tcacctcctc 2760

cttttcttgt g 2771

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgcttact caagggtcaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctctcctcc ttctctgctt 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttggaatggg tcagaaggat gc 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtggtgcct cagtaagaag c 21

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttgtat catagattca gtcgtcgtcg 30

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggatcccaca agaaaaggag gaggtgaaag gaatac 36

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgacaaaaa ccacccaag 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctttcttgtt accgccaac 19

Claims (6)

1.一种花生种子特异表达启动子AHSSP29，其特征在于：其具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的花生种子特异表达启动子AHSSP29，其特征在于：扩增所述AHSSP29的引物AHSSP29-F和AHSSP29-R序列为：

AHSSP29-F：5’-AAGCTTGTATCATAGATTCAGTCGTCGTCG-3’；

AHSSP29-R：5’-GGATCCCACAAGAAAAGGAGGAGGTGAAAGGAATAC-3’。

3.根据权利要求2所述的一种花生种子特异表达启动子AHSSP29，其特征在于：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP29的PCR反应体系为：ddH₂O 31μL，含Mg2+的5x HF buffer 10μL；浓度为2.5mM的dNTP 2μL；浓度为5μM的AHSSP29-F和AHSSP29-R各2μL；DMSO 0.6μL；Phusion酶0.5μL；基因组模板2μL。

4.根据权利要求2所述的一种花生种子特异表达启动子AHSSP29，其特征在于：扩增所述花生种子特异启动子AHSSP29的PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃50s，30个循环；72℃后延伸10min。

5.根据权利要求1所述的一种花生种子特异表达启动子AHSSP29在驱动外源基因在植物种子中特异表达的应用。

6.根据权利要求5所述的一种花生种子特异启动子AHSSP29在驱动外源基因在拟南芥、花生、大豆、小麦、玉米、油菜、棉花、亚麻种子中特异表达的应用。