CN102242118B - 一种改良棉花的棉酚性状的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改良棉花的棉酚性状的方法及应用。通过在棉籽内特异性下调杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1的表达，可有效地抑制棉籽中的棉酚合成且不改变棉花其它组织的棉酚合成。本发明的方法改良了棉花植株中的棉酚性状，大大提高了棉花的综合利用价值。

Description

一种改良棉花的棉酚性状的方法及应用

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程领域；具体地说，本发明涉及特异降低棉花种子(棉籽)中的棉酚含量，而不影响棉花植株其他组织中的棉酚的方法和材料，以及由该方法获得的转基因棉花植物。

背景技术

棉酚是一种倍半萜醛衍生物，大量积累在棉株地上部分的腺体和根的表皮细胞里，且在棉籽中也有大量的积累。其作为棉花的一种植保素，在抗病抗虫反应中起重要作用。棉酚是一类具有普遍毒性的多酚类化合物，是一种危害细胞、血管及神经的有毒物质，严重影响棉子油和棉子饼的食用和饲料用价值。

棉花是集粮、棉、油、饲、药于一身的多用途作物，棉花生产的主要产品是棉纤维(皮棉)，约占籽棉重量的40％，轧花后留下的棉籽是棉花生产的主要副产品，每生产100公斤皮棉，就有约近200公斤棉籽产出。我国是世界上最大的棉花生产国，同时也是世界上最大的棉籽生产大国。棉籽饼粕是棉籽榨油后的主要副产品，其蛋白的含量约占33.21％～45.09％，富含硫胺素，磷含量在1.0％以上，钙则低于0.03％，是一种营养丰富的植物性蛋白；棉籽油脂含量高达18％～20％，是一种亚油酸含量极高的高级保健油；有效和合理利用棉仁，能大大提高人们的饮食质量和身体健康状况，而且棉籽的扩大利用和开发可以成为棉花生产增收的一项主要来源。但由于棉籽中含有较高含量的棉酚，这一宝贵资源至今未得到充分利用。根据棉酚的毒理与毒性效应，联合国粮农组织蛋白质机构规定：脱毒棉籽饼粕中的棉酚含量小于0.065％；世界卫生组织规定棉酚含量小于0.04％。在陆地棉棉籽中，一般游离棉酚占干仁重的0.85％左右，结合棉酚占0.15％左右。我国曾引进和培育了若干个低棉酚含量的棉花品种，但受到种植区域的影响和病虫害抗性低等原因不能大面积推广，因此我国目前主要种植的还是传统的有腺体棉花品种。棉籽榨油后，棉籽饼粕及棉仁粉的利用大多还只局限于用作反刍动物的粗饲料或有机肥料肥田，个别贫困地区的人们甚至还在危险食用。随着人们生活水平的提高和大量棉籽没有充分利用造成极大的浪费，高产和副产品利用的不协调等生产问题，制约了我国棉花生产的进一步发展。培育高产低酚棉花新品种是解决上述问题经济有效的途径。

综上所述，为了在不影响棉花植株抗虫抗病能力的前提下，降低棉籽棉酚含量，提高棉籽的综合利用价值，本领域迫切需要开发种子低酚、植株棉酚正常的转基因棉花新品种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的特异抑制棉花种子中棉酚合成途径、降低棉籽棉酚含量而不影响植株其他部分棉酚含量的方法。本发明的目的还在于提供所述转基因棉花材料的应用。

在本发明的第一方面，提供一种降低棉籽(棉花种子)中棉酚含量的方法，所述方法包括：在棉籽内特异性下调杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1(LP132)的表达，从而降低棉花种子中的棉酚含量。较佳地，不改变棉花其它组织的棉酚合成。

在一个优选例中，所述方法包括：

(1)提供一构建物，所述构建物依次含有以下结构(5’→3’)：种子(如棉籽)特异性启动子；Seq_正向-X-Seq_反向；

其中，Seq_正向为在导入棉花后形成特异性干扰(下调)杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B 1表达的分子的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

(2)将所述构建物转入棉花的细胞、组织、器官或种子，从而降低棉籽中的棉酚含量。

在另一优选例中，所述的种子特异性启动子是来源于双子叶植物的种子特异性启动子。

在另一优选例中，所述的种子特异性启动子是棉籽特异性启动子。

在另一优选例中，所述的种子特异性启动子是球蛋白αglobulin B的启动子(ProGlobulin)。

在另一优选例中，所述的种子特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在另一优选例中，所述的在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B 1表达的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在另一优选例中，所述的X的序列如SEQ ID NO：2所示。

在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

在另一优选例中，所述的启动子与Seq_正向-X-Seq_反向之间是操作性相连的。一般地，两者的间隔0-1000bp；较佳地0-500bp；更佳地0-200bp；如10bp，50bp，100bp。

在另一优选例中，所述Seq_正向-X-Seq_反向结构在转入植物细胞后，形成以下二级结构：

其中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在另一优选例中，所述的Seq_正向-X-Seq_反向结构可使得植物体内形成双链dsRNA。

在另一优选例中，所述的Seq_正向-X-Seq_反向结构的3’端，还包含一终止子。

在另一优选例中，步骤(2)包括：

(a)将所述的构建物转化农杆菌，获得携带所述构建物的农杆菌；和

(b)将棉花细胞或组织或器官与步骤(a)中的携带所述构建物的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入棉花细胞或组织或器官。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(c)选择出转入了所述的构建物的棉花细胞或组织或器官；和

(d)将步骤(c)中的棉花细胞或组织或器官再生成植物。

在本发明的另一方面，提供一种由上述方法获得的转基因棉花；或该转基因棉花的杂交后代。与野生型相比，所述的转基因棉花或其后代的种子中棉酚含量降低，而种子以外的其它组织中棉酚含量不变。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于降低棉籽中的棉酚含量。较佳地，用于导入棉花，形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子，从而降低棉籽中的棉酚含量。

在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述构建物依次含有以下结构(5’→3’)：种子特异性启动子；Seq_正向-X-Seq_反向；

其中，Seq_正向为在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_{正 向}和Seq_反向不互补。

在一个优选例中，所述的在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或

所述的种子特异性启动子是球蛋白αglobulin B的启动子(ProGlobulin)。

在本发明的另一方面，提供所述的构建物的用途，用于降低棉籽中的棉酚含量。较佳地，用于导入棉花，形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子，从而降低棉籽中的棉酚含量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、LP 132-1、RTM和ProGlobulin的序列。其中，

A：LP132-1的序列(SEQ ID NO：1)；

B：RTM的序列(SEQ ID NO：2)；

C：ProGlobulin的序列(SEQ ID NO：3)。

图2、dsRNA载体图谱和酶切位点。载体基本骨架为pCAMBIA2301，ProGlobulin插入位点为HindIII/BamHI，dsLP132-1的插入位点为BamHI/SacI，NOS终止子序列插入位点为SacI/EcoRI。

图3、PCR检测P1载体转化后部分T0代转基因棉花植株。R15：未转基因的棉花；P：质粒对照；P16，7，13：T0代不同转基因棉花。

图4、HPLC分析P1载体转化后部分T0代转基因棉花种子棉酚含量。R15：未转基因的棉花；P1-6，-12，-13，-14，-15；T0代不同转基因棉花的种子。

图5、HPLC检测T1代棉花种子和叶片中的棉酚类化合物含量。

A：有酚棉R15和P1-13-8种子的棉酚检测；

B：有酚棉R15和P1-13各株系种子棉酚含量统计；

C：HPLC检测R15和P1-13-8叶片中棉酚类化合物，Hemogossypolone：半棉酚酮；H1，H2，H3，H4：杀夜蛾素H1，H2，H3，H4；

D：R15和P1-13各植株叶片中棉酚类化合物总含量统计。

图6、间苯三酚法检测T1代转基因棉花种子中的棉酚含量。G：有酚棉R15种子的棉酚含量检测结果；GL：低酚棉种子的棉酚含量检测结果；13-8：转基因棉花株系P1-13-8种子的棉酚含量检测结果。

图7、RT-PCR检测棉花20天种子和叶片中CYP706B1的表达情况。

A：部分T0代转基因棉花种子中CYP706B1的表达水平；

B：20天种子中CYP706B1的表达；G：有酚棉种子；13-8：P1-13-8转基因棉花植株的种子；GL：低酚棉的种子；

C：叶片中CYP706B1的表达；G：有酚棉叶片；13-8：P1-13-8转基因棉花植株的叶片。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现通过在棉花种子内特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1(LP132)的表达，可有效地抑制棉花种子(棉籽)中的棉酚合成且不改变棉花其它组织的棉酚合成。本发明的方法在提高棉籽应用价值的同时，不影响棉花叶片和棉铃等组织的棉酚含量，保持棉花植株原有的抗病虫能力。因此，本发明的方法改良了棉花植株中的棉酚性状，大大提高了棉花的综合利用价值。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“改良棉花的棉酚性状”是指特异性地降低棉花种子(棉籽)中的棉酚含量，保持棉花其它组织(如棉铃等)的棉酚含量不变。

如本文所用，所述的“种子的棉酚含量低的棉花”是指一种转基因棉花或其后代，其在同样的生长条件下比野生型棉花的种子的棉酚含量低10％或更低(较佳地低20％或更低；更佳地低40％或更低；如低50％，60％，80％，100％，200％或更低)。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。

如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异性”又称“器官特异性”，在一些调控元件的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出其相关的发育调节的特性。本发明中，所述的“组织特异性表达”是指在棉花的种子(棉籽)中特异表达。通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000倍水平被表达，则认为相关基因的表达是组织或器官特异性的。

如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4、5、8、9个不匹配的核苷酸。如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG 3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT 3’)。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

如本文所用，除非另外说明，所述的“植物”是指棉花。

干扰杜松烯-8-羟化酶基因表达的分子

基于杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B 1的核苷酸序列，可以设计出在导入植物体后可形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因表达的分子的多核苷酸。设计时要考虑到特异性以及干扰的效率。

作为本发明的优选方式，提供一种分离的多核苷酸，其长度约400bp，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述的多核苷酸在导入植物体后可特异性的干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1的表达，与其它的核酸序列没有显著的同源性；并且经验证，其具有良好的干扰基因表达的效果。

此外，本发明还提供了在严格条件下能够与SEQ ID NO：1所限定的序列杂交且在导入植物体后能够形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因表达的分子的多核苷酸；或者，与SEQ ID NO：1所限定的序列有90％以上，较佳地95％，更佳地99％以上同源性且在导入植物体后能够形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因表达的分子的多核苷酸。

本发明对所述多核苷酸的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员可以以各种途径制备出所述的多核苷酸干扰分子。

构建物

为了特异性地下调棉花种子中的棉酚含量，本发明人作了广泛地研究，找到了适用的调控元件。

因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物依次含有以下结构(5’→3’)：棉花种子特异性启动子；Seq_正向-X-Seq_反向；其中，Seq_正向为在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

所述的构建物在导入到植物体内后，可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。也即，形成如下所示的二级结构：

其中，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间的基本上互补的关系。

所述的茎环结构可被植物体内的各种物质进一步作用、加工或剪切，并且形成双链RNA(dsRNA)。

所述的棉花种子特异性启动子优选的是ProGlobulin启动子。在该启动子的驱动下，所述构建物可特异地在棉花的种子内有效地形成dsRNA，发挥干扰的效果；而该启动子不能驱动载体在棉花其他组织中表达形成dsRNA，因此对于棉花种子以外的其它组织不发生影响。

通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。作为一种方式，制备转基因棉花的方法是：将携带所述启动子和多核苷酸(两者可操作地连接)的双元载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到棉花的染色体上。在本发明的具体实例中，所述的重组载体是pCAMBIA2301双元载体。球蛋白启动子ProGlobulin激活双链RNA在种子中特异的表达，通过植物体内的RNA干扰机制使组织中的CYP706B1表达被抑制，进而阻断棉酚的合成途径，使组织中棉酚含量降低。实验表明，P1载体的部分转基因棉花种子棉酚含量出现了显著降低，其中P1载体中P1-13-8植株种子的棉酚含量小于0.03％，符合低酚棉的标准。

本发明人的深入研究发现，所述的构建物在导入植物体内后，可有效地抑制植物种子中CYP706B1基因的表达，降低CYP706B1蛋白含量，进而抑制种子中的棉酚合成，降低棉籽棉酚含量，同时不影响棉花叶片和棉铃等组织的棉酚含量，保持原有的抗病虫能力。

改良棉花的棉酚性状的方法

本发明还提供了改良棉花的棉酚性状的方法，包括：在棉花种子内特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1(LP132)的表达，从而抑制棉花种子中的棉酚合成且不改变棉花其它组织的棉酚合成。

作为本发明特别优选的方式，所述方法包括：将所述的构建物转入棉花的细胞、组织、器官或种子，从而下调棉花种子中杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1的表达。

作为本发明特别优选的方式，采用农杆菌转化技术将所述的构建物转入棉花(特别是棉花的愈伤组织)中。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施以上的方法。

本发明还包括利用前述方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述构建物的的转基因植物；或者种子中杜松烯-8-羟化酶表达量降低(包括低表达或不表达)的植物等。

可以从这些转基因植物中选择种子中棉酚含量低的种子，用于培植棉花的后代(如杂交后代)，所述的棉花后代种子中棉酚含量低。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明首次公开了通过种子特异启动子驱动双链RNA载体，抑制棉籽中CYP706B1的表达，创制种子低酚、植株棉酚含量正常的转基因棉花的新方法。

(2)由于仅在种子中表达双链RNA，而植物叶片等其他组织中不含相关的双链RNA，因此植物其他组织中CYP706B1表达几乎不受影响，棉酚含量几乎没有变化。所述的转基因棉花由于植株中棉酚含量水平不变，对植物的抗虫和抗病性没有显著影响；种子中棉酚含量极低，可以直接用于食用或用作饲料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning：A laboratorymanual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、ProGlobulin和LP132-1片段获取

1.棉花的DNA提取

采用如下方法：取0.5克亚洲棉(G.arboreum)叶片，用液氮研磨至粉状，转移到8mL离心管中，加入5mL研磨缓冲液(1M葡萄糖，0.1M柠檬酸，5％Triton X-100(pH 5.0))，混匀。22℃、1000g离心10min，收集沉淀，重悬在研磨缓冲液中，再离心，重复三次，直至沉淀出现灰白色。5mL洗涤缓冲液(0.5M葡萄糖，0.05M柠檬酸(pH 5.0))洗涤沉淀，22℃、1000g离心10min，去除上清，重复2-4次直到沉淀呈现乳白色。加入5mL裂解缓冲液(1％SDS，1.4M NaCl，0.1M EDTA(pH 8.3))，60℃水浴中裂解15min。22℃、5000g离心10min，收集上清，加入2倍体积的无水乙醇，4℃、10,000g离心5min。弃上清，沉淀吹干，溶于2mL 0.1×SSC溶液，充分溶解后离心去除不溶物。补充NaCl至终浓度达到1M(约0.058g NaCl/mL 0.1×SSC(0.015M NaCl，0.015M柠檬酸钠))。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀，12,000rpm、4℃离心10min，取上清，重复抽提一次。上清中加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃静置10min，12,000rpm、4℃离心10min，沉淀溶于0.1×SSC。测定OD 260/280的比值，一般在1.8-2.0之间。DNA浓度(μg/mL)＝50×A260×稀释倍数。

2.通过PCR获得ProGlobulin片段

以棉花的基因组DNA为模板，用带有HindIII和BamHI酶切位点的引物对PG-F-HindIII和PG-R-BamHI通过高保真pfu酶扩增，启动子序列参考文献为Sunilkumar G，Connell JP，Smith CW，Reddy AS，Rathore KS，(2002)，Cottonalpha-globulin promoter：isolation and functional characterization in transgeniccotton，Arabidopsis，and tobacco，Transgenic Res.11(4)：347-359.反应液为：5μL10×缓冲液，2.5μL 10mM dNTP，2μL PG-F-HindIII，2μL PG-R-BamHI，2μL基因组DNA，1μL pfu酶，加水补充体积到50μL。PCR反应条件为94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环，72℃10min。收获PCR产物。

PG-F-HindIII：

5’-AAGCTTCTATTTTCATCCTATTTAGA-3’(SEQ ID NO：4)；

PG-R-BamHI：

5’-GGATCCGATTACGATAAGCTCTGTAT-3’(SEQ ID NO：5)。

3.棉花RNA提取

棉花材料用液氮研磨，每200mg材料加1ml 65℃预热的RNA提取液(0.2M Tris，pH 8.0，50mM EDTA，1M NaCl，1％CTAB和1％β-巯基乙醇)，65℃保温30分钟。加0.6ml氯仿抽提2次。上清加LiCl至终浓度2M。-20℃静置3小时，13000g离心10分钟。沉淀用70％乙醇洗一次，加水溶解，-20℃保存。

4.LP132-1片段获得

反转录使用RNA PCR Kit(Takara)。反应体系参考试剂盒说明书。20μl体系中加1μg棉花总RNA。42℃反应40分钟，合成第一链。

通过PCR获得LP132-1片段。以棉花cDNA为模板，用引物对1通过高保真pfu酶扩增相应片段。LP132序列信息参考文献为Luo P，Wang YH，Wang GD，Essenberg M，Chen XY.2001.Molecular cloning and functional identification of(+)-δ-cadinene-8-hydroxylase，a cytochrome P450monooxygenase(CYP706B 1)ofcotton sesquiterpene biosynthesis.Plant J.28(1)：95-104。反应液为：5μL 10×缓冲液，2.5μL 10mM dNTP，2μL引物F，2μL引物R，2μL cDNA，1μLpfu酶，加水补充体积到50μL。PCR反应条件为94℃4min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环，72℃10min。收获PCR产物。

引物对1：

LP132-F1：5’-TCAGCTCGTATTCATGGCTG-3’(SEQ ID NO：6)；

LP132-R1：5’-CAAATACAATATCATTGAGG-3’(SEQ ID NO：7)。

LP132-1和ProGlobulin的DNA序列分别见图1A(SEQ ID NO：1)、C(SEQID NO：3)。

实施例2、载体构建和农杆菌转化

1.载体构建

所需构建的dsRNA载体结构如图2中所示，包括一个种子特异启动子ProGlobulin，一个正向(即Sense，S)的基因片段，一个拟南芥RTM基因的内元(即Intron，约120bp，见图1B(SEQ ID NO：2))和一个反向的基因片段(即Antisense，AS)以及NOS终止子。其是通过用包含Sense-Intron-Antisense的序列插入到pCambia2301载体(购自Cambia公司)上的BamHI和SacI位点间而构建获得。

首先将拟南芥RTM基因(AT2G43730)的内元(约120bp)用含有XbaI和NotI的特异引物RTM+(5’-TCTAGAACGTTGTAAGTCTATTTTTG-3’(SEQ IDNO：8))和RTM-(5’-GCGGCCGCTCTGCTGGGTCCAAATCACA-3’(SEQ ID NO：9))通过高保真酶pfu进行PCR扩增，用XbaI和NotI限制性内切酶对PCR产物进行双酶切，克隆到pBSK(购自Clontech公司)的多克隆位点XbaI和NotI之间。

用含有NotI和SacI酶切位点的基因特异引物对1(LP 132-F1-SacI：5’-GAGCTCTCAGCTCGTATTCATGGCTG-3’(SEQ ID NO：10)和LP132-R1-NotI：5’-GCGGCCGCCAAATACAATATCATTGAGG-3’(SEQ ID NO：11))以LP132-1为模板，通过高保真酶pfu进行PCR扩增，克隆得到相应的片段，用NotI和SacI进行双酶切，分别插入到含有RTM内元的pBSK载体上的克隆位点(NotI/SacI)之间。

同时，用同样的方法用含有BamHI和XbaI酶切位点的基因特异引物对1(LP132-F1-BamHI：5’-GGATCCTCAGCTCGTATTCATGGCTG-3’(SEQ ID NO：12)和LP132-R1-XbaI：5’-TCTAGACAAATACAATATCATTGAGG-3’(SEQ IDNO：13))用高保真酶pfu进行PCR扩增，将获得的片段克隆到前述插入了反向(AS)LP132-1片段的pBSK的BamHI和XbaI之间。

将构建好的pBSK/dsLP132-1载体分别用BamHI和SacI进行双酶切，同时将pCAMBIA 2301载体用BamHI和SacI进行双酶切，分别将酶切下来的dsLP132-1片段插入到BamHI和SacI之间，命名为dsLP132-1/2301。

以ProGlobulin的PCR回收产物为模板，用引物对PG-F-HindIII和PG-R-BamHI，通过高保真酶pfu，通过PCR扩增得到球蛋白启动子ProGlobulin，用HindIII和BamHI进行双酶切，分别插入到dsLP132-1/2301载体的HindIII/BamHI位点，得到分别携带相应的目的片段的重组表达载体，称为ProGlobulin::dsLP132-1，简称为P1载体。

2.根癌农杆菌的转化

根癌农杆菌的转化采用冻融法。农杆菌菌株采用常用根癌农杆菌LBA4404(可参见US7321031)。前述构建的植物表达载体和50μl/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1分钟。在37℃水浴中5分钟使菌液融化，加1ml LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4小时。取50～100μl涂LB培养基平板(25mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和100mg/L链霉素)，2天后挑单菌落进行PCR鉴定。

实施例3、棉花转化以及转基因后代的筛选

采用农杆菌介导的方法转化棉花。含载体质粒P1或P2的农杆菌于添加卡那霉素50mg/L、利福平25mg/L、链霉素25mg/L的YEB细菌培养基上培养2～3天后，挑单菌落接种于含相同抗生素的YEB液体培养基中，于28℃、200rpm的摇床上悬浮培养过夜。菌液于4000rpm离心10min，沉淀用含葡萄糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS液体培养基重新悬浮，调OD₆₀₀值为0.4～0.6左右，作为感染液备用。

棉花R15(常规的陆地棉，来源于山西省农业科学院棉花研究所，参考上官小霞，李燕娥，梁运生，吴霞，杜春芳，张林水，GUS基因和NPT II基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用，棉花学报200719(3)))种子经常规消毒后置于1/2MS0(1/2MS盐+5g/L葡萄糖+7g/L琼脂粉，pH 6.0)培养基，在黑暗中萌发培养，5～7天后将无菌苗下胚轴切成1.0cm左右的切段作为转化外植体备用。

外植体在农杆菌菌液中浸泡感染15～20分钟，转移到共培养培养基MSB1(MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+0.1mg/L 2，4-D+2.2g/LGelrite，pH 6.0)上，22℃暗培养2天后，将外植体转移到培养基MSB2(MSB1+500mg/L头孢霉素+80mg/L卡那霉素)上进行愈伤组织的诱导。外植体经过抗性愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖及胚性愈伤的诱导(培养基MSB3：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+2.5g/L Gelrite，pH 6.0)、体细胞胚胎发生(培养基MSB4：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+1.0g/L天门冬酰氨胺+2.0g/L谷氨酰胺+3.0g/L Gelrite，pH 6.0；MS盐中KNO₃加倍，去除NH₄NO₃)，再生抗性试管苗。待试管苗长到3-4片真叶时，移栽到花盆中，放入人工气候室生长。

经过筛选，P1载体转化棉花获得了9个株系17株可以结种子的转基因棉花。

实施例4、转基因植物的分子生物学鉴定

在本实施例中，选取实施例3获得的转基因后代植株，采用PCR对转基因植株进行验证。由于pCAMBIA 2301载体自带GUS基因，因此检测GUS在植株中的存在情况即可获得鉴定结果。

DNA提取方法见实施例1。

PCR检测引物为GUS-F和GUS-R。序列为：

GUS-F：5’-CGTCCTGTAGAAACCCCAAC-3’(SEQ ID NO：14)

GUS-R：5’-CTGTCTGGCTTTTGGCTGTG-3’(SEQ ID NO：15)

PCR反应条件：94℃预变性5min；然后94℃预变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min，扩增片段大小约700bp。

P1载体转化棉花后部分T0代植株检测结果见图3。

实施例5、HPLC检测棉花种子和叶片中的棉酚含量

HPLC分析使用Agilent 1100系统，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18analytical column(150mm×4.6mm，5microm)反向C18分析柱。

棉籽液氮磨碎后每20mg加1ml棉籽提取液，叶片等其他材料用液氮磨碎后每100mg材料加1ml叶片提取液，浸泡1小时，离心，上清用0.22μm滤头过滤，进行HPLC检测。

HPLC检测条件：进样10μl，流动相流速1ml/min，柱温40℃，检测时间40min。

棉籽提取液：乙醇∶乙醚∶水∶醋酸＝59∶17∶24∶0.2。

叶片提取液：乙腈∶水∶磷酸＝80∶20∶0.1。

HPLC流动相：乙醇∶甲醇∶异丙醇∶乙腈∶水∶乙酸乙酯∶DMF∶磷酸＝16.7∶4.6∶12.1∶20.2∶37.4∶3.8∶5.1∶0.1。

分单株收获T0代转基因棉花种子。每株植物取5粒种子分别进行棉酚含量检测。同时分别检测5粒R15和低酚棉品种中棉所20(喻树迅，原日红，余学科，范术丽，黄祯茂，巩万奎，1999，低酚棉中棉所20遗传特异性与丰产性机理的研究，中国农业科学：32(5))的种子，作为对照。

在T0代转基因植物中，在P1载体转化的4株植物(4个株系)中检测到棉酚含量降低50％以上的种子，其中在P1-13植株中检测到一粒棉酚含量很低的种子。结果见图4。

将T0代棉籽播种，收获T1代植物的种子，进行棉酚含量检测。其中P1-13植株的后代P1-13-8植株的种子棉酚含量极低。结果见图5A和B。

对P1-13植株的T1代P1-13-8植株叶片进行棉酚类化合物的检测，发现这些化合物的种类和含量都没有显著变化。结果见图5C和D。

实施例6、间苯三酚法检测棉花种子中的棉酚含量

分单株收获T1代转基因棉花种子。每株植物取5粒种子分别进行棉酚含量检测。同时分别检测5粒R15和低酚棉的种子，作为对照。

取1粒种子，剥去外面的纤维和种皮，将果仁用液氮研磨成粉末状，称取20mg材料，加2ml 70％丙酮浸泡30分钟，4000rpm离心30s，取0.5ml上清，加0.5ml间苯三酚溶液(5g间苯三酚，80ml无水乙醇，20ml浓盐酸)，颠倒混匀，55℃反应5分钟。

部分转基因棉花种子提取物在间苯三酚染色反应中表现出颜色较浅，其中P1-13-8植株种子几乎没有颜色反应。结果见图6。

实施例7、RT-PCR检测棉花种子和叶片中的CYP706B1的表达水平

棉花组织RNA提取以及反转录合成cDNA参考实施例1。20μl PCR反应体系中加0.5μl反转录产物作为模板，扩增目的片段。以棉花histone 3gene(AF024716)作为内标。

采用引物对RT-LP132F(5’-TGACTGATCATGAGAAGCT-3’(SEQ ID NO：16))和RT-LP 132R(5’-GTGCTGGAGATTTGATGGT-3’(SEQ ID NO：17))，对T0代部分植株的种子进行CYP706B1表达水平检测，从图7A可以看到，CYP706B1转录本水平显著下调。

采用引物对RT-LP132F(5’-TGACTGATCATGAGAAGCT-3’(SEQ ID NO：18))和RT-LP 132R(5’-GTGCTGGAGATTTGATGGT-3’(SEQ ID NO：19))对T 1代P1-13-8的种子进行CYP706B1表达水平检测，从图7B可以看到，CYP706B1转录本水平显著下调。

检测了P1-13-8叶片中的CYP706B1表达水平，其转录本水平与对照相似，结果见图7C。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种改良棉花的棉酚性状的方法及应用

<130>100615

<160>19

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>408

<212>DNA

<213>亚洲棉

<400>1

tcagctcgta ttcatggctg ttgactgcta gcaaccagaa agatggaatg ttgttcccag    60

tagctttgtc atttttggta gccatattgg gaatttcact gtggcacgta tggaccataa    120

ggaagccaaa gaaagacatc gccccattac cgccgggtcc ccgtgggttg ccaatagtgg    180

gatatcttcc atatcttgga actgataatc ttcacttggt gtttacagat ttggctgcag    240

cttacggtcc catctacaag ctttggctag gaaacaaatt atgcgtagtc attagctcgg    300

caccactggc gaaagaagtg gttcgtgaca acgacatcac attttctgaa agggatcctc    360

ccgtttgtgc aaagattatt acctttggcc tcaatgatat tgtatttg                 408

<210>2

<211>128

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>2

acgttgtaag tctatttttg actcttcttt tttctccgtc acaatttcta cttccaacta    60

aaatgctaag aacatggtta taactttttt tttataactt aatatgtgat ttggacccag    120

cagataga                                                             128

<210>3

<211>1143

<212>DNA

<213>亚洲棉

<400>3

ctattttcat cctatttaga aatccaagtt gacacctaaa atttagttgg actgccatgt    60

aggattatcg ttagagagat aacggagctt aacggtagag tgatcacttt gtaacaaaat    120

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cctcgcctac ttgtttgttt ttaataaact aacatagtat aatatattgt taggattata    300

taaaattatt aataaatagt ataattaatt taaaatttat gaaaaataaa ttaccatatt    360

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attgaatcca aatccttact tttaagcgtt tttagtgaaa cattttattt tccattctta    480

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ccttccagtt acagatgcaa catgaacccc cctgcaacaa agtttgtccg aaccttgcta    900

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aagagacaat atttcgtctt ctttaatttg cacactcgtc atcttgcatg tcaatgtctt   1020

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<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>4

aagcttctat tttcatccta tttaga                                          26

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>5

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<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>6

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<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>7

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<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>8

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<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>引物

<400>9

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<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>10

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<210>11

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<212>DNA

<213>引物

<400>11

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<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>12

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<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>引物

<400>13

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<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>14

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<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>15

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<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>16

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<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>17

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<211>19

<212>DNA

<213>引物

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<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>19

gtgctggaga tttgatggt     19

Claims (9)

1.一种降低棉花的棉籽中棉酚含量的方法，其特征在于，所述方法包括：在棉籽内特异性下调杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1的表达，从而降低棉籽中的棉酚含量；

所述方法包括：

(1)提供一构建物，所述构建物按照5’→3’依次含有以下结构：种子特异性启动子；Seq_正向-X-Seq_反向；

其中，Seq_正向为在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

(2)将所述构建物转入棉花的细胞、组织、器官或种子，从而降低棉籽中的棉酚含量；

所述的在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子特异性启动子是球蛋白αglobulin B的启动子。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：

(a)将所述的构建物转化农杆菌，获得携带所述构建物的农杆菌；和

(b)将棉花细胞或组织或器官与步骤(a)中的携带所述构建物的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入棉花细胞或组织或器官。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

6.权利要求5的多核苷酸的用途，用于降低棉籽中的棉酚含量。

7.一种构建物，其特征在于，所述构建物按照5’→3’依次含有以下结构：种子特异性启动子；Seq_正向-X-Seq_反向-；

其中，Seq_正向的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，Seq_反向为与Seq_正向互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补。

8.如权利要求7所述的构建物，其特征在于，所述的种子特异性启动子是球蛋白αglobulin B的启动子。

9.权利要求7或8所述的构建物的用途，用于降低棉籽中的棉酚含量。

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