CN105638468A - 高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法及培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养及诱导技术领域，具体涉及一种高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法及培养基，培养基包括MSB培养基，2-(N-吗啡啉)乙磺酸0.5～1.5g/L，蔗糖20～30g/L，谷氨酰胺40～60mg/L，天冬酰胺40～60mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5～2mg/L，琼脂6～8g/L，pH值为5.6～5.8，将灭菌后的大豆种子4℃条件下静置培养14-18h后去除种皮，沿胚轴中线纵向切开上胚轴，得到带有3～5mm胚轴及顶端分生组织的大豆子叶节，然后接入培养基上，置于温室中培养20-25天，每个外植体最终可诱导出丛生芽20-40株左右，本发明在短时间内极大的提高了丛生芽的诱导率，为以子叶节为基础的高效扩繁体系及遗传转化体系研究提供重要的技术平台和支持。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养及诱导技术领域，具体涉及一种高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法及培养基。
背景技术
大豆原产我国，是目前世界上重要的油料作物及经济作物，并且是植物蛋白的重要来源。常规育种生产的大豆已不能满足社会需求，需要进行转基因遗传育种来生产高产具抗逆作用的大豆新品种。但大豆遗传转化技术一直属于植物基因工程领域的难点，受到多方面因素的限制，其中最主要的限制因素是大豆转化子叶节外植体的适当处理及之后丛生芽的快速大量诱导。如何提高大豆转化子叶节外植体的诱发速度并在短期内高效获取大量优良的丛生芽是技术瓶颈。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法及培养基，解决了现有技术中诱导大豆子叶节外植体时间长、出芽率低的问题，填补了技术空白，将该方法应用于相关的遗传转化研究和生产工作中，为转基因研究提供了重要的技术平台和支持。
本发明是这样实现的，根据本发明的一个方面，提供了一种高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的培养基，包括MSB基本培养基，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)0.5～1.5g/L，蔗糖20～30g/L，谷氨酰胺40～60mg/L，天冬酰胺40～60mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5～2mg/L，琼脂6～8g/L，pH值为5.6～5.8。
进一步地，培养基包括MSB基本培养基，2-(N-吗啡啉)乙磺酸1g/L，蔗糖25g/L，谷氨酰胺50mg/L，天冬酰胺50mg/L，6-苄氨基嘌呤1mg/L，琼脂6.5g/L，pH值为5.8。
根据本发明的另外一个方面，提供了高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法，包括如下步骤：
1)按照上述配方配置培养基；
2)大豆种子消毒灭菌及萌发，将大豆种子先用乙醇消毒5-10分钟，再用过氧化氢消毒15-30分钟，最后用灭菌水清洗3-5遍，之后再在大豆种子中加入灭菌水，放入4℃下静置培养至长出5-8mm胚轴；
3)大豆子叶节外植体的制备，将步骤2)中长出5-8mm胚轴的大豆种子剥去种皮，切去部分胚轴，留下带有3-5mm上胚轴的大豆种子，沿胚轴中线纵向切开上胚轴，得到带有3-5mm上胚轴和顶端分生组织的大豆子叶节，即得到大豆子叶节外植体；
4)丛生芽的诱导，将步骤3)中制备的大豆子叶节外植体接入步骤1)制备的培养基中，置于温室中培养，培养温度为24-26℃，湿度为50-70％，光照强度为1500-2000lux，光照时间为16h，7-10天后得到具有2-5株丛生芽的子叶节外植体；
5)大量丛生芽的诱导，将步骤4)中获得的长有2-5株丛生芽的子叶节外植体取出，切除大丛生芽，继续将其置于步骤1)中配置的培养基上并于温室中培养，培养温度为24-26℃，湿度为50-70％，光照强度为1500-2000lux，光照时间为16h，培养10-15天后获得具有20-40株丛生芽的子叶节外植体。
进一步地，步骤2)中乙醇的体积分数为70-80％。
进一步地，步骤2)中过氧化氢的体积分数为15-20％，并且用过氧化氢给种子消毒时，将种子置于25-28℃振荡培养箱中黑暗振荡，转速为100-200r/min。
进一步地，步骤2)中将大豆种子消毒灭菌后，再加入的灭菌水的量为刚没过大豆种子即可，将加有灭菌水的大豆种子培养14-18h，长出5-8mm胚轴。
进一步地，步骤4)中将大豆子叶节外植体插入所述培养基中的方式为斜插，子叶叶面朝上。
进一步地，步骤5)中切除的大丛生芽长度为2-4cm。
与现有技术相比，本发明的优点在于：将消毒灭菌后的大豆种子4℃静置培养，可在缩短萌发培养时间的同时减去萌发培养基的消耗；培养基各成分的配比及种子预处理，能够提供优良的可供遗传转化的外植体，经诱导后可诱导出大量优良健壮的丛生芽，且获得时间为20-25天，并且具有污染率低、丛生芽状态良好的优点，与现有技术诱导大豆丛生芽需要30-50天相比，本发明建立的大豆外植体快速高效诱导丛生芽体系能够极大的缩减大豆萌发时间及丛生芽的获得时间，为以大豆子叶节为转化外植体为基础的高效扩繁体系及遗传转化体系研究提供重要的技术平台和支持。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为利用本发明的方法制得的具有2-5株丛生芽的子叶节外植体；
图2为利用本发明的方法制得的具有20-40株丛生芽的子叶节外植体。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
为了解决现有技术中诱导大豆丛生芽外植体时间长、诱导率低的问题，本发明提供了一种高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法及培养基，以大豆子叶节为外植体，在20-25天培育出具有大量丛生芽的外植体。本发明所用材料、药品均为市售。
实施例1、
1)配置培养基，在1升蒸馏水中溶解MSB基本培养基，MES0.5g，蔗糖25g，谷氨酰胺50mg，天冬酰胺50mg，6-苄氨基嘌呤1.3mg，琼脂6.5g，加热完全溶解，调节培养基pH值为5.6～5.8之间，高压灭菌，待温度降低至60℃时倒平板，冷却备用，上述操作均在无菌状态下进行，其中MSB基本培养基的成分如下：
2)大豆种子消毒灭菌及萌发，在超净工作台里，将挑选出的优良大豆种子置于灭过菌的三角瓶中，加入体积分数70-80％乙醇消毒5-10分钟后，倒出乙醇沥干后再向大豆种子中加入体积分数15-20％的过氧化氢，置于25-28℃振荡培养箱中黑暗振荡消毒15-30分钟，转速为100-200r/min，然后用灭菌水清洗3-5遍，最后加入灭菌水没过种子，放入4℃冰箱静置培养过夜，培养时间为14-18h；
3)大豆子叶节外植体的制备，在超净工作台上，用镊子将已长出5～8mm胚轴的大豆种子取出置于灭菌培养皿中，剥去种皮，用解剖刀切去一部分胚轴，留3～5mm上胚轴，沿胚轴中线纵向切开上胚轴，得到带有3-5mm上胚轴和顶端分生组织的大豆子叶节，即得到大豆外植体，在子叶节顶端划伤即可直接用于遗传转化实验；
4)丛生芽的诱导，将步骤3)中制备的大豆子叶节外植体斜插接入步骤1)制备的培养基中，子叶叶面朝上，置于温室中培养，培养温度为24-26℃，湿度为50-70％，光照强度为1500-2000lux，光照时间为16h，7-10天后得到具有2-5株丛生芽的子叶节外植体，参考图1。
5)大量丛生芽的诱导，将步骤3)中长有2-5株丛生芽的子叶节外植体取出，切除长度为2-4cm的大丛生芽，继续将其置于步骤1)中配置的培养基中，并置于温室中，培养温度为24-26℃，湿度为50-70％，光照强度为1500-2000lux，光照时间为16h，培养10-15天后可获得具有20～40株丛生芽的子叶节外植体，参考图2。
实施例2、
与实施例1不同的地方在于，步骤1)中配置培养基时，在1升蒸馏水中溶解MSB基本培养基，MES0.7g，蔗糖28g，谷氨酰胺45mg，天冬酰胺45mg，6-苄氨基嘌呤1.4mg，琼脂7g，其他步骤与实施例1相同。
实施例3、
与实施例1不同的地方在于，步骤1)中配置培养基时，在1升蒸馏水中溶解MSB基本培养基，MES0.9g，蔗糖28g，谷氨酰胺50mg，天冬酰胺50mg，6-苄氨基嘌呤1.5mg，琼脂7.5g，其他步骤与实施例1相同。
实施例4、
与实施例1不同的地方在于，步骤1)中配置培养基时，在1升蒸馏水中溶解MSB基本培养基，MES1g，蔗糖30g，谷氨酰胺50mg，天冬酰胺50mg，6-苄氨基嘌呤1.6mg，琼脂8g，其他步骤与实施例1相同。
实施例5、
与实施例1不同的地方在于，步骤1)中配置培养基时，在1升蒸馏水中溶解MSB基本培养基，MES0.5g，蔗糖20g，谷氨酰胺40mg，天冬酰胺40mg，6-苄氨基嘌呤0.5mg，琼脂6g，其他步骤与实施例1相同。
实施例6、
与实施例1不同的地方在于，步骤1)中配置培养基时，在1升蒸馏水中溶解MSB基本培养基，MES1.5g，蔗糖30g，谷氨酰胺60mg，天冬酰胺60mg，6-苄氨基嘌呤2mg，琼脂8g，其他步骤与实施例1相同。
通过观察实施例2、实施例3、实施例4、实施例5和实施例6的结果，最终均得到了具有20～40株丛生芽的子叶节外植体。
Claims (8)
1.高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的培养基，其特征在于，所述培养基包括MSB基本培养基，2-(N-吗啡啉)乙磺酸0.5～1.5g/L，蔗糖20～30g/L，谷氨酰胺40～60mg/L，天冬酰胺40～60mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5～2mg/L，琼脂6～8g/L，pH值为5.6～5.8。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括MSB基本培养基，2-(N-吗啡啉)乙磺酸1g/L，蔗糖25g/L，谷氨酰胺50mg/L，天冬酰胺50mg/L，6-苄氨基嘌呤1mg/L，琼脂6.5g/L，pH值为5.8。
3.高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)按照权利要求1或2任一所述的配方配置培养基；
2)大豆种子消毒灭菌及萌发，将大豆种子先用乙醇消毒5-10分钟，再用过氧化氢消毒15-30分钟，最后用灭菌水清洗3-5遍，之后再在大豆种子中加入灭菌水，放入4℃下静置培养至长出5-8mm胚轴；
3)大豆子叶节外植体的制备，将步骤2)中长出5-8mm胚轴的大豆种子剥去种皮，切去部分胚轴，留下带有3-5mm上胚轴的大豆种子，沿胚轴中线纵向切开上胚轴，得到带有3-5mm上胚轴和顶端分生组织的大豆子叶节，即得到大豆子叶节外植体；
4)丛生芽的诱导，将步骤3)中制备的大豆子叶节外植体接入步骤1)制备的所述培养基中，置于温室中培养，培养温度为24-26℃，湿度为50-70％，光照强度为1500-2000lux，光照时间为16h，7-10天后得到具有2-5株丛生芽的子叶节外植体；
5)大量丛生芽的诱导，将步骤4)中获得的长有2-5株丛生芽的子叶节外植体取出，切除大丛生芽，继续将其置于步骤1)中配置的所述培养基上并于温室中培养，培养温度为24-26℃，湿度为50-70％，光照强度为1500-2000lux，光照时间为16h，培养10-15天后获得具有20-40株丛生芽的子叶节外植体。
4.根据权利要求3所述的高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法，其特征在于，步骤2)中乙醇的体积分数为70-80％。
5.根据权利要求3所述的高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法，其特征在于，步骤2)中过氧化氢的体积分数为15-20％，并且用过氧化氢给种子消毒时，将种子置于25-28℃振荡培养箱中黑暗振荡，转速为100-200r/min。
6.根据权利要求3所述的高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法，其特征在于，步骤2)中将大豆种子消毒灭菌后，再加入的灭菌水的量为刚没过大豆种子即可，将加有灭菌水的大豆种子培养14-18h，长出5-8mm胚轴。
7.根据权利要求3所述的高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法，其特征在于，步骤4)中将所述大豆子叶节外植体插入所述培养基中的方式为斜插，子叶叶面朝上。
8.根据权利要求3所述的高效诱导大豆子叶节外植体产生丛生芽的方法，其特征在于，步骤5)中切除的大丛生芽长度为2-4cm。
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