CN104782483B - 一种利用橡胶草须根诱导不定芽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用橡胶草须根诱导不定芽的方法，包括如下步骤：1)培养基的配制和消毒：所述培养基为MS培养基；并且在所述MS培养基中添加终浓度为20～30g/L的蔗糖、7～8g/L的琼脂粉、0.5～1.5mg/L的6‑BA和0.2～0.5mg/L的IAA；2)不定芽的接种和诱导：将橡胶草无菌苗的须根接种于培养基中进行不定芽诱导，每天光照14～18小时，光照强度2800～3200lux，温度为22‑25℃。本发明所述的方法培养基配方简单，成本低，操作简单，诱导率高，成苗质量好。

Description

一种利用橡胶草须根诱导不定芽的方法
技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，涉及一种以橡胶草的须根作为外植体高效诱导不定芽的方法。
背景技术
橡胶草又称俄罗斯蒲公英，其根部橡胶含量高，品质优良，具有适应性强、生长收获期短、适合机械化种植和采收、抗逆能力强以及生物相容性好、抗过敏性能强等诸多优点，是近年来备受关注的重要产胶作物。橡胶草自交不亲和，结实率低，杂种率较高，通过种子繁殖不利于优良品种的保存和繁殖，而且种子繁殖周期长，繁殖速度慢，难以满足商业化生产的要求。因此，橡胶草组织培养技术研发，尤其是适合商业化生产的组织培养技术，为进一步推动橡胶草的产业化发展具有重要的意义。
近年来，国内外学者对橡胶草组织培养技术开展了一些研究，已有的研究均以橡胶草的叶片作为外植体，诱导不定芽或者愈伤组织[林伯煌,魏小弟[J].热带农业工程,2009,33(4):1-3；罗成华,闫洁,祝建波[J].北方园艺,2012(07):115-119；陈菲,曲彦婷,李黎,等[J]国土与自然资源研究,2014,1:93-94；Uteulin K,Mukhambetzhanov S,Rakhimbaev I[J].International Journal of Biological,Veterinary,Agriculturaland Food Engineering,2014,8(4):373-375]，叶片作为外植体较容易取材，但是能够用于不定芽或者愈伤组织诱导的叶片仅限于分化能力较强的嫩叶，而一个植株上可获得具有良好分化能力的嫩叶尤其少，剪取幼嫩叶片后对植株损伤比较大，限制了组培苗的增值速度。与叶片相比，橡胶草的根系比较发达，除了主根外，还有大量的须根，无论是组培苗诱导生根还是常规栽培植株的根量均比较大，而且分生能力强，易于诱导，更适合用于作为组织培养的外植体。
现有的橡胶草组织培养技术均存在操作过程比较繁琐，诱导和继代需要转接不同培养基，成本高等缺点。因此，为了提高效率，降低成本并加快繁殖速度以适应商业化生产的要求，橡胶草组织培养研究的重点应该是简化繁殖过程，提高繁殖系数，优化再生植株的培养技术以获得生长健壮的组培苗。
发明内容
根据现有技术在橡胶草的组织培养方面存在操作过程繁琐，成本高的缺陷，本发明提供一种利用橡胶草的须根作为外植体高效诱导不定芽的方法，所述方法包括以下步骤：
1)培养基的配制和消毒：所述培养基为MS培养基；并且在所述MS培养基中添加浓度为20～30g/L的蔗糖、7～8g/L的琼脂粉、0.5～1.5mg/L的6-BA和0.2～0.5mg/L的IAA；
2)外植体的接种和诱导：将橡胶草无菌苗的须根接种于所述培养基进行不定芽诱导，每天光照14～18小时，光照强度2800～3200lux，温度22-25℃。
本发明中，所述的诱导培养基的pH经1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl溶液调整至6.0-7.0。选择这个PH值范围可提高不定芽的质量。
本发明中，所述蔗糖的添加浓度优选为20～25g/L，所述6-BA的添加浓度优选为1～1.5mg/L，所述IAA的添加浓度优选为0.4～0.5mg/L。选择这个范围的激素浓度范围能够进一步提高不定芽的分化效率。
本发明中，所述消毒的具体操作为所述培养基在121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟，组培瓶在121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌30分钟，于超净工作台内对灭菌的培养基进行分装，待凝固后用于接种。
本发明中，所述橡胶草的须根长度优选为1～2cm。
本发明中，所述培养条件优选为每天光照16小时，光照强度3000lux，温度为22-25℃。
进一步的，本发明的培养方法具有如下的优选方案，其步骤为：
1)配制诱导培养基：配制MS培养基、在其中添加蔗糖20g/L、琼脂粉7g/L以及1.5mg/L 6-BA和0.4mg/L IAA；配置后，将pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟，组培瓶在温度121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌30分钟，对灭菌的培养基进行分装，待凝固后用于接种；
2)外植体的接种和诱导：选取橡胶草无菌苗的须根，切成1-2cm长的根段接种于所述凝固后的培养基进行不定芽诱导，在每天16小时光照，光照强度3000lux，温度为22-25℃的条件下进行培养。
本发明所述的诱导方法可以应用于所有品种的橡胶草，优选为美国农业部引进的种质编号为W635178的品种。
相对于现有技术，本发明具有以下特点：
1)以橡胶草的须根作为外植体容易大量获得，对原植株损伤小，诱导启动快，接种后10天左右开始分化，25天左右即可获得生长健壮的不定芽。
2)诱导不定芽的频率高，平均每1-2cm长的根段可产生约20个不定芽，诱导率100％。
3)诱导培养基简单，在MS基础培养基的基础上只添加了6-BA和IAA两种特殊成分，降低了成本。
4)诱导过程没有褐化、玻璃化和白化苗产生，得到的不定芽生长健壮。
5)无需转接其他培养基进行继代，只经过一步诱导获得的不定芽即可进行生根，提高生产效率。
6)培养过程简单，减少了污染。
7)培养基配方简单，成本低，操作简单，诱导率高，成苗质量好，可工厂化生产。
附图说明
图1为接种根段培养10天后的生长情况图；
图2为接种根段培养25天后的生长情况图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的化学试剂均为市售。实施例中使用的橡胶草是美国农业部引进的种质编号为W635178的品种。
实施例1
本实施例涉及一种橡胶草须根诱导不定芽的方法，具体步骤如下：
1)培养基的配制和消毒：配制1L MS培养基、在其中添加蔗糖20g/L、琼脂粉7g/L以及1.5mg/L 6-BA和0.4mg/L IAA。配置后，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl溶液将pH调整至6.0-7.0，在121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌15分钟，组培瓶在121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌30分钟，于超净工作台内对灭菌的培养基进行分装，每瓶大约30mL，待凝固后用于接种。
2)外植体的接种和诱导：选取橡胶草无菌苗的须根，切成1-2cm长的根段接种于诱导培养基进行不定芽诱导，每天16小时光照，光照强度3000lux，温度为22-25℃，接种的根段培养10天后变绿并开始分化(参看图1)，经过25天左右培养即可获得大量的不定芽(参看图2)，期间无需转接其他培养基，平均每1-2cm长的根段可获得20个不定芽，诱导率100％，没有褐化、玻璃化和白化苗发生，不定芽生长健壮，无需继代和壮苗，可直接用于生根。
实施例2
本实施例涉及一种橡胶草须根诱导不定芽的方法，具体步骤如下：
1)培养基的配制和消毒：配制1L MS培养基、在其中添加蔗糖25g/L、琼脂粉8g/L以及0.5mg/L 6-BA和0.2mg/L IAA。配置后，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl溶液将pH调整至6.0-7.0，在121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌15分钟，组培瓶在121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌30分钟，于超净工作台内对灭菌的培养基进行分装，每瓶大约30mL，待凝固后用于接种。
2)外植体的接种和诱导：选取橡胶草无菌苗的须根，切成1-2cm长的根段接种于诱导培养基进行不定芽诱导，每天14小时光照，光照强度2800lux，温度为22-25℃，接种的根段培养12天后变绿并开始分化，经过28天左右培养即可获得大量的不定芽，期间无需转接其他培养基，平均每1-2cm长的根段可获得15个不定芽，诱导率100％，没有褐化、玻璃化和白化苗发生，不定芽生长健壮，无需继代和壮苗，可直接用于生根。
实施例3
本实施例涉及一种橡胶草须根诱导不定芽的方法，具体步骤如下：
1)培养基的配制和消毒：配制1L MS培养基、在其中添加蔗糖30g/L、琼脂粉8g/L以及1mg/L 6-BA和0.5mg/L IAA。配置后，用1.0mol/L NaOH和1.0mol/L HCl溶液将pH调整至6.0-7.0，在121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌15分钟，组培瓶经在121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌30分钟，于超净工作台内对灭菌的培养基进行分装，每瓶大约30mL，待凝固后用于接种。
2)外植体的接种和诱导：选取橡胶草无菌苗的须根，切成1-2cm长的根段接种于诱导培养基进行不定芽诱导，每天18小时光照，光照强度3200lux，温度为22-25℃，接种的根段培养8天后变绿并开始分化，经过23天左右培养即可获得大量的不定芽，期间无需转接其他培养基，平均每1-2cm长的根段可获得18个不定芽，诱导率100％，没有褐化、玻璃化和白化苗发生，不定芽生长健壮，无需继代和壮苗，可直接用于生根。
对比例1
同实施例1相比，其区别在于，诱导培养基中不添加IAA，结果须根的诱导率只有23％，而且分化的不定芽白化比较严重。
对比例2
同实施例1相比，其区别在于，诱导培养基中的IAA替换成0.4mg/L NAA，结果须根的诱导率只有11％，而且大部分是白化苗。
对比例3
同实施例1相比，其区别在于，诱导培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，结果须根的诱导率只有37％，而且分化的不定芽玻璃化很严重。
使用本发明所述的培养基和方法对橡胶草进行不定芽诱导，一方面可以实现须根100％诱导成芽；另一方面本方法步骤简单，节约成本和时间，适于大范围推广。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种利用橡胶草须根诱导不定芽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)培养基的配制和消毒：所述培养基为MS培养基中添加浓度为20～30g/L的蔗糖、7～8g/L的琼脂粉、0.5～1.5mg/L的6-BA和0.2～0.5mg/L的IAA；
2)外植体的接种和诱导：将橡胶草无菌苗的须根接种于所述培养基进行不定芽诱导，每天光照14～18小时，光照强度2800～3200lux，温度22-25℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述培养基的pH调节为6.0～7.0。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蔗糖的添加浓度为20～25g/L，所述6-BA的添加浓度为1～1.5mg/L，所述IAA的添加浓度为0.4～0.5mg/L。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述消毒的具体操作为所述培养基在121±2℃，蒸气压力103.4kPa下灭菌15分钟，组培瓶在121±2℃，蒸气压力103.4kPa下灭菌30分钟。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将所述橡胶草无菌苗的须根剪切至长度为1～2cm。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，培养条件为每天光照16小时，光照强度3000lux，温度为22-25℃。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)配制诱导培养基：配制MS培养基、在其中添加蔗糖20g/L、琼脂粉7g/L以及1.5mg/L6-BA和0.4mg/L IAA；配置后，将pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟，组培瓶在温度121±2℃，蒸气压力103.4kPa的条件下灭菌30分钟，对灭菌的培养基进行分装，待凝固后用于接种；
2)外植体的接种和诱导：选取橡胶草无菌苗的须根，切成1-2cm长的根段接种于所述凝固后的培养基中进行不定芽诱导，在每天16小时光照，光照强度3000lux，温度为22-25℃的条件下进行培养。
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