CN105052740B - 一种利用橡胶草叶片再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用橡胶草叶片再生植株的方法，其步骤为将经过预处理的橡胶草叶片依次进行愈伤组织诱导、愈伤组织继代培养、不定芽诱导和生根培养。利用本发明所述的诱导方法，繁殖系数高，且没有褐化和白化苗发生，再生植株健壮，根系发达，移植成活率高，可在短时间内获得大量的再生植株。

Description

一种利用橡胶草叶片再生植株的方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程领域，具体涉及一种利用橡胶草叶片再生植株的方法。

背景技术

橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)又名俄罗斯蒲公英(Russiandandelion)，为菊科蒲公英属的一种多年生草本植物，原产于哈萨克斯坦、欧洲以及中国新疆等地。橡胶草根部含有高品质的橡胶，含量可达20％以上(多年生的干重)，在工业上的利用价值不次于巴西橡胶树橡胶，而且橡胶草具有生长周期短、适应性强、适合机械化种植和采收等优点，使其成为具有发展前途的巴西橡胶树橡胶替代作物。除了橡胶之外，橡胶草的根、叶中还可以提取菊糖，提胶后的残渣可以加工酒精、沼气，并且具有一定药用价值。在原材料、能源日趋紧张的今天，橡胶草作为科研材料、工业原料和生物能源等方面均具有较大的优势。但橡胶草自交不亲和，自花授粉结实率很低，杂种率高，通过种子繁殖不利于优良品种的保存和繁殖，而且种子繁殖周期长，繁殖效率低，难以满足产业化的要求。尤其对于野外采集的珍稀材料，种子采集受季节的限制很大，叶片和根相对比较容易获得，因此，高效、成熟的橡胶草组织培养技术为珍稀材料的保存与繁殖以及推动橡胶草产业化具有十分重要的意义。

以橡胶草叶片作为外植体，诱导不定芽或者愈伤组织的研究已有报道[林伯煌,魏小弟[J].热带农业工程,2009,33(4):1-3；罗成华,闫洁,祝建波[J].北方园艺,2012(07):115-119；陈菲,曲彦婷,李黎,等[J]国土与自然资源研究,2014,1:93-94；Uteulin K,Mukhambetzhanov S,Rakhimbaev I[J].International Journal of Biological,Veterinary,Agricultural and Food Engineering,2014,8(4):373-375]。但由于橡胶草具有自交不亲和的繁殖特点，造成其品系混杂比较严重，不同品系之间的组织培养条件和方法存在差异，现有方法中关于橡胶草叶片诱导愈伤组织及其再生植株的方法不系统，诱导效率不高，诱导效果不够理想。

发明内容

(一)要解决的技术问题

针对现有技术中橡胶草的叶片诱导愈伤组织及再生植株的方法诱导效果不理想的缺陷，本发明提供一种利用橡胶草叶片再生植株的方法。

(二)技术方案

本发明所述的方法，包括如下步骤：

1)将预处理后的橡胶草叶片接种到愈伤诱导培养基中进行培养，至诱导出愈伤组织，所述愈伤诱导培养基的组成包括：MS+1.8～2.2mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L NAA或IAA；

2)将所述愈伤组织转移到继代培养基中进行培养，得到大量生长状况良好的愈伤组织，所述继代培养基的物质组成包括：MS+1.3～1.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L NAA或IAA；

3)将所述生长状况良好的愈伤组织接种到不定芽培养基上进行培养，至长出不定芽，所述不定芽培养基的物质组成包括：MS+0.8～1.2mg/L 6-BA；

4)将所述不定芽转接至生根培养基中诱导生根，所述生根培养基的组成包括：1/2MS+0.3～0.5mg/L NAA或IAA；

5)将生根后的苗在室温下炼苗后，移至培养基质中培养，得到橡胶草再生植株。本发明中，通过对各培养基中激素种类的选择，进一步对激素浓度进行调整，得到了适于橡胶草叶片再生植株的培养基。

所述愈伤诱导培养中和继代培养中的培养条件为：培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时。

所述不定芽诱导过程和生根过程中的培养条件为：培养温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，每天光照16小时。

对所述橡胶草的叶片进行表面清洗和消毒的步骤为：取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将所述叶片浸入70％酒精中，表面消毒1～2min，然后用无菌水洗2-3遍，之后浸于15％的双氧水中表面消毒6～8min，最后用无菌水冲洗5-6遍，然后将表面的水吸干。

所述步骤5)中，具体操作为：根长至8-10cm时，将橡胶草幼苗移至室温炼苗3～5天；然后将所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的混合培养基质中，并在80％～95％的空气湿度和25±2℃的环境中对橡胶草培养两周；最后移至正常的光照和温度条件下进行培养。

所述愈伤诱导培养基中还包括蔗糖25～35g/L，琼脂6～8g/L；所述继代培养基中还包括蔗糖25～30g/L，琼脂6～7g/L；所述不定芽诱导培养基中还包括蔗糖15～25g/L，琼脂5～7g/L；所述生根培养基中还包括蔗糖10～20g/L，琼脂5～7g/L；所述培养基的pH均为6.0～7.0。

本发明所述的愈伤组织的诱导和植株的培养方法，优选包括如下步骤：

1)取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将所述叶片浸入70％酒精中，表面消毒1～2min，然后用无菌水洗2-3遍，之后浸于15％的双氧水中表面消毒6～8min，然后用无菌水冲洗5-6遍，将叶片表面的水吸干，得备用材料；

2)将所述备用材料接种到愈伤诱导培养基中，至诱导出愈伤组织；所述愈伤诱导培养过程中，培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时；所述的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

3)将所述愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基上进行继代，继代培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时；所述的愈伤组织继代培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

4)愈伤组织增殖至所需数量时，将愈伤组织转接至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，培养温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，每天光照16小时；所述的不定芽诱导培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA，并添加蔗糖20g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

5)不定芽长至3-5cm时，将不定芽切下并转接至生根培养基中诱导生根，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时；所述的生根培养基为：1/2MS+0.4mg/L IAA，并添加蔗糖15g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

6)根长至8-10cm时，将橡胶草幼苗移至室温炼苗3～5天；然后将所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的体积比为4：1的混合培养基质中，并在80％～95％的空气湿度和25±2℃的环境中对橡胶草培养两周；最后移至正常的光照和温度条件下进行培养。

(三)有益效果

上述利用橡胶草叶片再生植株的方法，繁殖系数高，没有褐化和白化苗发生，再生植株生长健壮，根系发达，移植成活率高，可在短时间内获得大量的再生植株。

本发明为橡胶草大规模无性繁殖提供一种效率高、周期较短、繁殖系数高的方法，为橡胶草分子育种奠定基础。

附图说明

图1是转接至愈伤诱导培养基的叶片外植体；

图2是诱导分化的愈伤组织；

图3是由愈伤组织诱导分化的不定芽；

图4是不定芽诱导生根的情况；

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例涉及一种利用橡胶草叶片再生植物的方法，其具体步骤如下：

1)取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将清洗干净的叶片转移至超净工作台内并置于无菌的培养瓶中，加入70％酒精进行表面消毒1min，然后用无菌水洗2-3遍，之后换至一个无菌的培养瓶中，加入15％的双氧水消毒7min，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将叶片置于放有滤纸的平皿里将表面的水吸干，备用；

2)将叶片切成大约1-2cm²大小的外植体接种到愈伤诱导培养基中(参看图1)，培养温度为23±2℃，光照光强为2000-2500Lux，每天光照12小时。所述的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。外植体接入愈伤诱导培养基后15天开始启动，第25-30天的时候诱导出的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈，呈淡黄绿色，结构酥松(参看图2)；

3)将愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基上进行继代，继代培养温度为23±2℃，光照光强为2000-2500Lux，每天光照12小时。所述的愈伤组织继代培养基为：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

4)愈伤组织增殖至所需数量时，将愈伤组织转接至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时。所述的不定芽诱导培养基为：MS+1.0mg/L 6-BA，并添加蔗糖20g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

5)不定芽长至3-5cm时，一般需要15-20天(参看图3)，将不定芽切下并转接至生根培养基中诱导生根，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时。所述的生根培养基为：1/2MS+0.4mg/L IAA，并添加蔗糖15g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

6)不定芽转接生根培养基后20-25天，根可长至8-10cm(参看图4)，这时将生根后的苗连同培养瓶从培养箱中移至室温炼苗3天，然后将苗从培养基中取出，洗净根部培养基，移栽至穴盘中，基质为泥炭土：蛭石＝4:1，穴盘上方用带薄膜的罩子覆盖并保持80％空气湿度和25±2℃的温度条件，两周后去除罩子，逐步进行正常水肥管理。

根据以上方法，从离体叶片诱导愈伤组织的诱导率为96.3％(成功诱导出愈伤的叶片数占接种叶片总数的比例)，不定芽的诱导率为97.2％(能够分化出不定芽的愈伤数占转接愈伤总数的比例)，诱导生根的效率超过99％(能够成功诱导出根的不定芽数占转接不定芽总数的比例)，可以使植株在短时间内得到大量地增殖。

实施例2

本实施例涉及一种利用橡胶草叶片再生植株的方法，其具体步骤如下：

1)取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将清洗干净的叶片转移至超净工作台内并置于无菌的培养瓶中，加入70％酒精进行表面消毒1min，然后用无菌水洗2-3遍，之后换至一个无菌的培养瓶中，加入15％的双氧水消毒7min，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将叶片置于放有滤纸的平皿里将表面的水吸干，备用。

2)将叶片切成大约1～2cm²大小的外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养温度为23±2℃，光照光强为2000-2500Lux，每天光照12小时。所述的愈伤诱导培养基为：MS+1.8mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA，并添加蔗糖25g/L，琼脂6g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。外植体接入愈伤诱导培养基后15天开始启动，第25-30天的时候诱导出的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈，呈淡黄绿色，结构酥松。

3)将愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基上进行继代，继代培养温度为23±2℃，光照光强为2000-2500Lux，每天光照12小时。所述的愈伤组织继代培养基为：MS+1.3mg/L6-BA+0.1mg/L NAA，并添加蔗糖25g/L，琼脂6g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

4)愈伤组织增殖至所需数量时，可将愈伤组织转接至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时。所述的不定芽诱导培养基为：MS+0.8mg/L 6-BA，并添加蔗糖15g/L，琼脂5g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

5)不定芽长至3-5cm时，一般需要15-20天，将不定芽切下并转接至生根培养基中诱导生根，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时。所述的生根培养基为：1/2MS+0.3mg/L NAA，并添加蔗糖10g/L，琼脂5g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

6)不定芽转接生根培养基后20-25天，根可长至8-10cm，这时将生根后的苗连同培养瓶从培养箱中移至室温炼苗3天，然后将苗从培养基中取出，洗净根部培养基，移栽至穴盘中，基质为泥炭土：蛭石＝4:1，穴盘上方用带薄膜的罩子覆盖并保持90％的空气湿度和25±2℃的温度条件，两周后去除罩子，逐步进行正常水肥管理。

根据以上方法，从离体叶片诱导愈伤组织的诱导率为95.8％，不定芽的诱导率为97.6％，诱导生根的效率超过99％，可以使植株在短时间内得到大量地增殖。

实施例3

本实施例涉及一种利用橡胶草叶片再生植株的方法，其具体步骤如下：

1)取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将清洗干净的叶片转移至超净工作台内并置于无菌的培养瓶中，加入70％酒精进行表面消毒1min，然后用无菌水洗2-3遍，之后换至一个无菌的培养瓶中，加入15％的双氧水消毒7min，然后用无菌水冲洗5-6遍，清洗完毕后将叶片置于放有滤纸的平皿里将表面的水吸干，备用；

2)将叶片切成大约1-2cm²大小的外植体接种到愈伤诱导培养基中，培养温度为23±2℃，光照光强为2000-2500Lux，每天光照12小时。所述的愈伤诱导培养基为：MS+2.2mg/L6-BA+0.6mg/L IAA，并添加蔗糖35g/L，琼脂8g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。外植体接入愈伤诱导培养基后15天开始启动，第25-30天的时候诱导出的愈伤组织已经在材料与培养基接触的外围长满了厚实的一圈，呈淡黄绿色，结构酥松；

3)将愈伤组织切转接到愈伤组织继代培养基上进行继代，继代培养温度为23±2℃，光照光强为2000-2500Lux，每天光照12小时。所述的愈伤组织继代培养基为：MS+1.7mg/L 6-BA+0.3mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

4)愈伤组织增殖至所需数量时，将愈伤组织转接至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时。所述的不定芽诱导培养基为：MS+1.2mg/L 6-BA，并添加蔗糖25g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

5)不定芽长至3-5cm时，一般需要15-20天，将不定芽切下并转接至生根培养基中诱导生根，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时。所述的生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L IAA，并添加蔗糖20g/L，琼脂6g/L，pH调整至6.0-7.0，121±2℃，蒸气压力103.4kPa灭菌15分钟。

6)不定芽转接生根培养基后20-25天，根可长至8-10cm，这时将生根后的苗连同培养瓶从培养箱中移至室温炼苗3天，然后将苗从培养基中取出，洗净根部培养基，移栽至穴盘中，基质为泥炭土：蛭石＝4:1，穴盘上方用带薄膜的罩子覆盖并保持95％空气湿度和25±2℃的温度条件，两周后去除罩子，逐步进行正常水肥管理。

根据以上方法，从离体叶片诱导愈伤组织的诱导率为96.3％，不定芽的诱导率为98.2％，诱导生根的效率超过99％，可以使植株在短时间内得到大量地增殖。

对比例1

同实施例2相比，其区别在于，所述愈伤诱导培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA，所得愈伤组织的诱导率仅为27.8％。

对比例2

同实施例1相比，其区别在于，所述不定芽诱导培养基为MS+2.0mg/L 6-BA，不定芽的诱导率为63.2％，但不定芽玻璃化严重，不定芽长势不好，诱导生根的频率下降，诱导生根的效率为46.5％。

对比例3

同实施例1相比，其区别在于，所述生根培养基为1/2MS+1.0mg/L IAA，诱导生根的效率为100％，但形成的是畸形根，呈瘤状，非常脆极易折断，且移栽时绝大部分的根在清洗根部培养基的过程中折断，植株玻璃化严重，移栽成活率不足30％。

由以上对比例可看出，在选择本发明所述培养基的基础上，只有各激素的浓度在本发明所述的范围内才可取得良好的诱导效果，而且本发明所述的方法中不定芽生长健壮，无需继代培养，因此诱导周期较短，效率高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种利用橡胶草叶片再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将预处理后的橡胶草叶片接种到愈伤诱导培养基中进行培养，至诱导出愈伤组织，所述愈伤诱导培养基的组成包括：MS+1.8～2.2mg/L 6-BA+0.4～0.6mg/L NAA或IAA；

2)将所述愈伤组织转移到继代培养基中进行培养，得到大量生长状况良好的愈伤组织，所述继代培养基的物质组成包括：MS+1.3～1.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L NAA或IAA；

3)将所述生长状况良好的愈伤组织接种到不定芽培养基上进行培养，至长出不定芽，所述不定芽培养基的物质组成包括：MS+0.8～1.2mg/L 6-BA；

4)将所述不定芽转接至生根培养基中诱导生根，所述生根培养基的组成包括：1/2MS+0.3～0.5mg/L NAA或IAA；

5)将生根后的苗在室温下炼苗后，移至培养基质中培养，得到橡胶草再生植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养中和继代培养中的培养条件为：培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述不定芽诱导过程中和生根培养过程中的培养条件为：培养温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，每天光照16小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述橡胶草的叶片进行预处理的步骤为：取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将所述叶片浸入70％酒精中，表面消毒1～2min，然后用无菌水洗2-3遍，之后浸于15％的双氧水中表面消毒6～8min，最后用无菌水冲洗5-6遍，然后将表面的水吸干。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，具体操作为：根长至8-10cm时，将橡胶草幼苗移至室温炼苗3～5天；然后将所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的混合培养基质中，并在80％～95％的空气湿度和25±2℃的环境中对橡胶草培养两周；最后移至正常的光照和温度条件下进行培养。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基中还包括蔗糖25～35g/L，琼脂6～8g/L；所述继代培养基中还包括蔗糖25～30g/L，琼脂6～7g/L；所述不定芽诱导培养基中还包括蔗糖15～25g/L，琼脂5～7g/L；所述生根培养基中还包括蔗糖10～20g/L，琼脂5～7g/L；所述培养基的pH均为6.0～7.0。

7.根据权利要求3所述的利用橡胶草叶片再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将所述叶片浸入70％酒精中，表面消毒1～2min，然后用无菌水洗2-3遍，之后浸于15％的双氧水中表面消毒6～8min，然后用无菌水冲洗5-6遍，将叶片表面的水吸干，得备用材料；

2)将所述备用材料接种到愈伤诱导培养基中，至诱导出愈伤组织；所述愈伤诱导培养过程中，培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时；所述的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

3)将所述愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基上进行继代，继代培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时；所述的愈伤组织继代培养基为：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

4)愈伤组织增殖至所需数量时，将愈伤组织转接至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，培养温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，每天光照16小时；所述的不定芽诱导培养基为：MS+1.0mg/L6-BA，并添加蔗糖20g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

5)不定芽长至3-5cm时，将不定芽切下并转接至生根培养基中诱导生根，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时；所述的生根培养基为：1/2MS+0.4mg/LIAA，并添加蔗糖15g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

6)根长至8-10cm时，将橡胶草幼苗移至室温炼苗3～5天；然后将所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的体积比为4：1的混合培养基质中，并在80％～95％的空气湿度和25±2℃的环境中对橡胶草培养两周；最后移至正常的光照和温度条件下进行培养。

8.根据权利要求1、2、4、5或6任一项所述的利用橡胶草叶片再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取幼嫩的橡胶草叶片，用自来水将表面清洗干净，将所述叶片浸入70％酒精中，表面消毒1～2min，然后用无菌水洗2-3遍，之后浸于15％的双氧水中表面消毒6～8min，然后用无菌水冲洗5-6遍，将叶片表面的水吸干，得备用材料；

2)将所述备用材料接种到愈伤诱导培养基中，至诱导出愈伤组织；所述愈伤诱导培养过程中，培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时；所述的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

3)将所述愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基上进行继代，继代培养温度为23±2℃，光照强度为2000-2500Lux，每天光照12小时；所述的愈伤组织继代培养基为：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/L IAA，并添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

4)愈伤组织增殖至所需数量时，将愈伤组织转接至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导，培养温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，每天光照16小时；所述的不定芽诱导培养基为：MS+1.0mg/L6-BA，并添加蔗糖20g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

5)不定芽长至3-5cm时，将不定芽切下并转接至生根培养基中诱导生根，培养温度为23±2℃，光照光强为2500-3000Lux，每天光照16小时；所述的生根培养基为：1/2MS+0.4mg/LIAA，并添加蔗糖15g/L，琼脂7g/L，pH调整至6.0-7.0；

6)根长至8-10cm时，将橡胶草幼苗移至室温炼苗3～5天；然后将所述幼苗移栽至泥炭土、蛭石的体积比为4：1的混合培养基质中，并在80％～95％的空气湿度和25±2℃的环境中对橡胶草培养两周；最后移至正常的光照和温度条件下进行培养。