CN101195832B - 农杆菌介导的花椒转基因方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤：(1)将带腋芽幼嫩茎段及茎尖接种于诱导培养基中，以萌发20天腋芽的叶柄及茎段作为浸染外植体；(2)将农杆菌单菌落，用牙签挑取，加入到YEP液体培养基中培养震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7，离心收集菌体，用WPM重悬培养基重悬制得农杆菌菌液；(3)将叶柄及茎段切成0.5cm左右的外植体，接种到诱导培养基于黑暗中预培养，培养时间48-72h，投入步骤b农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触，取出外植体，转入共培养基上培养48-72h，然后转入筛选培养基中诱导芽再生，最后将材料接种到生根培养基中诱导生根。本发明能培育抗病虫、抗低温、抗干旱，高精油含量、高药用价值及无刺的转基因花椒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种农杆菌介导的花椒转基因方法。
背景技术
朝仓花椒(Zanthoxylum piperitum DC var.inerme Makino)芸香科花椒属落叶灌木。花椒用途广，是一种重要的经济树木，其果实不但能入药、榨油，且为人们日常烹饪的主要调料。现代研究表明花椒属植物的化学成分主要有生物碱、酰胺、木脂素、香豆素和脂肪酸等，对心血管系统、消化系统、免疫机能、凝血功能、肿瘤等具有较强的药理活性。研究发现花椒宁碱对癌细胞逆转录酶和DNA聚合酶活力有较高的抑制能力，因此对花椒中抗癌活性物质的研究，是国内外学者研究的热点。花椒树喜光、喜温，耐干旱，不耐涝，不耐寒。冻害常给花椒生产造成重大损失，造成花椒大量减产，甚至绝收。我国是世界花椒栽培面积、产量第一大国，但我国花椒研究主要以丰产栽培和病虫害防治为主，而良种选育及产品开发严重滞后。如不从根本上解决良种问题，花椒的生产水平难有大的发展，因此当前急需开展优良品种的选育研究。
转基因育种相对于传统的杂交育种、诱变育种和多倍体技术育种来说，不仅缩短了育种周期，而且能准确地选择任何一个目的基因(植物、动物乃至人类)，从而打破了遗传物质分类上门、纲、目、科及属界限，实现了基因的转移，大大拓宽了作物遗传改良可资利用的基因来源。
由于木本植物自身的特点，使其在遗传转化上有一定的难度和特殊性，只有建立快捷高效的遗传转化体系，完善和优化转基因技术，才有可能提高转化率，获得大量的转基因植株，筛选优良株系，培育优良品种。由于缺少高效的花椒组织培养再生体系，目前尚未见国内外有关花椒遗传转化及转基因育种研究方面的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一为培育抗病虫、抗低温、抗干旱，高精油含量、高药用价值及无刺的转基因花椒的农杆菌介导的花椒转基因方法。
一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤：
(1)材料消毒方法：田间取外植体在流水中冲洗2h，用少量洗衣粉刷洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分洗净，75％酒精表面消毒45s后无菌水冲洗1次再用0.1％升汞消毒7min后无菌水冲洗5次，切取0.5-1cm带腋芽茎段接种于诱导培养基；
(2)农杆菌的准备：用接种针蘸取-80℃冻存的含有pBin19重组质粒的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28℃恒温培养24-48h至长出合适大小的菌斑；用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7；将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体；用WPM重悬培养基重悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3-0.4之间；
(3)植物材料的农杆菌侵染：取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h，投入预先准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6-8min后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上，培养48-72h。立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；
(4)分化及壮苗：材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生3个月后愈伤组织再分化出芽，再生的芽4-5周后，小苗长至3-4公分高；
(5)完整植株的获得：将小苗转至生根培养基中诱导生根，2周后材料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植株试管苗。
其中：植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000lx，每日光照16小时，培养温度(26±2)℃。
生根培养基为1/2WPM培养基，其余培养基均为WPM常规培养基。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：共培养基中含有0.5mg/L
6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重悬培养基中含有20g/L蔗糖。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：诱导培养基中含有0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸及30g/L蔗糖，筛选培养基中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、150mg/L头孢霉素及30g/L蔗糖。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：1/2WPM生根培养基中含有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：1L WPM培养基中包含：硫酸钾(K2SO4)990毫克，硝酸铵(NH4NO3)400毫克，氯化钙(CaCl2·2H2O)96毫克，硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)556毫克，硫酸镁(MgSO4·7H2O)370毫克，磷酸二氢钾(KH2PO4)170毫克，硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3毫克，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6毫克，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)37.25毫克，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8毫克，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025毫克，氯化钴(COCl2·6H2O)0.025毫克，肌醇100毫克，烟酸0.5毫克，盐酸硫胺素(VB1)1.0毫克，盐酸吡哆素(VB6)0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5.80。
上述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中1LYEP培养基中包含：5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl，PH值7.20。
本研究采用花椒叶柄、茎段为外植体，通过诱导愈伤组织再分化出芽，完善了花椒再生体系。在上述研究的基础上，筛选出较合理的遗传转化方案，建立了农杆菌介导的花椒遗传转化体系，为通过转基因技术，深入研究并发掘花椒的药用、食用价值奠定了基础。
附图说明
图1：筛选40d花椒再生芽诱导情况(整皿)；
图2：花椒叶柄通过愈伤组织再分化60d再生芽(整皿)；
图3：花椒茎段通过愈伤组织再分化80d再生芽(单个)；
图4：花椒转基因材料的壮芽；
图5：花椒转基因材料的生根；
图6：转基因植株叶片GUS染色检测结果；
图7：非转基因对照植株叶片GUS染色检测结果；
图8：转基因花椒植株PCR检测结果。
图中标记：
M：100bp DNA ladder；
P：ipt-flp质粒；
1，2，3，4，5：转基因植株；
CK：非转基因植株
具体实施方式
以下结合附图及实验例，进一步说明本发明的有益效果：
实验例：花椒叶柄、茎段抗生素敏感性实验
本实验中用于花椒遗传转化的构建中含有卡那霉素抗性基因，因此采用卡那霉素对转基因植株进行筛选，另外本实验采用头孢霉素作为花椒材料在组培过程当中的农杆菌抑制剂。在花椒诱导培养基中，分别附加0mg/L卡那霉素，5mg/L卡那霉素，10mg/L卡那霉素，20mg/L卡那霉素，30mg/L卡那霉素，50mg/L卡那霉素和100mg/L卡那霉素，150mg/L的头孢霉素。将0.5cm左右的叶柄及茎段切段，接种到上述培养基中，25d后统计材料的分化及存活情况。结果表明，150mg/L的头孢霉素对花椒胚轴及子叶的分化影响不大，故在筛选时我们采用150mg/L的头孢霉素抑菌。花椒叶柄及茎段对卡那霉素比较敏感，当卡那霉素浓度为30mg/L时，外植体死亡率为78.1％，个别材料出现芽苗分化，但产生的芽严重白化，不能正常生长；当卡那霉素浓度为50mg/L时，叶柄褐变严重，死亡率97.5％，没有愈伤组织的产生；当卡那霉素浓度达到100mg/L时，外植体全部死亡。因而选择的筛选压为卡那霉素50mg/L，并附加150mg/L头孢霉素抑制农杆菌的生长。
实施例：
(1)材料消毒方法：田间取外植体在流水中冲洗2小时，用少量洗衣粉刷洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分洗净，75％酒精表面消毒45秒后无菌水冲洗1次再用0.1％升汞消毒7分后无菌水冲洗5次，切取0.5-1cm带腋芽茎段接种于诱导培养基
(2)农杆菌的准备：用接种针蘸取-80℃冻存的含有pBin19重组质粒(重组质粒中含有异戊烯基转移酶基因ipt和重组酶基因flp)的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28℃恒温培养24-48h至长出合适大小的菌斑；用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养，直到OD值达到0.4-0.7。将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体。用WPM重悬培养基重悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3-0.4之间；
(3)植物材料的农杆菌侵染：取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h，投入预先准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6-8min后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上，培养48-72h。立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；
(4)转基因植物的筛选及愈伤组织诱导情况见图1，在含有50mg/L卡那霉素的筛选培养基中，由于导入了卡那霉素抗性基因，因此转基因材料能够分解培养基中的卡那霉素，能够存活并能产生愈伤组织。
(5)分化及壮苗：材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生3个月后可见愈伤组织再分化出芽，再生的芽约4-5周后，小苗可长至3-4公分高。(见图3，图4)
(6)完整植株的获得：将小苗转至生根培养基中诱导生根。2周后材料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植株试管苗。(见图5)
(7)转基因植株GUS组织活性检测：本发明中用于花椒遗传转化的构建中含有β-葡萄糖苷酸酶基因，可进行GUS染色。取待检测材料的叶片清洗后抽真空，于5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸染色液(X-Gluc0.5mg/mL，100mmol/L磷酸缓冲液ph＝7.0，0.1％Triton X 100，1mmol/L铁氰化钾，1mmol/L亚铁氰化钾)中于37℃下保温过夜，然后分别用10％，25％，50％，75％，95％的乙醇脱色，每种浓度的乙醇分别脱色5min，最后组织继续放在95％的乙醇溶液中浸泡，直到绿色退去。
检测结果：经过GUS染色，转基植株的叶片因含有GUS基因而呈蓝色(见图6)，而对照植株的叶片没有着色，呈浅黄色(见图7)。
(8)转基因植株PCR分子检测：本实验中用于花椒遗传转化的构建中含有ipt基因，因此采用ipt引物对转基因植株及进行PCR检测。CTAB法提取花椒基因组DNA，以基因组DNA为模版利用ipt引物进行PCR扩增，待扩增片段长度为325bp。
引物序列为：
Forward primer：5’-ATCGGGTCCAATGCTGTGTCCTC-3’；
Reverse primer：5’-TGCTTAACTCTGGCCTTGGC-3’
反应体系：20μl反应体系中包含2.0μl 10×PCR buffer，1.6μl dNTP，0.3ul primer1，0.3ul primer2，0.2ul template DNA，0.1ul Taq酶，加ddH2O至总体积20ul；
扩增反应程序为：①94℃5min，②94℃30s，55℃30s，72℃30s进行35个循环，③72℃10min。扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳上检测并拍照。
检测结果见图8，其中M为100bp DNAladder，P为ipt-flp质粒，CK为非转基因植株，1、2、3、4、5为转基因植株，1-5号转基因植株扩增出了325bp的目标条带，结果与P ipt-flp质粒一致，而非转基因植株CK没有扩增出带。
培养基及培养条件：
共培养基中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重悬培养基中含有20g/L蔗糖。
诱导培养基中含有0.5mg/L6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸及30g/L蔗糖，筛选培养基中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、150mg/L头孢霉素及30g/L蔗糖。
1/2WPM生根培养基中含有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖。
本发明中生根培养基为1/2WPM培养基，其余培养基均为WPM常规培养基。
1L WPM培养基中包含：硫酸钾(K2SO4)990毫克，硝酸铵(NH4NO3)400毫克，氯化钙(CaCl2·2H2O)96毫克，硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)556毫克，硫酸镁(MgSO4·7H2O)370毫克，磷酸二氢钾(KH2PO4)170毫克，硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3毫克，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6毫克，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克，乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)37.25毫克，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8毫克，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025毫克，氯化钴(COCl2·6H2O)0.025毫克，肌醇100毫克，烟酸0.5毫克，盐酸硫胺素(VB1)1.0毫克，盐酸吡哆素(VB6)0.5毫克，甘氨酸2毫克，PH值5.80。
1L YEP培养基中包含：5.0g蛋白胨，5.0g酵母提取物，2.5gNaCl，PH值7.20。
植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000lx，每日光照16小时，培养温度(26±2)℃。
Claims (3)
1.一种农杆菌介导的花椒转基因方法，包括下列步骤：
(1)材料消毒方法：田间取外植体在流水中冲洗2h，用少量洗衣粉刷洗材料表面，再用流水将洗衣粉充分洗净，75％酒精表面消毒45s后无菌水冲洗1次再用0.1％升汞消毒7min后无菌水冲洗5次，切取0.5-1cm带腋芽茎段接种于诱导培养基；
(2)农杆菌的准备：用接种针蘸取-80℃冻存的含有pBin19重组质粒的农杆菌，在YEP固体培养基上划平板，28℃恒温培养24-48h至长出合适大小的菌斑；用牙签挑取农杆菌单菌落加入到5mlYEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养24h，于5ml菌液中取500ul加入50ml YEP液体培养基中，28℃200rpm震荡培养，直到OD值达到0.4～0.7；将菌液转移到50ml离心管中，6000rpm，4℃离心10min，收集菌体；用WPM重悬培养基重悬离心收集的农杆菌，调节菌液OD值在0.3～0.4之间；
(3)植物材料的农杆菌侵染：取诱导培养20天腋芽叶柄及茎段，切成0.5cm左右的切段，接种到诱导培养基中黑暗中培养48-72h后，投入预先准备好的农杆菌菌液中，不断摇动，使外植体与农杆菌充分接触，6～8min后，取出外植体，置于干燥无菌滤纸上吸去多余的菌液，转入共培养基上，培养48-72h，立刻转入筛选培养基中诱导愈伤组织的产生；
(4)分化及壮苗：材料转入筛选培养基后2周可见愈伤组织产生，3个月后愈伤组织再分化出芽，再生的芽4-5周后，小苗长至3-4公分高；
(5)完整植株的获得：将小苗转至生根培养基中诱导生根，2周后材料下端长出白色小根，继续培养即获得花椒转基因植株试管苗；
其中：植物组织培养各个阶段，除共培养及预培养阶段不需要光照外，培养条件为光照强度为2000lx，每日光照16小时，培养温度26±2℃；
生根培养基以1/2WPM培养基为基本培养基、1/2WPM生根培养基中含有150mg/L头孢霉素及20g/L蔗糖；其余培养基均以WPM常规培养基为基本培养基；
共培养基中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖，重悬培养基中含有20g/L蔗糖；
诱导培养基中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸及30g/L蔗糖，筛选培养基中含有0.5mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、50mg/L卡那霉素、150mg/L头孢霉素及30g/L蔗糖。
2.如权利要求1所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：1LWPM培养基中包含：K2SO4 990毫克，NH4NO3 400毫克，CaCl2·2H2O 96毫克，Ca(NO3)2·4H2O 556毫克，MgSO4·7H2O 370毫克，KH2PO4 170毫克，MnSO4·4H2O 22.3毫克，ZnSO4·7H2O 8.6毫克，Na2MoO4·2H2O 0.25毫克，Na2-EDTA·2H2O 37.25毫克，FeSO4·7H2O 27.8毫克，CuSO4·5H2O0.025毫克，CoCl2·6H2O 0.025毫克，肌醇100毫克，烟酸0.5毫克，盐酸硫胺素VB1 1.0毫克，盐酸吡哆素VB6 0.5毫克，甘氨酸2毫克，pH值5.80。
3.如权利要求1所述的农杆菌介导的花椒转基因方法，其中：1L YEP培养基中包含：10.0g蛋白胨，10.0g酵母提取物，5.0gNaCl，pH值7.20。
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