CN105087637B - 一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：1）菌种活化；2）植物材料准备；3）预培养；4）侵染；5）共培养；6）洗叶片；7）愈伤诱导；8）芽诱导；9）根诱导培养。本发明的方法提高了蓝莓转基因效率，转化率可达到10%以上。将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率。侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂（传统方法中常添加乙酰丁香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力），减小对蓝莓叶片的伤害，提高叶片培养的成活率和再生率。使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作。缩短了转基因的周期。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。
背景技术
蓝莓（Vaccinium spp.）是一种新兴果树，近年来在许多国家广泛栽培，是发展十分迅速的优良果树之一。 英国权威营养学家将蓝莓列为 15种健康食品之首，联合国粮农组织也将蓝莓列为人类五大健康食品之一。蓝莓作为一种营养丰富，具有巨大保健功能和极高经济价值的果树， 必将在人民生活水平不断提高的今天受到越来越多的关注。
随着科学的不断发展和技术的不断革新，蓝莓的研究必将逐步深入，其潜在的功效将被不断得到开发和利用，为人类的健康增添风采。蓝莓在国外研究起步较早，目前我国对蓝莓的研究也正飞速发展，但由于起步较晚，对于蓝莓各方面的研究还不够深入。许多分子生物学方面问题都值得我们进一步地研究。分子生物学研究热点中转基因的研究一直是热点问题之一，也是难点，尤其是蓝莓这种新兴的果树。目前很少有蓝莓转基因的相关报道，仅有的几个使用的方法也都是传统方法，转化效率低，周期长，不能够满足飞速发展的蓝莓分子生物学研究的需要。
目前常用的蓝莓基因转化方法有农杆菌介导法、基因枪法和电击法，其中农杆菌介导的叶盘法是蓝莓遗传转化的主要方法，也是迄今为止植物转基因研究中研究最为成熟最常用的一种转基因方法。由于蓝莓叶片偏小，操作起来比较困难，而且蓝莓叶片组织致密，不容易诱导愈伤组织，也不容易诱导再生芽，因此传统的农杆菌介导法在蓝莓转基因中效率非常低。获得的蓝莓植株转基因效率不到浅千分之一。因此如何获得一个高效快速的蓝莓稳定转化体系，是蓝莓转基因中亟待解决的一个问题。
蓝莓品种‘美登’丰产性好，品质优良，适于设施栽培，目前国内大范围的栽培次品种，本发明就是在已经建立的‘美登’蓝莓叶片再生体系的基础上，对影响根癌农杆菌转化蓝莓叶片的各项因素进行了研究，优化各种参数，简化操作过程，确定最佳转化条件。过程中选用了基于gataway技术的超表达载体，使得转基因后的检测工作更加便利，更加快速，从而建立了一个高效、快速、稳定的‘美登’蓝莓遗传转化体系，为进一步应用遗传转化方法改良蓝莓品种提供实践基础，有利于今后蓝莓分子育种工作的发展。
我们仍然面临这些需要解决的问题：解决农杆菌和杂菌的污染问题；解决蓝莓转化效率低的问题；解决蓝莓转基因中叶片褐化死亡的问题，缩短转基因周期；简化检测方法，加快检测速度。
发明内容
发明目的：本发明采用了基于gataway技术的超表达载体，简化了转基因后的检测过程，建立高效、快速、稳定的‘美登’蓝莓遗传转化体系，为进一步应用遗传转化方法改良蓝莓品种提供实践基础。本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：
1）菌种活化：将含质粒pK7WG2D农杆菌AGL0在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 ℃培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4；常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mL改良WPM液体培养基重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2～0.3之间；
2）植物材料准备：取蓝莓美登组培苗上幼嫩、平展的35～40天叶龄的叶片，从叶片中间横切一刀，将叶片切为两段；
3）预培养：将剪好的蓝莓叶片放置于培养基S2上预培养3天，这个过程能够使蓝莓叶片尽可能吸水，软化叶片；
4）侵染：预培养完成后将叶片放入悬浮的菌液中，在恒温摇床中150转每分钟的速度轻微摇匀，浸染40 分钟，过程中一直摇动，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；
5）共培养：侵染后的叶片接种在蓝莓共培养基S2中，25 ℃培养箱中黑暗培养3天；
6）洗叶片：共培养完成后将叶片放置于含有300mg/L羧苄青霉素和的300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗叶片10分钟，清洗完成后用无菌滤纸吸干水分；
7）愈伤诱导：清洗完成的蓝莓叶片，接种在蓝莓筛选培养基S3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，先暗培养21天，然后光照培养，培养40天左右，蓝莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，将发光的愈伤挑出，转入下一步的芽诱导培养基；
8）芽诱导：将诱导完成的愈伤组织接种在蓝莓芽诱导培养基S4上，培养室中光照培养，培养20天左右，遇上组织上会有小芽长出，继续培养，芽慢慢长成植株，叶片清晰可见，此时在体式荧光显微镜下进行观察，明显看出叶片有非常亮的绿光发出，而有一部分植株没有发光，将发光的植株挑出，转入下一步的根诱导培养基；
9）根诱导培养：抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入蓝莓生根筛选培养基S5上生根，获得完整的抗性苗，此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。
以上步骤完成以后可以获得稳定遗传的转基因植株。此方法操作过程简单，转化效率高，试验周期短，耗费人力物力较小。
其中，所述培养基S2为改良的WPM培养基添加蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L、TDZ 6mg/L， pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃左右分装平板备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L。
其中，所述培养基S3改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L、植物凝胶2.5 g/L、玉米素1mg/L、TDZ 1mg/L、2,4-D 0.4mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L。
其中，所述诱导培养基S4改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，ZT(玉米素)3mg/L ，TDZ 1mg/L，，pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素350 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L。
其中，所述要生根筛选培养基S5改良的1/2WPM培养基添加蔗糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，IBA 0.6mg/L， pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入羧苄青霉素300 mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L。
ZT：玉米素（Zeatin）是存在于高等植物的一种天然植物细胞分裂素不仅促进侧芽生长，刺激细胞分化（侧端优势），促进愈伤组织和种子发芽，还能防止叶片衰老，逆转芽部受到的毒素伤害和抑制过度根部形成。高浓度的玉米素还能产生不定芽分化。
TDZ：TDZ是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，且可以对植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节剂。在农业上有广泛的应用和推广价值。在蓝莓的组织培养中也很常用，在蓝莓‘美登’的转基因中添加2.0mg/L的TDZ能够很好诱导‘美登’叶片形成不定芽。将TDZ配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。
2,4-D：2,4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常有效，是组织培养中常用的植物生长调节剂。本试验中添加0.1mg/L的2,4-D就能够很好的诱导‘美登’不定芽形成。将2,4-D配制成1mg/mL的母液供配制培养基使用。
卡那霉素：卡那霉素是转基因中的植物筛选标记，通过在培养基中添加卡那霉素，可以剔除掉一部分非转基因的芽或者植株。转基因植株抗卡那霉素，因此可以在添加卡那霉素的培养基中成活，而普通植株不抗卡那霉素，会死亡。
羧苄青霉素：羧苄青霉素用于抑制转基因后期农杆菌的生长。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下的特色及优点：
1、提高蓝莓转基因效率，转化率可达到10%以上。
2、将菌液浓度降低，侵染时间加长，即避免农杆菌污染，又提高了侵染效率。
3、侵染菌液中不添加任何的辅助侵染的药品药剂（传统方法中常添加乙酰丁香酮等辅助侵染的药剂，会对叶片造成伤害，降低叶片再生能力），减小对蓝莓叶片的伤害，提高叶片培养的成活率和再生率。
4、使用携带强表达报告基因的载体，通过观察可直接筛选得到转基因植株，避免传统的检测中繁琐的工作。缩短了转基因的周期。
附图说明
图1菌夜浓度和侵染时间对蓝莓转基因效率的影响；
图2菌夜浓度和侵染时间对蓝莓转基因农杆菌污染的影响。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1 本发明培养基、菌株和植物表达载体的准备
1、材料
（1）植物材料
蓝莓‘美登’组培苗，在蓝莓继代培养基上继代供试验用。
（2）主要溶液和培养基配制
培养基配制方法如下：
蓝莓继代培养基（S1）：
改良的WPM培养基添加葡萄糖10g/L，植物凝胶2.5 g/L，ZT(玉米素)1.5mg/L，NAA0.4mg/L， pH5.4，高压灭菌，备用。
蓝莓共培养培养基（S2）
改良的WPM培养基添加蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L，TDZ 6mg/L， pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃左右分装平板备用。
蓝莓愈伤诱导培养基（S3）
改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，ZT(玉米素)1mg/L ，TDZ1mg/L，2,4-D 0.4mg/L， pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400 mg/L分装培养瓶备用
蓝莓芽诱导培养基（S4）
改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，ZT(玉米素)3mg/L ，TDZ1mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素350 mg/L分装培养瓶备用。
蓝莓生根筛选培养基（S5）
改良的1/2WPM培养基添加蔗糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，IBA 0.6mg/L， pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入羧苄青霉素300 mg/L分装培养瓶备用
改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L。
（3）菌株和植物表达载体
本发明中使用的菌株是农杆菌菌株AGL0，该菌株在转基因中使用较少，该菌株侵染能力超强，用于蓝莓转基因中可以提高转化效率。该菌株购买于美国模式培养物集存库ATCC (American type culture collection)。
植物表达载体选用基于Gateway™技术的pK7WG2D植物表达载体，Gateway™技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。此外pK7WG2D植物表达载体携带超强表达的报告基因Egfp，便于转基因植株的检测。载体购买于Invitrogen生物技术公司。
实施例2
一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：
1）菌种活化：将含质粒pK7WG2D农杆菌AGL0在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 ℃培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4；常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mL改良WPM液体培养基重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2～0.3之间；
2）植物材料准备：取蓝莓美登组培苗上幼嫩、平展的35～40天叶龄的叶片，从叶片中间横切一刀，将叶片切为两段；
3）预培养：将剪好的蓝莓叶片放置于培养基S2上预培养3天，这个过程能够使蓝莓叶片尽可能吸水，软化叶片；
4）侵染：预培养完成后将叶片放入悬浮的菌液中，在恒温摇床中150转每分钟的速度轻微摇匀，浸染40 分钟，过程中一直摇动，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；
5）共培养：侵染后的叶片接种在蓝莓共培养基S2中，25 ℃培养箱中黑暗培养3天；
6）洗叶片：共培养完成后将叶片放置于含有300mg/L羧苄青霉素和的300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗叶片10分钟，清洗完成后用无菌滤纸吸干水分；
7）愈伤诱导：清洗完成的蓝莓叶片，接种在蓝莓筛选培养基S3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，先暗培养21天，然后光照培养，培养40天左右，蓝莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，将发光的愈伤挑出，转入下一步的芽诱导培养基；
8）芽诱导：将诱导完成的愈伤组织接种在蓝莓芽诱导培养基S4上，培养室中光照培养，培养20天左右，遇上组织上会有小芽长出，继续培养，芽慢慢长成植株，叶片清晰可见，此时在体式荧光显微镜下进行观察，明显看出叶片有非常亮的绿光发出，而有一部分植株没有发光，将发光的植株挑出，转入下一步的根诱导培养基；
9）根诱导培养：抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入蓝莓生根筛选培养基S5上生根，获得完整的抗性苗，此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株。
本实施例中的培养基采用的是实施例1中的培养基、菌株和植物表达载体。
本试验结果与其他方法比对
（1）根据蓝莓的生长习性，不适用传统的MS培养基，而将WPM培养基进行改良，改良以后的WPM培养基更适合蓝莓的生长。为转基因提供良好条件。
（2）根据蓝莓叶片的特点，增加了预培养，通过预培养，使蓝莓叶片软化，活化伤口组织，在下一步的培养中更容易长出愈伤组织。
（3）七步式的培养方法，本发明的实验过程包括侵染、预培养、共培养、叶片清洗、愈伤组织诱导培养、芽诱导培养、根诱导培养这七个步骤，在每一个步骤都有特定的方法和特定的培养基配方，根据蓝莓生长各个阶段的特点，研究出适合不同转基因阶段的培养基配方，比以前的转基因过程更加细化，更大程度提高了转基因的效率。
本实验的转基因转化效率达到10%，文献报道的蓝莓转基因效率一般都在1%以下，因此，我们的发明大幅地提高了蓝莓转基因效率。
（4）中间用两种抗生素的液体来冲洗共培养后的叶片，减小后期农杆菌污染的可能性。
（5）使用gataway载体系统，携带能够容易检测的Egfp基因，似的后期的检测工作量极大的减小，并且缩短培养过程。
（6）菌液浓度和侵染时间的优化是本发明中最重要的以部分，不同于传统的蓝莓转基因方法中的菌液浓度高时间短的侵染方法，本发明中使用低浓度菌液，长时间侵染，经过多次试验，如图1和图2的数据能够证明，低浓度长时间侵染能够大幅度提高转化效率，而且培养后期不容易产生农杆菌污染。而且采用低浓度菌液长时间侵染能够显著提高Egfp基因表达率，提高转化效率。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）菌种活化：将含质粒pK7WG2D农杆菌AGL0在含50 mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB固体培养基上划线，28 ℃培养2天；挑取平板上长的好的单菌落2-3个，接种到50 mL含50mg/L壮观霉素和50 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm 在摇床中振荡培养至OD600值0.4；常温下，5000rmp离心8 分钟，去掉上清液，在无菌滤纸上倒扣离心管，尽量将上清液去除，用100 mL改良WPM液体培养基重悬菌体，在摇床中振荡培养大约1小时测定OD600值为0.2～0.3之间；
2）植物材料准备：取蓝莓美登组培苗上幼嫩、平展的35～40天叶龄的叶片，从叶片中间横切一刀，将叶片切为两段；
3）预培养：将剪好的蓝莓叶片放置于培养基S2上预培养3天，这个过程能够使蓝莓叶片尽可能吸水，软化叶片；
4）侵染：预培养完成后将叶片放入悬浮的菌液中，在恒温摇床中150转每分钟的速度轻微摇匀，浸染40 分钟，过程中一直摇动，增加菌液和叶片的接触面积，侵染完成后倒出菌液，将叶片在无菌滤纸上吸干表面的菌液；
5）共培养：侵染后的叶片接种在蓝莓共培养基S2中，25 ℃培养箱中黑暗培养3 天；
6）洗叶片：共培养完成后将叶片放置于含有300mg/L羧苄青霉素和的300mg/L头孢霉素的无菌水中清洗叶片10分钟，清洗完成后用无菌滤纸吸干水分；
7）愈伤诱导：清洗完成的蓝莓叶片，接种在蓝莓筛选培养基S3上，使伤口与培养基充分接触，在培养室中25±2 ℃，先暗培养21天，然后光照培养，培养40天左右，蓝莓叶片边缘会有白色愈伤组织长出，此时在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分愈伤有非常亮的绿光发出，这部分愈伤为抗性愈伤，要保留下，而一部分没有发光，这部分愈伤为非抗性愈伤，去除掉，将发光的愈伤挑出，转入下一步的芽诱导培养基；
8）芽诱导：将诱导完成的愈伤组织接种在蓝莓芽诱导培养基S4上，培养室中光照培养，培养20天左右，遇上组织上会有小芽长出，继续培养，芽慢慢长成植株，叶片清晰可见，此时在体式荧光显微镜下进行观察，明显看出叶片有非常亮的绿光发出，而有一部分植株没有发光，将发光的植株挑出，转入下一步的根诱导培养基；
9）根诱导培养：抗性植株长到大约2-3厘米高时，将抗性植株转入蓝莓生根筛选培养基S5上生根，获得完整的抗性苗，此时的抗性苗还不能完全确定是不是转基因苗，因此需要再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片，叶柄以及根都发亮绿光的可以确定为转基因植株；
所述蓝莓品种为‘美登’蓝莓；
所述培养基S2为改良的WPM培养基添加蔗糖30g/L，琼脂 5.5 g/L、TDZ 6mg/L， pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃左右分装平板备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L；
所述培养基S3改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L、植物凝胶2.5 g/L、玉米素1mg/L、TDZ 1mg/L、2,4-D 0.4mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素400 mg/L分装培养瓶备用；
所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L，
所述诱导培养基S4改良的WPM培养基添加葡萄糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，ZT(玉米素)3mg/L ，TDZ 1mg/L，pH5.4，高压灭菌，冷却至60℃加入卡那霉素20mg/L，羧苄青霉素350mg/L分装培养瓶备用；所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61mg/L、维生素C2 mg/L，
所述要生根筛选培养基S5改良的1/2WPM培养基添加蔗糖15g/L，植物凝胶2.5 g/L，IBA0.6mg/L， pH5.8，高压灭菌，冷却至60℃加入羧苄青霉素300 mg/L分装培养瓶备用；
所述改良的WPM培养基配方含有KNO3硝酸钾500 mg/L、(NH4)2SO4硫酸铵200 mg/L、MgSO4·7H2O 400 mg/L、KH2PO4 200mg/L、KI 1.1 mg/L、MnSO4·4H2O四水合硫酸锰20 mg/L、ZnSO4·7H2O七水合硫酸锌8 mg/L、H3BO3硼酸5 mg/L、乙二胺邻二羟基乙酸铁10 mg/L、CaCl2·2H2O100 mg/L、肌醇100mg/L、烟酸1 mg/L、维生素B10.5 mg/L、维生素B61 mg/L、维生素C2 mg/L。
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