CN107653264B - 一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法 - Google Patents

一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因转化方法技术领域，具体涉及一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。包括以下步骤：外植体的准备；农杆菌的准备；外植体的一级共培养转化；诱导培养；愈伤组织的二级共培养转化；转基因植株的培养筛选等步骤。本发明综合考虑到蓝莓组织中纤维素等细胞成分基因转化过程的影响，对现有的农杆菌介导的基因转化方法进行改进，分别在幼嫩组织期和愈伤组织期进行农杆菌的共培养转化，基因转化成功率可达25.7％以上，且基因转化蓝莓幼苗分化成活率达99％以上，开发出了一种高效、快速、稳定的基因转化方法。

Description

一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法
技术领域
本发明属于基因转化方法技术领域，具体涉及一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法。
背景技术
蓝莓属杜鹃花科，越桔属，果实呈深蓝色，球形或扁球形，直径约1cm，果皮薄，成熟果实呈蓝紫色，酸甜适口，可食性高。蓝莓果实中含有丰富的多糖、色素、果胶和保留遗传信息的DNA等物质。由于不同的蓝莓品种DNA之间存在差异，研究DNA与蓝莓表型之间的相互关系。转基因打破了不同植物物种之间的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的实现对生物体的改造。因此，选育出具有特殊性状或生理特性的转基因蓝莓品种是当前蓝莓育种的主要研究热点。
目前，常用的植物转基因方法包括载体介导法和DNA直接导入法，其中载体介导法又包括农杆菌介导法、病毒介导法。农杆菌介导法是目前双子叶植物常用的基因转移方法。它是利用携带有目的基因的农杆菌在植物形成肿瘤过程中可以将目的基因导入植物细胞中，进而构建出转化植株。虽然农杆菌介导的基因转化方法已经广泛应用于植物中，但是由于其操作步骤繁琐，浸染时间长，所以基因转化的成功率仅不到1％，效率不高。因此，开发一种高效快速稳定的蓝莓基因转化方法极为迫切。
发明内容
本发明提供的一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，是一种简化的、可以减少多酚和色素干扰的蓝莓果实总DNA提取方法，能够避免色素对DNA纯度的影响。
本发明目的是提供一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：
S1，外植体的准备：切取蓝莓组织，浸泡于消毒液中除菌，无菌水清洗，沥干水分，得到外植体，备用；
S2，农杆菌的准备：将含有目的基因的农杆菌扩繁培养至菌体浓度OD600＝0.4-0.8，培养温度为28±1℃，得到农杆菌菌液，备用；
S3，一级共培养转化：将无菌纱布浸泡于农杆菌菌液中10min，取出，沥掉多余菌液，将外植体包裹于纱布内，28±1℃孵育12h；加入筛选培养基，150-220rpm、28±1℃暗室培养24-48h，得到一级转化处理组织；
每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g、抗菌物质20-50mg，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；
S4，诱导培养：将纱布内的一级转化处理组织取出，无菌水清洗，置于诱导培养基中培养，28±1℃暗室培养1-3周，得到愈伤组织；
S5，二级共培养转化：将愈伤组织浸泡于农杆菌菌液中，共培养24-48h，得到二级转化处理组织；
S6，转基因植株的培养筛选：将所述二级转化处理组织置于分化筛选培养基中，培养至长出幼苗，得到含有目的基因的转化蓝莓植株；
所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基:黄原胶:抗菌物质＝1L:5-10g:20-50mg。
优选的，上述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，S1中，所述消毒液为0.5-1.5g/100ml的次氯酸钠溶液或者体积分数70％乙醇溶液；浸泡时间为20min。
优选的，上述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，S1中，所述蓝莓组织为蓝莓幼嫩茎或者蓝莓嫩叶。
优选的，上述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，S2中，所述农杆菌为LBA4404、EHA105或者GV3101。
优选的，上述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，S2中，农杆菌扩繁培养采用的培养基配方为：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0。
优选的，上述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，S3和S6中，所述抗菌物质为卡那霉素、链霉素或者头孢霉素，并且S3和S6中采用不同的抗菌物质。
与现有技术相比，本发明提供的一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，具有以下有益效果：
1、本发明综合考虑到蓝莓组织中纤维素等细胞成分基因转化过程的影响，对现有的农杆菌介导的基因转化方法进行改进，分别在幼嫩组织期和愈伤组织期进行农杆菌的共培养转化，基因转化成功率可达25.7％以上，且基因转化蓝莓幼苗分化成活率达99％以上，开发出了一种高效、快速、稳定的基因转化方法。
2、我们还研究了不同共培养转化方法和培养基对基因转化成功率和幼苗分化成活率的影响。结果表明，先将外植体包裹于纱布中，然后再孵育，有助于促进农杆菌的转化；羧甲基纤维素和果胶的添加均对农杆菌转化率有影响，且羧甲基纤维素的促进作用明显；黄原胶对于蓝莓愈伤组织分化率具有一定促进作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中涉及到数据范围的，在该数据范围内包括两个端点的任何数值均可实现，由于效果和步骤相同，故不赘述。
实施例1
一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：
S1，外植体的准备：切取蓝莓组织幼嫩茎，剪碎成0.3cm的小段，浸泡于消毒液中除菌，无菌水清洗，沥干水分，得到外植体，备用；所述消毒液为1g/100ml的次氯酸钠溶液，浸泡时间为20min；
S2，农杆菌的准备：将含有目的基因的农杆菌扩繁培养至菌体浓度OD600＝0.4，培养温度为28±1℃，200rpm振荡培养，得到农杆菌菌液，备用；实施例1中采用的是含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌LBA4404，其中含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌LBA4404按照常规方法制备，此处不涉及发明点，故不详述制备步骤；
农杆菌扩繁培养采用的培养基配方为：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0。
S3，一级共培养转化：将无菌医用纱布浸泡于农杆菌菌液中10min，取出，沥掉多余菌液，将外植体包裹于两层纱布内，28±1℃孵育12h；加入筛选培养基，150rpm、28±1℃暗室培养24h，得到一级转化处理组织；
每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g、卡那霉素20mg，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；
S4，诱导培养：将纱布内的一级转化处理组织取出，无菌水清洗，沥干水分，置于诱导培养基中培养，28±1℃暗室培养3周，得到愈伤组织；
S5，二级共培养转化：将愈伤组织浸泡于农杆菌菌液中，共培养24h，得到二级转化处理组织；
S6，转基因植株的培养筛选：将所述二级转化处理组织置于分化筛选培养基中，培养至长出幼苗(发芽和生根)，得到含有目的基因的转化蓝莓植株；
所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基(市售，北京索莱宝):黄原胶:链霉素＝1L:5g:50mg。
实施例2
一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：
S1，外植体的准备：切取蓝莓组织幼嫩茎，剪碎成0.5cm的小段，浸泡于消毒液中除菌，无菌水清洗，沥干水分，得到外植体，备用；所述消毒液为体积分数70％乙醇溶液，浸泡时间为20min；
S2，农杆菌的准备：将含有目的基因的农杆菌扩繁培养至菌体浓度OD600＝0.8，培养温度为28±1℃，200rpm振荡培养，得到农杆菌菌液，备用；实施例2中采用的是含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌EHA105，其中含有pCAMBIA 2301质粒的农杆菌EHA105按照常规方法制备，此处不涉及发明点，故不详述制备步骤；
农杆菌扩繁培养采用的培养基配方为：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0。
S3，一级共培养转化：将无菌医用纱布浸泡于农杆菌菌液中10min，取出，沥掉多余菌液，将外植体包裹于两层纱布内，28±1℃孵育12h；加入筛选培养基，220rpm、28±1℃暗室培养48h，得到一级转化处理组织；
每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g、链霉素50mg，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；
S4，诱导培养：将纱布内的一级转化处理组织取出，无菌水清洗，沥干水分，置于诱导培养基中培养，28±1℃暗室培养1周，得到愈伤组织；
S5，二级共培养转化：将愈伤组织浸泡于农杆菌菌液中，共培养48h，得到二级转化处理组织；
S6，转基因植株的培养筛选：将所述二级转化处理组织置于分化筛选培养基中，培养至长出幼苗(发芽和生根)，得到含有目的基因的转化蓝莓植株；
所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基(市售，北京索莱宝):黄原胶:头孢霉素＝1L:10g:20mg。
实施例3
一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，包括以下步骤：
S1，外植体的准备：切取蓝莓组织嫩叶，剪碎成0.5cm的小段，浸泡于消毒液中除菌，无菌水清洗，沥干水分，得到外植体，备用；所述消毒液为0.5g/100ml的次氯酸钠溶液，浸泡时间为20min；
S2，农杆菌的准备：将含有目的基因的农杆菌扩繁培养至菌体浓度OD600＝0.6，培养温度为28±1℃，200rpm振荡培养，得到农杆菌菌液，备用；实施例3中采用的是含有pK7WG2D质粒的农杆菌GV3101，其中含有pK7WG2D质粒的农杆菌GV3101按照常规方法制备，此处不涉及发明点，故不详述制备步骤；
农杆菌扩繁培养采用的培养基配方为：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0。
S3，一级共培养转化：将无菌医用纱布浸泡于农杆菌菌液中10min，取出，沥掉多余菌液，将外植体包裹于两层纱布内，28±1℃孵育12h；加入筛选培养基，200rpm、28±1℃暗室培养36h，得到一级转化处理组织；
每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g、头孢霉素35mg，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；
S4，诱导培养：将纱布内的一级转化处理组织取出，无菌水清洗，沥干水分，置于诱导培养基中培养，28±1℃暗室培养2周，得到愈伤组织；
S5，二级共培养转化：将愈伤组织浸泡于农杆菌菌液中，共培养36h，得到二级转化处理组织；
S6，转基因植株的培养筛选：将所述二级转化处理组织置于分化筛选培养基中，培养至长出幼苗(发芽和生根)，得到含有目的基因的转化蓝莓植株；
所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基(市售，北京索莱宝):黄原胶:链霉素＝1L:8g:50mg。
本发明综合考虑到蓝莓组织中纤维素等细胞成分基因转化过程的影响，对现有的农杆菌介导的基因转化方法进行改进，分别在幼嫩组织期和愈伤组织期进行农杆菌的共培养转化，基因转化成功率可达25.7％以上，且基因转化蓝莓幼苗分化成活率达99％以上，开发出了一种高效、快速、稳定的基因转化方法。下面以实施例1-3为例，说明本发明的效果。采用基因对比手段鉴定转化成功的蓝莓组织，不同阶段的蓝莓组织转化成功率结果如表1所示。
表1不同阶段的蓝莓组织转化成功率
Figure GDA0002715950710000081
另外，我们还研究了不同共培养转化方法和培养基对基因转化成功率和幼苗分化成活率的影响。设计以下对比实验：
实施例1组：实验操作同实施例1；
实验1组：实验操作基本同实施例1，区别在于S3中直接将外植体浸泡于农杆菌菌液中10min，28±1℃孵育12h；
实验2组：实验操作基本同实施例1，区别在于，S3中，每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、果胶1g、抗菌物质20-50mg，蒸馏水定容至1L，pH7.0；
实验3组：实验操作基本同实施例1，区别在于，S3中，每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、抗菌物质20-50mg，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；
实验4组：实验操作基本同实施例1，区别在于，S6中，所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基:链霉素＝1L:50mg。
实验5组：实验操作基本同实施例1，区别在于，S6中，所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基:蔗糖:链霉素＝1L:5g:50mg。
分别测定不同分组中蓝莓组织转化成功率和幼苗分化成活率，结果如表2所示。实验1组考察的是纱布包裹对转化成功率的影响，实施例1组的一级转化成功率明显高于实验1组，说明先将外植体包裹于纱布中，然后再孵育，有助于促进农杆菌的转化；实验2、3组考察的是不同筛选培养基对转化率的影响，实验3组的一级转化处理组织转化成功率最低，实验2组次之，说明羧甲基纤维素和果胶的添加均对农杆菌转化率有影响，且羧甲基纤维素的促进作用明显；实验4、5组考察的是不同分化培养基对愈伤组织分化率和幼苗成活率的影响，从表2的数据可以看出，与实施例1组相比，不使用黄原胶的情况下，实验4组，愈伤组织分化率和幼苗成活率均有降低，而以蔗糖替代黄原胶的实验5组，虽然仍有95.3％的幼苗成活率，但是愈伤组织分化率仍较低，与实验4组基本持平，说明黄原胶对于蓝莓愈伤组织分化率具有一定促进作用。综合考虑多种因素的影响，我们选择实施例1的方案作为最佳的基因转化方法。
表2不同阶段的蓝莓组织转化成功
Figure GDA0002715950710000101
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.一种蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，外植体的准备：切取蓝莓组织，浸泡于消毒液中除菌，无菌水清洗，沥干水分，得到外植体，备用；
S2，农杆菌的准备：将含有目的基因的农杆菌扩繁培养至菌体浓度OD600＝0.4-0.8，培养温度为28±1℃，得到农杆菌菌液，备用；
S3，一级共培养转化：将无菌纱布浸泡于农杆菌菌液中10min，取出，沥掉多余菌液，将外植体包裹于纱布内，28±1℃孵育12h；加入筛选培养基，150-220rpm、28±1℃暗室培养24-48h，得到一级转化处理组织；
每升所述筛选培养基的配方如下：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g、抗菌物质20-50mg，蒸馏水定容至1L，pH 7.0；
S4，诱导培养：将纱布内的一级转化处理组织取出，无菌水清洗，置于诱导培养基中培养，28±1℃暗室培养1-3周，得到愈伤组织；
S5，二级共培养转化：将愈伤组织浸泡于农杆菌菌液中，共培养24-48h，得到二级转化处理组织；
S6，转基因植株的培养筛选：将所述二级转化处理组织置于分化筛选培养基中，培养至长出幼苗，得到含有目的基因的转化蓝莓植株；
所述分化筛选培养基由以下比例的组分混合而成：MS基本培养基:黄原胶:抗菌物质＝1L:5-10g:20-50mg。
2.根据权利要求1所述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，S1中，所述消毒液为0.5-1.5g/100ml的次氯酸钠溶液或者体积分数70％乙醇溶液；浸泡时间为20min。
3.根据权利要求1所述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，S1中，所述蓝莓组织为蓝莓幼嫩茎或者蓝莓嫩叶。
4.根据权利要求1所述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，S2中，所述农杆菌为LBA4404、EHA105或者GV3101。
5.根据权利要求4所述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，S2中，农杆菌扩繁培养采用的培养基配方为：牛肉膏10g、酵母膏10g、氯化钠5g、羧甲基纤维素1g、果胶1g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0。
6.根据权利要求1所述的蓝莓的高效快速稳定基因转化方法，其特征在于，S3和S6中，所述抗菌物质为卡那霉素、链霉素或者头孢霉素，并且S3和S6中采用不同的抗菌物质。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103205459A (zh) * 2013-03-20 2013-07-17 广州甘蔗糖业研究所 一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化的方法
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