CN109486711A - 一种根瘤菌axlq16及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种根瘤菌AXLQ16及其应用，该菌株系是通过闽花11号花生品种捕捉自福建安溪地区土壤中的根瘤菌,从新鲜根瘤中对根瘤菌进行分离和纯化，并对菌株的16S rDNA部分序列进行测定，通过系统发育分析，确定为快生根瘤菌属（Rhizobium）的新菌株系，并命名为福农1号。本发明的根瘤菌AXLQ16通过实验室水培回接试验以及大田回接实验证明其具有高效结瘤、固氮能力强的特性，接种该根瘤菌能够提高花生生物量以及产量，可适用于华南酸性土壤，作为花生常规栽培的措施之一。

Description

一种根瘤菌AXLQ16及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种根瘤菌AXLQ16及其应用。

背景技术

根瘤菌（rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，能侵染豆科植物根部或茎部后形成根瘤（root nodule）或茎瘤（stem nodule），以共生体形式固定空气中的 N ₂ 成为植物可吸收利用的NH₄ ⁺。豆科植物与根瘤菌之间的共生体系在整个生物固氮中占有极其重要的地位。据估计，地球表面每年从空气中固定的氮素约有1亿吨，通过豆科植物和根瘤菌所固定的氮素约有5500万吨。根瘤菌与豆科植物形成共生固氮体系，除了满足植物自身的氮素需要外，还可以将多余的氮提供给与之混种或间种的非豆科植物，如与禾本科植物混播的非豆科植物可以少施氮肥；利用 ¹⁵N 示踪技术，研究发现，与豆科植物混播的禾本科植物 30% 的氮来源于豆科植物所固定的氮。根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强的优点，可以提高土壤肥力和为人畜提供蛋白质营养。研究根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，有利于实现农业、环境和生态可持续利用与发展。接种根瘤菌是提高豆科作物生产的重要措施。国内外大量试验证明，接种根瘤菌在多数土壤中可以提高豆科作物的产量和品质（李力曹等，2000；李友国等，2002）。Bohlool在总结多种作物在多年接种根瘤菌效果时指出，豆科作物接种根瘤菌的产量比不接种根瘤菌提高89.5%（Bohlool et al., 1973）。

花生是重要的豆科作物，也是我国主要的油料作物。根瘤菌和花生根系能够形成根瘤进行共生固氮，为花生生长提供氮素。接种高效根瘤菌，是促进花生共生固氮，改善花生氮素营养的重要措施。然而，目前还缺乏成熟有效的花生高效固氮根瘤菌剂。本研究利用来自不同生长区的花生品种进行盆栽、大田试验，从其根瘤中分离、纯化高效固氮根瘤菌；然后利用 PCR 技术对纯化的根瘤菌进行鉴定，并通过16s rDNA技术进行测序鉴定；在温室利用回接的方法验证宿主专一性及根瘤固氮酶活性，最后在大田试验筛选适宜南方酸性土壤生长的花生高效根瘤菌菌株，并根据土壤养分特性配制花生高效根瘤菌菌剂。研究结果将对花生高产高效生产提供实际有效的技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于提供一种根瘤菌AXLQ16及其应用，该菌株系是通过闽花11号花生品种捕捉自福建安溪地区土壤中的根瘤菌,从新鲜根瘤中对根瘤菌进行分离和纯化，确定为快生根瘤菌属（Rhizobium）的新菌株系，并命名为福农1号。本发明的根瘤菌AXLQ16通过实验室水培回接试验以及大田回接实验证明其具有高效结瘤、固氮能力强的特性，接种该根瘤菌能够提高花生生物量以及产量，可适用于华南酸性土壤，作为花生常规栽培的措施之一。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种根瘤菌AXLQ16菌株（即福农1号），于2018年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018214，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。

其16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

分离得到的根瘤菌AXLQ16菌株在菌落形态上，为快生型，圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多。在 YMA 平板上生长3～5天后的直径为 0.8～2.0 mm。

进一步，表明分离得到的根瘤菌AXLQ16菌株具有高效结瘤、固氮能力强的特性，可以应用于提高花生产量中。

本发明的优点在于：

（1）本发明的根瘤菌具有结瘤率高和固氮能力强的特性，回接试验发现，与不接种根瘤菌相比，接种该根瘤菌 20 天可显著提高花生植株鲜重和干重，可用于实际生产；

（2）花生接种本发明的根瘤菌，显著地提高植株全氮含量(P<0.01)，从而达到促进花生植株生长和提高花生产量的目的；

（3）本发明的根瘤菌适用于南方酸性土壤地区，可作为花生常规栽培的重要措施之一；

（4）本发明的根瘤菌释放到自然环境中，对人、动物和植物无害，不会污染环境，进而丰富了土壤间根瘤菌的群体多样性。

附图说明

图1为根瘤菌 AXLQ16在YMA培养基上的菌落形态。

图2为根瘤菌 AXLQ16的16s rDNA部分序列分析系统发育树 (方框内为根瘤菌AXLQ16)。

图3为根瘤菌 AXLQ16 水培回接效果图。

图4为固氮酶活性及结瘤数。

图5为水培接种根瘤菌AXLQ16对花生生长的影响。

图6为大田接种根瘤菌AXLQ16对花生生长、产量的影响。

图7为大田接种根瘤菌AXLQ16对花生生长、产量的影响效果图。

具体实施方式

实施例1 根瘤菌 AXLQ16 的分离和纯化

（1）取花生新鲜、成熟且个大饱满的根瘤，用灭菌水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分。

（2）放入体积分数 95% 的酒精中处理 3～5 分钟，再放入 1g/L HgCl₂中，灭菌 3～5分钟，取出后用无菌水冲洗 5～6 次。

（3）在火焰灭菌的载玻片上切成两半，用无菌镊子夹住半个瘤，切口面向 YMA 培养基表面划线，YMA 培养基的配方如表 1 所示，倒置后在28℃下培养。

（4）待长出菌体后，用灭菌的牙签从平板上刮取少量根瘤菌菌落，用无菌水稀释后再次于平板上划线培养，3 天之后观察菌落情况，一直观察到 15 天(慢生根瘤菌需 7～15天出现菌落)。如无单克隆菌落出现，则需反复在平板上划线纯化，直到出现单克隆菌落。

根据以下方法可初步判断是否为根瘤菌：

菌落形态：根瘤菌的菌落为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质较多。培养 3～5 天菌落直径达 2～4 mm 为快生型根瘤菌，培养 7～10 天菌落直径达 1 mm 则为慢生型根瘤菌。

本实施例菌株 AXLQ16 为快生型根瘤菌，在菌落形态上为圆形较小、乳白色、半透明、粘质较多；在 YMA 平板上生长 3～5 天后的直径为 0.8～2.0 mm（附图1）；最适生长条件为： pH＝7.0 ，温度 28℃ ，转速 180 r/min ，可利用广泛的碳源和氮源。

运用此分离纯化方法，经若干代反复纯化，在 YMA 固体培养基（表1）中划线培养，得到多株纯菌株系，纯菌株系经水培回接试验验证其结瘤固氮能力，本实施例分离纯化到结瘤率高和固氮能力强菌株系 AXLQ16 。

表1 YMA（Yeast Mannitol Agar）培养基配方

实施例2 根瘤菌 AXLQ16 的16s rDNA 序列测序

对根瘤菌单克隆菌液进行 PCR 特异性扩增，引物分别为 V3-V4-F 和 V4-V5-R，正向引物V3-V4-F为5′-GWATTACCGCGGCKGCTG-3′；反向引物V4-V5-R 为5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′，酶选用 2×star Mix。PCR 扩增产物做电泳成像技术进行检测，观察其是否具有条带，将剩余 PCR 扩增产物用于序列测定。测序结果如SEQ ID NO:1所示。其 PCR 反应体系如表2：

表2 16s rDNA 2×starMix酶反应体系

从 NCBI(GenBank)数据库中获取 12 个参比菌株序列，运用软件 BioEdit 和 MEGA6对分离菌株和参比菌株的 16s rDNA 部分序列进行分析，构建分离菌株与参比菌株的系统发育树(附图 2 )。从而确定根瘤菌 AXLQ16 为快生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新菌株系，并命名为福农 1 号。

实施例3 水培回接试验

1、菌株培养：将 -80℃ 保存的供试菌株转接于 YMA 液体培养基液体培养，培养至对数期，其菌株的生长情况用核酸蛋白测定仪检测，利用 OD 值计算含菌量。YMA(YeastMannnitol Agar)液体培养基配方为：称取甘露醇 10 g， MgSO₄∙7H₂O 0.2g，NaCl 0.1 g，酵母粉 3 g，K₂HPO₄ 0.25 g，KH₂PO₄ 0.25 g，CaCO₃ 3 g(保存时添加)，琼脂 15 g溶于 1 L 纯水中。

2、灭菌处理：将试验所需用的 2.5L 塑料桶、烧杯、镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒包好，将蛭石用保鲜袋装好， 121℃ ，灭菌 30 min 。YMA液体培养基、蒸馏水用瓶子装好，121℃ ，灭菌 20 min 。

将花生的种子放入 1g/L HgCl₂ 中 3min 进行表皮灭菌，并用清水反复冲洗干净，放入装有蛭石的 2.5L 塑料桶在人工生长室催芽 7 天，待胚根长出 3-5cm 即可回接水培。

3、水培及接种：

(1) 将催芽完成的花生放置于培养皿中，并置入纯化的根瘤菌（附图4），将花生根部完全没入根瘤菌中30min ，菌含量为 10⁹ ∙mL^-1 。

(2) 将上述已经回接好的花生移栽入 2.5L 塑料盆中并加入2L植物低氮营养液，并在人工生长室进行培养。生长室(光周期为：日/夜= 16h/8h ，温度为：日/夜= 26℃/24℃ )所述植物低氮营养液配方为：Ca(NO₃)₂∙4H₂O 0.03 g，MgSO₄·7H₂O 0.12 g, CaCl₂·2H₂O0.10 g，KH₂PO₄ 0.10 g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.15 g，C₆H₅O₇Fe·5H₂O 0.005 g，微量元素1 mL，蒸馏水 1000 mL, pH 5.8-6.0。微量元素配方(g∙L^-1): H₂MoO₄ 0.02 g，MnSO₄ 1.81 g，H₃BO₃ 2.86 g，CuSO₄·5H₂O 0.8 g，ZnSO₄·7H₂O 0.22 g。

以不接种为对照，做 3 个重复，接种 30 天后收获，以植株鲜重、干重、结瘤数、植株含氮量和 SPAD 值作为测定根瘤菌的结合性和固氮能力的判断指标。

结果显示，空白对照(CK)无结瘤现象，回接处理平均每棵花生可结瘤 23.33个。切开根瘤发现，根瘤内部为红色，基本判定供试菌株 AXLQ16为具有固氮效率的根瘤菌(附图4)，且对其根瘤固氮酶活性进行测定，其值为1.06 umol∙(g∙h)^-1 。

由图3和图5可知，与不接种根瘤菌相比，闽花 8 号接种根瘤菌AXLQ16可极显著提高其植株鲜重、植株干重、SPAD 值和植株含氮量(P<0.01)。说明根瘤菌AXLQ16的结合性和固氮效率均较高。

实施例4 田间接种试验

1、菌种培养：将 -80°C 保存的供试菌株转接于 YMA 液体培养，培养至对数期，其菌株的生长情况用核酸蛋白测定仪检测，利用 OD 值计算含菌量；YMA(Yeast Mannnitol Agar)液体培养基成分为：称取甘露醇 10 g， MgSO₄∙7H₂O 0.2g，NaCl 0.1 g，酵母粉 3 g，K₂HPO₄0.25 g，KH₂PO₄ 0.25 g，CaCO₃ 3 g(保存时添加)，琼脂 15 g溶于 1 L 纯水中。

2、大田试验实施：本试验在福建省安溪县龙涓乡举源村举源茶业合作社茶园进行。播种时期为2018年3月28日。本试验设有2个处理：接根瘤菌AXLQ16（福农1号）与不接根瘤菌剂处理，同时按5 kg 钙镁磷肥/亩的施肥量施用钙镁磷肥，钙镁磷肥以底肥的方式按照统一的标准一次性施入。本试验设3次重复。试验采取随机区组设计，于茶行间种植，每个茶行播种1行，播种密度为200cm×25cm(茶行距×株距)。播种、施肥、灌溉、杂草及病虫害按花生常规管理执行。

田间调查在花生的开花期（2018年6月26日）、结实期进行（2018年7月26日），调查了单株结瘤数、生物量、SPAD值、植株含氮量、单株产量（结果见图 6）。

从图 6 可见，接种根瘤菌AXLQ16能够促使花生结瘤。接种处理与不接种处理的根瘤个数存在着显著性差异。接种处理的单株生物量与不接种处理的单株生物量呈现显著性差异，接种根瘤菌有利于促进花生生长（如图7）。接种处理的花生地上部干重明显比不接种处理的高，增加的幅度为 33.6% 。接种根瘤菌 AXLQ16对于花生结荚数有显著的影响，增加的幅度为 48.6% 。接种根瘤菌 AXLQ16 对于花生产量有显著的影响，增加的幅度为65.6%。

本试验研究表明，在不施用氮肥的情况下，单纯使用根瘤菌 AXLQ16 有明显的增产效果，可见由本研究室研制出来的根瘤菌 AXLQ16 可以用于大面积的推广施用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种根瘤菌AXLQ16 及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc 60

gcacgtaggc ggatcgatca gtcaggggtg aaatcccagg gctcaaccct ggaactgcct 120

ttgatactgt cgatctggag tatggaagag gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa 180

ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc gaaggcggct cactggtcca ttactgacgc 240

tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 300

cgatgaatgt tagccgtcgg gcagtatact gttcggtggc gcagctaacg cattaaacat 360

tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacg 408

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gwattaccgc ggckgctg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgtcaattc mtttragttt 20

Claims (3)

1.一种根瘤菌（Rhizobium sp.）AXLQ16，于2018年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2018214。

2.根据权利要求1所述一种根瘤菌AXLQ16菌株，其特征在于其16s rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。

3.如权利要求1所述的根瘤菌AXLQ16菌株在提高花生产量中的应用。