CN1555682A - 轮叶黑藻工程苗快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域。运用轮叶黑藻组织培养技术，获得并大规模扩繁其优质工程苗，以克服该物种在自然环境中种源有限且污染严重的问题。满足目前湖泊生态修复工程中作为净水工具种和植被恢复先锋物种、鱼虾蟹塘养殖过程中作为饵料、避难和产卵场所，以及室内观赏水族养殖过程中作为布景材料的迫切需要。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速生产轮叶黑藻优质工程苗的方法。
二、背景技术
轮叶黑藻(Hydrilla verticillata Royle)是水鳖科黑藻属一种水生草本植物，生长在淡水湖泊中。该植物对水体污染具有很高的耐受性，在富营养化水体生态修复工程中可充当净水工具种和植被恢复先锋物种。该植物还被广泛栽植于鱼、虾和蟹塘中，不仅可以为上述水产品提供饵料，也可以为之提供必要的避难和产卵场所。另外，在室内观赏水族养殖过程中，该植物也是常用的造景材料。
目前市场上对轮叶黑藻种苗需求量很大。但有关轮叶黑藻的研究都集中在其自然种群的分布、其耐污性与净水效果、以及其在鱼虾蟹养殖中的应用。在实践过程中，轮叶黑藻种源都采集于自然环境。打捞过程中根系多遭受一定程度的破坏，且植株个体间又大小不一，不利于其成功移植。另外，自然来源的轮叶黑藻多数带菌，不利于鱼虾蟹塘和室内观赏水族缸中的安全使用。最后轮叶黑藻主要以冬芽繁殖，自然环境中种源有限，过量采集容易导致其原生生境的破坏。
迄今国内外未见有关轮叶黑藻无菌苗的培养及其大规模人工繁殖的研究与报道。
三、发明内容
本发明的目的是：利用植物组织培养技术，获得并在室内大规模繁殖轮叶黑藻工程苗，并尽量保持其无菌，以克服该物种野外收集有限且污染严重的弊端，适应我国淡水湖泊植被恢复、野外鱼虾蟹水产养殖以及室内观赏水族布景的需要。
本发明的技术方案是：
1.轮叶黑藻原始种源的采集与准备
于秋冬季从野外湖泊中采集轮叶黑藻植株，剪取带冬芽的茎段，于肥皂水中浸泡2h以上，用自来水洗净后，培养在温室中。每日更换自来水，且每周添加适量Hoagland大量元素营养液(见表1)。温室中光照强度1000lx左右，每日光照10h，温度25℃左右。
表1.Hoagland大量元素营养液配方为：
| 试剂名称 | 用量(每L) |
| Ca(NO3)2 | 0.821g |
| KNO3 | 0.506g |
| MgSO4·7H2O | 0.616g |
| KH2PO4 | 0.272g |
| Fe-EDTANa2-EDTAFeSO4·7H2O | 7.45mg5.57mg |
*上述试剂中除Fe-EDTA两种成分须先加热熬合，其余各成分均各自用蒸馏水配成100倍母液，用时用自来水将各成分混合并防止沉淀，pH调整为6.0。
2.轮叶黑藻无菌苗的获得
取上述在温室中培养2周以上的冬芽，用70％乙醇浸泡一定时间，再用适当浓度的NaClO漂白剂并一定比例的Tween-80浸泡一定时间，用无菌水彻底漂洗后，接种于1/2Ms液体培养基中(见表2)，于组培室中培养。光照强度1500lx左右，每日光照10h，温度仍为25℃左右。期间注意观察，随时剔除仍然污染的材料。
3.轮叶黑藻无菌苗的大规模繁殖
上述材料中的无菌个体经过20d培养后，多数茎叶已明显伸长，植株粗壮。将材料于超净工作室中分割成带2～3节的小段，接种于相同成分的培养液中。各小段经一段时间培养后，多数会在小节处长出侧芽。待侧芽长大后切下，可继续分割，再接种于1/2Ms培养液中，以获得更大量茎芽；也可直接将侧芽切下，转接到1/4Ms液体培养基中，20d后多数将长出1～3cm长的根。上述培养也在组培室中进行，光照和温度不变。
4.轮叶黑藻工程苗的壮苗
将1/4Ms培养基中茎长6cm以上，根系发达的轮叶黑藻取出，可直接满足室内观赏水族布景的需要。若用于大型湖泊植被恢复和鱼虾蟹塘移栽，须先移栽到底部铺有灭过菌的沙石的大玻璃缸中。保持水深50cm以上，每周换水并添加一定量Hoagland营养液以促进其生长。当室外白昼气温20℃以上时，将玻璃缸置于室外，直接利用太阳光照；否则，仍放于温室中，保持温度并补充人工光照。当植株长至40cm以上时可进行大规模移栽。
5.轮叶黑藻工程苗的应用
收获1/4Ms培养液中茎长6cm以上的健康轮叶黑藻植株，用自来水将植株上残留的培养液冲洗干净后，根据布景的需要，栽种于室内观赏水族缸中。收获大玻璃缸中40cm以上的健康轮叶黑藻植株，采用合适的密度，单独或与其它水生物种一起移栽到目标湖泊中，用于目标地植被恢复与水质净化，或移栽到鱼虾蟹塘中，建群后用作鱼虾蟹饲料并为之提供避难和产卵场所。
表2.Ms液体培养基基本配方为：
| 试剂名称 | 用量(mg/L) | 试剂名称 | 用量(mg/L) |
| 大量元素 | 微量元素 | ||
| NH4NO3 | 1650 | KI | 0.83 |
| KNO3 | 1900 | H3BO3 | 6.2 |
| CaCl2·2H2O | 440 | MnSO4·4H2O | 22.3 |
| MgSO4.7H2O | 370 | ZnSO4·7H2O | 10.6 |
| KH2PO4 | 170 | Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| 有机成分 | CuSO4·5H2O | 0.025 | |
| 肌醇 | 100 | CoCl2·6H2O | 0.025 |
| 烟酸 | 0.5 | Fe-EDTA熬合剂 | |
| 盐酸吡哆醇 | 0.5 | Na2-EDTA | 37.3 |
| 盐酸硫胺素 | 0.1 | FeSO4-7H2O | 27.8 |
| 甘氨酸 | 2.0 | ||
| 蔗糖 | 30000 |
*将上述除蔗糖外的成分按大量元素、微量元素、有机成分和Fe-EDTA熬合剂用蒸馏水配成4种50倍母液，用时用蒸馏水再混合稀释，蔗糖现溶。调整pH到5.7后分装到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于121℃、0.1MPa左右湿热灭菌18min。
本发明的效果在于：
1)获得了轮叶黑藻无菌苗。野外采集的轮叶黑藻原材料本身污染严重，而该水草茎叶细嫩，又兼有吸收能力，使其灭菌过程具有相当难度。本技术采用肥皂水浸洗，并在自来水配合低浓度的营养液中预培养一定时间，先初步降低污染程度，并提高材料活力。再通过乙醇和NaClO漂白剂共同作用，彻底灭菌。本技术中选用轮叶黑藻的冬芽，有利于材料本身对消毒剂的抵抗力。通过该程序，在保证无菌率60％以上的基础上，材料存活率也在50％以上。
2)建立了轮叶黑藻工程苗快速繁殖途径。本技术在获得轮叶黑藻无菌苗的基础上，直接利用其侧芽进行分割繁殖，步骤简单，操作方便，所用试剂均为常规化工产品，成本低廉，便于其大规模工厂化生产。以20d为一个分割周期，每个无菌冬芽或侧芽至少可分割成4个带2～3小节的茎段，而每个茎段至少分蘖出3个侧芽，以此估算，每个原始芽一年内可至少分出(4×3)17个新芽。而每个幼芽自萌出到长成6cm以上完整植株约需40d，以此估算，一个长×宽为120cm×60cm的8层普通培养架，可年生产轮叶黑藻工程苗25000株以上。
本项发明可不分季节，随时为湖泊植被恢复、鱼虾蟹塘养殖和室内水族观赏布景提供足够的轮叶黑藻优质工程苗。
四、具体实施方式
实例1.于11月从苏州东太湖采集轮叶黑藻种源，剪取带冬芽的茎段，于肥皂水中浸泡4h后用自来水漂洗。用2L烧杯培养在温室中。每日更换自来水，且每周添加一次Hoagland营养液。温室中光照强度1000lx左右，每日光照10h，温度25℃左右。15d后选取茎杆粗壮，叶片无缺损的冬芽30枚，用70％乙醇浸泡数秒，再用稀释适当比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白剂浸泡数分钟，用无菌水彻底漂洗后，接种于含40mL 1/2Ms液体培养基的封口三角瓶中，于组培室中培养。平均光照强度1500lx，每日光照10h，温度25℃左右。此后每日观察，随时剔除污染材料，1周后得无菌芽21枚。20d后多数冬芽长至4cm以上，并有部分冬芽在基部又长出了侧芽。在无菌条件下切下1～2cm长的茎尖芽段，转接到1/4Ms液体培养基中。另外剩余茎段材料以每2～3小结再分段，继续培养在1/2Ms培养液中。又经20d，在1/4Ms中共有25个芽段发育成带根植株。将这些完整植株转接到新的1/4培养液中再培养一段时间后用于观赏水族布景。同时在1/2Ms中培养的材料经20d也分化出92个新芽，继续切割培养。实例2.取保存在温室中带冬芽的轮叶黑藻茎段，于肥皂水中浸泡3h后用自来水彻底漂洗，再在流动自来水中培养。采用自然光照，温度25℃左右。48h后切取茎杆粗壮，叶片无缺损的冬芽50枚，用70％乙醇浸泡数秒，再用稀释适当比例并含有一定量Tween-80的NaClO漂白剂浸泡数分钟，用无菌水彻底漂洗后，接种于含40mL 1/2Ms液体培养基的封口三角瓶中，于组培室中培养。光照强度1500lx左右，每日光照10h，温度仍为25℃。此后随时剔除仍然污染的材料，1周后得无菌芽34枚。20d后在无菌条件下将培养物全部切成至少带2～3小结的茎段，继续培养在1/2Ms培养液中。又经20d，共获得413个新芽，将其中1.5cm以上长度的新芽取下，转接到1/4Ms培养液中，再培养30d，共获得356株健康幼苗。将这些幼苗移栽到铺有灭过菌的沙石的大玻璃缸中，用于湿地植被恢复研究。
Claims (4)
1.一种轮叶黑藻无菌苗培养及其工程苗快速扩繁的方法，其特征为该方法利用植物组织培养原理，经过一系列预培养和灭菌过程，获得轮叶黑藻无菌冬芽，切段后培养于1/2Ms液体培养基中以获得更多新芽，再将芽段转接到1/4Ms液体培养基中以诱导根的形成，继续培养至茎长6cm以上，转到大玻璃缸中，补充Hoagland营养液继续壮苗，直到植株长到40cm以上。
2.根据权利要求1所述轮叶黑藻工程苗的应用，其特征在于该工程苗在湖泊植被恢复工程中的应用。
3.根据权利要求1所述轮叶黑藻工程苗的应用，其特征在于该工程苗在鱼虾蟹养殖过程中的应用。
4.根据权利要求1所述轮叶黑藻工程苗的应用，其特征在于该工程苗在室内观赏水族养殖过程中的应用。
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