CN111454985A - 一种简易可视化的转基因植物筛选系统及其应用 - Google Patents

一种简易可视化的转基因植物筛选系统及其应用 Download PDF

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CN111454985A CN202010202610.5A CN202010202610A CN111454985A CN 111454985 A CN111454985 A CN 111454985A CN 202010202610 A CN202010202610 A CN 202010202610A CN 111454985 A CN111454985 A CN 111454985A
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黄振
段真珍
周宇明
李慧雪
张木清
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C12N15/8212—Colour markers, e.g. beta-glucoronidase [GUS], green fluorescent protein [GFP], carotenoid

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Abstract

本发明公开了一种简易可视化的转基因植物筛选方法及其应用。本发明所提供的一种简易可视化的转基因植物筛选方法为含有可视化标记基因的植物表达载体，所述含有可视化标记基因的植物表达载体为花青素生物合成途径中的重要调控基因AtPAP2。本发明将颜色调控基因应用到植物遗传转化操作上，有效减轻了转化后的筛选工作，根据该基因在植株上的表现，可有选择的保留有价值的转化材料，从而大大节省筛选时间和研究经费，且实验结果的准确度和可信度大大提高，这为开展转化后分析工作奠定了很好的基础。另外，本发明利用颜色基因的瞬时表达，可更为直观地对转化效果进行可视化分析，从而避免各种影响转化因素的发生。

Description

一种简易可视化的转基因植物筛选系统及其应用
技术领域
本发明涉及转基因植物领域，具体为一种简易可视化的转基因植物筛选系统及其应用。
背景技术
花青素是一类在植物中广泛存在的次级代谢产物，属于黄酮类物质。在自然界中花青素赋予了花草、树木多彩缤纷的颜色，有助于其吸引各种昆虫媒介进行授粉、种子传播，同时，花青素在植物抵抗各种逆境胁迫等方面也具有较为重要的作用。现代医学研究表明，花青素在治疗心脏病和癌症，清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面具有重要疗效[4]，因而关于花青素的研究也越来越受到人们的重视。因此用花青素代替传统的筛选标记是安全的。目前传统的转基因实验主要nptII为筛选标记，gus或gfp为报告基因，筛选效率低、准确性差。报告基因用于检测转化事件。理想的报告基因应具有易检测、低内源背景、易定量分析等特点，检测过程不应对植株造成损伤。常用的报告基因有beta-葡萄糖苷酸酶，萤火虫荧光素酶，绿色荧光蛋白等。虽然目前有很多种方法检测是否为转基因植株，但是以花青素基因作为遗传转化的报告基因优势明显：无需筛选条件、无需进行组织化学检测或特殊的仪器设备、肉眼即可观测，十分方便。
发明内容
为了解决现有技术中转基因筛选的筛选效率低、准确性差的问题，本发明从拟南芥中分离克隆了AtPAP2基因并构建了高效的植物表达载体，通过农杆菌介导法将AtPAP2基因转入到烟草中，培养获得了紫色的烟草，并利用qRT-PCR检测了转AtPAP2基因烟草中花青素合成相关基因的表达量变化情况，初步解析了AtPAP2基因在花青素合成中的作用，本发明具体是通过以下技术方案来实现的：
一种简易可视化的转基因植物筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤a.得到AtPAP2基因；
步骤b.将AtPAP2基因转接入pMD18-T载体中，得到pMD18-PAP2；
步骤c.将步骤b得到pMD18-PAP2转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到含有pMD18-PAP2的大肠杆菌DH5α；
步骤d.提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA，分别进行限制性酶切反应并回收目的片段后进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2；
步骤e.将步骤d得到的pGNP-PAP2转入农杆菌EHA105感受态细胞；
步骤f.将步骤e得到的含有pGNP-PAP2的农杆菌EHA105浸染并将其导入受体植物细胞中。
进一步的，所述AtPAP2基因是以拟南芥cDNA为模板，利用引物对pPAP2-F和pPAP2R进行PCR扩增获取的，所述pPAP2-F核苷酸序列为：5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAG-3’，所述pPAP2-R核苷酸序列为：5’-CAAGTTCAACAGTCTCTCC-3’。
进一步的，所述pMD18-T载体是通过引物对M13-F和M13-R进行PCR扩增获取的，所述M13-F核苷酸序列为：
5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，所述M13-R核苷酸序列为：
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
进一步的，提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA用限制性内切酶BstXI和KpnI分别进行双酶酶切反应，纯化相应的质粒酶切产物，利用胶回收纯化试剂盒分别纯化相应的质粒酶切产物，并在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2。
同时，提出了基于权利要求1至4任一所述的方法在筛选转基因植物中的应用。
进一步的，所述转基因植物为烟草。
本发明的有益效果是：AtPAP2在烟草中可以高效表达，农杆菌浸染过后约2个周即可看到紫色愈伤出现，紫色愈伤长成的紫色烟草相对于正常的野生型烟草，仅存在颜色差异，生长状态，生长速度均不受影响，表明AtPAP2基因可以在烟草中表达且不影响烟草的正常生长。AtPAP2作为报告基因最大的优势是转化后较短的时间内就可以直接的观察到紫色愈伤和紫色的烟草，不需要组织化学染色和特殊的仪器观察，极其方便。因此AtPAP2具有传统报告基因不可比拟的优势，十分适合在烟草的遗传转化中作为报告基因使用。
附图说明
图1为本发明中花青素生物合成途径的流程图；
图2为拟南芥叶片总RNA提取和AtPAP2基因克隆结果，其中，A为拟南芥叶片总RNA，B为拟南芥AtPAP2基因的克隆；
图3为物表达载体pGNP-PAP2的构建图谱；
图4为载体pMD18-AtPAP2双酶切产物；
图5为农杆菌EHA105转化子的单克隆菌液PCR产物；
图6为转基因烟草株系的PCR检测；
图7为转AtPAP2基因烟草植株表型观察，其中，A：农杆菌浸染后的烟草叶片；B：紫色抗性愈伤组织；C：愈伤组织分化出丛生芽；D-E：诱导生根的紫色抗性烟草小苗；F-H：转基因烟草(右)和未转基因烟草(左)整株、根部和叶片的比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
一种简易可视化的转基因植物筛选方法，具体包括以下步骤：
步骤a.得到AtPAP2基因；
步骤b.将AtPAP2基因转接入pMD18-T载体中，得到pMD18-PAP2；
步骤c.将步骤b得到pMD18-PAP2转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到含有pMD18-PAP2的大肠杆菌DH5α；
步骤d.提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA，分别进行限制性酶切反应并回收目的片段后进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2；
步骤e.将步骤d得到的pGNP-PAP2转入农杆菌EHA105感受态细胞；
步骤f.将步骤e得到的含有pGNP-PAP2的农杆菌EHA105浸染并将其导入受体植物细胞中。
进一步的，所述AtPAP2基因是以拟南芥cDNA为模板，利用引物对pPAP2-F和pPAP2R进行PCR扩增获取的，所述pPAP2-F核苷酸序列为：5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAG-3’，所述pPAP2-R核苷酸序列为：5’-CAAGTTCAACAGTCTCTCC-3’。
进一步的，所述pMD18-T载体是通过引物对M13-F和M13-R进行PCR扩增获取的，所述M13-F核苷酸序列为：
5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，所述M13-R核苷酸序列为：
5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
进一步的，提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA用限制性内切酶BstXI和KpnI分别进行双酶酶切反应，纯化相应的质粒酶切产物，利用胶回收纯化试剂盒分别纯化相应的质粒酶切产物，并在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2。
同时，提出了基于权利要求1至4任一所述的方法在筛选转基因植物中的应用。
进一步的，所述转基因植物为烟草。
实施例1
1材料与方法
1.1实验材料
本实验所用的野生型烟草(Nicotiana tabacum cv.xanthinc)无菌苗、野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana Col-0)幼苗、大肠杆菌菌株(DH5α)和农杆菌菌株(EHA105)均由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存，植物表达载体pGNP由美国康涅狄格大学植物学系惠赠。
RNAprep Pure Plant Kit和植物基因组DNA提取试剂盒购自美国Qiagen生物公司，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和2×Taq PCR Mix均购自美国Roche生物公司，pMD18-T simple载体和SYBR Premix Ex Taq TM购自大连宝生物公司，质粒DNA提取试剂盒和DNA胶回收纯化试剂盒购自美国Qiagen生物公司，T4 DNA连接酶购自美国Promega公司，Murashige&Skoog(MS)Basal Medium w/Vitamins购自PhytoTechnology公司，其他实验所用试剂均为进口或国产分析纯。基因序列测定和相关引物合成均由南京金斯瑞生物公司完成。
烟草遗传转化所采用的预培养培养基：MS+6-BA 2.0mg·l-1+NAA 0.2mg·l-1；分化培养基(含抗生素)：MS+6-BA 2.0mg·l-1+NAA 0.2mg·l-1+Kan 75mg·l-1+Timentin150mg·l-1；生根培养基：MS基本培养基；悬浮培养基：液体MS培养基；以上培养基均含有蔗糖30g·l-1，琼脂0.7g·l-1(悬浮培养基除外)，pH5.8～6.0，培养温度为(25±1)℃，除暗培养步骤外，烟草遗传转化过程中其他步骤均在光照下(12h·d-1)培养，光照度1000～2000lx。
1.2拟南芥叶片总RNA提取和AtPAP2基因的克隆
根据GenBank公布的拟南芥AtPAP2基因(登录号为AF325124)序列信息，在开放阅读框两侧设计一对特异性扩增引物，命名为pPAP2-F/R，用以扩增目的基因片段(表1)。
参照美国Qiagen生物公司的RNA提取试剂盒说明书，提取长势良好的拟南芥叶片组织的总RNA，用NanoDrop 2000测定RNA的浓度与纯度。取1μg RNA为模板，采用美国Roche生物公司的反转录试剂盒进行反转录合成第一链cDNA。以拟南芥cDNA为模板，利用pPAP2-F/R引物进行PCR扩增获取目的基因。PCR反应体系为cDNA 1μL、dNTP 2μL、2×Taq PCR Mix10μL、pPAP2-F(10mM)0.5μL、pPAP2-R(10mM)0.5μL，用ddH2O补足至20μL。反应条件为94℃预变性3min；94℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸30sec，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后取1μL产物用1％琼脂糖凝胶检测。同时，利用DNA胶回收试剂盒切胶回收并纯化目的条带，连接至pMD18-T载体中，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上培养，获得单克隆进行PCR检测，将阳性克隆送去南京金斯瑞生物公司进行测序验证，命名为pMD18-PAP2。
表1本实验所用引物
Figure BDA0002419894820000071
Figure BDA0002419894820000081
以上序列依次记为：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.20
1.3植物表达载体的构建及其遗传转化农杆菌
参考美国Qiagen生物公司的质粒DNA提取试剂盒说明提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA，用限制性内切酶BstXI和KpnI进行双酶酶切反应。利用胶回收纯化试剂盒分别纯化相应的质粒酶切产物，并在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至100mg/L卡那霉素的LB平板上，置于37℃培养箱中培养12小时。挑取单克隆并利用菌液PCR进行验证后,将阳性的转化子送南京金斯瑞生物公司进行测序。选择经测序验证序列正确的菌液保存并提取重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2,利用液氮冻融法将该质粒转入到农杆EHA105感受态细胞,随机挑取单克隆利用PCR进行验证,扩增引物pPAP2-F和pPAP2-R序列见表1。
1.4烟草遗传转化及转基因植株的筛选鉴定
剪取数十片无菌烟草组培苗叶片，用刀片切成0.5cm×0.5cm小叶片，置于预培养上暗培养3天。取含有pGNP-PAP2的EHA105农杆菌划线接种至LB固体培养基(Kan 100mg·l-1)，28℃培养过夜后挑取单菌落并接种到50mlLB液体培养基中(Kan 100mg·l-1)，28℃下振荡培养12-16小时至OD600约为0.5，经扩大培养4-6h至OD600约为0.6后低速离心弃上清，用等体积的悬浮培养基重悬菌体。将预培养的叶片置于重悬菌液中10-15min后取出，接种至分化培养基上进行培养，直至长出愈伤并分化出丛生芽，将丛生芽剪下转接至生根培养基上继续培养，直至长成完整的植株。利用植物基因组DNA提取试剂盒提取转基因烟草小苗叶片总DNA，以pPAP2-F和pPAP2-R为引物进行PCR检测，验证AtPAP2基因是否整合到烟草基因组DNA上。
1.5qRT-PCR分析花青素合成相关基因的表达差异烟草的花青素是以苯丙氨酸为前体物质，经过一系列酶促反应而合成的，其间受到编码各类酶合成结构基因的调控，如图1所示，本实验从中选取7个基因，设计合成qRT-PCR的引物见表1，内参基因选取Elongationfactor 1α(EF-1α)，Genbank序列号为AF120093。参照1.2中植物叶片总RNA提取方法，分别提取紫色转基因烟草和野生型烟草的RNA，反转录合成得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，通过与野生型烟草比较，分析转AtPAP2基因紫色烟草中7个基因表达量的变化情况。
2结果与分析
2.1拟南芥叶片总RNA提取和AtPAP2基因的克隆
利用RNA提取试剂盒从拟南芥的叶片中提取了总RNA，如图2A所示，A：拟南芥叶片总RNA，1-2：提取的拟南芥叶片总RNA，以表1中pPAP2-F和pPAP2-R为特异性引物，拟南芥总RNA反转录获得的cDNA为模板，通过PCR扩增获得了AtPAP2基因，1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，获得的目的基因条带约在750bp左右，[与预期AtPAP2基因大小一致，如图2B所示，拟南芥AtPAP2基因的克隆，M：DNA marker DL2000；1：AtPAP2基因PCR产物。将目的条带进行切胶回收纯化后，连接至T/A克隆载体pMD18-T，然后转化至大肠杆菌DH5α。随机挑取单克隆进行菌落PCR验证后，对阳性克隆继续测序验证，将测序结果通过SnapGene Viewer生物学软件进行分析，结果表明克隆的目的片段大小为750bp，与Genebank中AtPAP2基因序列完全一致，含有AtPAP2的完整的编码序列，命名为pMD18T-PAP2，可用于下一步的植物表达载体构建。
2.2植物表达载体的构建及其转化至农杆菌根据图3所示的植物表达载体图谱进行载体构建。先提取pMD18T-PAP2菌液的质粒DNA，与植物表达载体pGNP的质粒DNA同时用限制性内切酶BstXI和KpnI进行酶切，用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测并分别切胶纯化回收AtPAP2目的片段和pGNP载体的大片段如图4所示，其中，M：DNA marker DL2000；1：质粒DNApMD18T-PAP2酶切产物。利用T4 DNA连接酶进行连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含有卡那霉素抗性的筛选培养基上培养。
随机挑取单菌落进行菌落PCR验证，筛选出的阳性克隆命名为pGNP-PAP2。利用液氮冻融法将该质粒转化到农杆菌EHA105感受态细胞中，挑取单菌落进行菌落PCR检测如图5所示，M：DNA marker DL5000；1-3：3个不同的农杆菌转化子的PCR检测，将检测为阳性的菌液送往公司测序，结果表明表明AtPAP2基因已经完整构建至植物表达载体，并成功转化至农杆菌EHA105中，可以用于下一步的植物受体材料的遗传转化。
2.3转基因烟草植株的获得及其表型观察
用含有pGN-PAP2的农杆菌EHA105侵染烟草叶片，置于含有抗生素的培养基上培养约15天左右，可以看到叶片周围有紫色的抗性愈伤组织出现，继续培养10-15天即可分化出紫色的丛生芽。待紫色抗性丛生芽长出叶片，将其接种至含抗生素的生根培养基上继续培养，大约5-7天开始生根，继续培养20天左右烟草幼苗可长至5-10cm高，可将其移栽至土壤中。提取紫色抗性转基因烟草植株的基因组DNA，利用表1中特异性引物pPAP2-F和pPAP2-R对其进行PCR检测，结果显示表现为紫色的抗性烟草苗均能够扩增出750bp的AtPAP2基因序列，如图6所示，证实了该外源基因已经整合进入烟草基因组。
过培养观察发现，相对于野生型烟草，紫色的转基因烟草仅在植株叶片、茎和根等器官的颜色上存在差异，在其生长速度，生长状态及开花结实特性等方面均表现为完全一致，进一步表明了AtPAP2基因在转基因烟草中可以过量表达，从而使得转基因烟草呈现出紫色如图7A-G所示，其中，A：农杆菌浸染后的烟草叶片；B：紫色抗性愈伤组织；C：愈伤组织分化出丛生芽；D-E：诱导生根的紫色抗性烟草小苗；F-H：转基因烟草(右)和未转基因烟草(左)整株、根部和叶片的比较。
结论：上述实验表明：本发明从拟南芥中分离克隆了AtPAP2基因并构建了高效的植物表达载体，通过农杆菌介导法将AtPAP2基因转入到烟草中，培养获得了紫色的烟草，并利用qRT-PCR检测了转AtPAP2基因烟草中花青素合成相关基因的表达量变化情况，初步解析了AtPAP2基因在花青素合成中的作用。
应用本发明中的筛选方法可以从表型上观察到是否为转基因植株。
AtPAP2在烟草中易于转化，农杆菌浸染过后约2个星期，即可看到紫色愈伤出现，紫色愈伤长成的紫色烟草相对于正常的野生型烟草，仅存在颜色差异，生长状态，生长速度均不受影响，表明AtPAP2基因可以在烟草中表达且不影响烟草的正常生长。AtPAP2作为报告基因最大的优势是转化后较短的时间内就可以直接的观察到紫色愈伤和紫色的烟草，不需要组织化学染色和特殊的仪器观察，极其方便。因此AtPAP2具有传统报告基因不可比拟的优势，十分适合在烟草的遗传转化中作为报告基因使用。
AtPAP2基因是拟南芥花青素生物合成途径中的重要调控基因，为了实现该基因在烟草中的高效表达，我们从拟南芥中分离克隆出了AtPAP2基因并构建了植物表达载体，利用农杆菌介导的浸染方法，将该基因成功转入到烟草受体材料中，并获得了紫色的转基因烟草植株，相对于野生型烟草，该烟草在根、茎、叶等组织上均表现出不同程度的紫色。进一步的qRT-PCR分析结果表明，在花青素生物合成途径中，AtPAP2基因的表达可以上调从4-香豆酰CoA到最终合成花青素的过程中的相关基因，促进了合成反应的进行，对花青素的合成具有重要的作用。本发明对于揭示AtPAP2基因的作用以及烟草花青素合成途径相关基因的调节机理具有重要的意义。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Figure BDA0002419894820000141
Figure BDA0002419894820000151
Figure BDA0002419894820000161
Figure BDA0002419894820000171
Figure BDA0002419894820000181
Figure BDA0002419894820000191
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序列表
<110> 广西大学
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<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttggacatcg acagttccag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggcgttgaa gctcatactg 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggaattaggc acacactttg c 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgagatgcac cacgaagctc 20
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccaacattgt caccaggaag tg 22

Claims (6)

1.一种简易可视化的转基因植物筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤a.得到AtPAP2基因；
步骤b.将AtPAP2基因转接入pMD18-T载体中，得到pMD18-PAP2；
步骤c.将步骤b得到pMD18-PAP2转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到含有pMD18-PAP2的大肠杆菌DH5α；
步骤d.提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA，分别进行限制性酶切反应并回收目的片段后进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2；
步骤e.将步骤d得到的pGNP-PAP2转入农杆菌EHA105感受态细胞；
步骤f.将步骤e得到的含有pGNP-PAP2的农杆菌EHA105浸染并将其导入受体植物细胞中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述AtPAP2基因是以拟南芥cDNA为模板，利用引物对pPAP2-F和pPAP2R进行PCR扩增获取的，所述pPAP2-F核苷酸序列为：
5’-ATGGAGGGTTCGTCCAAAG-3’，所述pPAP2-R核苷酸序列为：5’-CAAGTTCAACAGTCTCTCC-3’。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pMD18-T载体是通过引物对M13-F和M13-R进行PCR扩增获取的，所述M13-F核苷酸序列为：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’，所述M13-R核苷酸序列为：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中具体为：提取pMD18-PAP2和植物表达载体pGNP的质粒DNA用限制性内切酶BstXI和KpnI分别进行双酶酶切反应，纯化相应的质粒酶切产物，利用胶回收纯化试剂盒分别纯化相应的质粒酶切产物，并在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到重组质粒DNA，命名为pGNP-PAP2。
5.基于权利要求1至4任一所述的方法在筛选转基因植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转基因植物为烟草。
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