WO1996023072A1 - Für glutathion-s-transferase kodierende desoxyribonukleinsäure und ihre verwendung - Google Patents

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WO1996023072A1
WO1996023072A1 PCT/EP1996/000068 EP9600068W WO9623072A1 WO 1996023072 A1 WO1996023072 A1 WO 1996023072A1 EP 9600068 W EP9600068 W EP 9600068W WO 9623072 A1 WO9623072 A1 WO 9623072A1
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dna
gstiiic
plants
transgenic plants
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PCT/EP1996/000068
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Barbara Bieseler
Peter Reinemer
Rüdiger Hain
Karlheinz Mann
Hans-Jörg REIF
Jürgen Ernst THOMZIK
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Bayer Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to a new deoxyribonucleic acid (DNA) and its use for the transformation of vectors, host organisms and plants and for the production of plants which have increased resistance to herbicides.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • Glutathione-S-transferases are multifunctional proteins that play an essential role in the detoxification of cytotoxic substances.
  • the enzymes catalyze the conjugation of reduced glutathione to electrophilic, hydrophobic
  • GSTIIIc glutathione-S-transferase IIIc
  • plants in whose genome the new GSTIIIc DNA was incorporated have an increased resistance to herbicides, preferably heteroaryloxyacetamide herbicides, in comparison with the corresponding “starting plants”
  • the new GSTIIIc DNA was isolated from mutin maize (Zea grass). This DNA codes for the protein GS ⁇ IIc of the amino acid sequence according to SEQ ID NO 2. In plant cells, 2 molecules of the protein GS ⁇ IIc spontaneously form the dimeric active enzyme (hereinafter referred to as "GSTIIIc enzyme"), which ensures the detoxification of the herbicide used and thus the plants against that
  • the GSTIIIc DNA preferred according to the invention has the sequence listed in SEQ ID NO: 1
  • GSTIIIc DNA as contained on the vector plasmids pET3a-GSTIIIc and pSS-GSTIIIc described below
  • the new GSTIIIc DNA can be in the form of a single strand or in the form of the double strand which additionally contains a strand which is complementary to the respective single strand
  • the usual promoters which are active in plants can be used.
  • the promoter of the gene of the small subunit of ribulose-1,5-b-phosphate-carboxylase (rbsc) is exemplary. see EMBO Journal, vol 5 No. 9, 2063-2071 (1986)) Promoters of plant viruses are preferably used, where in the CaMN 35S R ⁇ A promoter should be mentioned as an example.
  • the known construct from the CaMN 35S enhancer and the CaMN 35S promoter (“CaMV 35S double promoter") which follows in 5'-3 'order is particularly preferably used.
  • a corresponding preferred construct from the GSTIIIc-D ⁇ A and the CaMN double promoter is contained on the vector plasmid pSS-GSTMc explained below.
  • the natural promoter which regulates the expression of the GSTIIIc-D ⁇ A in maize, variety mutin.
  • the type of the 3'-termination sequence following the GSTTIIc-D ⁇ A in 5'-3 'order is largely variable and is not of critical importance for the present invention. Plant 3'-termination sequences are preferably used.
  • the natural termination sequence of the GSTÜIc gene from maize, variety Mutin, can also be used as an example.
  • Also part of the present invention is the new protein GS ⁇ IIc with the amino acid sequence according to SEQ ID ⁇ O: 2 and its likewise new dimer
  • DNA sequences or protein according to the invention also include the DNA sequences or protein sequences derived from this DNA or from this protein.
  • DNA or protein sequences derived from this DNA or from this protein.
  • Proteins with derived sequences are to be understood as DNA or protein which still have the essential features of the GSTIIIc-DNA or the protein GSTIIIc (possibly as a GSTIIIc enzyme in the dimeric form), which are therefore essentially equivalent, i.e. produce the herbicide resistance according to the invention to a sufficient extent in plants.
  • Sequences may be missing individual DNA's, codons, and / or partial DNA sequences or individual amino acids or partial amino acid sequences (in the case of DNA, for example, by using restriction enzymes) and / or by other, essentially equivalent DNA, codons and DNA Partial sequences or amino acids or partial amino acid sequences can be replaced. Such modifications can be due to the degeneration of the genetic code or result from the manipulation of the GSTIIIc DNA or the protein GSTIIIc or the GSTIIIc enzyme.
  • the DNA according to the invention can also contain DNA's, codons or DNA sequences which facilitate its handling, for example so-called Linkers or which of such linkers remain after manipulations (eg after cuts with restriction enzymes).
  • the GSTIIIc DNA or the protein GSTIIIc or the GSTIIIc enzyme can be of natural origin or can be partially or completely in synthesized form.
  • Part of the present invention is also a recombinant prokaryotic or eukaryotic DNA which contains the new GSTIIIc DNA or a DNA derived therefrom as "foreign” or “additional” DNA.
  • examples include viral DNA, microbial DNA (in particular bacterial DNA, such as DNA from Escherichia coli or Agrobacterium tumefaciens) and vegetable DNA.
  • the GSTHIc DNA according to the invention and the DNA sequences derived therefrom and the recombinant prokaryotic or eukaryotic DNA and the DNA sequences derived therefrom can be used as "foreign” or “additional” DNA in vectors (in particular plasmids, cosmids or phages), in transformed or transgenic microorganisms (preferably bacteria, such as Escherichia coli or Agrobacterium tumefaciens) as well as in transformed or transgenic plant cells and plants or in their DNA.
  • vectors, microorganisms, plant cells and plants and their DNA are part of the present invention.
  • the vector plasmids pET3a-GSTIIIc and pSS-GSTIIIc may be mentioned as particularly preferred vectors. Both vectors contain the GSTIIIc DNA according to the invention as shown in SEQ ID NO: 1.
  • the plasmid pET3a-GSTIIIc contains the GSTIIIc DNA on a Ndel / BamHI-
  • the GSTIIIc DNA as Xbal / BamHI fragment was purified from the vector pET3a-GSTIIIc and cloned into the plasmid Bluescript-SKII (Xbal / BamHI-linearized; Stratagene).
  • the GSTIIIc DNA was then isolated from the plasmid Bluescript-SKII-GSTIIIc obtained in this way via an Sstl / Smal restriction cleavage and ligated into the vector pRTlOl (Sstl / Smal-linerized; Töpfer et al. 1987).
  • the GSTIIIc DNA was then purified as an EcoRI / Smal fragment from the vector pRTlOl-GSTTIIc thus obtained and cloned into the binary vector pSS (EcoRI / Smal-linearized; Voß et al. 1994).
  • the coding GSTIIIc DNA is under the control of a duplicated 35S RNA promoter from CaMV.
  • the plasmid pSS-GSTIIIc (10000 bps) is shown as Fig. 2.
  • the person skilled in the art can isolate the GSTIIIc DNA according to the invention from the plasmids mentioned by the generally customary methods and methods.
  • the Escherichia coli strains DS pET3a-GSTfflc and DS pSS-GS ⁇ IIc and their mutants may be mentioned as particularly preferred transformed or transgenic microorganisms according to the invention.
  • the strain DS pET3a-GSTIIIc contains the plasmid pET3a-GS ⁇ Üc and the strain DS pSS-GSTIIIc contains the plasmid pSS-GSTIIIc.
  • Mutants according to the invention are those microorganisms which still contain the features which are essential for the implementation of the invention, that is to say in particular also contain the plasmids pET3a-GSTIIIc and / or pSS-GSTIIIc or DNA sequences derived therefrom. These strains can be propagated according to the generally accepted methods.
  • the plamides pET3a-GSTIIIc and pSS-GSTIIIc can also be isolated from these microorganisms by the generally customary methods.
  • the Escherichia coli strain pET3a-GSTIIIc was obtained from the German Collection of Microorganisms (DSM), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany in accordance with the provisions of the Treaty of Budapest on the international recognition of the deposit of microorganisms for the Purposes of patent procedures deposited (Filing date: January 17, 1995).
  • the strain received the deposit number DSM 9677.
  • the present invention also includes transgenic plants and plant cells (including protoplasts) and plant Parts (such as callus, leaves, stems, bleeds, parts of blood, roots, tubers, seeds and other propagation material) of such transgenic plants which contain in their genome the GSTIIIc DNA or DNA sequences derived therefrom and / or a recombinant prokaryotic or eukaryotic DNA according to the invention contained as "foreign" or "additional" DNA
  • transgenic plants according to the invention also include the progeny of the transgenic plants obtainable according to the invention and the cross-breeding results with other plants and their progeny as long as these transgenic plants contain the GSTIIIc DNA or DNA sequences derived therefrom as "foreign" or "additional" DNA
  • Preferred transgenic plants are those plants which contain the GSTIIIc DNA according to SEQ ID NO 1 as “foreign” or “additional” DNA in their genome
  • transgenic plants are those plants which have in their genome the construct of the CaMV 35S double promoter and the GSTIIIc
  • Very particularly preferred transgenic plants are those plants which contain in their genome the GSTIIIc DNA according to SEQ ID NO: 1 and / or the construct from the CaMV 35S double promoter and the GSTIIIc DNA according to SEQ ID NO 1 as "foreign" DNA. So far, no plants have become known, apart from the maize variety Mutin, which contain a DNA corresponding to GSTIIIc DNA in their genome
  • “foreign” DNA is to be understood as such DNA which is not naturally contained in a certain prokaryotic or eukaryotic (including plant) genome, but is only incorporated into this genome by human intervention (transformation)
  • "Additional” DNA is a DNA that is already present in the respective prokaryotic or eukaryotic genome, but is added to this genome by human intervention (transformation).
  • the "foreign” or “to” ⁇ sentence "DNA can be incorporated in one or more copies depending on the need and type of the present case As has already been explained, the main objective of the present invention is that new plants are produced which have an increased resistance to herbicides, preferably to heteroaryloxyacetamide herbicides.
  • novel transgenic plants according to the invention are preferred which, in addition to the properties stated above (content of “foreign” or “additional” GSTIIIc DNA), have an increased resistance to herbicides, in particular, in comparison to the corresponding non-transgenic plants against heteroaryloxyacetamide herbicides. Cultures of these transgenic plants can thus be treated with the herbicides to control unwanted plants without damaging the crop plants.
  • the increased herbicide resistance of the transgenic plant cells and plants according to the invention is important for agriculture and forestry, for ornamental plant cultivation, medicinal plant cultivation and plant cultivation.
  • the present invention thus also relates to a process for the production of transgenic plant cells (including protoplasts) and plants (including plant parts and seeds) with increased resistance to herbicides, which is characterized in that
  • the desired plant parts are obtained from the transgenic plants of the parent generation or further generations obtained therefrom.
  • Process steps (a), (b) and (c) can be carried out in a conventional manner by known processes and methods.
  • Transgenic plant cells including protoplasts
  • plants including plant parts and seeds
  • Parts of the present invention are also:
  • transgenic plant cells according to the invention including protoplasts
  • plants including plant parts and seeds
  • Ti plasmid from Agrobacterium tumefaciens is available as a particularly inexpensive and widely applicable vector for the transfer of "foreign” or "additional" DNA into genomes of dicotyledonous and monocotyledonous plants.
  • the genetic material which codes for the protein GSTIIIc is optionally used together with regulatory DNA sequences in the T-DNA of suitable Ti plasmids (for example Zambryski et al., 1983) and by infection of the plant, infection of parts of plants or Plant tissues, such as, for example, from leaf disks, stems, hypocotyls, cotyledons, meristems and tissues derived therefrom, such as, for example, secondary embryos and calli, or by coculturing protoplasts with Agrobacterium tumefaciens.
  • suitable Ti plasmids for example Zambryski et al., 1983
  • Plant tissues such as, for example, from leaf disks, stems, hypocotyls, cotyledons, meristems and tissues derived therefrom, such as, for example, secondary embryos and calli, or by coculturing protoplasts with Agrobacterium tumefaciens.
  • the DNA uptake can also be favored by an electric field (electroporation) (e.g. Fromm et al., 1986).
  • the DNA can also be introduced in a known manner via plant pollen by "bombarding" pollen or other plant parts with physically accelerated particles which carry the DNA (cf. EP-A 0 270 356).
  • the GSTIIIc-DNA from the plasmid pET3a-GSTIIIc is cloned into a binary expression vector (e.g. Voss et al. (1994)).
  • the chimeric gene construct is then transferred to Agrobacterium tumefaciens (Koncz and Schell 1986).
  • the chimeric gene construct on the vector pSS-GSTIIIc is transferred in the usual way by direct gene transfer to plant protoplasts (for example Hain et.al. 1985).
  • the plasmid can be in circular, but preferably in linear form.
  • kanamycin-resistant protoplasts are then checked for expression of GSTIIIc
  • Transformed (transgenic) plants or plant cells are produced using the known methods, e.g. by leaf disc transformation (e.g. Horsch et al. 1985), by coculture regenerating plant protoplasts or cell cultures with Agrobacterium tumefaciens (e.g. Marton et al. 1979, Hain et al. 1985) or by direct DNA transfection. Resulting transformed plants are either selected by selection for the expression of the reporter gene, e.g. by phosphorylation of kanamycin sulfate in vitro (Reiss et al. 1984; Schreier et al. 1985) or by the expression of nopaline synthase (according to Aerts et al. 1983) or by GS ⁇ IIc by Northern blot analysis and Western blot analysis grasslands.
  • the protein GSTIIIc can also be detected in a known manner in Western blot analyzes with the aid of specific antibodies in transformed plants.
  • the cultivation of the transformed plant cells and the regeneration to complete plants is carried out according to the generally customary methods with the aid of the appropriate nutrient media.
  • Herbicides especially against heteroaryloxyacetamide herbicides.
  • plants means both complete plants and parts of plants, such as leaves, seeds, tubers, cuttings, etc.
  • Plant cells include protoplasts, cell lines, plant calli, etc.
  • Propagation material means plants and plant cells which can be used to multiply the transformed plants and plant cells and is therefore also part of the present invention
  • Plants which can be given increased resistance to herbicides by incorporating (transforming) the GSTIIIc DNA according to the invention include practically all plants. A particular need for
  • Resistance is naturally produced in crops such as forest plants, such as spruce, fir, Douglas fir, pine, larch, beech and oak, and Plants supplying food and raw materials, e.g. cereals (in particular wheat, rye, barley, oats, millet, rice and corn), potatoes, legumes (such as legumes and in particular alfalfa, soybeans), vegetables (in particular cabbages and tomatoes), fruit (in particular apples , Pears, cherries, grapes, citrus, pineapple and bananas), oil palms, tea, cocoa and coffee bushes, tobacco, sisal and cotton as well as medicinal plants such as rauwolfia and digitalis. Potatoes, sugar beets, sugar cane, cereals such as wheat and barley and sorghum, and rice are particularly preferred.
  • the GSTIIIc DNA according to the invention is preferably incorporated into the genome of plants as "foreign" DNA.
  • Preferred herbicides against which an increased herbicide resistance can be generated according to the invention, belong to the group of heteroaryloxyacetamides.
  • the heteroaryloxyacetamides of the general formula (I) are particularly preferred.
  • Het stands for an optionally substituted heteroaromatic radical with preferably 5 ring members, which preferably contains at least one nitrogen atom and one sulfur or oxygen atom, the particularly preferred radical being 5-trifluoromethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl Rest is called;
  • R 1 for optionally substituted alkyl or alkoxy (each with preference
  • R stands for an optionally substituted aryl radical (preferably phenyl radical, which is preferably substituted by halogen).
  • the protein from etiolated maize seedlings (zea grass), mutin variety, is first purified (1) and the amino acid sequence is determined completely by protein sequence analysis (2). Also from maize seedlings, mRNA is isolated (3) and by Reverse transcriptase enzymatically rewritten into cDNA (4) The cDNA obtained in this way is used as a template in the polymerase chain creatone (Mullis KB, Faloona FA, (1987) Methods Enzymol 155 335-350) for the isolation of the GSTIIIc DNA
  • Buffer A 50 mM potassium phosphate pH 7.3
  • Buffer B 1.0 M potassium phosphate pH 7.3
  • Gradient 0-100% B in 500 ml
  • Buffer B 50 mM potassium phosphate pH 8.0, 5 mM glutathione
  • Buffer B 20 mM Tris HCl pH 8.0, 1.0 M NaCl gradient: 0-25% B in 20 ml
  • the GSTIIIc protein isolated from maize (variety mutin) is reduced, carboxymethylated and dialyzed against 0.2 M ammonium hydrogen carbonate
  • cleavage reactions are terminated by adding 0J% trifluoroacetic acid.
  • Insoluble peptides are centrifuged off, the soluble peptides are separated from one another by reversed-phase HPLC under the following conditions:
  • amino acid sequence of the isolated peptides is applied using the amino acid sequence of the isolated peptides.
  • Biosystems protein sequencers 470A and 473A determined The complete protein sequence of the GSTIIIc protein is shown in SEQ ID No 2
  • the GSTIIIc DNA, the mRNA and the corresponding cDNA contain nucleotide sequences that can be derived from one another.
  • polyadenyherized mRNA from localized maize seedlings is first prepared. The isolation is carried out using Dynabeads Oligo (dT) 25 in accordance with the manufacturer's protocol (Dynal, Oslo / Norway; Jakobsen KS, Breivold E, (1990 ) Nucleic Acids Res 18.3669)
  • This method of purifying poly (A) + RNA is based on the base pair bond between the poly (A) + residues at the 3 'end of mRNA and oligo (dT) residues that are covalent on the surface are bound by magnetic metal balls (Dynabeads) 0.2 g of plant material are used per milligram of Dynabeads.
  • the mRNA isolated with this method is used without further purification steps for the enzymatic synthesis of cDNA
  • cDNA is carried out using the "First Strand cDNA Synthesis Kit” (Pharmacia PL Biochemicals Ine). This method is based on the enzymatic activity of viral DNA polymerases (reverse transcriptases), which synthesize DNA according to an RNA matrix ( Maniatis T, F ⁇ tsch EF, Sambrook j, (1982) Molecular Cloning A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory)
  • reaction is carried out as follows 5 ⁇ m poly (A) + mRNA from maize, type Mutin were mixed with:
  • I I ⁇ m reaction mixture (bulk reaction mix) consisting of:
  • Murine reverse transcriptase 135 mM Tris / HCl, pH 8.3, 204 mM KCl,
  • the mRNA is removed by alkaline hydrolysis.
  • the synthesized cDNA is precipitated and used as a template for the polymerase chain reaction.
  • the nucleotide sequence coding for GSTIIIc is first amplified with the aid of the polymerase chain reaction (Mullis K.B., Faloona F.A., (1987) Methods Enzymol. 155: 335-350).
  • the cDNA produced from maize mRNA serves as the template for the reaction.
  • the primers 1 For specific enrichment of the GSTHIc DNA, the primers 1
  • the polymerase chain reaction takes place in a GeneAmp PCR System 9600 thermal cycler (Perkin Elmer). 1 ⁇ l of Pfu-Dna polymerase (Stratagene, 2500 U / ml) is added as the heat-stable polymerase. Overall 35 reaction cycles with the following temperatures and reaction times were carried out 45 sec at 94 ° C, 45 sec at 58 ° C, 45 sec at 72 ° C.
  • the amplified DNA fragment which contains the nucleotide sequence coding for GSTIIIc, is obtained by agarose gel electrophoresis purified and, as already described, cloned into the vector pET 3a. The complete DNA
  • Sequence of GSTIIIc DNA is determined using the Sequenase DNA Sequencing Kit (United States Biochemical / Cleveland) (Sanger F., Coulson R, (1975) J Mol Biol 94 441-448).
  • transgenic rice plants In comparison to non-transformed controls, transgenic rice plants "show resistance to the herbicide mentioned.
  • Nicotiana tabacum (Petit Havana SRI) is propagated as a sterile sprout culture on hormone-free LS medium (Linsmaier and Skoog 1965). At intervals of approx. 6-8 weeks, shoot sections are placed on fresh LS medium.
  • the shoot cultures are kept in a culture room at 24-26 ° C under 12 h light (1000-3000 lux).
  • leaf protoplasts approx. 2 g of leaves (approx. 3-5 cm long) are cut into small pieces (0.5 cm x 1 cm) with a fresh razor blade.
  • the leaf material is in 20 ml enzyme solution consisting of K3
  • the pre-cleaned protoplasts are made up to 10 ml with fresh K3 medium (0.4 M sucrose as an osmotic agent) and floated again.
  • the washing medium is suctioned off and the protoplasts are diluted to 1-2 ⁇ 10 5 / ml for culture or subsequent infection with agrobacteria (coculture).
  • the protoplast concentration is determined in a counting chamber.
  • the GSTIIIc DNA and the Shine-Delgarno sequence were cut out as an Xbal BamHI fragment from the vector pET3a-GSTIIIc, purified and into the plasmid Bluescript II Sk +/- (Stratagene, La Jolla, California), hereinafter referred to as pBS -SKII, cloned
  • pBS -SKII plasmid Bluescript II Sk +/-
  • the GSTIIIc DNA was then purified as an EcoRI / Smal fragment from the vector pRTl01 -GSTIIIc and linearized into the expression vector pSS (EcoRI / Smal, cloned (Voss A et al, Molec. Breeding 1: 15-26 (1995)) .
  • the protoplasts are isolated as described and at a density of l-2xl0 5 / ml in K3 medium (0.4 M sucrose, 0.1 mg / ml NAA, 0.2 mg kinetin) for two days in the dark and one or two days incubated under low light (500 lux) at 26 ° C.
  • the Zeil suspension is at a density of 5 x 10 4 / ml in K3 medium (0.3 m sucrose) with 1 mg / 1 NAA (naphthyl-1-acetic acid), 0.2 mg / 1 kinetin and 500 mg / 1 of the cephalosporin antibiotic cefotaxime.
  • K3 medium 0.3 m sucrose
  • NAA naphthyl-1-acetic acid
  • kinetin 500 mg / 1 of the cephalosporin antibiotic cefotaxime.
  • the cell suspension is diluted every week with fresh K3 medium and the osmotic value of the medium is gradually increased by 0.05 M sucrose (approx. 60 mOsm / kg) per Week reduced.
  • kanamycin 100 mg / 1 kanamycin sulfate (Sigma), 660 mg / g active km
  • kanamycin 100 mg / 1 kanamycin sulfate (Sigma), 660 mg / g active km
  • plasmid pSS-GSTIIIc In a Petri dish, approximately 10 6 protoplasts in 180 ⁇ l K3 medium are carefully mixed with 20 ⁇ l aqueous DNA solution containing 20 ⁇ g plasmid pSS-GSTIIIc.
  • the plasmid pSS-GSTIIIc can be obtained by known methods from the plasmids pET3a-GSTIIIc, pRTlOl, pBS-SKII and pSS.
  • 200 ⁇ l of fusion solution (0J M calcium nitrate, 0.45 M mannitol, 25% polyethylene glycol (PEG 6000), pH 9) are carefully added. After 15 minutes, 5 ml of washing solution (0.275 M
  • a modified "bead type culture” technique (Shillito et al. 1983) is used for the culture and selection of kanamycin-resistant colonies described below.
  • K3 medium 0.3 M sucrose + hormones; 1.2% (Seaplaque) LMT agarose (low melting agarose, marine Colloids) are mixed in 5 cm Petri dishes, for this purpose agarose is dry autoclaved and briefly boiled in the microwave after adding K3 medium.
  • the agarose disks (beads) with the embedded tobacco microcalli are added in 10 for further culture and selection cm Petri dishes transferred and each 10 ml K3 medium (OJ M sucrose, 1 mg / 1 NAA, 0.2 mg / 1 Kinetin) and 100 mg / 1 kanamycin sulfate (Sigma) added.
  • the liquid medium is changed every week. The osmotic value of the medium is gradually reduced.
  • the exchange medium (K3 + Km) is reduced by 0.05 M of saccharide (approx. 60 mOsm) per week.
  • Neomycin phosphotransferase (NPT II) enzyme test :
  • NPT II activity in plant tissue is determined by in situ phosphorylation of kanamycin, as described by Reiss et al. (1984) and by Schreier et al. (1985) modified as follows. 50 mg of plant tissue are homogenized in 50 ⁇ l extraction buffer (10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.1% SDS, 0.025% bromophenol blue, 62.5 mM Tris pH 6.8) with the addition of glass powder on ice and for 10 minutes centrifuged in an Eppendorf centrifuge at 4 ° C.
  • the gel is placed on a glass plate of the same size and covered with 40 ml of 1% agarose in reaction buffer which contains the substrates kanamycin sulfate (20 ⁇ g / ml) and 20-200 ⁇ Ci 32 P ATP (Amersha).
  • the sandwich gel is 30 min. incubated at room temperature and then a sheet of phosphocellulose paper P81 (Whatman) is placed on the agarose. About four Filtrie ⁇ apierlagen 3 MM, (Whatman) and some paper towels stacked. The transfer of in situ phosphorylated radioactive kanamycin phosphate to the P81 paper is stopped after 3-4 hours. The P81 paper is for 30 min.
  • the presence of the GSTIIIc DNA was confirmed by Southern blot analysis.
  • the expression of the GSTIIIc-DNA was detected by Northern blot analysis and Wester blots with the help of specific antibodies.
  • Macro elements 1/2 of the concentration of MS salts Macro elements 1/2 of the concentration of MS salts
  • Nicotiana tabacum occidental Havana SRI On the culture of Nicotiana tabacum occidental Havana SRI, Nicotiana tabacum Wiscon ⁇ sin 38, and Nicotiana plumaginifolia protoplasts (Nagy and Maliga, 1976)
  • Vitamins nicotinic acid 1 mg / 1
  • Murashige and Skoog Medium (Murashige and Skoog, 1962) are for the culture of regenerating protoplasts and for tissue culture of tobacco tumors and callus Linsmaier and Skoog (LS) Medium with the following modifications
  • Thiamine is weighed in a higher concentration 0.4 mg / 1 instead of OJ mg / 1,
  • Glycine, pyridoxine and nicotinic acid are missing.
  • Kinetin 0.2 mg / 1 pH 5.7 The following literature can be cited for the transformation of plants or plant cells:
  • T L -DNA gene 5 controls the tissue- specific expression of chimaeric genes carried by a noval type of Agrobacterium linary vector. Mol. Gen. Genet. (1986) 204: 338-396
  • the plants are grown at a temperature of 23 ° C and a relative humidity of 70 - 80%.
  • the treatment with the herbicidal compound mentioned above, formulated as 70 WP (wettable powder), takes place 24 hours after laying out the seeds at concentrations which correspond to an application rate of 2,000-4,000 g of active ingredient / ha.
  • Evaluation takes place 20 days after treatment with herbicide. The percentage of total damage to transgenic plants in comparison to corresponding control plants which were treated with the same concentration of active ingredient is rated.
  • the transformed tobacco plants in which the GSTIHc DNA according to the invention was used, show a markedly increased resistance to high amounts of herbicide (2,000-4,000 g ha) compared to corresponding non-transformed corresponding control plants.
  • GCC GCC ATC CCC TTG CCC CCG CCG CCC TCC TCC TCG GCT TGA 666
  • This international depository accepts the microorganism designated under I, which it received on 19 95 - 01 - 17 (date of first deposit) 1 .
  • microorganism under 1 bcz ⁇ ichnctc was received by this international depository on (date of first deposit) and an application for the conversion of this initial deposit into a deposit under the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the application for conversion).

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ihre Verwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeugung von Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden aufweisen.

Description

FÜR GLUTATHION-S-TRANSFERASE KODIERENDE DESOXYRIBONUKLEINSÄURE UND IHRE VERWENDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Desoxyribonukleinsäure (DNA) und ihre Nerwendung zur Transformation von Vektoren, Wirtsorganismen und Pflanzen sowie zur Erzeugung von Pflanzen, die eine erhöhte Resistenz gegenüber Her- biziden aufweisen.
Es ist bereits bekannt, Pflanzen genetisch so zu verändern, daß sie gegenüber be¬ stimmten Herbiziden eine erhöhte Resistenz aufweisen. Dies ermöglicht es, Her¬ bizide, die bei einer geringen Selektivität ansonsten vorteilhafte Eigenschaften auf¬ weisen, in den Kulturen von solchen Pflanzen, die in der ursprünglichen nicht transgenen Form durch diese Herbizide geschädigt würden, einzusetzen. Durch die Bereitstellung von herbizidresistenten Pflanzen wird somit die Auswahl an ein¬ setzbaren Herbiziden vergrößert, und es ist auch in vielen Fällen möglich, mit relativ geringen Herbizidaufwandmengen auszukommen, z.B. wenn die Be¬ kämpfung der unerwünschten Pflanzen erst nach deren Auflaufen bei Erreichung der jeweiligen Schadschwelle, vorgenommen werden kann. Es besteht somit ein erhebliches Bedürfnis neue Kulturpflanzen zu erzeugen, welche gegenüber wei¬ teren Herbiziden eine erhöhte Resistenz aufweisen.
Glutathion-S-Transferasen sind multifunktionelle Proteine, die eine wesentliche Rolle bei der Entgiftung cytotoxischer Substanzen spielen. Die Enzyme kataly- sieren die Konjugation von reduziertem Glutathion an elektrophile, hydrophobe
Substrate, die natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein können.
Die physiologischen Substrate pflanzlicher Glutathion-S-Transferasen und ihre Rolle im Stoffwechsel der Pflanzen sind im einzelnen nicht bekannt. Nachgewie¬ sen ist jedoch die Beteiligung dieser Enzyme an der Entgiftung und damit am Selektivitätsmechanismus für eine Reihe wichtiger Herbizide aus der Gruppe der
Thiocarbamate, Chloroacetanilide und S-Triacine: Mozer TJ., Tiemeier D.C., Jaworski E.G., Biochemistry 22: 1068-1072 (1983); Moore R.E., Davies M S., O'Connell K.M., Harding EJ, Wiegand R.C., Tiemeier D.C., Nucleic Acids Res. 14 7227-7235 (1983), Grove G , Zarlengo R P , Timmermann K P , Li N , Tarn M F , Tue C P D , Nucleic Acids Res 16 425-438 (1988)
Es wurde nun die neue Desoxyribonukleinsäure gefunden, welche für das neue Pro¬ tein Glutathion-S-Transferase IIIc (im folgenden "GSTIIIc") kodiert, das die in SEQ ID NO 2 aufgeführte Aminosauresequenz aufweist (wobei die neue erfin¬ dungsgemäße DNA im folgenden als "GSTIIIc-DNA" bezeichnet wird )
Weiterhin wurde gefunden, daß Pflanzen, in deren Genom die neue GSTIIIc-DNA eingebaut wurde, im Vergleich zu den entsprechenden "Ausgangspflanzen", eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden, vorzugsweise Heteroaryloxyacetamid- Herbiziden, besitzen
Die neue GSTIIIc-DNA wurde aus Mais (Zea mais) der Sorte Mutin isoliert. Diese DNA kodiert für das Protein GSΗIIc der Aminosauresequenz gemäß SEQ ID NO 2. In Pflanzenzellen bilden 2 Moleküle des Proteins GSΗIIc spontan das dimere aktive Enzym (im folgenden als "GSTIIIc-Enzym" bezeichnet), welches für die Entgiftung des eingesetzten Herbizides sorgt und damit die Pflanzen gegen das
Herbizid resistent werden läßt
Die erfindungsgemäß bevorzugte GSTIIIc-DNA weist die in SEQ ID NO: 1 auf¬ geführte Sequenz auf
Erfindungsgemaß ebenfalls bevorzugt ist die GSTIIIc-DNA, wie sie auf den weiter unten beschriebenen Vektor Plasmiden pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc enthalten
Die neue GSTIIIc-DNA kann in Form eines Einzel Stranges oder in Form des Dop¬ pelstranges vorliegen, der zusätzlich einen zum jeweiligen Einzelstrang komple¬ mentären Strang enthalt
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung wird der
GSTIIIc-DNA am 5'-Ende ein in Pflanzen wirksamer Promotor vorgeschaltet Hierfür können die üblichen, in Pflanzen wirksamen Promotoren verwendet wer¬ den Beispielhaft sei der Promotor des Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose- 1,5-bψhosphat-carboxylase (rbsc) (vgl EMBO Journal, vol 5 Nr 9, 2063-2071 (1986)) genannt Bevorzugt werden Promotoren von Pflanzenviren eingesetzt, wo- bei der CaMN 35S RΝA Promotor als Beispiel genannt werden soll. Besonders bevorzugt wird das bekannte Konstrukt aus dem CaMN 35S Enhancer und dem sich in 5'-3'-Reihenfolge anschließenden CaMN 35S Promotor ("CaMV 35S-Doρ- pelpromotor") verwendet. Ein entsprechendes bevorzugtes Konstrukt aus der GSTIIIc-DΝA und dem CaMN-Doppelpromotor ist auf dem weiter unten er¬ läuterten Vektor Plasmid pSS-GSTMc enthalten. Es ist jedoch auch möglich, den natürlichen Promotor, der die Expression der GSTIIIc-DΝA in Mais, Sorte Mutin reguliert, zu verwenden.
Die Art der sich an die GSTTIIc-DΝA in 5'-3'-Reihenfolge anschließenden 3'-Ter- minationssequenz ist weitestgehend variabel und für die vorliegende Erfindung nicht von entscheidender Bedeutung. Bevorzugt werden pflanzliche 3'-Termina- tionssequenzen eingesetzt. Beispielhaft kann auch die natürliche Terminations- sequenz des GSTÜIc-Gens aus Mais, Sorte Mutin verwendet werden.
Ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung ist das neue Protein GSΗIIc mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID ΝO: 2 sowie dessen ebenfalls neues Dimeres
(GSTIIIc-Enzy ), welches, wie bereits oben ausgeführt wurde, aus 2 Molekülen des Proteins GSTIIIc nach deren Bildung in Pflanzenzellen spontan entsteht.
Zur erfindungsgemäßen DNA bzw. zum erfindungsgemäßen Protein (gegebenfalls in der dimeren Form) gehören jeweils auch die von dieser DNA bzw. von diesem Protein abgeleiteten DNA-Sequenzen bzw. Proteinsequenzen. Unter DNA bzw.
Proteinen mit abgeleiteten Sequenzen soll DNA bzw. Protein verstanden werden, welche noch die wesentlichen Merkmale der GSTIIIc-DNA bzw. des Proteins GSTIIIc (gegebenfalls als GSTIIIc-Enzym in der dimeren Form) aufweisen, die also im wesentlichen gleichwirkend sind, d.h. in Pflanzen die erfindungsgemäße Herbizidresistenz in einem ausreichenden Maße erzeugen. In solchen abgeleiteten
Sequenzen können einzelne DNA's, Kodons, und/oder DNA-Teilsequenzen bzw. einzelne Aminosäuren oder Aminosäuren-Teilsquenzen fehlen (im Falle der DNA z.B. durch die Verwendung von Restriktionsenzymen) und/oder durch andere, im wesentlichen gleichwirkende, DNA's, Kodons und DNA-Teil Sequenzen bzw. Aminosäuren oder Aminosäuren-Teilsequenzen ersetzt sein. Solche Modifikationen können aufgrund der Degeneration des genetischen Kodes vorliegen oder sich bei der Manipulation der GSTIIIc-DNA bzw. des Proteins GSTIIIc oder des GSTIIIc- Enzyms ergeben. Die erfindungsgemäße DNA kann auch DNA's, Kodons oder DNA-Sequenzen enthalten, welche ihre Handhabung erleichtern, z.B. sogenannte Linker oder welche von solchen Linkern nach Manipulationen (z.B. nach Schnitten mit Restriktionsenzymen) übrig bleiben. Die GSTIIIc-DNA bzw. das Protein GSTIIIc oder das GSTIIIc-Enzym kann natürlichen Ursprungs sein oder teilweise oder vollständig in synthetisierter Form vorliegen.
Teil der vorliegenden Erfindung ist auch eine rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die neue GSTIIIc-DNA oder eine davon abgeleitete DNA als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthält. Beispielhaft seien virale DNA, mikrobielle DNA (insbesondere bakterielle DNA, wie DNA von Escherichia coli oder Agrobakterium tumefaciens) und pflanzliche DNA genannt.
Die erfindungsgemäße GSTHIc-DNA sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequen¬ zen sowie die rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA sowie die davon abgeleiteten DNA-Sequenzen können als "fremde" oder "zusätzliche" DNA in Vektoren (insbesondere Plasmiden, Cosmiden oder Phagen), in transformierten bzw. transgenen Mikroorganismen (vorzugsweise Bakterien, wie Escherichia coli oder Agrobakterium tumefaciens) sowie in transformierten bzw. transgenen Pflan¬ zenzellen und Pflanzen bzw. in deren DNA enthalten sein. Diese Vektoren, Mikroorganismen, Pflanzenzellen und Pflanzen sowie deren DNA sind Teil der vorliegenden Erfindung. Sie können, ebenso wie die rekombinante prokaryontische und eukaryontische DNA durch den Fachmann bei Kenntnis der vorliegenden Beschreibung, insbesondere der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2, gemäß den allgemein bekannten und/oder üblichen Verfahren und Methoden erhalten werden.
Als besonders bevorzugte Vektoren seien die Vektor Plasmide pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc genannt. Beide Vektoren enthalten die erfindungsgemäße GSTIIIc- DNA gemäß SEQ ID NO: 1.
Das Plasmid pET3a-GSTIIIc enthält die GSTIIIc-DNA auf einem Ndel/BamHI-
Fragment. Zur Konstruktion dieses Plasmides wurde die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 in die Ndel und BamHI Schnittstellen des Vektors pET-3a (Novagen/Madison) kloniert (Studier F.W., Moffatt B.A., J. Mol. Biol. 189: 1 13- 130; Studier F.W., J. Mol. Biol. 219:37-44 (1991)). Dieses Plasmid (5306 bps) wird in Fig. 1 dargestellt. Die Pfeilrichtung zeigt die Richtung des Promotors und des Gens bzw. der GSTIIIc-DNA mit dem Startkodon ATG. "Amp" steht für das Ampicillin-Resistenzgen. Zur Konstruktion des Plasmids pSS-GSTIIIc wurde die GSTIIIc-DNA als Xbal/BamHI-Fragment aus dem Vektor pET3a-GSTIIIc gereinigt und in das Plasmid Bluescript-SKII (Xbal/BamHI-linearisiert; Stratagene) kloniert. Anschlie¬ ßend wurde die GSTIIIc-DNA über eine Sstl/Smal-Restriktionsspaltung aus dem so erhaltenen Plasmid Bluescript-SKII-GSTIIIc isoliert und und in den Vektor pRTlOl (Sstl/Smal-linerisiert; Töpfer et al. 1987) ligiert. Danach wurde die GSTIIIc-DNA als EcoRI/Smal-Fragment aus dem so erhaltenen Vektor pRTlOl- GSTTIIc gereinigt und in den binären Vektor pSS (EcoRI/Smal-linearisiert; Voß et al. 1994) kloniert. In dem entstandenen Vektor pSS-GSTIIIc steht die kodierende GSTIIIc-DNA unter der Kontrolle eines duplizierten 35S RNA Promotors aus CaMV. Das Plasmid pSS-GSTIIIc ( 10000 bps ) ist als Fig. 2 dargestellt.
Die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA kann bei Bedarf durch den Fachmann aus den genannten Plasmiden nach den allgemein üblichen Verfahren und Methoden isoliert werden.
Als besonders bevorzugte erfindungsgemäße transformierte bzw. transgene Mikro¬ organismen seien die Escherichia coli-Stämme DS pET3a-GSTfflc und DS pSS- GSΗIIc sowie deren Mutanten genannt. Der Stamm DS pET3a-GSTIIIc enthält das Plasmid pET3a-GSΗÜc und der Stamm DS pSS-GSTIIIc enthält das Plasmid pSS-GSTIIIc. Erfindungsgemäße Mutanten sind solche Mikroorganismen, die noch die für die Ausfuhrung der Erfindung wesentlichen Merkmale enthalten, also insbesondere noch die Plasmide pET3a-GSTIIIc und/oder pSS-GSTIIIc oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen enthalten. Diese Stämme können nach den allgemein üblichen Methoden vermehrt werden. Die Plamide pET3a-GSTIIIc und pSS- GSTIIIc können aus diesen Mikroorganismen ebenfalls nach den allgemein üblichen Methoden isoliert werden.
Der Escherichia coli-Stamm pET3a-GSTIIIc wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland in Übereinstimmung mit den Bestimmungen des Bu¬ dapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt (Hinterlegungs¬ datum: 17.01.1995). Der Stamm erhielt die Hinterlegungsnummer DSM 9677.
Wie bereits oben dargelegt wurde, gehören zur vorliegenden Erfindung auch transgene Pflanzen sowie Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan- zenteile (wie Kallus, Blatter, Stengel, Bluten, Blutenteile, Wurzel, Knollen, Samen und sonstiges Vermehrungsmaterial) solcher transgenen Pflanzen, welche in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen und/oder eine erfindungsgemaße rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA als "fremde" oder "zusatzliche" DNA enthalten
Zu den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gehören auch die Nachkommen der erfindungsgemaß erhältlichen transgenen Pflanzen sowie die Kreuzungsergeb¬ nisse mit anderen Pflanzen und deren Nachkommen, solange diese transgenen Pflanzen die GSTIIIc-DNA oder davon abgeleitete DNA-Sequenzen als "fremde" oder " zusatzliche" DNA enthalten
Bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO 1 als "fremde" oder "zusatzliche" DNA ent¬ halten
Besonders bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom das Konstrukt aus dem CaMV 35S Doppelpromotor und der GSTIIIc-
DNA gemäß SEQ ID NO 1 als "fremde" oder "zusatzliche" DNA enthalten
Ganz besonders bevorzugte transgene Pflanzen sind solche Pflanzen, die in ihrem Genom die GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO: 1 und/oder das Konstrukt aus dem CaMV 35S Doppelpromotor und der GSTIIIc-DNA gemäß SEQ ID NO 1 als "fremde" DNA enthalten. Bisher sind keine Pflanzen, außer der Mais-Sorte Mutin, bekanntgeworden, welche eine der GSTIIIc-DNA entsprechende DNA in ihrem Genom enthalten
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll unter "fremder" DNA eine solche DNA verstanden werden, welche in einem bestimmten prokaryontischen oder eukaryonti sehen (einschließlich pflanzlichen) Genom nicht naturlich enthalten ist, sondern erst durch den Eingriff des Menschen (Transformation) in diesen Genom aufgenommen wird "Zusatzliche" DNA ist eine solche DNA, welche in dem jeweiligen prokaryontischen oder eukaryonti sehen Genom zwar bereits vor¬ handen ist, jedoch in zusatzlicher Menge durch Eingriffe durch den Menschen (Transformation) in diesen Genom aufgenommen wird Die "fremde" oder "zu¬ satzliche" DNA kann je nach Bedarf und Art des vorliegenden Falles in einem oder mehreren Exemplaren eingebaut werden Wie bereits dargelegt wurde, liegt die Hauptzielsetzung der vorliegenden Erfin¬ dung darin, daß neue Pflanzen erzeugt werden, die eine erhöhte Resistenz gegen¬ über Herbiziden, vorzugsweise gegenüber Heteroaryloxyacetamid-Herbiziden auf¬ weisen.
Somit werden solche erfindungsgemäße neue transgene Pflanzen bevorzugt, wel¬ che zusätzlich zu den oben angegebenen Eigenschaften (Gehalt an "fremder" oder "zusätzlicher" GSTIIIc-DNA) im Vergleich zu den entsprechenden nicht-trans- genen Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen Herbizide, insbesondere gegen Heteroaryloxyacetamid-Herbizide, aufweisen. Kulturen dieser transgenen Pflanzen können somit mit den Herbiziden zur Bekämpfung von unerwünschten Pflanzen behandelt werden, ohne die Kulurpflanzen zu schädigen.
Die erhöhte Herbizidesistenz der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen ist von Bedeutung für Landwirtschaft und Forsten, für den Zier¬ pflanzenanbau, den Heilpflanzenanbau und die Pflanzenzucht.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung trans- gener Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen) mit erhöhter Resistenz gegen Herbizide, welches da¬ durch gekennzeichnet ist, daß man
(a) ein oder mehrere Exemplare der GSTIIIc-DNA und/oder erfindungsgemäße rekombinante DNA, welche die GSTIIIc-DNA enthalten, die für das Pro¬ tein GSΗIIc kodieren, in das Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls
(b) aus den transformierten Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll¬ ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls vermehrt und gegebenenfalls
(c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder wei¬ terer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflanzenteile (ein¬ schließlich Samen) gewinnt.
Die Verfahrensschritte (a), (b) und (c) können nach bekannten Verfahren und Methoden in üblicher Weise durchgeführt werden. Transgene Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteile und Samen), welche die GSTIIIc-DNA ein oder mehrfach als "fremde" oder "zusätzliche" DNA enthalten sowie solche transformierte Pflan¬ zenzellen und Pflanzen, welche nach den obigen Verfahren erhältlich sind, gehören ebenfalls zur vorliegenden Erfindung.
Teile der vorliegenden Erfindung sind auch die:
(a) Verwendung der GSTIIIc-DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombi- nanten DNA und/oder der erfindungsgemäßen rekombinanten Vektoren und/oder der erfindungsgemäßen transformierten Mikroorganismen zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflan¬ zen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen), die
(b) Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen (einschlie߬ lich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenteilen und Samen) zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflan- zen und deren Vermehrungsmaterial, die
c) Verwendung der auf dem Plasmid pET3a-GSTIIIc enthaltenen cDNA oder ihrer Teile sowie der den Sequenzinformationen gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NOJ entsprechenden DNA-Sequenzen zur Bestimmung von DNA, die für GSTIIIc-Protein bzw. GSTIIIc-Enzym kodieren in Pflanzen sowie (allgemein) bei der Erzeugung von transgenen Pflanzenzellen (einschlie߬ lich Protoplasten) und Pflanzen^einschließlich Pflanzenteilen und Samen) sowie die Verwendung der durch die GSTIIIc-DNA von pET3a-GSTIIIc- codierten Proteinsequenz sowie des Proteins gemäß SEQ ID NO:2 bei der Isolierung und dem Nachweis der GSTIIIc-DNA (z.B. durch die übliche Antikörper-Technik).
Eine Anzahl verschiedener Methoden steht zur Verfügung, die GSTIIIc-DNA, gegebenenfalls als Konstrukt mit dem CaMV35S Doppelpromotor, als "fremde" oder "zusatzliche" DNA in das genetische Material von Pflanzen bzw. Pflanzen¬ zellen einzusetzen Der Gentransfer kann nach den allgemein üblichen bekannten Methoden erfolgen, wobei der Fachmann die leweils geeignete Methode ohne
Schwierigkeiten ermitteln kann Das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens steht als besonders günstiger und breit einsetzbarer Vektor zur Übertragung von "fremder" oder "zusätzlicher" DNA in Genome dikotyler und monokotyler Pflanzen zur Verfügung. Das- genetische Material, welches für das Protein GSTIIIc kodiert, wird gegebenenfalls zusammen mit regulatorischen DNA-Sequenzen in die T-DNA von geeigneten Ti-Plasmiden eingesetzt (z.B. Zambryski et al.,1983) und durch Infektion der Pflanze, Infektion von Pflanzenteilen oder Pflanzengeweben, wie z.B. von Blattscheiben, Stengeln, Hypokotylen, Kotyledonen, Meristemen und davon ableitenden Geweben, wie z.B. sekundären Embryonen und Kalli oder durch Kokultur von Protoplasten mit Agrobacterium tumefaciens übertragen.
Eine Alternative ist die Inkubation von gereinigter DNA, die das gewünschte Gen bzw. die gewünschte DNA enthält, in Pflanzenprotoplasten (z.B. Hain et al., 1985; Krens et al., 1982; Paszkowski et al., 1984) in Gegenwart von Polykationen oder Calziumsalzen und Polyethylenglykol.
Die DNA-Aufnahme kann auch zusätzlich durch ein elektrisches Feld (Elektro- pöration) begünstigt werden (z.B. Fromm et al., 1986).
Die DNA kann in bekannter Weise auch über Pflanzenpollen eingeführt werden, indem Pollen oder andere Pflanzenteile mit physikalisch beschleunigten Partikeln "beschossen" werden, welche die DNA tragen (vgl. EP-A 0 270 356).
Die Regeneration der Pflanzen erfolgt in bekannter Weise mit Hilfe geeigneter
Nährmedien (z.B. Nagy und Maliga 1976).
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die GSTIIIc-DNA aus dem Plasmid pET3a-GSTIIIc in einen binären Expressions¬ vektor kloniert (z.B. Voß et al. (1994)). Das chimäre Genkonstrukt wird dann auf Agrobakterium tumefaciens (Koncz und Schell 1986) übertragen.
Alternativ wird das chimäre Genkonstrukt auf dem Vektor pSS-GSTIIIc in üb¬ licher Weise durch direkten Gentransfer auf Pflanzenprotoplasten übertragen (z.B. Hain et.al. 1985). Dabei kann das Plasmid in zirkulärer, vorzugsweise jedoch in linearer Form, vorliegen. Bei der Verwendung dieses Plasmids mit Reportergen werden Kanamycin-resi- stente Protoplasten dann auf Expression von GSTIIIc überprüft
Transformierte (transgene) Pflanzen bzw. Pflanzenzellen werden nach den bekann¬ ten Methoden, z.B. durch Blattscheiben-Transformation (z.B. Horsch et al. 1985), durch Cokultur regenerierender Pflanzenprotoplasten oder Zellkulturen mit Agro¬ bacterium tumefaciens (z.B. Marton et al. 1979, Hain et al. 1985) oder durch direkte DNA Transfektion erzeugt. Resultierende transformierte Pflanzen werden entweder durch Selektion auf die Expression des Reportergens, z.B. durch die Phosphorylierung von Kanamycinsulfat in vitro (Reiss et al. 1984; Schreier et al. 1985) oder durch die Expression der Nopalinsynthase (nach Aerts et al. 1983) oder von GSΗIIc durch Northern-Blot-Analyse und Western Blot-Analyse nachge¬ wiesen. Das Protein GSTIIIc kann auch in bekannter Weise in Western-Blot- Analysen mit Hilfe spezifischer Antikörper in transformierten Pflanzen nachge¬ wiesen werden.
Die Kultivierung der transformierten Pflanzenzellen sowie die Regeneration zu vollständigen Pflanzen erfolgt nach den allgemein üblichen Methoden mit Hilfe der jeweils geeigneten Nährmedien.
Sowohl die transformierten Pflanzenzellen als auch die transformierten Pflanzen, welche die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA enthalten und welche Bestandteile der vorliegenden Erfindung sind, zeigen eine erheblich höhere Resistenz gegen
Herbizide, insbesondere gegen Heteroaryloxyacetamid-Herbizide.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "Pflan¬ zen" sowohl vollständige Pflanzen als auch Pflanzenteile, wie Blätter, Samen, Knollen, Stecklinge u.s.w.. "Pflanzenzellen" schließen Protoplasten, Zelllinien, Pflanzenkalli usw. ein. "Vermehrungsmaterial" bedeutet Pflanzen und Pflanzen¬ zellen, welche zur Vermehrung der transformierten Pflanzen und Pflanzenzellen verwendet werden können und ist somit ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung
Zu den Pflanzen, welchen durch den Einbau (Transformation) der erfindungs¬ gemäßen GSTIIIc-DNA eine erhöhte Resistenz gegenüber Herbiziden verliehen werden kann, gehören praktisch alle Pflanzen Ein besonderes Bedürfnis zur
Resistenzerzeugung besteht naturgemäß bei den Kulturpflanzen, wie Forstpflanzen, z.B Fichten, Tannen, Douglasien, Kiefern, Lärchen, Buchen und Eichen sowie Nahrungsmittel und Rohstoffe liefernden Pflanzen, z.B. Getreide (insbesondere Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Hirse, Reis und Mais), Kartoffel, Leguminosen (wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohnen), Gemüse (insbesondere Kohlarten und Tomaten), Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Wein- trauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffee- sträucher, Tabak, Sisal und Baumwolle sowie bei Heilpflanzen, wie Rauwolfia und Digitalis. Besonders bevorzugt seien Kartoffel, Zuckerrüben, Zuckerrohr, Getreide, wie Weizen und Gerste und Sorghum, und Reis genannt. Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße GSTIIIc-DNA als "fremde" DNA in den Genom von Pflanzen eingebaut.
Bevorzugte Herbizide, gegen die erfindungsgemäß eine erhöhte Herbizidresistenz erzeugt werden kann, gehören zur Gruppe der Heteroaryloxyacetamide. Besonders bevorzugt sind hierbei die Heteroaryloxyacetamide der allgemeinen Formel ( I )
Het-O-CH2-CO-NR1R2 ( I )
in welcher
Het für einen gegebenfalls substituierten heteroaromatischen Rest mit vorzugs¬ weise 5 Ringliedern steht, der vorzugsweise wenigstens ein Stickstoffatom und ein Schwefel- oder Sauerstoffatom enthält, wobei als besonders bevorzugter Rest der 5-Trifluormethyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl-Rest genannt sei;
R1 für gegebenfalls substituiertes Alkyl oder Alkoxy (mit jeweils vorzugsweise
1-4 Kohlenstoffatomen) steht; und
R für einen gegebenfalls substituierten Arylrest (vorzugsweise Phenylrest, welcher vorzugsweise durch Halogen substituiert ist) steht.
Solche Herbizide sind bereits bekannt (vgl. z.B. EP-A-18 497 und die entsprechen- de US-Patentschrift Nr. 4 645 525, die EP-A-94 541 und die entsprechende
US-Patentschrift Nr. 4 585 471 sowie die EP-A- 348 737 und die entsprechende US-Patentschrift Nr. 4 968 342). Die in diesen Patentanmeldungen bzw. Patent¬ schriften genannten Herbizide sind im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt wird erfindungsgemaß eine Resistenz gegen das in der EP-A-348 737 und in der entsprechenden US-Patentschrift Nr 4 968 342 genannte Herbizid mit der chemischen Bezeichnung (5-Tπfluormethyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl- oxy)-essigsaure-N-isopropyl-N-(4-fluorphenyl)-amιd (vorgeschlagener common name Thiafluamide) Diese Resistenz erlaubt den Einsatz des genannten Herbizi¬ des auch in solchen Kulturen, die in der nicht-resistenten Form in einer nicht akzeptablen Weise durch das Herbizid geschadigt wurden
Die vorliegende Erfindung soll anhand der folgenden beispielhaften Ausführungen naher erläutert werden
I. Isolierung der GSTIIIc-DNA aus Mais
Bei der Isolierung der GSTIIIc-DNA werden die bekannten Verfahren und Methoden der Molekularbiologie verwendet, wie sie beispielsweise in folgendem Handbuch beschrieben werden Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Second Edition 1989
Zur Isolierung der GSTIIIc-DNA wird zunächst das Protein aus etiolierten Maiskeimlingen (Zea mais), Sorte Mutin, gereinigt (1) und die Amino¬ sauresequenz vollständig durch Proteinsequenzanalyse bestimmt (2) Eben¬ falls aus Maiskeimlingen wird mRNA isoliert (3) und durch Reverse Transkriptase enzymatisch in cDNA umgeschrieben (4) Die so gewonnene cDNA wird als Matrize in der Polymerase-Kettenreatkon (Mullis K.B , Faloona F A, (1987) Methods Enzymol 155 335-350) zur Isolierung der GSTIIIc-DNA eingesetzt
1. Isolierung des GSTIHc-Proteins aus Mais, Sorte, Mutin
Zur Reinigung des GSTIIIc-Proteins werden Maiskeimlinge aufgeschlossen und mit 0,2 M Tπs/HCl pH 7,8, 1 M EDTA (2 ml/g Fπschgewicht) versetzt Die Suspension wird zentπfugiert und die Proteinfraktion im Überstand durch fraktionierte Ammoniumsulfatfallung mit einer Sättigung von 30 % und 70 % gewonnen Die Isolierung des GSTIIIc-Proteins erfolgt durch Chromatographie auf folgenden Säulen mit den aufgeführten Puffer¬ bedingungen A) Sephadex G-100 (Trennmedium auf Dextranbasis), v = 500 ml (Pharmacia)
Puffer A: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,3
B) DEAE-Sepharose (vernetzte Agarosematrize mit kovalent gebun- dener Diethylamino-ethyl-Gruppe), v = 50 ml (Pharmacia)
Puffer AJ0 mM Kaliumphosphat pH 7,3 Puffer B: 1,0 M Kaliumphosphat pH 7,3 Gradient: 0-100 % B in 500 ml
C) Glutathion-Sulfobromophthalein-Agarose, v = 20 ml (Sigma) Puffer A: 50 mM Kaliumphosphat pH 7,3
Puffer B: 50 mM Kaliumphosphat pH 8,0, 5 mM Glutathion
D) Mono Q HR 5/5 (Anionenaustauscher-Material auf Basis quervernetzter Agarose mit geladenen -CH2N(CH3)3 + -Gruppen, Partikelgröße von 10+5 μm), v = 1 ml (Pharmacia) Puffer A: 20 mM Tris/HCl pH 7,5
Puffer B: 20 mM Tris HCl pH 8,0, 1,0 M NaCl Gradient: 0-25 % B in 20 ml
2. Proteinsequenzanalyse des GSTIIIc-Proteins
Das aus Mais (Sorte Mutin) isolierte GSTIIIc-Protein wird reduziert, car- boxymethyliert und gegen 0.2 M Ammoniumhydrogencarbonat dialysiert
(Glazer A.N., Delange RJ., Sigman D.S., (1975) Chemical Modification of Proteins, Elsevier Biomedical Press, Amsterdam). Die anschließende Spal¬ tung des Proteins mit den Endoproteasen Asp-N (sequencing grade, Boehringer Mannheim) oder Trypsin (TPCK-treated, Worthington) erfolgt bei 23°C für 16 Stunden mit einem Protein-Protease- Verhältais von 1 :100.
Die Spaltungsreaktionen werden durch Zugabe von 0J % Trifluoressigsäu- re beendet. Unlösliche Peptide werden abzentrifugiert, die löslichen Peptide werden durch Reversed-Phase-HPLC unter folgenden Bedingungen von¬ einander getrennt:
Säule: Vydac C 18 (Trenngel auf Silicabasis mit aliphatischen Ket¬ ten (C18)), 0,46 cm x 25 cm Eluent A OJ % Trifluoressigsaure
Eluent B OJ % Trifluoressigsaure, 90 % Acetonitril
Gradient 0 - 60 % B in 40 min
Flußrate 0,25 ml/min
Die Aminosauresequenz der isolierten Peptide wird mit Hilfe der Applied
Biosystems Proteinsequenatoren 470A und 473A bestimmt Die vollstän¬ dige Proteinsequenz des GSTIIIc-Proteins ist in SEQ ID No 2 dargestellt
3. Isolierung von poly(A) + mRNA aus Mais (Sorte Mutin)
Die GSTIIIc-DNA, die mRNA und die entsprechende cDNA enthalten Nukleotidsequenzen, die voneinander abgeleitet werden können. Zur Iso¬ lierung der GSTIIIc-DNA wird zunächst polyadenyherte mRNA aus etio- lierten Maiskeimlingen präpariert Die Isolierung erfolgt mit Hilfe von Dynabeads Oligo (dT)25 entsprechend dem Protokoll des Herstellters (Dynal, Oslo/Norwegen; Jakobsen K.S., Breivold E , (1990) Nucleic Acids Res 18.3669) Diese Methode zur Reinigung von poly(A) + RNA basiert auf der Basenpaarbindung zwischen den poly(A) + -Reste am 3'-Ende von mRNA und oligo(dT)-Resten, die kovalent auf der Oberfläche von mag¬ netischen Metallkugeln (Dynabeads) gebunden sind Pro Milligramm Dynabeads werden 0,2 g Pflanzenmaterial eingesetzt Die mit dieser Me- thode isolierte mRNA wird ohne weitere Reinigungsschritte für die enzy- matische Synthese von cDNA eingesetzt
4. Enzy atische Synthese von cDNA
Die Herstellung von cDNA wird mit Hilfe des "First Strand cDNA Synthesis Kits" (Pharmacia P-L Biochemicals Ine ) durchgeführt Diese Methode basiert auf der enzymatischen Aktivität von viralen DNA-Poly- merasen (Reverse Transkriptasen), welche DNA nach einer RNA-Matπze synthetisieren (Maniatis T , Fπtsch E F , Sambrook j , (1982) Molecular Cloning A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory)
Entsprechend den Angaben des Herstellern wird die Reaktion folgender- maßen durchgeführt 5 μm poly(A) + mRNA aus Mais, Sorte Mutin wurden versetzt mit:
1 μm 0,5 M Dithioeritrit
I μm d(T)16_18-Primer
I I μm Reaktionsmischung (Bulk Reaction Mix) bestehend aus:
Murine Reverse Transkriptase, 135 mM Tris/HCl, pH 8,3, 204 mM KCl,
27 mM MgCl2, 0,24 mg/ml BSA, 5,4 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
Nach einer Reaktionszeit von einer Stunde bei 37°C wird die mRNA durch alkalische Hydrolyse entfernt. Die synthetisierte cDNA wird gefällt und als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt.
Amplifizierung, Klonierung und Sequenzierung der GSTIIIc-DNA
Zur Isolierung der GSTIIIc-DNA wird die für GSTIIIc codierende Nukleotidsequenz zunächst mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ampli- fiziert (Mullis K.B., Faloona F.A., (1987) Methods Enzymol. 155:335-350). Als Matrize für die Reaktion dient die aus Mais-mRNA hergestellte cDNA. Zur spezifischen Anreicherung der GSTHIc-DNA werden die Primer 1
(forward) gemäß SEQ ID NO: 3 und Primer 2 (reverse) gemäß SEQ ID No: 4 eingesetzt.
Reaktionsansätze mit folgender Zusammensetzung werden hergestellt:
5 μm cDNA (200 ng/μl) 1 μm 50 μM Primer 1
1 μm 50 μM Primer 2
4 μl 250 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP
5 μl 200 mM Tris HCl, pH 8,8, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 15 mM Mg Cl2, 1 % Triton X-100 34 μl H,O
Die Polymerase-Kettenreaktion erfolgt in einem GeneAmp PCR System 9600-Thermocycler (Perkin Eimer). Als hitzestabile Polymerase wird 1 μl Pfu-Dna-Polymerase (Stratagene, 2500 U/ml) zugesetzt. Insgesamt werden 35 Reaktionszyklen mit folgenden Temperaturen und Reaktionszeiten durchgeführt 45 sec bei 94°C, 45 sec bei 58°C, 45 sec bei 72°C Das am- plifizierte DNA-Fragment, welches die für GSTIIIc kodierende- Nukleotid- sequenz enthalt, wird durch Agarosegelelektrophorese gereinigt und, wie bereits beschrieben, in den Vektor pET 3a kloniert Die vollständige DNA-
Sequenz der GSTIIIc-DNA (SEQ ID NO- 1) wird unter Verwendung des Sequenase DNA Sequencing Kits (United States Biochemical/Cleveland) bestimmt (Sanger F., Coulson R , (1975) J Mol Biol 94 441-448).
Transformation von Reis
Die Transformation von Reis (Oryza sativa) kann entsprechend der Me¬ thoden, die in folgenden Literaturstellen beschrieben werden, durchgeführt werden
Zhang H M., Yang H., Rech E.L , Golds T J , Davis A.S , Mulligan BJ., (1988) Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plas- mid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep 7 379-384
Zhang W., Wu R., (1988) Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasats and correctly regulated expression of the foreign gene in the plant. Theor. Appl. Gen 76 835-840
Shimamoto K, Terada R , Izawa T., Fujimoto H , (1989) Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts Nature 338.274-276
Datta S K , Peterhans A , Datta K, Potrykus I , (1990) Genetically engineered fertile indica-πce recovered from protoplasts Biotechnol 6 736- 740
Hayashimoto A., Li Z , Murai N , (1990) A polyethylene glycolmediated transformation System for production of fertile transgenic rice plants Plant
Physiol 93 857-863
Für die Übertragung des Vektors pSS-GSTIIIc in Reis wurde die Methode von Hayashimoto et al (1990) ohne Veränderungen verwendet Kanamycinrestistente Transformanden wurden in Northern Blot-Experi- menten auf die Expression von GSTIIIc überprüft. Die Bildung des GSTIIIc-Proteins wurde durch spezifische Antiköφer nachgewiesen. Die enzymatische Aktivität des Proteins konnte im Rohextrakt von trans¬ formierten Reispflanzen gezeigt werden durch den Nachweis der enzym¬ katalysierten Modifikation des Herbizides (5-Trifluormethyl-l,3,4-thiadia- zol-2-yl-oxy)-essigsäure-N-isoproypl-N-(4-fluoφhenyl)-amid.
Transgene Reispflanzen weisen im Vergleich zu nicht transformierten Kon¬ trollen" eine Resistenz gegenüber dem genannten Herbizid auf.
ID. Transformation von Tabak
a) Kultur von Tabaksprossen und Isolierung von Tabakprotopasten
Nicotiana tabacum (Petit Havanna SRI) wird als sterile Sproßkultur auf hormonfreiem LS Medium (Linsmaier und Skoog 1965) vermehrt. In Ab- ständen von ca. 6-8 Wochen werden Sproßabschnitte auf frisches LS-
Medium umgesetzt. Die Sproßkulturen werden bei 12 h Licht (1000- 3000 Lux) in einem Kulturraum bei 24-26°C gehalten.
Für die Isolierung von Blattprotoplasten werden ca. 2 g Blätter (ca. 3-5 cm lang) mit einer frischen Rasierklinge in kleine Stücke (0,5 cm x 1 cm) ge- schnitten. Das Blattmaterial wird in 20 ml Enzymlösung, bestehend aus K3
Medium (Nagy und Maliga 1976), 0,4 M Saccharose, pH 5,6, 2 % Zellu- lase RIO (Serva), 0,5 % Macerozym RIO (Serva) für 14-16 h bei Raum¬ temperatur inkubiert. Danach werden die Protoplasten durch Filtration über 0,30 mm und 0J mm Stahlsiebe von Zellresten getrennt. Das Filtrat wird 10 Minuten lang bei 100 x g zentrifugiert Während dieser Zentrifugati on flotieren intakte Protoplasten und sammeln sich in einer Bande am oberen Rand der Enzymlösung. Das Pellet aus Zellresten und die Enzymlösung werden mit einer Glaskapillare abgesaugt. Die vorgereinigten Protoplasten werden mit frischem K3 Medium (0,4 M Saccharose als Osmotikum) auf 10 ml aufgefüllt und erneut flotiert. Das Waschmedium wird abgesaugt und die Protoplasten werden für Kultur oder folgende Infektion mit Agrobak- terien (Kokultur) auf 1-2 x 105/ml verdünnt Die Protoplastenkonzentration wird in einer Zählkammer bestimmt.
b) Konstruktion des Vektors pSS-GSTIIIc und Übertragung in Agro- bacterium tumefaciens
Die GSTIIIc-DNA und die Shine-Delgarno-Sequenz wurde als Xbal BamHI-Fragment aus dem Vektor pET3a-GSTIIIc herausgeschnitten, gereinigt und in das Plasmid Bluescript II Sk +/- (Stratagene, La Jolla, Californien), im folgenden bezeichnet als pBS-SKII, kloniert Verwendet wurden die Schnittstellen Xbal und BamHl Anschließend wurde die
GSTIIIc-DNA über die Schnittstellen Sstl und Smal aus dem Vektor pBS- SKII-GSTIIIc herausgeschnitten, isoliert und in den Vektor pRTl O l (Sstl/Smal linearisiert) ligiert (Töpfer R, Matzeit V., Gronenborn B., Schell J., Steinbiß H.H., (1987) Nucleic Acids Res. 14:5890).
Danach wurde die GSTIIIc-DNA als EcoRl/Smal-Fragment aus dem Vektor pRTl 01 -GSTIIIc gereinigt und in den Expressionsvektor pSS (EcoRl/Smal linearisiert, (Voß A et al, Molec. Breeding 1:15-26 (1995)) kloniert.
Statt der genannten Vektoren können beliebige andere Expressionsvektoren und intermediäre Vektoren, die entsprechende Schnittstellen aufweisen, ein¬ gesetzt werden, wobei der Fachmann anhand der obigen Angaben eine ge¬ eignete Auswahl leicht treffen kann. Der resultierende intermediäre Vektor pSS-GSTIIIc, der die GSTIIIc-DNA enthält, wird nach Agrobacterium tumefaciens, das eine funktioneile vir-Region enthält, übertragen (Koncz und Schell 1986, van Haute et al. 1983).
c) Transformation von regenerierenden Tabakprotoplasten durch Ko- kultur mit Agrobacterium tumefaciens
Es wird im folgenden die Methode von Marton et al. 1979 mit kleinen
Veränderungen benutzt. Die Protoplasten werden wie beschrieben isoliert und in einer Dichte von l-2xl05/ml in K3 Medium (0,4 M Saccharose, 0,1 mg/ml NAA, 0,2 mg Kinetin) zwei Tage im Dunkeln und ein bis zwei Tage unter Schwachlicht (500 lux) bei 26°C inkubiert.
Sobald die ersten Teilungen der Protoplasten auftreten, werden 30 μl einer Agrobakteriumsuspension gemäß b) in minimal A (Am) Medium (Dichte ca. 109 Agrobakterien/ml) zu 3 ml regenerierenden Protoplasten gegeben. Die Kokulturdauer beträgt 3-4 Tage bei 20°C im Dunkeln. Danach werden die Tabakzellen in 12 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt, mit Seewasser (600 mOsm/kg) auf 10 ml verdünnt und bei 60 x g 10 Minuten lang pelletiert. Dieser Waschvorgang wird noch 1-2 x wiederholt um den größten Teil der Agrobakterien zu entfernen. Die Zeil Suspension wird in einer Dichte von 5 x 104/ml in K3 Medium (0,3 m Saccharose) mit 1 mg/1 NAA (Naphthyl-1 -essigsaure), 0,2 mg/1 Kinetin und 500 mg/1 des Cephalosporin-Antibiotikums Cefotaxim kultiviert. Die Zellsuspension wird jede Woche mit frischem K3 Medium verdünnt und der osmotische Wert des Mediums graduell um 0,05 M Saccharose (ca. 60 mOsm/kg) pro Woche reduziert. Die Selektion mit Kanamycin (100 mg/1 Kanamycinsulfat (Sigma), 660 mg/g aktives Km) wird 2-3 Wochen nach der Kokultur in Agarose "bead type culture" (Shillito et al 1983) gestartet. Kanamycin- resistente Kolonien können 3-4 Wochen nach Beginn der Selektion vom Hintergrund zurückgebliebender Kolonien unterschieden werden.
d) Direkte Transformation von Tabakprotoplasten mit DNA. Calcium- nitrat-PEG Transformation.
In einer Petrischale werden ca. 106 Protoplasten in 180 μl K3 Medium mit 20 μl wäßriger DNA Lösung, welche 20 μg Plasmid pSS-GSTIIIc enthält, vorsichtig gemischt. Das Plasmid pSS-GSTIIIc ist nach bekannten Me¬ thoden aus den Plasmiden pET3a-GSTIIIc, pRTlOl, pBS-SKII und pSS er¬ hältlich. Anschließend werden 200 μl Fusionslösung (0J M Calciumnitrat, 0,45 M Mannit, 25 % Polyethylenglykol (PEG 6000), pH 9) vorsichtig zugegeben. Nach 15 Minuten werden 5 ml Waschlösung (0,275 M
Calciumnitrat pH 6) addiert und nach weiteren 5 Minuten werden die Protoplasten in ein Zentrifugenröhrchen transferiert und bei 60 x g pelliert. Das Pellet wird in einer kleinen Menge K3 Medium aufgenommen und wie im nächsten Abschnitt beschrieben kultiviert Alternativ können die Proto- plasten nach Hain et al. 1985 transformiert werden.
e) Kultur der mit DNA inkubierten Protoplasten und Selektion Kanamycin resistenter Kalli:
Für die im folgenden beschriebene Kultur und Selektion Kanamycin resistenter Kolonien wird eine modifizierte "Bead Type culture"-Technik (Shillito et al. 1983) verwendet. Eine Woche nach Behandlung der Proto¬ plasten mit DNA (vgl. d) werden 3 ml der Zeil Suspension mit 3 ml K3 Medium (0,3 M Saccharose + Hormone; 1 ,2 % (Seaplaque) LMT Agarose (low melting agarose, Marine Colloids) in 5 cm Petrischalen gemischt. Für diesen Zweck wird Agarose trocken autoklaviert und nach Zugabe von K3 Medium im Mikrowellenherd kurz aufgekocht Nach Erstarren der Agarose werden die Agarosescheiben ("beads") mit den eingebetteten Tabak- mikrokalli für weitere Kultur und Selektion in 10 cm Petrischalen trans¬ feriert und je 10 ml K3 Medium (OJ M Saccharose, 1 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin) und 100 mg/1 Kanamycinsulfat (Sigma) addiert. Das Flüssigme¬ dium wird jede Woche gewechselt. Dabei wird der osmotische Wert des Mediums stufenweise herabgesetzt.
Pro Woche wird das Austauschmedium (K3 + Km) um 0,05 M an Saccha¬ rose (ca. 60 mOsm) reduziert.
Schema der Selektion kanamycinresistenter Tabakkolonien nach DNA Transformation:
0,4 M 0J M 0,25 M 0,20 M 0,15 M 0,10 Saccharose im Flüssigmedium
E S K
Wochen nach DNA Aufnahme
(K3 Medium 1 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin)
A = DNA Aufnahme E = Einbettung in Agarose
S = Selektion mit Kanamycin (100 mg/1 Kanamycinsulfat) K = Kanamycinresistente Kolonien können vom Hintergrund eindeutig unterschieden werden
e) Regeneration kanamycinresistenter Pflanzen:
Sobald die kanamycinresistenten Kolonien einen Durchmesser von ca. 0,5 cm erreicht haben, wird die Hälfte auf Regenerationsmedium (LS-Me- dium, 2 % Saccharose, 0,5 mg/1 Benzylaminopurin BAP) gesetzt und bei 12 h Licht (3000-5000 lux) und 24°C im Kulturraum gehalten. Die andere Hälfte wird als Kalluskultur auf LS Medium mit 1 mg/1 NAA, 0,2 mg/1 Kinetin, 0,1 mg/1 BAP und 100 mg/1 Kanamycinsulfat propagiert. Wenn die regenerierten Sproße ca. 1 cm groß sind, werden sie abgeschnitten und auf 1/2 LS Medium (1 % Saccharose, 0,8 % Agar) ohne Wachstums¬ regulatoren zur Bewurzelung gesetzt. Die Sproße werden auf 1/2 MS- Medium mit 100 mg/1 Kanamycinsulfat bewurzelt und später in Erde umgesetzt. g) Transformation von Blattscheiben durch Agrobacterium tumefaciens
Für die Transformation von Blattscheiben (Horsch et al. 1985)- werden ca. 2-3 cm lange Blätter von sterilen Sproßkulturen in Scheiben von 1 cm Durchmesser gestanzt und mit einer Suspension entsprechender Agro- bacterien (ca. 109/ml) (vgl. c) in Am-Medium, siehen unten) für ca.
5 Minuten inkubiert. Die infizierten Blattstücke werden auf MS-Medium (siehe unten) ohne Hormone für 3-4 Tage bei ca. 24°C gehalten. Während dieser Zeit überwächst Agrobakterium die Blattstücke. Die Blattstücke wer¬ den anschließend in MS-Medium (0,5 mg/ml BAP, OJ mg/ml NAA) ge- waschen und auf das gleiche Medium (0,8 % Agar) mit 500 μg/ml Cefo- taxim und 100 μg/ml Kanamycinsulfat gelegt. Nach zwei Wochen sollte das Medium erneuert werden. Transformierte Kanamycin-resistente Sproße werden nach weiteren 2-3 Wochen sichtbar.
Biochemische Nachweismethode der Transformation
Neomycin-Phosphotransferase (NPT II) Enzymtest:
NPT II Aktivität in Pflanzengewebe wird durch in situ Phosphorylierung von Kanamycin, wie bei Reiß et al. (1984) beschrieben und von Schreier et al. (1985) modifiziert, wie folgt, nachgeweisen. 50 mg Pflanzengewebe werden in 50 μl Extraktionspuffer (10 % Glycerin, 5 % 2-Mercaptoethanol, 0,1 % SDS, 0,025 % Bromphenolblau, 62,5 mM Tris pH 6,8) unter Zusatz von Glaspulver auf Eis homogenisiert und 10 Minuten lang in einer Eppendorfzentrifuge bei 4°C zentrifugiert. 50 μl des Überstandes werden auf ein natives Polyacrylamidgel (145 x 110 x 1,2 mm; Trenngel: 10 % Acrylamid, 0,33 % Bisacrylamid, 0,375 M Tris pH 8,8, Sammelgel: 5 % Acrylamid, 0J65 % Bisacrylamid, 0J25 M Tris pH 6,8) aufgetragen und über Nacht bei 4°C und 60 V elektrophoretisiert. Sobald der Bromphenolblau-Marker aus dem Gel herausläuft, wird das Gel zweimal mit destilliertem Wasser 10 Min. lang und einmal 30 Min. mit Reaktionspuffer ge¬ waschen (67 mM Tris-Maleat, pH 7J, 42 mM MgC , 400 mM Ammonium¬ chlorid). Das Gel wird auf eine gleichgroße Glasplatte gelegt und mit 40 ml 1 %iger Agarose in Reaktionspuffer, der die Substrate Kanamycinsulfat (20 μg/ml) und 20-200 μCi 32P ATP (Amersha ) enthält, überschichtet. Das Sandwichgel wird 30 min. bei Zimmertempreratur inkubiert und dann wird ein Blatt Phospho- zellulosepapier P81 (Whatman) auf die Agarose gelegt. Darüber werden vier Filtrieφapierlagen 3 MM, (Whatman) und einige Papierhandtücher gestapelt. Der Transfer von in situ phosphoryliertem radioaktiven Kanamycinphosphat auf das P81 Papier wird nach 3-4 h gestoppt. Das P81 Papier wird für 30 min. in einer Lösung von Proteinase K und 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 60°C inkubiert und dann 3-4 mal in 250 ml 10 mM Phosphatpuffer pH 7,5 bei 80°C gewaschen, getrocknet und für 1-12 h lang bei -70°C autoradiografiert (XAR5 Film Kodak).
Alle Prozentangaben in den obigen sowie den weiter unten folgenden Beispielen beziehen sich auf Gewichtsprozente, wo nichts anderes angegeben wird.
In den gemäß den obigen sowie Beispielen erhaltenen Pflanzenzellen und Pflanzen wurde die Anwesenheit der GSTIIIc-DNA durch Southern Blot Analyse bestätigt. Die Expression der GSTIIIc-DNA wurde durch Northern Blot Analyse und We¬ stern Blots mit Hilfe von spezifischen Antiköφern nachgewiesen.
Im folgenden werden einige der bei der Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzte Medien beschrieben:
Am-Medium
3,5 g K2HPO4
1,5 g KH2PO4
0,5 g Na3 Citrat
0J g MgSO4 x 7H2O 1 g (NH4 )2S04
2 g Glukose ad 1 1
Medium für sterile Sproßkultur von Tabak
Macro-elemente 1/2 der Konzentration der MS Salze Macro-elemente 1/2 der Konzentration der MS Salze
Fe-EDTA Murashige und Skoog (MS)
Myo-Inosit 100 mg/1
Sucrose 10 mg/1
Agar 8 mg/1
Vitamine Ca-panthotenat 1 mg/1
Biotin 10 mg/1
Nicotinsäure 1 mg/1
Pyridoxin 1 mg/1
Thiamin 1 mg/1 pH 5,7 vor dem Autoklavieren
K3 -Medium
Zur Kultur von Nicotiana tabacum petit Havana SRI, Nicotiana tabacum Wiscon¬ sin 38, und Nicotiana plumaginifolia Protoplasten (Nagy und Maliga, 1976)
Macro-elemente NH4N03 250 mg/1
KNO3 2500 mg/1
CaCl2-2H2O 900 mg/1
MgS04-7H2O 250 mg/1
NaH2PO4JH2O 150 mg/1
(NH4)2SO4 134 mg/1
CaHPO4JH20 50 mg/1
Micro-elemente H3BO3 3 mg/1
MnSO4JH2O 10 mg/1
ZnS04-4H20 2 mg/1
KI 0,75 mg/1
Na2MoO4-2H2O 0,25 mg/1
CuSO4-5H2O 0,025 mg/1
CoCl2-6H2O 0,025 mg/1
Fe-EDTA Na2EDTA 37,2 mg/1
FeS04-7H20 27,8 mg/1
Inosit 100 mg/1
Sucrose 137 g/i
(= 0,4 M)
Xylose 250 mg/1
Vitamine Nicotinsäure 1 mg/1
Pyridoxin 1 mg/1
Thiamin 10 mg/1
Hormone NAA 1,0 mg/1
Kinetin 0,2 mg/1 pH 5,6
Filter sterilisieren Linsmaier und Skoog Medium (Linsmaier und Skoog 1965)
Zur Kultur von regenerierenden Protoplasten und für Gewebekultur von Tabak¬ tumoren und Kallus Linsmaier und Skoog (LS) Medium ist Murashige und Skoog Medium (Murashige und Skoog, 1962) mit den folgenden Modifikationen
Thiamin wird in höherer Konzentration eingewogen 0,4 mg/1 anstatt OJ mg/1,
Glycin, Pyridoxin und Nicotinsäure fehlen.
Macro-elemente NH4NO3 1650 mg/1
KN03 1900 mg/1
CaCl2-2H20 440 mg/1
MgS04-7H20 370 mg/1
KH2P04 170 mg/1
Micro-elemente H3B03 6,2 mg/1
MnS04JH20 22,3 mg/1
ZnS04-4H20 8,6 mg/1
KI 0,83 mg/1
Na2Mo04-2H20 0,25 mg/1
CuS04-5H20 0,025 mg/1
CoCl2-6H20 0,025 mg/1
Fe-EDTA Na2EDTA 37,2 mg/1
FeS04-7H20 27,8 mg/1
Inosit 100 mg/1
Saccharose 30 g i
Agar 8 mg/1
Vitamine Thiamin 0.4 mg/1
Hormone NAA 1 mg/1
Kinetin 0.2 mg/1 pH 5,7 Zur Transformation von Pflanzen bzw. Pflanzenzellen kann die folgende Literatur angeführt werden:
Fraley R.T., Rogers S.G., Horsch R.B., Sanders P.R., Flick J.S., Adams S.P., Bittner M.L., Brand L.A., Fink C.L., Fry J.S., Fallupi G R., Goldberg S.B., Hoffmann N.L., Woo S.C. (1983). Expression of bacterial genes in plant cells.
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-4807.
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Weiterhin können die folgenden veröffentlichten Patentanmeldungen aufgeführt werden:
EP- A 116 718 EP- A- 126 546
EP-A 159 418 EP-A- 164 597
EP-A 120 515 EP-A- 175 966
EP-A- 120 516 WO 84/02913 EP-A-172 112 WO 84/02919
EP-A-140 556 WO 84/02920
EP-A- 174 166 WO 83/01176 EP-A- 122 791
Die erhöhte Resistenz der erfindungsgemäßen transformierten Pflanzen sei anhand des folgenden Beispiels erläutert:
Nachweis der erhöhten Resistenz von transformierten Pflanzen:
Zur Prüfung der erhöhten Resistenz gegenüber herbizid wirkenden Herterooxyace- tamiden wird die Schädigung der erfindungsgemäß transformierten Pflanzen im
Vergleich zu Kontrollpflanzen bestimmt. Als Testherbizid wird die Verbindung (5- Trifluormethyl- 1 ,3 ,4-thiadiazol-2-yl-oxy-essigsäure-N-isopropyl-N-(4-fluoφhenyl)- amid eingesetzt.
Samen der Fl -Generation der transformierten Pflanzen werden im Gewächshaus auf Landerde mit 3 % Humusanteil in Töpfe (d = 11 cm) ausgelegt. Die Anzucht der Pflanzen erfolgt bei einer Temperatur von 23°C und einer relativen Luftfeuchte von 70 - 80 %. Die Behandlung mit der oben genannten herbiziden Verbindung, formuliert als 70 WP (wettable powder), erfolgt 24 Stunden nach dem Auslegen der Samen mit Konzentrationen die einer Aufwandmenge von 2 000 - 4 000 g Wirkstoff/ha entsprechen.
Die Auswertung erfolgt 20 Tage nach der Behandlung mit Herbizid. Bonitiert wird der prozentuale Gesamtschaden an transgenen Pflanzen im Vergleich zu ent¬ sprechenden Kontrollpflanzen, die mit der gleichen Wirkstoffkonzentration be¬ handelt wurden.
Die transformierten Tabakpflanzen, in die die erfindungsgemäße GSTIHc-DNA eingesetzt wurde, zeigen eine deutlich erhöhte Resistenz gegenüber hohen Auf¬ wandmengen von des Herbizides (2 000 - 4 000 g ha) im Vergleich zu nicht trans¬ formierten entsprechenden Kontrollpflanzen.
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Bayer AG
(B) STRASSE : Bayerwerk
(C) ORT: Leverkusen
(E) LAND: Deutschland
(F) POSTLEITZAHL: D-51368
(G) TELEFON: 0214/30 66400 (H) TELEFAX: 0214/30 3482 (I) TELEX: 85 101-265 by d
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Desoxyribonukleinsaeure und ihre Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 4
(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 666 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:1..663
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
ATG GCG CCT CTG AAG CTG TAC GGG ATG CCG CTG TCC CCC AAC GTG GTG 48
Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val 1 5 10 15
CGC GTG GCC ACC GTG CTC AAC GAG AAG GGC CTC GAC TTC GAG ATC GTC 96
Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Aεp Phe Glu Ile Val 20 25 30
CCC GTC GAC CTC ACC ACC GGC GCC CAC AAG CAG CCC GAC TTC CTC GCC 144 Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gin Pro Asp Phe Leu Ala 35 40 45
CTC AAC CCT TTC GGC CAG ATC CCG GCT CTC GTC GAC GGA GAC GAA GTC 192 Leu Asn Pro Phe Gly Gin Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Asp Glu Val 50 55 60
CTC TTC GAG TCC CGT GCG ATC AAC CGG TAC ATC GCC AGC AAG TAC GCG 240 Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala 65 70 75 80
TCG GAG GGC ACG GAC CTG CTC CCC GCG ACG GCG TCG GCG GCG AAG CTG 288 Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu 85 90 95 GAG GTG TGG CTG GAG GTG GAG TCG CAC CAC TTC CAC CCG AAC GCG TCG 336 Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser 100 105 110
CCG CTG GTG TTC CAG CTG CTC GTG AGG CCG CTC CTG GGC GGC GCC CCC 384 Pro Leu Val Phe Gin Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro 115 120 125
GAC GCG GCG GTG GTG GAG AAG CAC GCG GAG CAG CTC GCC AAG GTG CTC 432 Asp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gin Leu Ala Lys Val Leu 130 135 140
GAC GTG TAC GAG GCG CAC CTG GCC CGC AAC AAG TAC CTC GCC GGG GAC 480 Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp 145 150 155 160
GAG TTC ACG CTC GCC GAC GCC AAC CAC GCG TCC TAC CTG CTC TAC CTC 528 Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu 165 170 175
AGC AAG ACC CCC AAG GCC GGG CTC GTC GCC GCC CGC CCC CAC GTC AAG 576 Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys 180 185 190
GCC TGG TGG GAG GCC ATC GCC GCC CGC CCC GCG TTC CAG AAG ACC GTC 624 Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gin Lys Thr Val 195 200 205
GCC GCC ATC CCC TTG CCC CCG CCG CCC TCC TCC TCG GCT TGA 666
Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala 210 215 220 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 221 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Ala Pro Leu Lys Leu Tyr Gly Met Pro Leu Ser Pro Asn Val Val 1 5 10 15
Arg Val Ala Thr Val Leu Asn Glu Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ile Val 20 25 30
Pro Val Asp Leu Thr Thr Gly Ala His Lys Gin Pro Asp Phe Leu Ala 35 40 45
Leu Asn Pro Phe Gly Gin Ile Pro Ala Leu Val Asp Gly Aεp Glu Val 50 55 60
Leu Phe Glu Ser Arg Ala Ile Asn Arg Tyr Ile Ala Ser Lys Tyr Ala 65 70 75 80
Ser Glu Gly Thr Asp Leu Leu Pro Ala Thr Ala Ser Ala Ala Lys Leu 85 90 95
Glu Val Trp Leu Glu Val Glu Ser His His Phe His Pro Asn Ala Ser 100 105 110
Pro Leu Val Phe Gin Leu Leu Val Arg Pro Leu Leu Gly Gly Ala Pro 115 120 125 sp Ala Ala Val Val Glu Lys His Ala Glu Gin Leu Ala Lys Val Leu
130 135 140
Asp Val Tyr Glu Ala His Leu Ala Arg Asn Lys Tyr Leu Ala Gly Asp 145 150 155 160
Glu Phe Thr Leu Ala Asp Ala Asn His Ala Ser Tyr Leu Leu Tyr Leu 165 170 175
Ser Lys Thr Pro Lys Ala Gly Leu Val Ala Ala Arg Pro His Val Lys 180 185 190
Ala Trp Trp Glu Ala Ile Ala Ala Arg Pro Ala Phe Gin Lys Thr Val 195 200 205
Ala Ala Ile Pro Leu Pro Pro Pro Pro Ser Ser Ser Ala 210 215 220
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
AGCGCATATG GCGGCTCTGA AGCTGTACGG GAT 33
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iv) ANTISENSE: NEIN
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
GACGGATCCT CAAGCCGAGG AGGAGGGCGG 30
INTERNATIONALES FORMBLATT
Bayer AG
Geschäf sbereich Pflanzenschutz
Forschung/Biotechnologie
Pflanzenschutzzentrum Monhei
EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG,
51368 Leverkusen ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: BB pET3a-GSTIIIc
DSM 9677
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOM1SCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
(X ) eine wissenschaftliche Beschreibung
(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).
III. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 19 95 - 01 - 17 (Datum der Ersthinterlegung)1 eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter 1 bczςichnctc Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst¬ hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlcgung in eine Hinterlegung gemäß Budapestcr Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON UnterschriΩ(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstell
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Maschcrodcr Weg lb D-38124 üraunschweig U. u?*r Ό
Daium 1 995 - 01 - 18
1 us einer internati e un sstelle cnvorbcπ worden ist.

Claims

Patentansprüche
1 DNA (Desoxyribonukleinsäure), welche für das Protein Glutathion-S-Trans¬ ferase IIIc (GSTIIIc) gemäß SEQ ED NO 2 oder eine davon abgeleitete Proteinsequenz kodiert (GSTIIIc-DNA).
2. DNA gemäß Anspruch 1, welche die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder eine davon abgeleitete Sequenz aufweist
3. DNA gemäß Anspruch 1, welche die Sequenz der GSTIIIc-DNA, die auf dem Vektor Plasmid pET3a-GSTIIIc enthalten ist oder eine davon abge¬ leitete Sequenz aufweist.
4. DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, welche in Form eines DNA-Doppel¬ stranges vorliegt, der die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 und einen dazu komplementären DNA- Strang enthält
5 DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, bei welcher am 5'-Ende der kodierenden Sequenz ein in Pflanzen wirksamer Promotor vorgeschaltet ist.
6 DNA gemäß Anspruch 5, wobei als Promotor der CaMN 35S-Promotor oder der aus dem CaMV 35S Enhancer und dem CaMV 35S Promotor zusammengesetzte CaMV 35S Doppelpromotor verwendet wird
7. DNA gemäß Anspruch 5, welche ein Konstrukt aus der GSTIIIc-DNA und dem CaMV 35S Doppelpromotor darstellt, wie es auf dem Vektor Plasmid pSS-GSTIIIc vorliegt
8 Rekombinante prokaryontische oder eukaryontische DNA, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 enthalt
9 Rekombinante DNA, die in Pflanzen oder Pflanzenzellen enthalten ist und die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 enthalt
10 Vektoren, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 oder die rekom¬ binante DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 enthalten
1 1. Vektor-Plasmide pET3a-GSTIIIc und pSS-GSTIIIc.
12. Transformierte Mikroorganismen, welche die DNA gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 oder die rekombinante DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 ent¬ halten.
13. Escherichia coli Stamm DS pET3a-GSTIIIC (gemäß DSM 9677) sowie seine Mutanten, welche noch die für die Ausführung der Erfindung wesent¬ lichen Merkmale aufweisen.
14. Transgene Pflanzen (einschließlich Teile dieser Pflanzen sowie deren Ver¬ mehrungsmaterial, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklingen usw.), die in ihrem Genom die DNA gemäß den An¬ sprüchen 1 bis 7 zusätzlich zur DNA der entsprechenden nicht transgemen Pflanzen enthalten.
15. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 14, welche in ihrem Genom die DNA gemäß Anspruch 6 enthalten.
16. Transgene Pflanzen gemäß Anspruch 14, welche in ihrem Genom die DNA gemäß Anspruch 7 enthalten.
17. Transgene Pflanzen gemäß den Ansprüchen 14 bis 16, welche einen Gehalt an Glutathion-S-Transferase IIIc (GSΗIIc) gegebenenfalls in der dimeren Form aufweisen.
18. Transgene Pflanzen gemäß den Ansprüchen 14 bis 17, welche im Vergleich zu den entsprechenden nicht transgenen Pflanzen, eine erhöhte Resistenz gegen Herbizide, insbesondere gegenüber Heterooxyacetamid-Herbiziden, aufweisen.
19. Verwendung der DNA gemäß Ansprüchen 1 bis 7 und/oder der rekom- binanten DNA gemäß den Ansprüchen 8 und 9 und/oder der Vektoren gemäß den Ansprüchen 10 und 11 und/oder der transformierten Mikro¬ organismen gemäß den Ansprüchen 12 und 13 zur Erzeugung von trans¬ genen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschlie߬ lich Pflanzenteilen und Samen).
0 Verfahren zur Herstellung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man
(a) die DNA gemäß Anspruch 1 und/oder die rekombinante DNA ge¬ mäß Anspruch 8 in den Genom von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) einsetzt und gegebenenfalls
(b) aus den transgenen Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) voll¬ ständige transformierte Pflanzen regeneriert und gegebenenfalls ver¬ mehrt und gegebenenfalls
(c) von den so erhaltenen transgenen Pflanzen der Elterngeneration oder weiterer daraus gewonnener Generationen die gewünschten Pflan¬ zenteile (einschließlich Vermehrungsmaterial) gewinnt.
21. Verwendung der transgenen Pflanzen gemäß Anspruch 14 zur Erzeugung von Vermehrungsmaterial sowie zur Erzeugung neuer Pflanzen, die die DNA gemäß Anspruch 1 oder die rekombinante DNA gemäß Anspruch 8 enthalten und deren Vermehrungsmaterial.
22. Verwendung von DNA, welche ganz oder teilweise der GSTIIIc-DNA ent¬ spricht, die auf dem Plasmid pET3a-GSTIIIc enthalten ist oder welche ganz oder teilweise der SEQ ID NO: 1 entspricht, als Sonde zum Nachweis des Gehaltes an GSTIIIc-DNA oder ihrer Bestandteile in einer DNA, die auf diesen Gehalt untersucht werden soll.
23 Verwendung der für das Protein GSTIIIc gemäß SEQ ID NO: 2 ko¬ dierenden DNA zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, welche im Ver¬ gleich zu den entsprechenden nicht transgenen Pflanzen, eine erhöhte Re¬ sistenz gegenüber Herbiziden, insbesondere Heterooxyacetamid-Herbiziden, aufweisen
24 Protein mit einer Aminosauresequenz gemäß SEQ ED NO 2 oder einer da¬ von abgeleiteten Sequenz
25 Protein gemäß Anspruch 24 in der dimeren Form
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