DD279269A5 - Verfahren zur herstellung einer herbizid-toleranten pflanze - Google Patents

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DD279269A5
DD279269A5 DD32633787A DD32633787A DD279269A5 DD 279269 A5 DD279269 A5 DD 279269A5 DD 32633787 A DD32633787 A DD 32633787A DD 32633787 A DD32633787 A DD 32633787A DD 279269 A5 DD279269 A5 DD 279269A5
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lys
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Georgia Helmer
John Duesing
Steven Rothstein
Liliana Scarafia
Mary-Dell Chilton
Hui-Chen Jean Lai
Chen-Pei D Tu
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Ciba-Geigy Ag,Ch
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Herbizid-toleranten Pflanze. Unter Verwendung gentechnologischer Methoden wird die Enzymaktivitaet der Glutathion-S-Transferase in den Pflanzen deutlich erhoeht. Das erfindungsgemaesse Verfahren besteht darin, dass man eine Pflanze mit einem rekombinanten DNA-Molekuel transformiert, das befaehigt ist eine Herbizid-Toleranz, die auf der Detoxifikation des Herbizids beruht, auf eine Pflanze zu uebertragen.

Description

Verfahren zur Herstellung einer Herbizid-toleranten Pflanze Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Herbizid-toleranten Pflanze unter Anwendung der rekorabinanten DNA-Technologie, wobei die besagte Herbizidtoleranz aus der Detoxifikation des entsprechenden Herbizids resultiert.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die Glutathion-S-Transferasen (EC 2.5.1*18) gehören zu einer Klasse von Enzymen, die bei der Detoxifikation von Xenobiotika eine wichtige Rolle spielen. Diese Enzyme findet man bei den meisten lebenden Organismen, einschließlich Mikroorganismen, Pflanzen, Insekten und höheren Tieren. 3edes der Glutathion-S-Transferase (GST)-Enzyme innerhalb dieser Klasse unterscheidet sich zwar vom anderen» aber alle diese Enzyme besitzen eine sich überlappende Substratsspezifität. Vgl.: Dakobi et al., "Rat Glutathione S-transferasesj Binding and Physical Properties," in Glutathione: Metabolism and Function, ed. I. Arias and W. Oakoby (Raven Press, New York, 1976); Reddy et al«, "Purification and Characterization of Individual Glutathione S-Transferase from Sheep Liver, "Archives of Biochem. and Biophys., 224: 87-101 (1983)
Unter den zahlreichen GST-Funktionon ist die Katalyse der Konjugation von Glutathion mit elektrophilen Verbindungen von besonderem Interesse. H. Rennenberg, "Glutathione
Metabolism and Possible Biological Roles in Higher Plants«" Phytochemlstry« 21; 2771-2781 (1982); vgl.: Meister and Täte, "Glutathione and Related Gamma-Glutamyl Compounds: Biosynthesis and Utilisation," in Ann« Rev« Biochem«. 45: 560-604 (1976). Zahlreiche Xenobiotika, darunter Herbizide, Pestizide und Insektizide gehören zu den elektrophilen Verbindungen. Im Verlauf der Konjugation des Glutathion und einer elektrophilen Verbindung rnagiert die Sulfhydryl-Gruppe des Glutathion mit dem elektrophilen Zentrum dieser Verbindung« wobei das Glutathion als Nucleophil fungiert. Diese Konjugation wird von einem spezifischen GST-Enzym katalysiert. (Rennenbeir> supra).
Für die Pflanzen ist diese Reaktion von besonderer Bedeutung, da sie eine Möglichkeit zur Detoxifikation von Xenobiutika bietet. Die konjugierte, elektrophile« xenobiotische Verbindung wird dabei wasserlöslich und 1st somit für die Pflanze nicht mehr toxisch.
Ziel der Erfindung
Mit der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen zur Verfügung gestellt« die gegenüber Herbiziden tolerant sind« indem man unter Verwendung gentechnologischer Methoden die Enzymaktivität der Glutathion-S-Transferase in den Pflanzen deutlich erhöht.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin« Pflanzen bereitzustellen« die gegenüber Herbiziden tolerant sind.
- 2a -
ΖΪ9Ζ19
Gegenstand der vorliegenden Erfindung iac ein Verfahren zur Herstellung Herbizid"toleranter Pflanzen, wobei die Herbizid Toleranz durch rekombinante DNA-Moleküle übertragen wird und die Herbizide durch Produktion von Proteinen datoxifiziert werden.
Zu den bekannten Detoxifikationsmechanismen gehören die Konjugation von Glutathion an elektrophile Verbinungen, eine Reaktion, die durch die Glutathion-S-Transferase katalysiert wird; die Konjugation von D-Aminosäure an 2,4-D.i.chlorphenoxyessigsäure (2,4-D) sowie die Hydroxylierung ind Kohlenhydrat-Konjugation bei Sulfonylharnstoffen.
Das rekombinante DNA-Molekül beoteht aus verschiedenen Sequenzabschnitten, die sich von genomischer DNA und/odor cDNA ableiten und die zu einer vollständigen Glutathion-S-Transferaee kodierenden DNA-Sequenz zusammengesetzt sind.
Die DNA-Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase PoIypeptid kodiert, stammt von einem Säuger. Die DNA-Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase PoIypoptid der Ratte kodiert« besitzt folgende Nukleotid-Sequenz:
40 50 60
ATGCCTATGATACTGGGATACTGG MPMI LGYW
70 80 90 100 110 120
AACGTCCGCGGGCTGACACACCCGATCCGCCTGCTCCTGGAATACACAGACTCAAGCTAT NVRGLTHPIRLL LEYTDSSY
130 140 150 160 170 180
GAGGAGAAGAGATACGCCATGGGCGACGCTCCCGACTATGACAGMGCCAGTGGCTGAAT EEKRYAMGDAPDYDRSQWLN
- 2b -
190 200 210 220 230 240 GAGAAGTTCAAACTGGGCCTGGACTTCCCCAATCTGCCCTACTTAATTGATGGATCGCGC EKFKLGLDFPNLPYLIDGSR
250 260 270 280 290 300 AAGATTACCCAGAGCAATGCCATAATGCGCTACCTTGCCCGCAAGCACCACCTGTGTGGA KITQSNAIMRYLARKHHLCG
310 320 330 340 350 360 GAGACAGARGAGGAGCGGATTCGTGCAGACATTGTGGAGAACCAGGTCATGGACAACCGC ETESERIRADTVENQVMDNR
370 380 390 400 410 420 ATGCAGCTCATCATGCTTTGTTACAACCCCGACTTTGAGAAGCAGAAGCCAGAGTTCTTG MQLIMLCYNPDFEKQKPEFL 4'iO 440 450 460 470 480
aagaccatccctgagaagatgaagctctactctgagttcctgggcaagcgaccatggttt ktipekmklyseflgkrpwf
490 500 510 520 530 540
gcaggggacaaggtcacctatgtggatttccttgcttatgacattcttgaccagtaccac agdkvtyvdflaydildqyh
550 560 570 580 590 600
ATTTTTGAGCCCAAGTGCCTGGACGCCTTCCCAAACCTGAAGGACTTCCTGGCCCGCTTC IFEPKCLDAFPNLKDFLARF
610 620 630 640 650 660
gagggcctgaagaagatctctgcctacatgaagagcagccgctacctctcaacacctata eglkkisaymkssrylstpi
670 680 690 700 710 720
ttttcgaagttggcccaatggagtaacaagtag fsklaqwsnk
Diese DNA-Sequenz kann auch folgende Nukleotld-Sequenz aufweisen:
- 2c -
CTG TAC AGC ATG 1 10 GCT CCC GAC TAT GAC 13 O CAG
Leu Tyr Ser Met GGG GAT AIa Pro Asp Tyr Asp AGA AGC Gin
150 Gly Asp 1 70 Arg Ser
TAC AGT GAG AAG CTG GGC CTG GAC TTC CTG
TGG Tyr Ser GlU Lys TTC AAA Leu Gly Leu Asp Phe CCC AAT Leu
Trp 30 19 O Phe Lys 210 Pro Asn
CTG TTA ATT GAT CAC AAG ATC ACC CAG GCC
CCC Leu Leu He Asp GGG TCA His Lye He Thr Gin AGC AAT AIa
Pro Gly Ser 25 0 Ser Asn 270
2 GAG CGC TAC CTT AAG CAC AAC CTT TGT ACA
ATC Glu Arg Tyr Leu GGC CGG Lys His Asn Leu Cys GGG GAG Thr
He Gly Arg Gly Glu
ACC GAG AGG ATT 2 90 GAC GTT TTG GAG AAC 31 O ATG
GAG Thr Glu Arg He CGT GTG Asp VaI Leu Glu Asn CAG GCT Met
Glu 330 Arg VaI 3 50 GIn AIa
AGA CGC CTA CAG ATG GTC TGC TAC AGC TTT
GAC Arg Arg Leu Gin TTG GCC Met VaI Cys Tyr Ser CCT GAC Phe
Asp 10 37 O Leu AIa 390 Pro Asp
CTT AAG AAG CCA TTA GAG GGT CTC CCT ATG
GAG Leu Lys Lys Pro GAG TAC Leu Glu Gly Leu Pro GAG AAG Met
Glu Glu Tyr 43 0 Gly Lys 450
4 AAG TAC TCC GAA GGC AAG CAG CCA TGG GGG
AAG Lys Tyr Ser Glu TTC CTG Gly Lys Gin Pro Trp TTT GCA Gly
Lys Phe Leu Phe AIa
CAC ATT ACG TAT 4 70 TTT CTT GTT TAC GAT 49 O GAT
AAC His He Thr Tyr GTG GAT Phe Leu VaI Tyr Asp GTC CTT Asp
Asn 510 VaI Asp 5 30 VaI Leu
CGT ATA TTT AAG TGC CTG GAC GCC AAC
CAA Arg He Phe GAA CCC Lys Cys Leu Asp Ala TTC CCA Asn
Gin GlU Pro Phe Pro
55 O 570
CTG AAG GAC TTC GTG GCT CGG TTT GAG GGC CTG AAG AAG ATA TCT Leu Lys Asp Phe VaI Aia Arg Phe GIu GIy Leu Lys Lye He Ser
5 90 61 0 630
GAC TAC ATG AAG AGC GGC CGC TTC CTC TCC AAG CCA ATC TTT GCA Aep Tyr Met Lys Ser Gly Arg Phe Leu Ser Lye Pro He Phe AIa
6 50
AAG ATG GCC TTT TGG AAC CCA AAG TAG Lys Met AIa Phe Trp Asn Pro Lys End
Diese DNA-Sequenz kann auch die folgende Nukleotid-Sequenz aufweisen:
10 30
ATG CCT ATG ACA CTG GGT TAC TGG GAC ATC CGT GGG CTG GCT CAC Met Pro Met Thr Leu Gly Tyr Trp Asp lie Arg Gly Leu Ala His
50 7 0 90
GCC ATT CGC CTG TTC CTG GAG TAT ACA GAC ACA AGC TAT GAG GAC Ala He Arg Leu Phe Leu Glu Tyr Thr Asp Thr Ser Tyr Glu Asp
1 10 13 O
AAG AAG TAC AGC ATG GGG GAT GCT CCC GAC TAT GAC AGA AGC CAG Lys Lys Tyr Ser Met Gly Asp Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser Gin
150 1 70
TGG CTG AGT GAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG GAC TTC CCC AAT CTG Trp Leu Ser Glu Lys Phe Lys Leu Gly Leu Asp Phe Pro Asn Leu
19 0 210
CCC TAC TTA ATT GAT GGG TCA CAC AAG ATC ACC CAG AGC AAT GCC Pro Tyr Leu lie Asp Gly Ser His Lys He Thr Gin Ser Asn AIa
2 30 25 0 270
ATC CTG CGC TAC CTT GGC CGG AAG CAC AAC CTT TGT GGG GAG ACA lie Leu Arg Tyr Leu Gly Arg Lys His Asn Leu Cys Gly Glu Thr
- 2β -
2 90 31 0
GAG GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC GTT TTG GAG AAC CAG GCT ATG Glu GIu Glu Arg lie Arg VaI Asp VaI Leu Glu Asn Gin Ala Met
330 3 50
GAC ACC CGC CTA CAG TTG GCC ATG GTC TGC TAC AGC CCT GAC TTT Asp Thr Arg Leu Gin Leu Ala Met VaI Cys Tyr Ser Pro Asp Phe
37 O 390
GAG AGA AAG AAG CCA GAG TAC TTA GAQ GGT CTC CCT GAG AAG ATG Glu Arg Lye Lys Pro Glu Tyr Leu Glu GIy Leu Pro Glu Lye Met
4 10 43 0 450 AAG CTT TAC TCC GAA TTC CTG GGC AAG CAG CCA TGG TTT GCA GGG Lye Leu Tyr Ser Glu Phe Leu GIy Lys Gin Pro Trp Phe Ala Gly
4 70 49 0
AAC AAG ATT ACG TAT GTG GAT TTT CTT GTT TAC GAT GTC CTT GAT Asn Lys lie Thr Tyr VaI Asp Phe Leu VaI Tyr Asp VaI Leu Asp
510 5 30
CAA CAC CGT ATA TTT GAA CCC AAG TGC CTG GAC GCC TTC CCA AAC Gin His Arg lie Phe Glu Pro Lys Cys Leu Asp Ala Phe Pro Asn
55 0 570
CTG AAG GAC TTC GTG GCT CGG TTT GAG GGC CTG AAG AAG ATA TCT Leu Lys Asp Phe VaI Ala Arg Phe Glu Gly Leu Lys Lys lie Ser
5 90 61 O G30 GAC TAC ATG AAG AGC GGC CGC TTC CTC TCC AAG CCA ATC TTT GCA Asp Tyr Met Lys Ser Gly Arg Phe Leu Ser Lys Pro lie Phe Ala
6 50
AAG ATG GCC TTT TGG AAC CCA AAG TAG Lys Met Ala Phe Trp Asn Pro Lys End
Die DNA-Sequenz kann auch die folgende Nukleotid-Sequenz besitzen:
A GAC CCC AGC ACC ATG CCC ATG ACA CTG GGT TAC TGG GAC ATC
Met Pro Met Thr Leu Gly Tyr Trp Asp He
5 0 70
CGT GGG CTA GCG CAT GCC ATC CGC CTG CTC CTG GAA TAC ACA GAC
Arg Gly Leu AIa His AIa He Arg L.3U Leu Leu Glu Tyr Thr Asp
90 11 0 130
TCG AGC TAT GAG GAG AAG AGA TAC ACC ATG GGA GAC GCT CCC GAC
Ser Ser Tyr Glu Glu Lys Arg Tyr Thr Met Gly Asp AIa Pro Asp
1 50 17 O
TTT GAC AGA AGC CA3 TGG CTG AAT GAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG
Phe Asp Arg Ser Gin Trp Leu Asn Glu Lys Phe Lys Leu Gly Leu
190 2 10
GAC TTC CCC AAT CTG CCC TAC TTA ATT GAT GGA TCA CAC AAG ATC
Asp Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Leu He Asp Gly Ser His Lys He
23 0 250 2
ACC CAG AGC AAT GCC ATC CTG CGC TAT CTT GGC CGC AAG CAC AAC
Thr Gin Ser Asn AIa He Leu Arg Tyr Leu Gly Arg Lys His Asn
70 29 O 310
CTG TGT GGG GAG ACA GAA GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC ATT CTG
Leu Cys Gly Glu Thr Glu Glu Glu Arg He Arg VaI Asp He Leu
3 30 35 O
GAG AAT CAG CTC ATG GAC AAC CGC ATG GTG CTG GCG AGA CTT TGC
Glu Asn Gin Leu Met Asp Asn Arg Met VaI Leu AIa Arg Leu Cys
370 3 90
TAT AAC CCT GAC TTT GAG AAG CTG AAG CCA GGG TAC CTG GAG CAA
Tyr Asn Pro Asp Phe Glu Lys Leu Lys Pro Gly Tyr Leu Glu Gin
41 0 430 4
CTG CCT GGA ATG ATG CGG CTT TAC TCC GAG TTC CTG GGC AAG CGG
Leu Pro Gly Met Met Arg Leu Tyr Ser Glu Phe Leu Gly Lys Arg
- 2g -
50 TGG TTT GCA GGG GAC 47 O ACC TTT GTG GAT TTC 490 GCT
CCA Trp Phe Ala Gly Asp AAG ATC Thr Phe VaI Asp Phe ATT AIa
Pro 5 10 Lys He 53 O He
GAT GTT CTT GAG AGG GTG TTT GAG GCC ACG CTG
TAC Asp VaI Leu Glu Arg AAC CAA VaI Phe Glu Ala Thr TGC Leu
Tyr 550 Asn Gin 5 70 Cys
GCG TTC CCA A/>C CTG TTC ATA GCG CGC TTT GGC
GAC Ala Phe Pro Asn Leu AAG GAT Phe He AIa Arg Phe GAG Gly
Asp 59 O Lys Asp 610 Glu 6
AAG AAG ATC TCC GAC AAG TCC AGC CGC TTC CCA
CTG Lys Lys He Ser Asp TAC ATG Lys Ser Ser Arg Phe CTC Pro
Leu Tyr Met Leu
30 CCT CTG TTC ACA AAG 65 O ATT TGG GGC AGC AAG 670 GAC
AGA Pro Leu Phe Thr Lys ATG GCT He Trp Gly Ser Lys TAG Asp
Arg 6 90 Met AIa 71 O End
GAC AGG TGG GCT TTA AGA TAC CAA ATC TCC GTT
CCT Asp Arg Trp Ala Leu GGA GAA Arg Tyr Gin He Ser TGG VaI
Pro 730 Gly Glu 7 50 Trp
CAA GAG CCC TAA GGA AGG ATT CCT GAG CCC AGC
TGC Gin Glu Pro End Gly GCG GGC Arg He Pro Glu Pro CAG Ser
Cys 77 O AIa Gly 790 Gin 8
GTT TTC TTC CTT CCT CCA GTC CCC AAG CCT CAG
CAT VaI Phe Phe Leu Pro TCC ATT Pro VaI Pro Lys Pro TAC GIn
His Ser He Tyr
10 TCA TTT TTT GGT CAT 83 O CCT GCC AAA CAC AGG 850 TTA
CTC Ser Phe Phe Gly His CAA ATT Pro AIa Lye His Arg CTC Leu
Leu 8 70 Gin He 89 O Leu
GCC CTA GCA ACT CCT TAG CAA AAT AGC CTT AAG
AAA Ala Leu Ala Thr Pro TTC CAT End Gin Asn Ser Leu CTA Lys
Lys Phe His Leu
- 2h - Z19ZC3
910 9 30
TTA AAG TGC CCC GCC CCC ACC CCT CGA GCT CAT GTG ATT GGA TAG Leu Lye Cys Pro AIa Pro Thr Pro Arg Ala His VaI He Gly End
95 0 970 9
TTG GCT CCC AAC ATG TGA TTA TTT TGG GCA GGT CAG GCT CCC CGG Leu AIa Pro Asn Met End Leu Phe Trp AIa Gly Gin AIa Pro Arg
90 101 0 1 030
CAG ATG GGG TCT ATC TGG AGA CAG TAG ATT GCT AGC AGC TTT GAC Gin Met Gly Ser He Trp Arg Gin End He Ala Ser Ser Phe Asp
10 50 107 0
CAC CGT AGC CAA GCC CCT CTT CTT GCT GTT TCC CGA GAC TAG CTA HIs Arg Ser Gin AIa Pro Leu Leu Ala VaI Ser Arg Asp End Leu
1 090 11 10
TGA GCA AGG TGT GCT GTG TCC CCA GCA CTT GTC ACT GCC TCT GTA End Ala Arg Cys Ala VaI Ser Pro Ala Leu VaI Thr Ala Ser VaI
113 0 1 150 11
ACC CGC TCC TAC CGC TCT TTC TTC CTG CTG CTG TGA GCT GTA CCT Thr Arg Ser Tyr Arg Ser Phe Phe Leu Leu Leu End Ala VaI Pro
70 119 0 1 210
CCT GAC CAC AAA CCA GAA TAA ATC ATT CTC CCC TTA AAA AAA AAA Pro Asp His Lys Pro Glu End lie lie Leu Pro Leu Lye Lye Lys
AAA AAA AAA A Lys Lys Lys
Die herbizidtoleranten Pflanzen sind mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert« welches für ein Enzym kodiert* das für die Detoxifikation von Herbiziden verantwortlich ist
Die rekombinanten DNA-Moleküle sind durch eine Gen-Sequenz
gekennzeichnet, welche für ein Glutathion-S-Transferase-Polypeptid kodiert, sowie herbizidtolerante transformierte Pflanzen, die eine erhöhte Glutathion-S-Transferase-Enzymaktivität aufweisen. Im Rahmen dieser Erfindung ist die Pflanzenzelle mit einem Glutathion-S-Transferase-Gen transformiert, welches im Zuge seiner Expression oder Oberexpression der Pflanze eine Herbizid-Toleranz verleiht.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus auch aus transformierten Pflanzenzellen regenerierte Pflanzen sowie deren Samen« darüber hinaus auch die Nachkommen von aus trans· genen Pflanzenzellen regenerierten Pflanzen sowie Mutanten und Varianten davon.
Die Erfindung bezieht sich ebenso auf chimäre genetische Konstruktionen, die ein Glutathion-S-Traneferase-Gen enthalten» auf Klonierungsvehikel und Wirtsorganismen sowie Methoden zur Übertragung der Herbizid-Toleranz auf Pflanzen.
Nachfolgend sollen die beigefügten Abbildungen kurz charakterisiert und erläutert werden:
Abbildung 1 legt die Sequenzisrungs-Stratogie für das pGTR200-cl?NA-Insert von Υ^200 dar, einem GltJtathion-S-Transferase-Gen aus der Rattenleber.
Abbildung 2 zeigt das Plasmid pCIB710, ein E.coli-Replikon, das den Promotor für das CaMV-35S-SNA-Transkript sowie dessen Terminator, und polyA-Zusatzsignai umfaßt.
V y <J- ί?') -j ι
Abbildung 3 zeigt die Konstruktion des Plasmids pCIB12, ain E.coli-Replikon, enthaltend das chimäre Gen mit dem CaMV-35S-Promotor, das mit dem Glutathion-S-Transferase-cDNA-Gen aus Rattenleber Y,200, und dem CaMV Terminator verknüpft ist.
Abbildung 4A veranschaulicht die Konstruktion des Plasmids pCIB14, eines Repliken mit weitem Wirtsbereich, das zwei chimäre Gene innerhalb einer T-DNA Grenzsequenz enthält, wobei das chimäre Gen auo dem CaMV-ßSS-Promotor besteht, der mit" dem Glutathion-S-
Transfe.raae-Gen Y, 200, dem CaMV-Terminator und dem Kanamvcinb
Resistenz-Gen, nos-neo-nos, verknüpft iet.
Abbildung AB zeigt die Fertigstellung eines Teilklones mit Hilfe der in vivo Rekombinationsmethode.
Abbildung 4C zeigt die Fertigstellung eines Teilklones mit Hilfe der in vitro Verknüpfungsmethode.
Abbildung 5 zeigt Fluoreszenz-Induktionsmuster, die für nichttransgene Tabak-Blätter typisch sind. Die obere Kurve erhält man, nachdem die Blätter 10 M Atrazin über einen Zeitraum von 48 Stunden aufgenommen haben. Die untere Kurve erhält man bei Aufnahme reiner Pufferlösung.
Abbildung 6 zeigt die Fluoreszenz-Induktionsmuster, die man in Blättern aus transgenen pCIB14 Tabkpflanzen nach 48-stündigern Aufsaugen von 10 N Atrazin erhält, dabei lassen sich drei Klassen von Antworten ermitteln: (i) Keine Detoxifikstion dee Atrazin, obere Kuryp; (ii) signifikante Detoxifikation des Atrazin, untere Kurve; (iii) eine mittlere Detoxifikation, mittlere Kurve.
Abbildung 7a zeigt die Konstruktion dos Plasmide pCIBS. Abbildung 7b zeigt die Konstruktion des Plasmids pClB4. Abbildung 7c zeigt die Konstruktion des Plasmide pCIB2.
Abbildung 7d/e beschreibt die Konstruktion dee Plaamids pCIBlO. Abbildung 7f/g beschreibt die Konstruktion des Plasmids pCIDlOa.
In der folgenden Beschreibung werden eine Reihe von Ausdrucken verwendet, die in der rekomhinanten DNA Technologie, sowie in der Pflanzengenetik gebräuchlich sind.
Um ein klaree und einheitliches Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche eowie des Umfange, der den besagten Ausdrücken zukommen soll, zu gewährleisten, werden die folgenden Definitionen aufgestellt:
Heterologe(s) Gen(e) oder DNA: Eine DNA Sequenz, die für ein spezifisches Produkt, Produkte odar eine biologische Funktion kodiert und die von einer anderen Spezies stammt als derjenigen, in welche das besagte Gen eingeschleusst wird; besagte DNA Sequenz wird auch als Fremdgen oder Fremd-DNA bezeichnet.
Homologet, 3) Gen(e) oder DNA: Eine DNA Sequenz, die für ein spezifisches Produkt, Produkte oder eine biologische Funktion kodiert und die aus der gleichen Spezies stammt, in welche das besagte Gen eingeschleusst wird.
Pflanzen-Promotor· Eine Kontrollsequenz der DNA Expression, die die Transkription jeder beliebigen homologen oder heterologen DNA Gensequenz in einer Pflanze gewährleistet, sofern diese in operabler Weise nit fiinem aolchen Promotor verknüpft ist.
Ueberproduzierender Pflanzen-Promotor (OPP): Pflanzen-Promotor, der in der Lage ist, in einer tranegenen Pflanzenzelle die Expression einer jeden in o|>i>rnbler Wei00 vorkniipften funktionnlon Gensequenz(un) in einem Au oma β υ (gcmosuei. in l'Orni der KNA mim" der
Polypeptidmenge) zu bewirken, das deutlich höher liegt, als dies natürlicherweise in Wirtszellen, die nicht mit besaßt pm OIM' transformiert sind, beobachtet wird.
Glutathion-S-Trant;ferase: Die Definition dieses Enzyms erfolgt auf funktionale Art und W^ise und schlieest jede Glutathion-S-Transferaae (GST) mit ein, die in der Lage ist, in einer gegebenen und gewünschten Pflanze die Konjugation von Glutathion und einer elektrophilen Verbindung zu katalysieren. Dieser Ausdruck umfasst daher nicht nur das Enzym aus der spezifischen Pflanzenspezies, die in die genetische Transformation einbezogen ist, sondern schliesst auch Glutathion-S-Transferaeen (GSTen) aus anderen Pflanzenspezies sowie aus Mikroorganismen oder Säugerzellen mit ein, sofern diese GST in der Lage sind, in der transgenen Pflanzenzelle ihre natürliche Funktion zu erfüllen.
Der Begriff GST schliesst Aminosä'uresequenzen mit ein, die kurzer oder langer sind als die Sequenzen natürlicher GSTen, wie z.B. funktionelle Hybride oder Teilfragmente von GSTen oder deren Analoge.
Pflanze; Jedes photosynthetisch aktive Mitglied aus dem Reich Planta, das durch einen merobranumhüllten Nukleus, ein in Form von Chromosomen organisiertes genetisches Material, membranumhüllte cytoplaamatieche Organelle und der Fähigkeit.zur Durchführung einer Meiose charakterisiert ist.
Pflanzen-Zelle: Strukturelle und physiologische Einheit der Pflanze, bestehend aus einem Protoplasten und einer Ze. Lwand.
Pflanzengewebe: Eine Gruppe von Pflanzenzellen, die in Form einer strukturellen und funktioneilen Einheit organisiert sind.
Pflanzenorgan: Ein abgegrenzter und deutlich sichtbar differenzierter Teil einer Pflanze, wie beispielsweise Wurzel, Stamm, Blatt oder Embryo.
-7
Herbizidtolerante Pflanzen mit erhöhter GST-Enzymaktivität;
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstollung Herbizid-toleranter Pflanzen, deren auf der Detoxifikation des Herbizids basierende Herbizid-Toleranz durch rekomblnante DNA-Moleküle verliehen wird.
Zu den bekennten Detoxifikationsmechanismen gehören die Hydroxylierung Ui.i Kohlenhydrat-Konjugation von Sulfonylhurnstoff (Hutchison et al. , Pesticide Eiochem. and PhysJol.,, 22; 243-249 (Ϊ984)), die D-Arainosäure-Konjugation ur, 2-4-D (Davidonis et al., Plant Phys., 70: 357-360 (3352;) und die Konjugation von Glutathion an elektrophile Verbindungen, katalysiert durch die Glutathion S-Transforase.
Die vorliegende Erfindung betrifft herbizidtolerante Pflanzen, die mit einem rekoaibin< «ton DNA-Mülekül transformiert sind, des für ein Enzym kodiert, welches für die Detoxifikation von Herbiziden verantwortlich ist. Die rekombiner.ten DNA-Moleküle sind durch sine Gen-Sequenz gekennzeichnet, welche für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid kodiert, sowie herbizidtolerante transformierte Pflanzen, die einet erhöhte Glutathion S-Transferase Enzymaktivität aufweisen. Die Glutathion enthaltenden Pflanzenzellen und Pflanzen Kind durch ein Glutathion S-Transferase Gen transformiert, oas bei der Expression in besagter Pflanzenzelle oder Pflanze die GST-Enzymaktivität steigert und somit der Pflanze eine Toleranz gegenüber Herbiziden verleiht. Im Rahmen dieser Erfindung werden für die Modifikation dieser Pflanzen genmanipulatorische Techniken verwendet.
Unter einer "herbizidtoleranten Pflanze" ist im Rahmen der vorliegenden Er.xndung definitionsgeraäß eine Pflanze zu verstehen, die in Gegenwart einer normalerweise wirksamen Herbizidkonzentration überlebt und vorzugsweise ein normales Wachstum zeigt.
Herbizid-Toleranz in Pflanzen bezieht sich erfindungsgemäss auf einen Detoxifikationsmechanismus in der Pflanze, auch wenn der Herbizid-Dindunge- oder -Zielort weiterhin sensitiv ist.
Unter Resistenz ist die maximal erreichbar» Toleranz zu verstehen.
Die Detoxifikation muss von anderen Mechanismen zur Uebertragung piner.Herbizid-Toleranz unterschieden werden, bei denen der Herbizid-Bindung«- oder -Zielort verändert wird und nicht, langer sensitiv ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bleibt der Hi>rbiz1d-llindunp,iiorl in dar Pflanze unverändert sensitiv, wobei aber daö Herbizid nicht gebunden wird, da es z.B. durch das GST-Enzym zuvor entgiftet wird.
Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Herbizid-Toleranz" soll daher sowohl Toleranz als auch Resistenz gegenüber Herbiziden umfassen, wobei besagte Toleranz bzw, Resistenz auf die Detoxifikation von Herbiziden, beispielsweise aufgrund einer erhöhten GST-Enzymaktivitär. zurückzuführen ist. Eine herbizidtolerante Pflanze kann ohne Schädigungen in der Gegenwart bestimmter Herbizide überleben, die für herbizidsensitive Pflanzen letal sind oder deren Wachstum oder Vitalität beeinträchtigen.
Unter Herbiziden sind im Rahmen dar vorliegenden Erfindung alle Herbizide zu verstehen, die detoxifiziert werden können, beispielsweise durch Bildung von Konjugate an pflanzliches ulutathion oder Glutathionanaloge oder -homologe, bzw. an jede elektrophile Verbindung. Besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Herbizide, die einen Chlor-Rest aufweisen. Beispiele derartiger Herbizide, die aber keine Limitierung darstellen, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung: Triazine, einschlieeslich der Chloratrazine, Acetamide, einschlieselich der Chloracßtanilide, Sulfonylharnstoffe, Imidazolinone, Thiocarbamate, chlorierte Nitrobem'.ole, Diphenylether und andere. Einige spezifischen Beispiele solcher Herbizide umfassen
- 9 - ZfS2Cf
das Atrazin, Alachlor, S-Ethyldipropylthiocarbamat und Diphenylether. Siehe ebenso: Herbicide Resistance in Plants (H. LeBaron and J. Gresael, ed., 1982).
Bei einigen der genannten Herbizide handelt es sich um potente Photosynthesehemmer in der Pflanze.
Frear et al., Phytochemistry, 9: 2123-2132 (1970) (Chlortriazine); Frear et al., Pesticide Biochem. and Physiol., 20: 299-310 (1983) (Diphenylether); Lay et al., Pesticide Biochem. and Physiol., 6: 442-456 (1976) (Thiocarbamate); and Frear et al., Pesticide Biochem. and Physiol., 23: 56-65 (1985) (Metribuzin). Andere Herbizide führen zur Inaktivierung von Enzymen, die in der Biosynthese von Aminosäuren eine Rolle spielen.
Auch wenn der Ausdruck "Herbizide" verwendet wird um diese Verbindungen zu beschreiben, so ist der Gebrauch dieses Ausdruckes im Rahmen dieser Erfindung nicht als limitierend zu betrachten. So gibt es beispielsweise zahlreiche Insektizide und Pestizide (zur Kontrolle von Krankheiten, Parasiten und Frassfeinden), die bei Applikation auf die Pflanze schädliche Auswirkungen auf die Vitalität der Pflanze haben. Das insektizid- oder pestizid-wirksame Agens kann möglicherweise durch die Blätter, den Stamm oder aus dem Boden über das Wurzelsystem in die Pflanze aufgenommen werden.
Darüberhinaus gibt es zahlreiche Xenobiotika, die zu den elektrophilen Verbindungen gehören und die in einer durch die GST-Enzymaktivität katalysierten Reaktion an Glutathion konjugiert werden können. Diese xenobiotischen Verbindungen sind ebenso von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Eine spezifische AusfUhrungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Herbizide, die Sensibilisatoren darstellen, d.h. Inhibitoren der GST-Enzymaktivität. Diese Sensibilisatoren hemmen den endogenen DetoxifikationemechaiiiBmue, indem sie ein GST-Sensibilisator-Konjugat bilden.
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Die gleichzeitige Applikation eines Herbizids und eines Sensibilisator, z.B. Tridiphrn, auf eine Pflanze, führt zu einer Hemmung der enzymkatalysierten Konjugation zwischen Glutathion und dem Herbizid. Ezra et al., "Tridiphane as a Synergist for Herbicides in Corn (Zea mays) and Proso Millet (Panicum miliaceum), Weed Science, 33: 287-290 (1985).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung führt daher die Anwendung genmanipulatorischer Techniken zur Uebertragung einer GST-Enzymaktivitä't oder einer erhöhten GST-Enzymaktivität auf eine Pflanze, zu einer transgenen Pflanze, die eine erhöhte Toleranz bzw. Resistenz gegenüber Sensibilisatoren wie Tridiphan aufweist.
Auf diese Welse können beispielsweise ein Sensibilisator und ein Herbizid in Kombination auf Herbizid-sensitive und gleichzeitig auf Herbizid-tolerante Pflanzen gemä'ss der vorliegenden Erfindung appliziert werden. Diese Kombination von Sensibilisator und Herbizid wird in der Regel für die Herbizid-sensitiven Pflanzen toxisch sein, nicht aber f(ir transgene Pflanzen.
Jede Pflanze, die Glutathion oder eine analoge Verbindung, wie beispielsweise Homo-Glutathion, enthält und die einer genetischen Manipulation unter Anwendung gsnmanipulatorischer Techniken zugänglich ist, kann im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Die transgene Pflanze muss darüberhinaus in der Lage sein, das GST-Gen zu exprimieren.
Unter Pflanzen sollen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Pflanzenzellen, Pflanzenprotoplasten, pflanzliche Gewebekulturen, die kultiviert und zur Bildung ganzer Pflanzen induziert werden können, aber auch Pflanzenkalli, Pfl&nzenklumpen sowie Pflanzenzellen als intakte Bestandteile einer Pflanze und Pflanzenteile verstanden werden
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Der Ausdruck "Pflanze" bezieht eich auch auf Pollen, der mit Hilfe genmanipulatorischer Techniken transformierbar ist.
Die höchsten Glutarhionkonzentrationen in Pflanzen finde:, man in der Regel in den subzellulären Kompartimenten des pflanzlichen Gewebes, wie z.B. in den pflanzlichen Piastiden, insbesondere in den Chloroplaet;en (Rennenberg, H., Phytochemiotry, ,21.: 2771-2781 (1982)]. Glutathion hat eine Gamma-L-Glutarayl-L-Cysteinyl-Glycin-Struktur. Eine homologe Form des Glutathion, das Homo-Glutathion, wurde in einigen Pflanzen gefunden. Es hat die Struktur des Gamma-L-Glutamyl-L-Cysteinyl-bi'ta-AlnninB [Carnegie, P., Hiochoin. J. , £9: 459-471 (1963) und Carnegie, P., Biochem. J., £9: 471-478 (1963)).
Pflanzen weisen unterschiedliche Mengen an Glutathion oder Homo-Glutathion auf.'So findet man beispielsweise in verschiedenen Leguminosen in der Hauptsache Homo-Glutathion, während andere Leguminosen vorzugsweise Glutathion enthalten. Normalerweise liegt in Fällen, in denen eine der beiden Komponenten, entweder Homo-Glutathion oder Glutathion, in der Pflanze vorherrscht, die andere Komponente nur in geringer Konzentration, vor. (Rennenberg, supra).
Die für das Glutathion-S-Transferase (GST)-Gen kodierende Region, die gema'ss der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann homologen oder heterologen Ursprungs sein, im Verhältnis zu der Pflanzenzelle oder der Pflanze, die uransformiert werden soll. Es ist jedoch auf alle Fälle notwendig, dass die Gensequenz, die für GST kodiert exprimiert wird und zur Produktion eines funktionstüchtigen Enzyme oder Polypeptide in der resultierenden Pflanzenzelle führt. Bestandteil der vorliegenden Erfindung sind daher Pflanzen, die entweder homologe oder heterologe GST-Gene besitzen und die das GST-Enzym exprimieren.
Weiterhin kann die GST aus anderen Pflanzen-Spezies oder aus Organismen stammen, die einer anderen taxonomitchen Einheit angehören, so z.B. aus Mikroben oder aus Säugern.
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Wie zuvor beschrieben, handelt es sich bei dem GST-Enzym um eine Klasse multifunktioneller Enzyme. Daher ist es notwendig, ein GST-Gen auszuwählen, das die Konjugation von Glutathion und einer elektrophilen Verbindung katalysiert.
Da Glutathion als Substrat der GST fungiert, war es vor dieser Erfindung ungewiss, ob das GST-Enzym, das für'die Konjugation von Glutathion spezifisch let, Homo-Glutathion in transformierten Pflanzen akzeptiert. Frear et al., Phytochemistry, 9: 2123-2132 (1970) (weist nach, dass GlutatMon-S-Trnnsferase spezifisch für induziertes Glutathion int). Dae benötigte GST-Enzym, dna spezifisch ist für Glutathion, kann durch Verwendung eines Assays, bei dem zur Differenzierung der verschiedenen Glutathion-S-^Vansferasen die Substratspezifitä't bestimmt wird, identifiziert und ausgewählt werden. In einem typischen Assay kann die Glutathion-spezifische GST mit Hilfe einer Affinitätschromatographie charakterisiert werden [Tu et al., Biochem. and Biophys. Research Comm., 108; 461-467 (1982); Tu et al., J. Biol. Chem., 258: 4659-4662 (1983); and Jakoby et al., in Glutathione; Metabolism and Function, (Raven Press, New York, 1976)].
In einer spezifischen Ausführungeform dieser Erfindung handelt es sich bei der GST um eine pflanzliche GST, die der zu traneformierenden Pflanze homolog ist. In einer weiteren Ausführungeform dieser Erfindung, handelt es sich bei der GST um eine pflanzliche GST, die heterolog ist zu der zu transformierenden Pflanze.
Zu den Pflanzen, die einer. GST-Ueberschuss haben, gehören Mais und Sorghum. Eine weitere Ausführungeform der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine Säuger-GST. Säuger-GSTen sind bekannt und beschrieben bei Reddy et al., Archives of Biochem. and Biophys., 224: 87-101 (1963) (Schafeleber); Tu et al., J. Biol. Chem., 258: 4659-4662 (1983) (Rattengewebe aus Herz, Niere, Leber, Lunge, Milz und Testie). Das bevorzugte G£T-Gen ist gekennzeichnet durch die kodierende Region des GS'f-Gens aus Rattenleber, insbesondere durch
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Y, 200, beschrieben in Beispiel I sowie das vervollständigte Y, 187 beschrieben in Beispiel IB. Ein weiterer Bestandteil der vorliegenden Erfindung betrifft die codierende Region eines GST-Gens aus dem Rattengehirn, insbesondere den cDNA Klon GlY. » der in Beispiel IE beschrieben ist. Er sind jedoch auch andere Gene bekannt, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Siehe: Mannervik, B., Adv. Enzymol Relat. Areas Mol. Biol., 52·· 357-417 (1985), per Referenz in diese Erfindung inkorporiert.
Die für die Glutathion-S-Transferase kodierende DNA-Sequenz kann ausschliesslich aus genomischer bzw. aus cDNA konstruiert sein. Eine andere Möglichkeit besteht in der Konstruktion einer hybriden DNA-Sequenz bestehend sowohl aus cDNA als auch aus genomischer DNA. In diesem Fall kann die cDNA aus demselben Gen stammen wie die genomische DNA oder aber, sowohl die cDNA, wie auch die genomische DNA können aus verschiedenen Genen stammen. In jedem Fall können aber, sowohl die genomischen DNA und/oder die cDNA, jede fur sich, aus dem gleichen oder aus verschiedenen Genen hergestellt sein.
Wenn die DNA-Sequenz Anteile von mehr als einem Gen beinhaltet, können diese Gene entweder von ein und demselben Organismus, von mehrteren Organismen, die mehr als einem Stamm, einer Varietät oder einer Spezies derselben Gattung angehören, oder aber von Organismen, die mehr als einer Gattung derselben oder einer anderen taxonomischen Einheit (Reich) angehören, abstammen.
Die verschiedenen DNA-Sequenzabschnitte können mit Hilfe an sich bekannter Methoden miteinander zu einer vollständigen Glutathion-S-Transferase kodierenden DNA-Sequenz verknüpft sein. Geeignete Methoden schliessen beispielsweise die in vivo Rekombination von DNA-Sequenzen, die homologe Abschnitte aufweisen sowie die in vitro Verknüpfung von Restriktionsfragmenten mit ein.
Es werden somit eine Vielzahl von AusfUhrungsformen von dem breiten Konzept dieser Erfindung umfasst.
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Eine dieser erfindungegemässen Ausführungsformen ist durch eine chimäre Gen-Sequenz gekennzeichnet, enthaltend:
(a) eine erste Gen-Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid kodiert, das nach erfolgter Expression des Gens in einer gegebenen Pflanzenzelle Glutathion S-Traneferase-Aktivität aufweist; und
(b) eine oder mehrere zusätzliche Gensequenzen, die in operabler Weise mit beiden Seiten der für GST-kodierenden Region verknüpft sind. Diese zusätzlichen Gensequenzen enthalten Promotor- und/oder Terminator-Regionen. Die pflanzlichen regulatoriuchen Sequenzen können im Verhältnis zu der Wirtszelle heterolog oder homolog sein .
Jeder Promotor und jeder Terminator, der in der Lage ist, eine Induktion der Expression einer für GST-kodierenden Region zu bewirken, kann als Bestandteil der chimären Gensequenz verwendet werden· Beispiele geeigneter Promotoren und Terminatoren sind z.B. solche der Nopalin-Synthase-Gene (nos), itr Octopin-Synthase-Gene (ocs.) sowie der Cauliflower Mosaik Virus Gene (CaMV).
Ein wirksamer Vertreter eines Pflanzenpromotors, der Verwendung finden kann, ist ein Uberproduzierender Pflanzenpromotor. Diese Art von Promotoren sollte, sofern sie in operabler Weise mit der Gensequenz für die GST verknüpft ist, in der Lage sein, die Expression besagter GST in einer Weise zu vermitteln, dass die transformierte Pflanze gegenüber einem Herbizid aufgrund der vorhandenen bzw. aufgrund einer erhöhten GST-Enzymaktivität tolerant ist.
Ueberproduzierende Pflanzenpromotoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommen können, nchliessen den Promotor der kleinen Untereinheit (email subunit; es) der Ribulose-1,5-bisphoephat-Carboxylaee aus Sojabohnen (Berry-Lowe et al., J1 Molecular and App. Gen., U 483-498 (1982)1 sowie der, Promotor des Chlorophyll-a/b-Bindungsproteine ein. Diese beiden Promotoren sind
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dafür bekannt, dass sie in eukaryontischen Pflanzenzellen durch Licht induziert werden [siehe z.B. Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, New York 1983, Seite 29-38; Coruzzi G. et al., The Journal Of Biological Chemistry, 2_58: 1399 (1983) und Dunsmuir, P. et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 2: 285 (1983)].
Die chimare Gensequenz, die aus einem Glutathion-S-Traneferase-Gen besteht, das in operabler Weise mit einem pflanzlichen Promotor verknüpft iet, kann in einen geeigneten Klonierungsvektor eingeapleisst werden. Im allgemeinen verwendet raan Plasroid- oder Virus-(Bakteriophage)-Vektoren mit Replikationa- und Kontrollsequenzen, die von Spezies stammen, die mit der Wirtszelle kompatibel sind.
Der Klonierungevektor trägt in der Regel einen Replikationsursprung, auseerdem spezifische Gene, die zu phenotypischen Selektionsmerkmalen in der transformierten Wirtszelle führen, insbesondere zu Resistenzen gegenüber Antibiotika oder gegenüber bestimmten Herbiziden. Die transformierten Vektoren können anhand dieser phenotypischen Marker nach einer Transformation in einer Wi rtszelle selektiert werden.
Als Wirtszellen kommen im Rahmen dieser Erfindung Prokaryonten in Frage, einschliesslich bakterieller Wirte, wie z.B. A.tumefaciens, E.coil, S.typhimurium und Serratia marcescens, sowie Cyanobakterien. Ferner können auch eukaryontieche Wirte wie Hefen, mycelbildende Pilze und Pflanzenzellen im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
Der Klonierungsvektor und die mit diesem Vektor transformierte Wirtszelle werden erfindungsgemäss dazu verwendet, die Kopienzahl des Vektors zu erhöhen. Mit einer erhöhten Kopienzahl ist es möglich, den Vektor, der das GST-Gen trägt, zu isolieren und z.B. für die Einschleusung der chimaren Gensequenz in die pflanzliche Zelle zu verwenden.
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Die Einschleusung von DNA in Wirtezellen kann mit Hilfe von an eich bekannten Verfahren durchgeführt werden. So können beispielsweise bakterielle Wirtezellen nach einer Behandlung mit Calciumchlorid transformiert werden. In Pflanzenzellen läset sich DNA durch direkten Kontakt mit den aus den Zellen hergestellten Protoplasten einschleusen.
Eine andere Möglichkeit zur Einführung von DNA in Pflanzenzellen bestellt darin, dass man die Zellen mit Viron oder mir Agrobacteriuro in Kontakt bringt. Dies kann durch Infektion eensitiver Pflanzenzellen oder durch Co-Cultivierung von Protoplasten, die sich aus Pflanzenzellen ableiten, bewerkstelligt werden.
Diese Verfahren werden im folgenden noch genau diskutiert.
Für die direkte Einschleuaung von DNA in Pflanzenzellen stehen eine Reihe von Verfahren zur Verfügung· So kann das genetische Material, das in einem Vektor enthalten ist, beispielsweise mit Hilfe von Mikropipetten für den mechanischen Transfer deν rekombinanten DNA direkt in die Pflanzenzellen mikrpinjiziert werden· Das genetische Material kann ebenso nach einer Behandlung der Protoplasten mit Polyethylenglykol in diese eingebracht werden. (Paszkowski et al., EMBO J., 3: 2717-22 (1984)].
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Einschleusung des GST-Gene in die Pflanzenzelle mit Hilfe der Elektroporation [Shillito et al., Biotechnology, 3: 1099-1103 (1985); Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, £2: 5824 (1985)].
Bei dieser Technik werden pflanzliche Protoplasten in der Gegenwart von Plasmiden, die das GST-Gen enthalten, einer Elektroporation unterzogen.
Elektrische Impulse hoher Feldstärke führen zu einer reversiblen Permeabilitätserhöhung von Biomembranen und ermöglichen damit die Einschleusung der Plasmide, Elektroporierte pflanzliche Protoplasten
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erneuern ihre Zellwand, teilen eich und bilden Kallusgewebe. Die Selektion der transformierten Pflanzenzellen mit dem exprimierten GST-Enzym kann mit Hilfe der zuvor beschriebenen phenotypiechen Marker erfolgen.
Das Cauliflower Mosaik Virus (CaMV) kann im Rahmen diessr Erfindung ebenso ale Vektor für die Einschleusung des GST-Gens in die Pflanze verwendet werden (Hohn et al., in "Molecular Biology of Plant Tumor«", Arndomie ProsB, New York, 1982, Seito 549-"JCiO; llowol I , US-Patent Patent No. A,407,956).
Das gesamte virale DNA-Genom von CaMV wird dabei in ein bakterielles Elternplasmid integriert unter Ausbildung eines rekombinanten DNA Moleküls, das in Bakterien vermehrt werden kann. Nach erfolgter Klonierung wird dae rekombinante Plaemid mit Hilfe von Restriktionsenzymen entweder zufällig oder an ganz spezifischen nicht essentiellen Stellen innerhalb des viralen Teils des rekombinanten Plasmids gespalten, z.B. innerhalb des Gens, das für die Uebertragbarkeit des Virus durch Blattläuse kodiert, um die GST-Gensequenz einbauen £u können.
Ein kleines Oligonucleotid, ein sog. Linker, der eine einzige, spezifische Restr.' .'.ionserkennungsstelle besitzt, kann ebenfalx.-integriert werden Das so modifizierte rekombinante Plasmid wird erneut klonier.t und durch E^nspleissen der GST-Gensequenz in eine nur einmal vorkommende Reetriktionsstelle weiter modifiziert.
Der modifizierte virale Anteil des rekorbinanten Pias lids wird dann aus dem bakteriellen Eltern-Plasmid ausgeschnitten und für die Inokulation der Pflanzenzellen oder der gesamten Pflanzen verwendet.
Eine andere Methode zur Einschleusung der GST-Gene in die Zelle bedient sich dar Infektion der Pflanzenzelle mit Agrobacterlum tumefaciens, welches mit dem GST-Gen transformiert ist. Die transgenen Pflanzenzellen werden anschliessend unter geeigneten, dem
Fachmann bekannten Kultivierungsbedingungen kultiviert, so dass sie Schösslinge und Wurzeln nusbilden und letztlich ganze Pflanzen resultieren.
Die GST-Gansequenzen lassen eich beispielsweise mit Hilfe des Ti-Plastnids von Agrobacterium tumefacions in geeignete Pflanzenzellen überführen [DeCleene et al., Bot. Rev., 47: 147-194 (1981); Bot. Rev., kl\ 389-466 (1976)], Das Ti-Plasmid wird im Verlaufe der Infektion durch Agrobacterium tumefaciens auf die Pflanze übertragen und stabil uns Pflanzengenom integriert. [Horsch et al., Science, 233: 496-493 (1984); Fraley et al., Proc. Nrti. Acad. Sei. USA, 80: 4803 (1983)].
Für Pflanzen, deren Zellen für eine Infektion mit Agrobacterium nicht sensitiv sind, kann man auf die Co-Kultivierung von Agrobacterium mit dem entsprechenden Protoplasten zurückgreifen.
Ti-Plasmide besitzen zwei Regionen, die für die Herstellung traneformierter Zellen essentiell sind. Eine davon, die Transfer-DNA Region, wird auf die Pflanze übertragen und führt zur Induktion von Tumoren. Die andere, die virulenzverleihende (vir) Region, ist nur für die Ausbildung, nicht aber für die Aufrechterhaltung der Tumoren essenLiull. Die Transfer-DNA Region kann in ihren Dimensionen durch Einbau der GST-Gensequenz vergrössert werden, ohne dass die Uebertragungsfähigkeit beeinträchtigt wird. Durch Entfernen der tumorverursacheriden Gene, wodurch die transgenen Pflanzenzellen nichttumorös bleiben und durch Einbau einee aelokiionierbaren Markers, kann das modifizierte Ti-Plasmid als Vektor für den Transfer der erfinüungsgemässen Genkonstruktion in eine geeignete Pflanzenzelle verwendet werden.
Die vir-Region bewirkt den Transfer der T-DHA Region von Agrobacterium auf das Genom der Pflanzenzelle, unabhängig davon, ob die T-DNA-Region und die vir-Region auf demselben Vektor oder auf
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verschiedenen Vektoren innerhalb derselben Agrobacterium-Zelle vorliegen. Eine vir-Region auf einem Chromosom induziert ebenso den Transfer dar T-DNA von einem Vektor :i.n eine Pflanzenzelle.
Bevorzugt wird ein System zur Debertragung einer T-DNA-Region von einem Agrobacterium in Pflanzenzellen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die vir-Region und die T-DNA-Region auf verschiedenen Vektoren liegen. Ein solches System ist unter dem Begriff "binäres Vektor-System" bekannt und der die T-DNA enthaltende Vektor wird als ein "binärer Vektor" bezeichnet.
Jeder T-DNA enthaltende Vektor, der in Pflanzenzellen übertragbar ist und der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt, ist für die Verwendung im Rahmen dieser Erfindung geeignet. Bevorzugt, ist ein Vektor, der aus einem Promotor, einer kodierenden Sequenz und pCIBlO hergestellt ist.
Jeder Vektor mit einer vir-Region, der den Transfer einer T-DNA-Region von Agrobacterium auf Pflanzenzellen bewirkt, kann im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden, Der bevorzugte Vektor mit einer vir-Region ist pCIB542.
Pflanzenzellen oder Pflanzen, üe gemäss der vorliegenden Erfindung transformiert worden sind, können mit Hilfe eines geeigneten phenotypischen Markers, der neben dem GST-Gen Bestandteil der DNA ist, eelektioniert werden. Beispiele solcher phenotypischer Marker, die aber nicht als limitierard aufzufassen sind, beinhalten Antibiotikaresistenz-Marker, wie Lfrispielsweise Kanamycinresietenz- und Hygromycinresistenz-Gene, oder Herbizidresistenz-Marker> Andere plipfiotypinrhe Markör sind dem Fachmann bekannt und können ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.
Alle Pflanzen, deren Zellen sich durch direkte Einschleusung von DNA oder durch Kontakt mit Agrobacteriumtransformieren lassen und anechliessand zu vollständigen Pflanzen regenerierbar sind, können dem erfindungagemässen Verfahren zur Herstellung tranogener ganzer
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Pflanzen, die das übertragene GST-Gen enthalten, unterzogen werden. Es existiert eine ständig wacheende Anzahl von Hinweisen, die darauf schliessen lassen, dass sich im Prinzip alle Pflanzen aus kultivierten Zellen oder Geweben regenieren laufen, einschlieselich, aber nicht beschränkt auf, alle wichtige Getreidearten, Zuckerrohr, Zuckerrüben, Baumwolle, Obstbäumen und anderer Baumarten, Leguminosen sowie Gemüsen.
Zu den Zielkulturen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zählen beispielsweise auch jene, ausgewählt aus der Reihe: Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vlgna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopaia, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, lycopersion, Nicotiana, Solsnum. Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorlum, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Neme8Ja, Pelargonium, Panicum, Pennise':um. Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumia, Browallia. Glycine, LoHum, Zea, Triticum und Sorghum, einechliesslich derjenigen, ausgewählt aus der Reihe: Ipomoea, Paasiflora, Cyclamen, Malus, Prunus, Rosa, Rubua, Populue, Santalum, Allium, I.xlium, Narcissus, Ananas, Arachis, Phaseolue u ι id Pi sum.
Die Kenntnissse darüber, inwieweit alle diese Pflanzen mit Hilfe von Agrobacterium transformiert werden können, sind zur Zeit noch beschränkt. In'vitro lassen sich beispielsweise auch Pflanzenepeziee transformieren, die keine natürlichen Wirtspflanzen für Agrobacteriuro sind. So oind beispielsweise monokotyle Pflanzen, insbesondere die Getreidearten und Gräser, keine natürlichen Wirte für Agrobacterium.
Es r^ibt in cer Zwischenzeit vermehrt Hinweise darauf, dass sich auch Monokotyledonon mit Agrobacterium transformieren lassen, so dass unter Verwendung von neuen t scperimantellen Ansätzen, die jetzt verfügbar werden, aach Getreide und Grase'-Spezies einer Transformation zugänglich sind [Griraeluy, N., et al., Nature, 325; 177-179 (1987)).
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Die Regeneration von in Kultur gehaltenen Protoplasten zu ganzen Pflanzen ist bei Evane, et al., "Protoplast Isolation and Culture", in Handbook of Plant Cell Culture, U 124-176 (MacMillan Publishing Co. New York 1983); M.R. Davey, "Recent Developments in tht Culture and Regenration of Plant Protoplaste", ProtoplaBts, 1983 - Lecture Proceedings, Seite 19-29, (Birkhä'user, Basel 1983); P.J. Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", in Protoplasts 1983 - Lecture Proceedings, Seite 31-Al, (Uirkhäuser, Basel 1983); und H. Binding, "Regeneration of Plants", in Plant Protoplasts, Seite 21-37, (CRC Press, Boca Raton 1985) beschrieben.
Die Regeneration unterscheidet sich von Pflanzenspezies zu Pflanzenspezies. Im allgemeinen aber wird zunächst eine Suspension von transformierte·! Protoplasten, Zellen oder von Gewebe, die zahlreiche Kopien der GST-Gene enthalten, hergestellt. Ausgehend von diesen Suspensionen kann anschliessend die Induktion der Embryobildung erfolgen. Man lässt die Entwicklung der Embryonen bis zum Stadium der Reife und Keimung fortschreiten, wie dies auch bei natürlicherweise vorkommenden Embryonen der Fall ist. Die Kulturmedien enthalten in der Regel verschiedene Aminosäuren und Hormone, wie z.B. Auxin und Cytokinine. Es erweist sich ebenfalls als vorteilhaft, dem Medium Glutaminsäure und Prolin zuzugeben, insbesondere bei Spezies wie Mais und Alfalfa. Die Spross- und Wurzelbildung erfolgt im allgemeinen simultan. Eine effiziente Regeneration hängt in erster Linie vom Medium, vom Genotyp und von der Vorgeschichte der Kultur ab. Werden diese drei Variablen hinreichend kontrolliert, dann ist die Regeneration vollständig reproduzier- und wiederholbar.
Pflanzen, die für die erfindungsgemä'&se Verwendung geeignet sind, schlieseen beispielsweise Spezies aus den Gattungen Lotus, Medicare/, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Citrus, Linum, Manihot, Daucus, Arabldopsis, Bra:sica, Raphanue, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyo8cyarou8, Lycopereicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Majorana, Cichorium, Hfeiianthus, Lactuca, Asparagus, Antirrhinum, Panicum,
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Pennisetum, Ranunculua, Salpiglossis, Glycine, GosBypium, Malus, PrunuB, Rosa, Populua, Allium, Lilium, Narciasus, Ananas, Arachio, Phaseolua und Pit>um ein.
Nachdem man herausgefunden hat, dass Oryza (Reis) aus Protoplasten zu ganzen Pflanzen regeneriert werden kann,.sollte es jetzt auch möglich sein, andere Pflanzen aus der Familie der Gramineae zu regenerieren. Es können im Rahmen der vorliegenden Erfindung daher auch die folgenden Pflanzen verwendet werden: LoIium, Zea, Triticum, Sorghum und Bromus.
Besonders bevorzugt gema'ss dieser Erfindung sind Pflanzen aus den Gattungen Nicotana spp. (z.B. Tabak), Glycine spp. (insbesondere Glycine max, Sojabohne) und Gossypium spp. (Daumwolle).
Die reifen Pflanzen, die aus transformierten Pflanzenzellen herangezogen wurden, werden zur Samenproduktion mit sich selbst gekreuzt. Einige der Samen enthalten die Gene für eine gesteigerte GST-Enzymakt-tvität in einem Verhältnis, das genau den etablierten Ges^zen der Vererbung gehorcht. Dieso Samen können zur Produktion herbizidtoleranter Pflanzen verwendet werden. Die Toleranz dieser Samen läset sich beispielsweise durch Wachstum der Samen in herbizidhaltiger Erde bestimmen. Alternativ dazu kann auch die Herbizid-Toleranz der transformierten Pflanze bestimmt werden, und zwar durch Applikation des Herbizids auf die Pflanze.
Homozygote Linien können durch wiederholte Selbstfertilisation und Herstellung von Inzuchtlinien gewonnen werden. Diese Inzuchtlinien können dann wiederum zur Entwicklung von herbizidtoleranten Hybriden verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine? herbizidtolerante In/.uchtlinie mit einer anderen Inzuchtlinie zur Produktion herbizidresistenter Hybride gekreuzt.
Teile, die von regenerierten Pflanzen erhalten werden können, wie z.B. BiUten, Samen, Blätter, Zweige, Früchte u.a. sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung, sofern diece Teile herbi-
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zidtolerante Zellen beinhalten. Nachkommen (ainschliesslich hybrider Nachkommen), Varietäten und Mutanten der regenerierten Pflanzen sind ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung.
Verwendung der GST-Genkonstruktionen und herbizidtoleranter Pflanzen
Die zuvor beschriebenen GST Genkonstruktionen können in Vektoren als Zwischenprodukte bei der Herstellung herbizidtolerant.er Pflanzenzellen, Pflanzenorgane, Pflanzengewebe sowie ganzer Pflanzen verwendet werden.
Die Bedeutung herbizidto.leranter Pflanzen gemäss der vorliegenden Erfindung ist offensichtlich. Diese Pflanzen ermöglichen es den Landwirten nämlich, zunächst eine herbizidtolerante Feldfrucht auszupflanzen und das Feld anschliessend zur Bekämpfung von Unkräutern mit dem Herbizid zu behandeln, ohne dabei die Feldfrucht zu schädigen.
Darüberhinaus erlaubt es eine herbizidtolerante Pflanze den Landwirten, Feldfrüchte auf Flächen anzupflanzen, die zuvor mit Herbiziden behandelt worden sind, beispielsweise im Zuge einer Fruchtfolge, bui der einer von Natur aus toleranten Pflanze eine natürlicherweise sensitive Pflanze folgt. Diese herbizidbehandelten Anbauflächen können einen "Herbizidüberschuss" im Boden enthalten, so dass vcn Natur aus herbizidsensitive Pflanzen im Rahmen einer Fruchtfolge durch diesen Herbizidüberschusa. im Boden geschädigt werden können, wenn sie wich nicht als tolerant erweisen ((Sheets, T., Residue Reviews, 32: 287-310 (1970); Burnside et al., Weed Science, lj>: 290-293 (1971)].
Landwirte pflanzen beispielsweise in der Regel Mais und Sojabohnen in wechselnder Folge an. Während die Maispflanzun von Natur aus tolerant sind gegenüber bestimmten Herbiziden, wie z.B. verschiede-
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nen Triazinen, wie Atrazin, können die empfindlicheren Sojabohnenpflanzen geschädigt werden, wenn sie auf eine Fläche ausgepflanzt worden, die zuvor mit Herbiziden behandelt worden lot. Dei der Verwendung einer herbizidtoleranten Pflanze gemäsa vorliegender Erfindung, wird eine Schädigung aufgrund eines Herbizid-Überschusses im Boden vermieden (Fink et al., Weed Science, 17; 35-36 (1969) (Sojabohnen); Khan et al., Weed Research, 2J.: 9-12 (1981) (Hafer und Timotheuspf lanzen); Brink.nan et al. , Crop Science, 20: 185-189 (1980) (Hafer); Eckert et al. , J. Ranp.e Mf.nit. , Tb: 219-224 (1972) (Quecke)).
Die vorliegende Erfindung schlieest ebenfalls ein Verfahren zur Pflanzenkontrolle mit ein, welches sich dadurch kennzeichnet, dass man eine Mischpopulation bestehend aus einer herbizidsensitiven Pflanze, wie z.B. einem Unkraut, und einer erfindungsgemäss herbizidtoleranten Pflanze mit einer für die Bekämpfung der herbizideensitiven Pflanze wirksamen Menge eines Herbizids in Kontakt bringt. Daher iet das Verfahren der Plattbehandlung von herbizidtoleranton Pflanzen und herbizidsensitiven Unkräutern mit Herbiziden auf dem Feld, wobei beide Pflanzentypen im Verlaufe der Behandlungsoperation gleichzeitig mit dem Herbizid in Kontakt gebracht werden, ebenfalls ein Gf/ganstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein zuvor bereits beschriebenes Verfahren der Pflanzenkontrolle, das sich dadurch kennzeichnet, dass ein Herbizid und ein Sensibilisator in einer Miechpopulation gleichzeitig sowohl auf herbizidtolerante als auch auf h.erbizidsensitive Pflanzen appliziert werden.
Der Begriff "pflanzenkontrollierende Menge eines Herbizida" beschreibt auf funktionelle Weise eine Aufwandmenge eines Herbizide, die in der Lage ist, das Wachstum oder die Entwicklung einer bestimmten Pflanze zu beeinträchtigen. Die Aufwandmenge kann demnach entweder möglichst klein gehalten werden, so dass sie flir einen
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Rückgang bzw. eine Unterdrückung des Wachstums oder der Entwicklung ausreicht« oder aber sie kann so groß gewählt werden« daß ein irreversible Schädigung der sensitiven Pflanze eintritt.
Die tatsächliche Aufwandmenge hängt zum einem von dem verwendeten Herbizid« zuei anderen von der zu kontrollierenden Pflanze ab. Für dikotyle Pflanzen und Unkräuter z. B. werden in der Regel Aufwandmengen zwischen 0,5 und 1,5 kg/ha benötigt. Für monokotyle Pflanzen liegen die benötigten Herbizidkonzentrationen im allgemeinen zwischen 0,5 und etwa 2,0 kg/ha. Verschiedene Herbizide, wie beispielsweise die Sulfonylharnstoffe« sind dafür bekannt« daß sie bereits in sehr geringen Aufwandmengen wirksam sind.
Die Herbizide können mit den entsprechenden Pflanzen unter Verwendung gut bekannter Sprüh- oder Streuverfahren in Kontakt gebracht werden. So kann beispielsweise die vorpublizierte Blattapp.likation zur Kontrolle von Unkräutern durch Atrazin in Gegenwart von Atrazin-toleranten Pflanzen gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden.
Nach der allgemeinen Beschreibung der vorliegenden Erfindung soll nun zum besseren Verständnis auf spezifische Ausführungebeispiele Bezug genommen werden, die zum Zwecke der Illustration in die Beschreibung mitaufgenommen werden, und die keinen limitierenden Charakter haben, es sei denn, es wird speziell darauf hingewiesen.
Ausfuhrungsbeispiel Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher er-
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läutert.
Die in den folgenden Beispielen verv/endeten Verfahren sind generell bei Maniatis et al»« Molecular Cloning« Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), beschrioben. Enzyme können, wenn nicht extra darauf hingewiesen wird, von New Englang Biolabs bezogen werden. Sie werden entsprechend den Angaben dee Herstellers verwendet, es sei denn, es wird gesondert darauf hingewiesen.
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Beiepiel IA; Isolierung des GST-cDNA-Klons Y, 200 Antikörper:
Antisera gegen homogene Leber-Glutathion-S-Tränsferasen (GSTen) (af finita'tschromatographische Fraktion) werden entsprechend vorbeschriebener Verfahren hergestellt [Tu et al., Nucleic Acids ReB., K): 5407-5419 (1982)). Die IgG Fraktion wird über eine Protein-A-Sopharoae (Pharmacia) Säule gereinigt und durch Ultrafiltration (Amicon, XM—50 Membran) aufkonzentriert, entsprechend der Beschreibung bei Kraus und Rosenberg [Kraus & Rosenberg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, ]9_', 4015-4019 (1982)]. Sie wird anschliessend in 50 %igem Glycerol und 0,2 mg/ml Heparin bei -180C aufbewahrt.
Isolierung von Polysomen Die Lebern (ca. 26 g) von awei männlichen Sprague-Dawley-Ratten
(Körpergewicht ca. 300 g) werden mit einem Potter-Elvehjem-Homog'enisator in 150 ml (Endvolumen) 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2,0,25 M Sucroselösung enthaltend Bentonit (1 mg/ml), tieparin(0,2 mg/ml) und Cycloheximid (1 μβ/ΐτιΐ) in verschiedenen Aliquote zueinem 15%igen (w/v) Homogenisat homogenisiert. Die Polysomenieolation wird exakt nach dem von Kraue und Rosenberg (siehe oben)beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Ausbeuten vor und nach der
Dialyse betragen 1389 A-,„ Einheiten bzw. 1208 A0,n Einheiten.
Immobilisierung der Polysomen-Antikörperkomplexe und Elution spezifischer mRNA
1130 Αο,~ Polysomen-Einheiten werden für die Iinmunabsorption mit Anti-GST IgG (7,1 mg) wiedergewonnen. Die Protein A-Sepharoae Affinitätschromatographie sowie die Elution gebundener RNA-Moleküle werden entsprechend den Anweisungen bei Kraus und Rosenberg aupra durchgeführt. Die eluierten RNA-Moleküle werden sofort an 0,5 M NaCl und 0,5 % Dodecyleulfat angepasst und über eine Oligo(dT)-Cellulose Säule weiter gereinigt [Aviv & Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 69: 1408-1412 (1972); Bantle et al., Anal. Biochem., 72: 413-417 (1976)}. Die gereinigten PoIy(At)-RNA Moleküle werden anhand einer in vitro Translation und einer Immunpräzipitaticn (Tu et al., Nucleic Acids Res., K): 5407-5419 (1982); Pelham and Jackson,
- 27 -
Eur. J. Biochem., §]_'. 247-256 (1976)] analysiert, bevor sie für die cDNA Synthese verwpidet werden. Das immunpräzipitierte Material wird auf einem Dodecyleulfat Polyacrylaraid-Gel aufgetrennt und durch Fluorographie sichbar gemacht (Laemmli, Nature, 227; 680-684 (1970); Swanstrom and Shenk, Anal. Biochem., 86: 184-192 (1978)).
Isolierung der GST-cDNA Klone
Die Synthese der cDNA wird, abgesehen von kleineren Abweichungen, analog zu der Methode von Okayama und Berg [Okayama and Berg, Mol. Cell Biol., 2: 161-170 (1982)] durchgeführt, entsprechend einer Modifikation von Gublor und Hoffman [Gubler und Hoffman, Gene, 25: 263-269 (1983)J. Für die cDNA Synthese werden ungefähr 100-500 ng of PoIy(A+) RNA aus immunpräzipitierten Polysemen verwendet. Die reverse Transkription der mRNA in die entsprechende cDNA erfolgt in einer Reaktionseinheit von 40 μΐ, die 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM Natriumpyrophosphat, 1,25 mM der vier ilNTP's, 1800 U/ml RNAsin (Promega Biotec), 100 Hg/ml Oligo-(dT)12-18 (Pharmacia/PL) und 3000 U/ml Reverse Transkriptaue (Molecular Genetics) enthält.
Das Reaktionsgemisch wird für einen Zeitraum von 25 Minuten bei einer Temperatur von 430C inkubiert. Anechlieseend wird die Reaktion durch Zugabe von 2 μΐ 0,5 M EDTA beendet. Das Reaktionsgomisch wird mit einem Volumenteil Phenol!Chloroform extrahiert und die wässrige Phase anschliessend mit einem halben Volumenteil Chloroform rlickextrahiert. Auch die organische Phase wird erneut rückextrahiert und zwar mit TE-Puffer.
Die wässrigen Phasen werden anschliessend vereinigt. Nach Zugabe von einem Volumentnil 4 M Ammoniumacetat werden die Nucleinsäuren durch Hinzufügen von zwei Volumenteilen Ethanol präzipitiert und anschliessend 20-30 Minuten auf Trockeneis kaltgestellt. Die Lösung wird dann 5 Minuten auf Zimmertemperatur erwärmt und 15 Minuten in einer Kppenriorf-ZontrJ fuge ("Mi^rofugo") bei oiner Temporntur von 4°C zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wird in 25 μΐ TE-Puffer aufgelöst. Der Vorgang der Nucleinsäure-Präzipitation und Wiederge-
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winnung wird, wie zuvor beschrieben, durch Zugabe von Ammoniumacetat (25 μΐ; 4 M) und 100 μΐ Ethanol wiederholt. Das so erhaltene Peilet wird dann mit 70 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in /0 μΐ Wasser gelöst.
Der Austausch des mRNA Stranges dee mRNAicDMA-Hybrids wird in einer Reaktionseinheit von 50 μΐ durchgeführt, die 20 mM Trip-HCl pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10 mM Ammoniumsulfat, 100 mM KCl, 0,15 mM beta-NAD, 0,04 mM der vier dNTP's, 20 μΐ des Erststrang-Produkts, 10-20 \iCio "P-dATP, 10 U/ml E.coli DNA Ligase (New England Biolabs), 230 U/ml DNA Polymeraee (Boehringer Mannheim) und 8,5 U/ml E.coli RflAse H (Pharmacia/PL) enthält. Die Inkubationszeit beträgt 90 Minuten bei einer Temperatur von 12° bis 140C, sowie eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Die doppelsträngige cDNA wird durch Phenol:Chloroform Extraktion gereinigt und durch Ethanol-Präzipitation wiedergewonnen, entsprechend der Beschreibung für das Eretstrang-Produkt. Das zuletzt erhaltene getrocknete Pellet wird in 20 μΐ Wasser gelöst.
10 μΐ der Doppelstrang-cDNA werden in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ, enthaltend 100 mM Kaliumkakodylat pH 7,0, 1 mM CoCl2, 0,2 mM DTT, 0,1 mM dCTP und 500 U/ml terminale Deoxynucleotid Transferase (Pharmacia/PL) mit einem dCTP Anhang versehe . Die Inkubationszeit beträgt 1 bis 2 Minuten bei einer Temperatur von 370C. Anechliessend werden 20 μΐ 4 mM EDTA hinzugefügt und das Enzym durch 10-minütige Inkubation bei 650C Hicze-inaktiviert.
Pstl-verdaute und mit einem dG-Anhang versehene pBR322 (Betheeda Research Labs, Inc.) wird in einem molaren Verhältnis von ca. 1:1 zu der dC-haltigen, doppelaträngigen cDNA hinzugegeben (d.h. mit einem etwa 5-10-fachen Ueberschuss im Hinblick auf das Molekulargewicht des Vektors im Vergleich zu der angenommenen cDNA-Menge). Die DNA-hallige »',ösung (cDNA + Vektor) wird bis zu. einer DNA-Gesamtk^nzentration von 0,5-2,0 ng/μΐ (0,5 ng sind optimal) in Gegenwart von 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM SDTA und 150 mM NaCl verdünnt. Diese
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Mischung wird zunächst 5 Minuten bei 650C inkubiert, anschlieseend erfolgt die eigentliche Renaturierungsreaktion ("annealing") bei einer Temperatur von 55-580C über einen Zeitraum von 90 Minuten.
Der E.coli Stamm MM294 wird mit dem renaturierten cDNA:Vektor-Komplex transformiert unter Verwendung von 5 μΐ DNA pro 200 μΐ Aliquot an transformationskompetenten Zellen [Hanahan, J. Mol. Biol., 155; 557-580 (1983)]. Die Trtnsformationsfrequenz der Kontrolle liegt hei 1-2 χ 108 Transfo.-manten pro jig kovalent geschlossener zirkulärer pBR322 DNA. Die transformierten Zellen werden auf LM-Platten (ohne Magnesium), die 17 μg/ml Tetrazyklin enthalten, aueplattiert (Hanahan, supra). Die so erhaltenen Kolonien werden auf Ampicillinempfindlichkeit hin untersucht. Die Tetrazyklin-resistenten und Ampillicin-seneitiven (ca. 50 %) Kolonien werden für die weitere Analyse herausgesucht.
Hybrid-selektierte in vitro Translation von pGTR2G0 Plaemid DNA-Moleküle von 354 Ampiliicin-eenBitiven Tranaforwsr.ten werden unter Anwendung eines alkalischen Lyseverfahrens [Birnboim and DoIy, Nucleic Acid Research, U 1513-1523 (1979)] gereinigt. Die gereinigten DNA-Moleküle werden anschliessend zur Bestimmung der Grosse der integrierten cDNA-Moleküle mit Pstl verdaut. Von diesen enthielten nach der Durchführung einer Agarose-Gel-Elektrophorese insgesamt 134 sichtbare cDNA-Inserts* Inserts mit mehr als 800 Nucleotiden werden mit Hilfe der Southern blot Hybridisierung einer weitergehenden Analyse unterzogen (Southern, J. Mol. Biol., 98: 5.03-517 (1975)] unter Verwendung von Y (pGTR261) und Y (pGTR262) als Probemoleküle (Lai et al., J. Biol. Chem., 259: 5536-5542 (1984); Tu et al., J. Biol. Chem., 259: 9434-9439 (1984)].
12 Klone, die nicht mit diesen Probumolekülen hybridisieren, werden iinschliesaend mit Hilfe der llybrid-selektierten in vlf.ro Translation [Cleveland et al., Cell, 20: 95-105 (1980)] weiter charakterisiert. Einer dieser negativen Klone wird mit pGTR200 bezeichnet. PoIy(A+)-RNA-Moleküle aue Rattenleber, die durch pGTR200-DNA, welche an aktivierter Aminophenylthioether Cellulose (APT-Papier) immobil!-
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siert vorliegt, selektioniert wurden, werden bei 750C und 1000C eluiert und anachliessend für die in vitro Translation im Kaninchen Retikulozyten Lysat-System verwendet. Die in vitro Tranolationsprodukte werden mit Hilfe von Antisera gegen die Gesamt-Kattenleber-GCTen immuropra'zipitiert, gefolgt von einer Dodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorene. Das immunpräzipitierte Produkt besitzt die gleiche Mobiütät wie Y, . Durch pGTR200 wird keine andere Klasse von fiST-Unrnroinhpiten oplaktierr. Früher diirrhp.fführfp Hvbrid-flelakliorli» in vitro TrunnlutionBfxnurimoiiLo mit Y und Y Klonen erbrachten keine Produkte mit Y,-Untereinheiten (Lai et al., supra;
Tu et al., supra). Nucleotid-Sequenz des pGTR200-DNA-InBert
Die DNA Sequenz der οDNA in pGTR200 wird entsprechend der in Abbildung 1 wiedergegebenen Strategie mit Hilfe des chemischen Verfahrens nach Maxam und Gilbert [Maxam and Gilbert, Method*? Enzymol., 65: 499-560 (1980)] durchgeführt. Die DNA Fragmente, die aufgrund der Spaltung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten werden, werden am 3'-Ende markiert· Jede Bestimmung wurde mindestens einmal wiederholt.
Die Nucleotidsequenz ist unten wiedergegeben. Für die 218 Reste des offenen Leserahmens wurde der Einbuchutaben-Code für Aminosäuren verwendet [Old and Primrose, Principles of Gene Manipulation, (1985), B.lackwell's Publications, London, S. 346]. Das PoIy(A)-Additionesi^nal, AATAAA ist unterstrichen.
10 20 30 40 50 60 CTGAAGCCAAATTGAGAAGACCACAGCGCCAGAACCATGCCTATGATACTGGGATACTGG
MPMILGYW
70 80 90 100 110 120 AACGTCCGCGGGCTGACACACCCGATCCGCCTGCTCCTGGAATACACAGACTCAAGCTAT NVRGLTHPIRLLLEYTDSSY
130 140 150 160 170 180 GAGGAGAAGAGATACGCCATGGGCGACGCTCCCGACTATGACAGAAGCCAGTGGCTGAAT EEKRYAMGDAPDYDRSQWLN
190 200 210 220 230 240 GAGAAGTTCAAACTGGGCCTGGACTTCCCCAATCTGCCCTACTTAATTGATGGATCGCGC EKFKLGI, U FPNLPYLIDGSR
- 31 -
250 260 270 280 290 300 AAGATTACCCAGAGCAATGCCATAATGCGCTACCTTGCCCGCAAGCACCACCTGTGTGGA KIT. QSNAIMRYLARK H HLCG
310 320 330 3A0 350 360 GAGACAGAGGAGGAGCGGATTCGTGCAGACATTGTGGAGAACCAGGTCATGGACAACCGC ETEEERIRADIVENQVMDNR
370 380 390 AOO AlO A20 ATGCAGCTCATCATGCTTTGTTACAACCCCGACTTTGAGAAGCAGAAGCCAGAGTTCTTG MQLIMLCYNPDFEKQKPEFL
A30 AAO A50 A60 A70 A80 AAGACCATCCCTGAGAAGATGAAGCTCTACTCTGAGTTCCTGGGCAAGCGACCATGGTTT KTIPEKMKLYSEFLGKRPWF
A90 500 510 520 530 5A0 GCAGGGGACAAGGTCACCTATGTGGATTTCCTTGCTTATGACATTCTTGACCAGTACCAC AGUKVTYVDFLAYDI LDQYH
550 560 570 580 590 600 ATTTTTGAGCCCAAGTGCCTGGACGCCTTCCCAAACCTGAAGGACTTCCTGGCCCGCTTC IFF. PKCLDAFPNLKDFLARF
610 620 630 6A0 650 660
gagggcctgaagaagatctctgcctacatgaagagcagccgctacctctcaacacctata eglkkisaymkssrylstpi
670 680 690 700 710 720
ttttcgaagttggcccaatggagtaacaagtaggcccttgctacactggcactcacagag fsklaqwsnk*
730 7A0 750 760 770 780 AGGACCTGTCCACATTGGATCCTGCAGGCACCCTGGCCTTCTGCACTGTGGTTCTCTCTC
790 800 8)0 820 830 8A0 CTTCCTGCTCCCTTCTCCAGCTTTGTCAGCCCCATCTCCTCAACCTCACCCCAGTCATGC
850 860 870 880 890 900 CCACATAGTCTTCATTCTCCCCACTTTCTTTCATAGTGGTCCCCTTCTTTATTGACACCT
910 920 930 9A0 950 960 TAACACAACCTCACAGTCCTTTTCTGTGATTTGAGGTCTGCCCTGAACTCAGTCTCCCTA
970 980 990 1000 1010 1020 GACTTACCCCAAATGTAACACTGTCTCAGTGCCAGCCTGTTCCTGGTGGGGGAGCTGCCC
1030 10AO 1050 1060 1070 CAGGCCTGTCTCATCTTTAATAAAGCCTGAAACACAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Beispiel IB: Isolierung des partiellen GST-cDNA-Klons Y 187 Mit Hilfe der im Prinzip gleichen Methode erhält man den cDNA-Klon Y. 187. Bei Y, 187 handelt es sich um einen partiellen cüNA-Klon, dem am 5'-Endß dar codierenden Sequenz 96 Nucleotide fehlen. Die
-32- ZfS ZC 9
Nucleotid- und die entsprechende Aminosäure-Sequenz sowie die Sequenz für die 96 fehlenden Nucleotide und für Yyl87 sind im folgenden wiedergegeben:
1 0 30
ATG CCT ATG ACA CTG GGT TAC TGG GAC ATC CGT GGG CTG GCT CAC Met Pro Met Thr Leu GIy Tyr Trp Aep He Arg GIy Leu Ala His
50 7 0 90
GCC ATT CCC CTG TTC CTG GAG TAT ACA GAC ACA AGC TAT GAG GAC Ala lie Arg Leu Phe Leu GIu Tyr Thr Asp Thr Ser Tyr GIu Asp
1 10 13 0
AAG AAG TAC AGC ATG GGG GAT GCT CCC GAC TAT GAC AGA AGC CAG Lyo Lys Tyr Ser Met GIy Asp Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser GIn
150 1 70
TGG CTG AGT GAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG GAC TTC CCC AAT CTG Trp Leu Ser GIu Lys Phe Lys Leu GIy Leu Aap Phe Pro Asn Leu
19 0 210
CCC TAC TTA ATT GAT GGG TCA CAC AAG ATC ACC CAG AGC AAT GCC Pro Tyr Leu He Asp GIy Ser His Lye He Thr Gin Ser Asn AIa
2 30 25 0 270
ATC CTG CGC TAC CTT GGC CGG AAG CAC AAC CTT TGT GGG GAG ACA Ιΐβ Leu Arg Tyr Leu GIy Arg Lye Hie Asn Leu Cys GIy GIu Thr
2 90 31 0
GAG GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC GTT TTG GAG AAC CAG GCT ATG GIu GIu GIu Arg He Arg VaI Asp VaI Leu GIu Aan Gin AIa Met
330 3 50
GAC ACC CGC CTA CAG TTG GCC ATG GTC TGC TAC AGC CCT GAC TTT Asp Thr Arg Leu GIn Leu AIa Met VaI Cye Tyr Ser Pro Asp Phe
37 0 390
GAG AGA AAG AAG CCA GAG TAC TTA GAG GGT CTC CCT GAG AAG ATG GIu Arg Lys Lys Pro GIu Tyr Leu GIu GIy Leu Pro GIu Lya Met
4 10 43 0 450 AAG CTT TAC TCC GAA TTC CTG GGC AAG CAG CCA TGG TTT GCA GGG Lys Leu Tyr Ser GIu Phe Leu GIy Lyo GIn Pro Trp Phe Ala GIy
4 70 4, 0
AAC AAG ATT ACG TAT GTG GAT TTT CTT GTT TAC GAT GTC CTT GAT Asn Lys He Thr Tyr VaI Asp Phe Leu VaI Tyr Asp VaI Leu Asp
510 5 30
CAA CAC CGT ATA TTT GAA CCC AAG TGC CTG GAC GCC TTC CCA AAC GIn Ηΐε Arg He Phe GIu Pro Lys Cys Leu Asp Ala Phe Pro Asn
55 0 570
CTG AAG GAC TTC GTG GCT CGG TTT GAG GGC CTG AAG AAG ATA TCT lnu Lys Ätsp Phe VaI AIa Arg Phe GIu GIy Leu Lys Lys He Ser
5 90 61 0 630 GAC TAC ATG AAG AGC GGC CGC TTC CTC TCC AAG CCA ATC TTT GCA Asp Tyr Met Lye Sev GIy Arg Phe Leu Ser Lys Pro He Phe AIa
- 33 - Z79ZC9
6 50
AAG ATG GCC TTT TGG AAC CCA AAG TAG Lys Met Ala Phe Trp Αβη Pro Lye End
Beispiel IC: Der vollständige, Y. 187 entsprechende Klon Dip fehlenden Nucleotide werdet) nntwedei* |n_vi_yo durcli Kokombination oder in vitro durch Verknüpfung der entsprechenden Restriktionafragmente zu vul87 hinzugefügt. Diese Verfahren sind in den Abbildungen 4B und 4C dargestellt.
Eine Rekombination kann durch die Einführung eines genomischen DNA Klone, als Bestandteil des Plasmids colEl (z.B. pUC8 oder pBR322) und einee cDNA Klqns, der sich auf dem Plasmid inc Pl (z.B. pRK29O) befindet, in den E.coil Stamm SR43. (ATCC Hinterlegungsnummer 67217, hinterlegt am 22. September 1986) durchgeführt werden. Der Stamm SR43 trägt die Mutationen polAl supF183 [Tacon, W. & Sherratt, D., Mol. Gen. Genet., 147; 331-335 (1976)), so dass die Replikation des colEl-Plasmids bei einer restriktiven Temperatur (420C) gehemmt ist.
Eine Ueberfuhrung der SR43-3akterien, welche die beiden genannten Plasmide enthalten, von einer perraissiven Temperatur von 280C auf 420C unter gleichzeitiger Beibehaltung der Selektionitsrbarkeit auf Antibiotikaresistenz., die auf dem Plasmid-colEl (z.B. Ap-Reeistenz von pBR322) liegt, gestattet die Selektion von Bakterien, die eine kointegrierte Form der zwei Plasmide enthalten.
Solche kointegrierten Plasmide kommen durch Rekombination homologer DNA Regionen zustande.
Die Isolierung kointegrierter Plasmide ermöglicht die Klonierung der Gesamt cDNA Sequenz sowie der stromaufwärts gelegenen genomischen DNA in Form eines einzigen Petl oder BamHI Fragments.
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Restriktion der stromaufwärts gelegenen DNA rait BaI31, gefolgt von der Addition eines BamHI-Linkers, gestattet die Isolierung von Klonen, die die gesamte kodierende Region (bestätigt durch DNA-Sequenz-Analyee) enthalten.
Die gesamte kodierende Region wird in Form eines BamHI-Fragments in pCID710 kloniert, entsprechend der Beschreibung in Beispiel IA, und für die Uebertragung auf die Pflanzenzelle verwendet.
Dasselbe Fragment wird für die Expression in E.coil in pDR540 kloniert, wie in Beispiel TV, unten, beschrieben.
Eino andere Möglichkeit für die Konstruktion eines vollständigen Klones, der Y, 187' entspricht, besteht in der Verknüpfung geeigneter Restriktionsfragmente der cDNA und der genomischen Klone (Abbildung I).
Das Plasmid pUC19 enthalt das 5'-Ende des genomischen Klone, eingespleieet als ein Pstl-Hindlll-Fragment, welches annäherungsweise die ersten 400 Basen der kodierenden Sequenz enthält.
Das 3'-Ende der kodierenden Sequenz der cDNA kann als ein 630 Basen umfassendes HinfI-Fragment von dem partiellen cDNA-Klon in BR325 isoliert werden. Das an seiner einzigen Hinfl-Stelle geschnittene pUC Plasmid und das HinfI Fragment, welches das 3'-Ende dee Gens trägt, werden miteinander verknüpft, wobei die gesamte kodierende Sequenz des GST-Gens wiederhergestellt wird. DaB komplette Gen wird als ein Bgll-Pstl-Fragment isoliert.
Eine Isolierung der gesamten kodierenden Region, ohne die stromaufwärts gelegenen DNA Sequenzen, lässt sich durch Herausschneiden der stromaufwärts gelegenen DNA mit Hilfe von BaI31 gefolgt von einer BamHI Linker Addition erreichen. Dieses BamHI-Fragment wird dann in pCIB710 bzw. in pDR540 einge&pleisst, entsprechend den oben gemachten Angaben.
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Beispiel ID: Hybride Klone
Hybride Klone, die sich aus kodierenden Sequenzen für verschiedene Gene herleiten, werden im Prinzip in der gleichen Art und Weise konstruiert, wie o'ies zuvor für die Kombination des partiellen cDNA
Klone Y, 187 und der fehlenden Nucleotide beschrieben wurde (Beib
spiel IC), indem heterologe Gene als Aiisgangamatorial für die zwei DNA-Fragmente verwendet werden.
Beispiel IE: Isolierung des GST-eDNA Klons GlY Mit Hilfe des Phagen-Expressionsvektoj-e λ gtll [Young, R.A. and Davis, R.W., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80: 1194 (1983)] wiri eine cDNA-Genbibliothek hergestellt, ausgehend von einer polyCA) RNA, die zuvor aus Rattengehirn isoliert wurde gacia'ss den oben beschriebenen Verfahren (siehe Beispiel IA).
Die cDNA wird anschliessend mit Hilfe eines Antikörper-Screenings unter Verwendung von Antikörpern, die gegen GST aus dem Rattengehirn gerichtet sind, isoliert.
Die Isolierung der RNA sowie die Herstellung und Isolierung der zugehörigen cDNA erfolgt nach bereits bekannten Verfahren, wie sie z.B. bei Young und Davis beschrieben sind [Young, R.A. and Davis, R.W., Science, 222: 778-782 (1983)).
Die Nucleotidsequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz das resultierenden cDNA Klons GlY, sind im folgenden wiedergegeben:
10 30
A GAC CCC AGC ACC ATG CCC ATG ACA CTG GCT TAC TGG GAC ATC Met Pro Met Thr Leu GIy Tyr Trp Asp lie
5 0 70
CGT GGG CTA GCG CAT GCC ATC CGC CTG CTC CTC GAA TAC ACA GAC Arg GIy Leu Ala His Ala He Arg Lou Lt* u L.ou GIu Tyr Thr Aup
90 11 0 130
TCG AGC TAT GAG GAG AAG AGA TAC ACC ATG GGA GAC GCT CCC GAC Ser Ser Tyr GIu GIu Lye Arg Tyr Thr Met GIy Asp Ala Pro Asp
1 50 17 0
TTT GAC AGA AGC CAG TGG CTG AAT OAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG Phe Asp Arg Ser GIn Trp Leu Asn GIu Lys ?he Lye Leu GIy Leu
- 36 -
190 2 10
GAC TTC CCC AAT CTG CCC TAC TTA ATT GAT GGA TCA CAC AAG ATC Asp Phe Pro Αβη Leu Pro Tyr Leu I.le Αβρ GIy Ser Hie Lye He
23 0 250 2
ACC CAG AGC AAT GCC ATC CTG CGC TAT CTT GGC CGC AAG CAC AAC Thr GIn Ser Αβη Ala He Leu Arg Tyr Leu GIy Arg Lye Hie Aen
70 29 0 310
CTG TGT GGG GAG ACA GAA GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC ATT CTG Leu Cys GIy GIu Thr GIu GIu GIu Arg He Arg VaI Asp He Leu
3 30 35 0
GAG AAT CAG CTC ATG GAC AAC CGC ATG GTG CTG GCG AGA CTT TGC GIu Asn GIn Leu Met Aep Asn Arg Met VaI Leu AIa Arg Leu Cys
370 3 90
TAT AAC CCT GAC TTT GAG AAG CTG AAG CCA GGG TAC CTG GAG CAA Tyr Aen Pro Asp Phe GIu LyB Leu Lye Pro GIy Tyr Leu GIu GIn
41 0 ATG ATG CGG CTT TAC 430 GAG TTC CTG GGC AAG 4
CTG CCT GGA Met Met Arg Leu Tyr TCC GIu Phe Leu GIy Lye CGG
Leu Pro GIy 47 0 Ser 490 Arg
50 GCA GGG GAC AAG ATC TTT GTG GAT TTC ATT
CCA TGG TTT AIa GIy Αβρ Lye lie ACC Phe VaI Αβρ Phe He GCT
Pro Trp Phe 5 10 Thr 53 0 AIa
CTT GAG AGG AAC CAA TTT GAG GCC ACG TGC
TAC GAT GTT Leu GIu Arg Αβη Gin GTG Phe GIu Ala Thr CyB CTG
Tyr Asp VaI VaI Leu
550 5 70
GAC GCG TTC CCA AAC CTG AAG GAT TTC ATA GCG CGC TTT GAG GGC Asp AXa Phe Pro Asn Leu Lys Asp Phe XIe AIa Arg Phe GXu GXy
59 0 610 6
CTG AAG AAG ATC TCC GAC TAC ATG AAG TCC AGC CGC TTC CTC CCA Leu Lys Lye He Sar Aep Tyr Met Lys Ser Ser Arg Phe Leu Pro
30 65 0 670 .
AGA CCT CTG TTC ACA AAG ATG GCT ATT TGG GGC AGC AAG TAG GAC Arg Pro Leu Phe Thr Lye Met Ala He Trp GXy Ser Lye End Αβρ
6 90 71 0
CCT GAC AGG TGG GCT TTA GGA GAA AGA TAC CAA ATC TCC TGG GTT Pro Αβρ Arg Trp AXa Leu GXy GXu Arg Tyr GXn IXe Ser Trp VaX
730 7 50
TGC CAA GAG CCC TAA GGA GCG GGC AGG ATT CCT GAG CCC CAG AGC Cys GXn GXu Pro End GXy AXa GXy Arg IXe Pro GXu Pro GXn Ser
77 0 790 8
CAT GTT TTC TTC CTT CCT TCC ATT CCA GTC CCC AAG CCT TAC CAG Hie VaX Phe Phe Leu Pro Ser He Pro VaX Pro Lys Pro Tyr GXn
10 83 0 850
CTC TCA TTT TTT GGT CAT CAA ATT CCT GCC AAA CAC AGG CTC TTA Leu Ser Phe Pha GXy His GXn He Pro AXa Lye Hie Arg Leu Leu
-37-
8 70 89 0
AAA GCC CTA GCA ACT CCT TTC CAT TAG CAA AAT AGC CTT CTA AAG Lye. Ala Leu Ala Thr Pro Phe His End Gin Asn Ser Lau Leu Lye
910 9 30
TTA AAG TGC CCC GCC CCC ACC CCT CGA GCT CAT GTG ATT GGA TAG Leu Lys Cys Pro Ala Pro Thr Pro Arg Ala His VaI lie GIy End
95 0 970 9
TTG GCT CCC AAC ATG TGA TTA TTT TGG GCA GGT CAG GCT CCC CGG Leu Ala Pro Asn Met End Leu Phe Trp Ala GIy Gin Ala Pro Arg
90 101 0 1 030
CAG ATG GGG TCT ATC TGG AGA CAG TAG ATT GCT AGC AGC TTT GAC Gin Met GIy Ser He Trp Arg Gin End He Ala Ser Ser Phe Asp
10 50 107 0
CAC C3T AGC CAA GCC CCT CTT CTT GCT GTT TCC CGA GAC TAG CTA His Arg Ser Gin Ala Pro Leu Leu Ala VaI Ser Arg Αβρ End Leu
1 090 11 10
TGA GCA AGG TGT GCT GTG TCC CCA GCA CTT GTC ACT GCC TCT GTA End Ala Arg Cye Ala VaI Ser Pro Ala Leu VaI Thr Ala Ser VaI
113 0 1 150 11
ACC CGC TCC TAC CGC TCT TTC TTC CTG CTG CTG TGA GCT GTA CCT Thr Arg Ser Tyr Arg Set Phe Phe Leu Leu Leu End Ala VaI Pro
70 119 0 1 210
CCT GAC CAC AAA CCA GAA TAA ATC ATT CTC CCC TTA AAA AAA AAA Pro Asp His Lye Pro GIu End He He Leu Pro Leu Lye Lys Lys
AAA AAA AAA A Lys Lye Lye
Beispiel II: Konstruktion dee Plaamlds pCIB710
Das Plasroid pLWlll, ATCC Nr. 40235, besteht aus den drei kleineren EcoRI-Fragmenten des BJI-Stammee von Cauliflower Mosaik Virus (CaMV) [Franck et al., Cell, 21.: 285-294 (1980)], die in pMB9 kloniert werden. Das Plasmid pLWlll wird mit BgIII verdaut und ein 1149 Bp umfassendes Fragment (Basenpaare H6494-7643) isoliert. Dieses Fragment wird in die BamHI-Stelle von pUC19 eingespleisBt. Diesee Reetriktionsfragment kodiert sowohl für den Promotor der CaMV 35S RNA als auch für das PoIyA Additionssignal (d.h. den Terminator) für dieses Transkript.
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In Vitro Mutagene8e
Zwischen diesen Promotor und Terminator wird via in vitro Mutagene&e eine einzelne BamHI-Restriktionsschnittetelle eingefügt. Es wird ein 36-Easen umfassendes Oligonucleotid synthetisiert, welches, abgesehen von einer BamHI-Restriktionsstelle, die bei dem Basenpaar #7464 in die Sequenz eingebaut ist, mit der entsprechenden Sequenz der CaMV-Region identisch ist.
Das oben erwähnte 1149 Pp umfassende "Iglll Fragment wird zunächst in Ml 3inp 19 kloniert; anschliessend wird eine einzelsträngige Phagen-DNA isoliert. Diese Einzelstrang-DNA wird dann mit dem synthetischen Oligonucleotid gepaart ("annealed").
Unter Verwendung dieses. Oligonucleotids als Primer wird dann zunächst ein neuer DNA-Strang synthetisiert und die DNA anschliessend in den E.coli Stamm JMlOl IZoller & Smith, DNA 3: 479-488 (198O)J mittels Transfektion eingeschleust.
Die Isolierung des M13-Phagen mit der eingebauten BamHI-Stelle wird entsprechend der Beschreibung bei Zoller & Smith, supra, durchgeführt.
Selektion des gewünschten Mutanten-Phagen
Das 36-Basen-Oligonucleotid wird in einer Kinase-Reaktion mit yl P-ATP markiert. Eine Auswahl von durch Transfektion eihaltener Ml3 Phagen-Plaques wird auf einen Nitrocellulose-Filter übertragen
Diener Filter wird mit dem markierten 36 Basen umfassenden Oligonucleotid hybridisiert, und anschliessend bei steigenden Temperaturen gewaschen. Das markierte Oligonucleotid, gebunden an den Mutanten-Phagen, ist noch bei höheren Waschtemperaturen stabil
Einer dieser bei erhöhter Temperatur stabilen Phagen wird isoliert und zur Bestätigung der Anwesenheit der BamHI-Stelle sequenziert.
Konstruktion von pCIB710
Von diesem Phagen isolierte doppelsträngige DNA wird mit Hindlll und EcoRI verdaut. püC19 wird ebenfalls mit Hindlll und EcoRI gespalten. Diese beiden verdauten DNA-Moleküle werden anschliesaend miteinander
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verknüpft. Traneformanten werden aufgrund ihrer Ampicillin-Resiatenz selektiert. Einer der Transformanten, die aus dieser Verknüpfungsreaktion hervorgehen, ist pCI3710, ein Plasmid, das in Abbildung 2 dargestellt ist.
Beispiel III; Konstruktion der Plasmide pCIBll, pCIB12, pCIB13 und pCIBIA
1. Das Plasmid pGTR200 wird mit Haell, Pstl und PvuII verdaut und das 678 Bp umfassende Haell/Pstl-Fragraent, das die GST kodierende Sequenz enthält, aus einem Agarose-Gel isoliert,
2. Dieses Haell/Pstl Fragment erhält durch Behandlung mit TA DNA-Polymerase glatte Enden, an die mit Hilfe der TA DNA-Ligase BarnHI-Linker (dCGGATCCG-New England Biolabs) angeknüpft werden.
3. Das Plasmid pCIB710 wird mit BamHI geschnitten und anschliessend mit alkalischer Phosphotase aus Ka.berdarm (Boehringer Mannheim) behandelt.
A. Das oben beschriebene> mit einem BamHI-Linker versehene GST-Fragment wird in das mit BaraHl verdaute Plasmid pCIB710 eingespleisst, die Ligationsmiechung in den E.coli Stamm HBlOl transformiert und die gewünschten Transformanten anhand ihrer Ampillicin-Resistenz selektiert. Es lassen sich sowohl Transformanten charakterisieren, welche die GST codierende Sequenz im Hinblick auf die Transkription, ausgehend vom CaMV-Promotor, in der richtigen Orientierung (pCIB12) enthalten, als auch solche mit einer entgegengesetzten Orientierung (pCIBll).
5. Das Plasmid pCIBlO (siehe Beiepiel IV) wird mit Hilfe von Xbal und EcoRI verdaut.
6. Das Plasrnid pCIBl2 wird ebenfalls mit Hilfe von Xbal und EcoRI verdaut und das kleinere Fragment aus einem Agarote-Gel isoliert.
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7. Dan isolierte Xbal/EcoRI Fragment, welches das chimäre Gen trägt, wird in das zuvor verdaute Plasmid pCIBlO eingespleisst; das gesamte Ligationsgemisch wird anschlieseend in E.coli HBlOl transformiert. Die Transformanten werden aufgrund ihrer Kanamycin-Resietenz selektiert. Diese Trunsformanten, die die GST kodierende Sequenz in der passenden Orientierung im Hinblick auf die Transkription, ausgehend vom CaMV-Proraotor, enthalten, werden mit pCIB14 (siehe Abbildung 3) bezeichnet.
8. Das Plasmid pCIBll wird zur Konstruktion von pCIBl3 in ähnlicher Weise manipuliert. Es handelt sich hei pCIB13 um »in Plasroid, welches die GST kodierende Region in einer Orientierung enthält, die einer geißgelten Transkription, ausgehend vom CaMV-Promo to.·, entgegensteht.
Einführung von pCIB13 und pCIB14 in Agrobacterium Gereinigte Plasraid-DNA vom Typ pCIB13 oder pCIB14 wird mit Hilfe der Traneformation in Agrobacterium tumefaciens Al 36 eingeschleust I Watson et al«, J. Bacteriol., 123; 255-264 (1975)J, welches das Plasmid pCIB542 (siehe ebenso Beispiel VII, unteji) enthält. Die Transformanten werden auf Kanamycin (50 pg/ral) und auf Spectinomycin
(25 μg/ml) selektiert.
Beispiel IV: Einhau dea Y, 200 GST in den trp-lac-Expressions-Vektor
C Jj C C
Das Plasmid pCIB12 wird mit BamHI verdaut und ein 7Q8 Bp umfassendes, mit einem Barn-Linker versehenes GST-Genfragment isoliert. Das Plaeraid pDR54O (Pharmacia P-L Biochemical), ein trp-lac-ExpreB-sions-Vektor iRussel, D.R. and Bennett, G.N., Gene, 20: 231-243 (1982) J wird ebenfalls mit BamHI verdaut und das GST-Fragmenl in die entsprechende Restriktionsschnittstelle eingespleisst. Das resultierende rekombinante Plaemid wird in den E.coli Stamm JM103 transformiert. Kulturen des resultierenden Stammes sind zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch Zugabe von 1,0 mM leopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) induzierbar.
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Nach Induktion durch IPTG und Expression des Yb200 GST-Gens wird der bakterielle Wirt pelletiert. Das gebildete Pellet wird anschliessend in 59 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 8,0, und 1 mM EDTA resuspendiert. Zu dieser Suspension werden 0,5 ml 100 mM Phenylrcethylsulfonylfluorid (PMSF) in Ethanol und 5 ml Lysozym (10 mg/ml) in Pufferlösung hinzugefügt.
Die Suspension wird für ca. 15 Minuten bei einer Temperatur von 37UC inkubiert, bis die bakteriellen Zellen lysiert sind. Die in der Suspension vorliegenden lysierten Bakterienzellen werden erneut pelletiert. Der Ueberstand wird gesammelt und anschliessend gegen 25 mM Trie-HCl, pH 8,0, mit 1/100 Volumen PMSF dialysiert.
Der dialysierte Ueberstand wird dann.auf GST-Aktivität hin untersuchti Anschliesaend wird der dialysierte lieberstand auf eine S-Hexylglutathion-agaroee Affinitätssäule gepackt, bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/Minute. Die Säule wird mit 25 raM Tris-HCl und 0,2 M KCl gewaschen bis das Absorptionsvermögen bei 280 nm unter einen Wert von 0,005 absinkt. Nachdem alles nicht gebundene Material von der Säule heruntergewaschen ist, wird das gebundene Material mit 25 mM Tris-HCl, 0,2 M XCl (pH 8,0) enthaltend 5 mM S-Hbxylglutathion und 2,5 mM Glutathion, eluiert. Die eluierten Fraktionen werden anhand ihres Absorptionsvermögens bei 280 nm kontrolliert.
Die Fraktionen, von denen man annimmt, dass sie das gereinigte Enzym enthalten, werden einzeln gegen 0,1 M NaPOi^-Puffer (pH 6,5), der PEG zur Konzentrierung der Fraktionen enthält, und annchliesnend gegen den gleichen Puffer ohne PEG, dialysiert.
Die Volumina in jeder der dialynierten Fraktionen werden registriert. Für jede Fraktion wird die Konzentration und die Menge der Probe kalkuliert und anschliessend in der Weise verdünnt, dass am Ende in jeder Fraktion der gleiche Anteil im Verhältnis zu der Ausgangsfraktion vorhanden ist. Jede Fraktion wird auf ihre Enzymaktivität hin untersucht.
Die Bestimmung der Enzymaktivität wird unter Verwendung von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (ClDNB) ale Substrat durchgeführt. Für jede Reaktion wird zu 5 mM reduziertem Glutathion (30,8 mg/ml in Puffer, 0,1 M Natriumphosphat, pH 6,5) und GST-Enzym 1 mM ClDNB (20,2 mg/ml in Ethanol) zugegeben.
ClDNB und reduziertes Glutathion werden täglich frisch hergestellt. Die Reaktionseinheit hat ein Endvolumen von 1 ml. Die Reaktion wird bei Zimmertemperatur durchgeführt und durch Zugabe von ClDNB gestartet. Der Reaktionsverlauf wird mit Hilfe eines Gilford Spektrophotonieters bei einer Wellenlänge von 340 nm überwacht. Ein typischer Reaktionuablauf beinhaltet 10 bis 50 Einheiten GST, wobei 1 Einheit dem Umsatz von 1 mmol Substrat pro Minute und ml entspricht.
Die Proteinkonzentration der enzymatisch aktiven Fraktionen im Ausgangsmuterial wird bestimmt (Biorad, BSA Standard). Jede der enzymatisch aktiven Fraktionen wird auf einem 15 %igen Läramli Gel analysiert unter Verwendung von Verdünnungsreihen von Standard-Enzymen (1,0 ]ig, 0,3 μg und 0,1 pg) als quantitative Standards. Der Nachweis des gereinigten Enzyms erfolgt mit Hilfe des "Immunblotting" unter Verwendung spezifischer Antikörper.
Beispiel V: Konstruktion von pCIBlO und pCIBlOa Die Konstruktion der Plasmide pCIBlO und pCIBlOa ist in der hängigen
US-Patentanmeldung mit der Serial-Nummer 757.098, die ac. 19. Juli 1985 unter dem Titel "Transformation of Plastids and Mitochondria" eingereicht wurde und die per Referenz hierin inkorporiert ist, beschrieben.
Die folgenden Einzelschritte, die in der oben genannten Referenz-Patentanmeldung wie folgt beschrieben und numeriert wurden, werden für die Konstruktion der Plasraide durchgeführt (siehe Abbildung 7a-g):
Konstruktion von pCIBlO
15. Eine T-ONA Fragment, das die linke Grenzsequenz des Plasmide
pTiT37 trägt, wird von pBR325 (EcoRI29) 1Yadav et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, |9: 6322 (1982)J isoliert. pBR325 (EcoR129) wird mit EcoRl geschnitten und das 1,1 Kb umfassende Fragment mit Hindlll-Linkern (New England Biolabs) verknüpft^
16. Das Plasmid pBR322 (Bolivar et al., Gene, 2: 75) wird mit Hindlll geschnitten.
17. Das in Schritt 15 genannte, die linke Grenzsequenz enthaltende Fragment, wird in das Hindlll verdaute Plasmid pBR322 eingespleisst,
18. Das Plasmid pBR322 mit der linken Grenzsequenz aus Schritt 17 wird mit CIaI und Hindlll verdaut; da« 1,1 Kb umfassende Hindlll/Clal Fragment wird isoliert (Hepburn et al.,
J. Hol. Appl. Genet., 2: 211 <1983)J.
19. Das Piasmid pHCl8 (Norrander et al., Gene, U\ 101 (1983)J wird mit Hindlll und EcoRI geschnitten; ein 60 Bb umfassender Polylinker wird mit Hilfe der T4 Polynucleotidkinase und Gamma ^P-dATP endraarkiert und aus einem Acrylamid-Gel isoliert.
20. Das Plasmid pBR322 wird mit EcoRI und CIaI geschnitten und das groüsa Fragment isoliert.
2l\ Der 60 Bp umfassende Hindlli/EcoRI Polylinker und das 1,1 Kb umfassende Hindlll/Clal Fragment von EcoRl29 werden in das Plasroid pBR322, das zuvor mit CIaI und EccRI geschnitten wurde, eingespleisst, unter Bildung von PCIB5 (Schritt 15-21, siehe Abbildung 7a).
22. Aus Bin6 iBevan, Nucleic Acids Res-, Jj?: 8711 (1984)J wird ein chimäres Gen, das für Kanamycinresistenz kodiert (noe-nao-nos), in Form eines Sall/EcoRI Fragments gewonnen.
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23. Das Plaemid pUC18 wird mit EcoRI und Sail geschnitten,
24. Dae Sall/EcoRI Fragment, welches das in Schritt 22 erwähnte chimäre Ten enthält, wird .*n das mit EcoRI und Sail geschnittene Plasmid pUC18 oingespleisst.
2ς. Die BamHI-Erkennungsstelle in der Terminationssequenz dieses chimäien Gens wird durch Schneiden mit DamHI zerstört, unter Verwendung von T4 + DNA-l'olymerase ergänzt und schliesslich wieder verknüpft.
26. Das resultierende Plasmid wird mit Sstll (Bethesda Research Laboratories) und Hindlll geschnitten·
27. Ein 1,0 Kb umfassendes Fragment, welches den 5' gelegenen Teil des nos-Promotors und die rechte Grenzsequenz des Plasmido pTiT37 trägt, wird durch Schneiden von pBR325 (Hind23) mit Hindlll und Sstll isoliert,
28. Dieses 1,0 Kb umfassende Hindll/Satll-Fragraent wird in das Plasmid pUC18 aus Schritt 26 eingespleisst, unter Bildung von pCIB4 (Schritt 22-28, siehe Abbildung 7b).
29. Das Plasmid pCIB5, das die linke DNA Grenzsequenz enthalt, wird mit Aatll geschnitten, durch behandlung mit T4 DNA Polymerase mit glatten Enden versehen und anschliessend mit EcoRI erneut geschnitten.
3C . pCIB4 wird mit Hindlll geschnitten, dur · , ^handlung mit dem Kl.inow Fragment der E. coli DNA Polymerase mit glatten Enden versehen und anschliessend mit EcoRI geschnitten.
31. Das nach Restriktion erhaltene Plaemid pCIB5 aus Schritt 29 wird mit dem verkürzten Plaemid pCIB4 (Schritt 30) unter Bildung von pCIB2 verknüpft, einem ColEl-Replikon, das die linke und die
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rechte T-DNA Grenzsequenz enthält, die ein chima'rea Kanamycin Resistenzgen und einen Polylinker P v.··.fieren (Schritt 29-31, siehe Abbildung 7c).
32. Das Plasmid pRZ102 iJorgenson et__al. , Mol. Gen. Genet; 177; 65 (1979)J wird mit BamHI verdaut und unter Verwendung von Klenow ergänzt.
33. V.8 wird eine teilaeiae Alul-Verdauung des Plasmids pA03 [Oka, J. MjI. ßiol. , 1_7_4: 217 (198I)J durchgeführt.
34. Das Alul-Verdauungsprodukc des Plasmids pA03 wird in das Plasmid pRZ102 aus Schritt 32 eingespleisst, wobei die gewünschten Tranaformanten aufgrund ihrer Kanaroycin-Reeistenz selektiert werden können.
35. Das^resultierende Plasmid besitzt die kodierende Sequenz von Tn9O3 auf einem 1,05 Kb BamHI-Fragment, das nach einer DamHI-Verdauung isoliert wird. Dieses Fragment wird anschliessend mit Klenow-DNA-Poylymeraee behandelt.
36. Das Plasmid pRK252, ein Abkömmling des Plasmids RK2, das einen weiten Wirtsbereich aufweist, kann von Dr. Don Helinski an der University of California in San Diego (USA) bezogen werden. Diesem Plasmid fehlt die Bglll-Seite, die in dem Staramplasmid pRK29O [Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, JJ'. 7347 (1980) j vorliegt.
pRK252 wird mit Smal und Sail verdaut, und mit Hilfe von Klenow ergänzt; das aus dieser Verdauung resultierende grosse Fragment wird isoliert.
37. Das in Schritt 35 isolierte, das Tn903 enthaltende Fragment, wird in das grosse Fragment von pRK252 eingespleisst, unter Bildung von pRK252Km (Schritt 32-37, siehe Abbildung 7d).
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38. Das Plaamid pRK252Km wird mit EcoRI geschnitten, unter Verwendung von Klenow mit glatten Enden versehen und mit Bglll-Linkern (New England Biolabs) verknüpft.
39. Das Plasmid pCIB2 wird mit EcoRV geschnitten und das kleinere Fragment-,. das die rechte Grenzsequenz und die nos-neo-nos-Sequenz enthält, wird isoliert. Dieses Fragment wird mit Klenow-Polymerase ergänzt und mit Bglll-Linkorn (New England Biolabs) verknüpft.
40. Das UrIII Frajjmont aus Schritt 39 wird mit dem l'lasmid
aus Schritt 38, das einen Linker trägt, verknüpft, unter Bildung von pCIBlO (Schritt 38-40, siehe Abbildung 7e).
Konstruktion von pCIBlOai
41. Das Plasmid pRZ102 iJorgeneen, et al , Mol Gen. Genet., 177: 65 (1979)J wird mit BamHI veraaut und unter Verwendung von Klenow aufgefüllt.
42. Teilverdauung des Plasmide pA03 lOka et al., Nature, 276: 845 C1978)J.
43. Das mit Hilfe von AIuI verdaute Material wird in das nach Restriktion erhaltene Plasmid pRZ102 aus Schritt 32 ningespleisst, wobei die gewünschten Transformanten aufgrund ihrer Kanamycin-Resietenz selektiert werden.
44. Das resultierende Plasmid besitzt die codierende Sequenz von Tn903 auf einem 1,05 Kb umfassenden BamHI-Fragment; dieses Fragment wird nach erfolgter BamHI-Verdauung und nach Auffüllen mit Hilfe von Klenow isoliert.
45. Das Plasraid pRK290, ein Derivat des Plasmids RK2, das einen weiten Wirtsbereich umfasst, kann von Dr. Don Helinski an der Universität von Kalifornien, San Diego (USA), bezogen werden. pRK29O wird mit Smal und Sail verdaut, mit Klenow ergänzt und das aus dieser Verdauung resultierende grosee Fragment isoliert.
46. Das Tn9O3 enthaltende Fragment, welches in Schritt 35 isoliert wurde, wird in das grosse Fragment von pRK2 eingespleiset unter Bildung von pRK29OKm.
47. Das Plaemid aus Schritt 46 wird mit DgIII verdaut, mit Hilfe von Klenow ergänzt und unter Zerstörung seiner Bglll-Stelle wieder verknüpft. Es entsteht das Plasmid pKR290Km (Schritt 41-47, siehe Abbildung 7f).
48. Das Plaemid pRK290Km wird nit EcoRI geschnitten, unter Verwendung von Klenow mit glatten Enden versehen und mit BglII-Link6rn (New England Biolabs) ausgestattet.
49. Das Plaemid pCIB2 wird mit EcoRV geschnitten und ebenfalls mit Bglll-Linkern (New England Biolabs) versehen.
50. Das mit Bglll-Linkern ausgestattete Plasmid pCIB2 aus Schrit wird .in den Vektor aus Schritt 47 eingespleiest unter Bildung von pCIBlOa (Schritt 48-50, siehe Abbildung 7g).
Die unter Punkt 41-50 beschriebenen Verfahrensschritte können in gleicher Weise unter Verwendung des Plasmids pRK252 anstelle von pRK290 durchgeführt werden.
Beispiel VI: Konstruktion von pCIB23 und pCIB24, Vektoren, die das GST-Enzym auf die Chloroplasten der transformierten Pflanzen ausrichten
Das Plasmid pSRS2.1, das die 5" Sequenz der kleinen Untereinheit (SSU) der Ribulose-bis-phoßphat-carboxylase (RuPUC) von Sojabohnen enthält iBerry-Lowe et al., J. Mol. Appl. Genet., U 483-498 (1982)) ist bei Dr. Richard Meagher vom Department of Genetics der University of Georgia in Athens, Georgia 30602 (USA) erhältlich.
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Dieses Plasmid wird mit EcoRI vordaut. Das 2,1 Kb umfassende Fragment, das die SSU 5' Region aus Sojabohnen enthält, wird von einem Agaroee-Gel isoliert. Das 2,1 Kb EcoRI-Fra^ment wird anschlies3end mit Ddel verdaut und ein 471 Bp umfassendes Ddel-Fragment wird isoliert. Dieses Fragment enthält das Transit-Peptid und einen Teil des zweiten Exon.
Das 471 Db umfassende Ddel-Fragment wird mit Klenow (New England Diolabs DNA Polynu?rai»e) behandelt. Ein mit Kinase behandelter BgIII-Linker Id(CAGATCTC New England Biolabs| wird mit diesem Fragment verknüpft. Dieses Bglll-Fragment wird anschliessend mit Taql verdaut und die resultierenden Taql Fragmente werden mit Klenow (Bethesda Research Labs DNA Polymerase) behandelt. Die resultierenden glatt endenden Fragmente wsrden mit BamHI-Lir.kern verknüpft, die zuvor mit Kinase behandelt worden sind Id(CGCGGATCCGCG) New England Biolabs J und anschliessend gereinigt. Diese BamHI-Fragmente werden dann mit BgIII und BamHI verdaut. Ein BamHI/Bglll-Fragment von annähernd 400 Bp, das die SSU 51 Ragion enthält, wird geieinigt.
Das Plasmid pCIBVIO wird mit BaaHI geochnitten und anschliessend mit alkalischer Phosphatide aus Kälberdarm behandelt. Das 400 Bp umfassende BamHI/Bglll-Fragrcent (siehe oben) wird in dieses Plasmid (pCIB710) eingespleisst. Das Verknüpfungsprodukt wird in E.coli HBlOl übertragen und die Transformanten werden auf Ampilli.cin selektiert.
Man findet auf diese Weise Transformanten, die das BaraHI/Bglll-Fragment in beiden Orientierungen tragen. Im Plasmid pSCR2 befindet sich die 51 Region des Transit-Polypeptids unmittelbar neben dem 35S Promotor. Demgegenüber liegt das BamHI/Bglll-Fragment im Plasmid pSCRl in der entgegengesetzten Orientierung vor.
Das Plasmid pCIB12 wird mit BamHI verdaut und das 708 Bp umfassende BaraHI-Fragment, das das GST-Gen trägt, wird ieoliert.
Das Plaomid pSCR2 wird ebenfalls mit BamHI geschnitten und anschliessend mit alkalischer Phocphatase aus Kälberdarra behandelt. Das 708 Dp umfassende BamHI-Fragment aus dem Plasmid pCIB12 wird dann in das mit BamHI behandelte Plasmid pSCR2 eingespleis.st Das Verknüpfungsprodukt wird in HBlOl überführt und die Transforroanten auf Ampillicin selektiert.
Man findet Iransformanten, die das GST-Gen in beiden OrieiiLierungen ira Hinblick auf die Kontroll-Regicn am 5' Ende aufweisen. Der Klon pCIB22 besitzt das GST-Gen in einer für die Transkription, ausgehend vom CaMV-Promotor, geeigneten Orientierung. Im Klon pCIB21 dagegen weist das GST-Gen die entgegengesetzte Orientierung auf. pCIB22 wird mit Xbal/EcoRI verdaut. Das Fragment, welches das chimäre Gen trägt, wird aus einem Gel isoliert und gereinigt.
Das Plasmid pCIBlO wird ebenfalls mit Xbal und EcoRI verdaut. Das Xbal/EcoRI Fragment, welches das chimäre Gen tragt, wird in das zuvor verdaute Plasmid pCIBlO eingespleisst und die Transformanten werden anhand ihrer Kanamycin-Resistenz selektiert. Bei dem resultierenden Plasmid pCIB24 handelt es sich um ein Plasmid mit weitem Wirtsbereich, welches das chimäre Gen in unmittelbarer Verbindung mit einer Chloroplasten Translt-Peptid-Sequenz enthält.
Das Plasmid pCIB23 wird, ausgehend von dem Klon pCIB21 anstelle von pCIB22 und unter Verwendung ähnlicher iiianipulatorischer Schritte, konstruiert. Dieses Plasimid enthält das GST-Gen in der entgegengesetzten Orientierung im Vergleich zu pCIB24.
Diese Plasmide werden in Agrobacterium Stämme übertragen und zwar in ähnlicher Weise wie dies zuvor für pCIB13 und pCIBH beschrieben wurde.
Beispiel VlI: Konstruktion des Plasmids pCIB542, eines Agropin Vir HeIfer-Plasmids, das ein Spectinomycin-Resistenz-Gen im Bereich der T-DNA trägt
Das Ti Plasmid pTiBo542 ISciaky, Ώ., Montoya, A.L. & Chilton, M-D, Plasmid, Ij 238-253 (1978) J ist von besonderem' Interesse, da Agrobakterien, die dieses Plasmid enthalten, in der Lage sind, die agronomisch bedeutsamen Leguminosen, Aifalfa und Sojabohnen zu infizieren |Hood, E.F.., ot al. , Bio/Technolop.y, 2: 702-708 (1904) j.
Die Konstruktion eines pTiBo542-Derivats, das im Bereich seiner T-DNA eine Deletion aufweist, ist bei Hood, Elizabeth E., (1985) Ph.D. thesis; Washington University, St. Ljuis, Mo. (USA) beschrieben. Bei dieser Konstruktion mit der Bezeichnung EHAlOl, ist die T-DNA durch ein Kanamycin-Resistenz-Gen ersetzt. Das Ausgangsplasmid von EHAlOl, A281, ist bei ATCC unter der ATCC-Nr. 53487 hinterlegt.
Ausgehend von EHAlOl wird ein Derivat konstruiert, bei dem das Kanamycin-Resistenz-Gen durch ein Spectinomycin-Resisteni-üen ersetzt ist. Das Plasmid ρ pi delta 307 IE. Hood, Washington University, Ph. D. thesis (1985)J ,besitzt eine 1,7 Kb umfassende Region, die homolog ist zur linken Seite von Bam a des Plasmids pTiBo542 iHood, et al., (1984)J, sowie eine 8 Kb umfassende Region, die homolog ist zur rechten Seite von Bam2a von pTiBo542, getrennt durch eine einzelne EcoRI-Stelle. Das Plasmid pMON30, ATCC Nr. 67113, enthält das Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz-Gen (spc/str) von Tn7 [Hollingsheaci, S. and Vapnek, D., Plasmid, 1_3: 17-30 (1985)]. Das t'lasmid pMON30 wird mit EcoRi verdaut; das 5,5 Kb umfassende Fragment, das die spc/str-Gene enthält, wird aus einem Agarose-Gel isoliert und in das durch EcoRI verkürzte Plasmid ρ pi delta 307 eingespleisst. Das gewünschte Rekombinationsprodukt wird in Form eines Spectinomycin-resistenten (50 |ig/ml) und eines Tetrazyklin-reeistenten (10 μg/ml) Transformanten selektiert. Dieses Plasmid wird in den Agrobacterium Stamm A136/EHA1O1 eingeschleust und anhand seines Streptomycinresistenz-, Tetrazyklinreeistenz- und Kanaraycinresistenz-Phenotype selektiert. Merodiploide Zellen ("homogenotes") iMatzke, A.J.M. & Chilton, M-D, J. Mol. Appl.
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Genet., U 39-49 (198I)J mit dem EHAIOI-Plasmid und dem Spectinomycin-Plasmid werden nach der Einschleusung des Austreibungsplasmids R751-pMG2 [Jacoby, G. et al. , J. Dacterio,'.. , 127: 1278-1285 (1976)1 und Selektion auf Gentamycin (50 μg/ml) und Spectinomycin" ausgelesen.
Die bevorzugte merodiploids Zelle zeichnet sich durch einen Gentamycin-resistenten, Spectinoraycin-resistenten, Tetrazyklin-sensitiven und Kanamycin-sensitiven Phenotyp aus. Die Struktur des resultierenden Plasmids wird mit Hilfe von "Southern blot" Untersuchungen bestätigt.
Beispiel VIII: Test von Pflanzen auf Atrazintoleranz Aufgrund zahlreicher Untersuchungen, wie
1) der Fluoreszenzinduktion; und
2) der Wachstumsfähigkeit von Sämlingen bei Atrazin-Konzentrationen, die für Kontroll- oder Wild-Typ-Pflanzen toxisch sind konnte gezeigt werden, dass regenerierte Tabakpflanzen, die die GST-Genkonstruktion pCIB14 tragen, tols^ant Bind gegenüber Atrazin.
Die Fluoreszenzinduktion gibt Auskunft über den Zustand des photochemischen Apparates der Pflanze iVoss et al , Weed Science, 32: 675-680 (1984)]. Im Verlauf dieses Assays wird Blattgewebe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt und die resultierende Fluoreszenz bei üiner zweiten Wellenlänge registriert. Abbildung 5 zeigt ein Fluoreszenzinduktionsmuster, das typisch ist für ein ausgestanztes (nicht transformiertes) Tabakblatt, das mit Pufferlösung infiltriert ist, die über den abgeschnittener. Petiolus (Blattstiel) aufgenommen wird (untere Kurve). Man erkennt zunächst einen starken Anstieg der Fluoreszenz, wenn das Licht eingeschaltet wird, der dann einen Peak erreicht, gefolgt von einer allmählichen Abnahuip Heß Signals mit der Zeit.
Dieses Muster macht deutlich, dass die Chloroplasten durch dar einfallende Licht bei einer Wellenlänge, die charakteristisch ist für das System, zur Fluoreszenz angeregt worden. An diesem l'unkt
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wird Energie aus dom Photosystem in Form von Elektronen herausgeschleust, die übor die Elektronentra'.isportwege von Photoeystem II
und I abfliessen dies wird wiedergegeben durch den allmählichen
Abfall der Kurve für das Fluoieszenzaignal.
Wenn aber das Blatt mit einer 10 * M Atrazinlösung infiltriere ist, ergibt sich ein Bild, wie es in der oberen Kurve der Abbildung 5 wiedergegeben ist. In diesem Fall wird ebenfalls zunächst dio Licht energie absorbiert", wodurch die Chloroplnsten zur Fluoreszenz angeregt weiden. Ei findet aber kein Energieabt'Utas statt, da der Elektronenfluss auf der Stufe der Chinonbindung des Photosysteir II blockiert ist. Es sieht ans, als wäro das Photosystem im angeregtan Zustand erstarrt. Daher lässt sich nach der anfänglich starken Zunahme der Fluoreszenz keinerlei Abfall erkennen.
Warden diese Messungen bei gemäss der vorliegenden Erfindung genetisch manipulierten Tßbakpf lanzen in Gegenwart von 10 * M Atrazin durchgeführt, so zeigen alle Kontrollpflanzen die gleichen Fluoreezenz-Induktionemuster wie die nicht trensgenan Tabakpflanzen.
Werden die Messungen dagegen bei den Versuchspflanzen vorgenommen, so lassen sich drei Klaseen von Fluoreszenz-Indukcionsmuetern unterscheiden (Abbildung 6).
Einige der transgenen Fflanzen zeigen keinerlei Anhaltspunkte für eine Atrazin-Detoxifikation (die oberste Kurve), einige zeigen eine mittlere Detoxifikation (r.ittlere Kurve) und einige lassen eine signifikante (untere Kurve) Atrazin-Ietoxifikation erkennen, was aufgrund des normalen ElektronenabfIu isea durch das Photosystem offensichtlich wird. Von 27 Pflanzen, die auf diese Weise charakterisiert wurden, zeigten 5 eindeutige Hinweise auf die Tb'higkeit zur Detoxifikation von Atrazin.
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Beispiel IX:
Agrobacterium-Infektion pflanzlichen Materiale Die verschiedenen Genotypen von Agrobacterium tumefaciens werden auf einem AB Minimal-Medium I Watson, B. et nl., J. Bacteriol., J_23: 255-264 (1975)j, dem Mannitol zugesetzt xst, 48 Stunden bei einer Temperatur von 28UC kultiviert. Die Bakterien werden pelletiert, in MSilN-Medium mit einer zweifachen Verdünnuni; resuspendiert und für drei Stunden bei einer Temperatur von 25°C inkubiert. Für die Hevöti? ϊ Uiiiß dos MSKN-Modiums wird tine vcu|',otorl \ i;t ο pulwrl 'örroiße Mixtur verwendet, die von KC Biological» bezogen worden k.iiin und die die Makro- und Mikroelemente des .nirashige und Skoog Mediums in Form ihrev Salze enthält. Die Endkonzentration der Bestandteile des MSBN-Mediums entspricht derjenigen des Mediums nach Murashige und Skocg. Zusätzlich enthalt das MSBN-Medium (Endkonzentrationen): Benzyladenin (1 mg/1); Naphthylessigsäure (0,1 mg/1); Myo-Inoaitol (i mg/1); Nicotinsäure (1 mg/1); Pyridoxin (1 mg/1); Thiamin KCl (10 mg); und Sucrose (30 mg/1)J. Der pH wird auf einen Wert von pH 5,7 bis 5,8 eingestellt.
Man lässt Blattscheiben von in vitro kultivierten Nicotiana tabacum cv. petite Havana SRI Pflanzen 10 Minuter» auf einer Bakteriensuspension aufschwimmen in einer Modifikation einer Methode von Hursch, R. et al., Science, £27: 1229-1231 (1985). Die Blattscheiben werden dann auf Filterpapier auf e:.n MSBN-Medium ohne Antibiotika übertragen. Nach 48 Stunden werden die Blattstückchen in flüssiges MSBN-Medium eingetaucht, das 500 mg/1 Carbenicillin enthält, und anschliessend auf ein festes Selektionamedium übertragen, das 100 mg/1 Kanamycin und 500 mg/1 Carbenicillin enthält.
Pflanzenreifung und Selbstbestäubung
Schösslinge, die sich auf dem Seloktionsmudium aus den Kalli entwickeln, werden entfernt und auf OMS-Medium mit 100 mg/1 Kanamycin und 250 mg/1 Carbenicillin übertragen. Man lässt dann die Entwicklung für drei weitere Wochen fortschreiten. Anschliessend werden die Pfläruchen in Erde ausgepflanzt und ins Gewächshaus überführt. Die Blütenbildung beginnt 4 bis 8 Wochen nach dem
- 54 - Zf9ZCS
Verbringen der Pflanzen ine Gewächshaus. Zu dein Zeitpunkt, da sich die Blüte öffnet und ihre Anthuren sich voneinander trennen, werden diese mit Hilfe einer Pinzette entfernt und zur Selbstbestäubung jeder'einzelnen Blüte auf die Narben aufgerieben. Die Samenkapseln reifen innerhalb von AO Tagen.
Testung der Samen-Nachkommenschaft von Kontrollpflanzen, transgenen Kontrollpflanzen und transgenon Versuchspflanzen Die Samen werden zunächst unter keimfreien Bedingungen aus der reifen Samenkapsel entfernt und in sterilen Petrischalen aufbewahrt. Die Samen werden anschliessend auf ein mittelweichee Samenkeimungsmedium (SKM) Überführt, das zusammengesetzt ist aus sämtlichen Makro- und Mikroelementen in Form ihrer Salze und in einer Konzentration, entsprechend dem Medium nach Murashige & Skoog (KC Diologicals), aus 1 mg/1 Thiaminhydrochlorid sowie 0,6 % gereinigtem Agar (Difco®). Dem Medium wird Atrazin in Analysequalität, in einer Konzentration von 10~7M, 3 χ 1O-7M, 5 χ 1θ"7Μ, 8 χ 10"7H und 10"6M zugesetzt.
Wachstum und Ueberlebensrate der Sämlinge wird bei den genannten Konzentrationan sowie bei einem Atrazinlevel von Null, über einen Zeitraum von 16 Tagen bestimmt; die Ergebnisse sind in Tabelle 1, unten, wiedergegeben. Alle Kontrollpflanzen und transgenen Kontrollpflanzen keimen zwar aus, erreichen aber in ihrem Wachstum bei Atrazinkonzentrationen von 5 χ 10 M oder bei höher&n Konzentrationen lediglich das Kotyledonenstadium. Unter den Sämlingen, die sich aus Samen entwickeln, der aus der Selbstbestäubung vcn pCIB14-Pflanzen hervorgegangen ist, bleiben bei einer Atrazinkonzen-Uration von 5 χ 10 M annähernd 75 % grün und bilden Primärblätter aus, während diese Sämlinge bei Atrazinkonzentrationen von 8 χ 10 M oder höheren Konzentrationen nur noch Kotyledonen ausbilden bevor pie ausbleichen und absterben.
-55-
Z?9
Obwohl die toleranten Sämlinge auf Atrazin-haltigem Medium nicht das gleiche gute Wachstum wie auf Atrazin-freiem Medium zeigen, können sie dennoch sehr leicht von den sensitiven Kontrollen auf dem gleichen Medium unterschieden werden.
Atrazin-Konzentrationen (M]
Genotyp der Sämlinge 10"7M 3 χ 10"7M 5 κ 10~7M 8 χ 10"7M 10"6M
Kontrolle + + ο O O
LBA 4404 + + O O O
Bin 6 + + O O O
pCIBH + + O O O
pCIB14 + + + O O
Die Tabelle macht den Unterschied im Wachstum und Ueberleben zwischen den Nachkommen von transgenen pCIB14-Pflanzen und den Kontrollen deutlich. Positives Wachstum i3t durch "+" gekennzeichnet, negatives Wachstum durch ein "o".
Obwohl die vorliegende Erfindung zuvor anhand von Abbildungen und Beispielen zum Zwecke der Anschaulichkeit und Verständlichkeit in verschiedenen Einzelheiten beschrieben worden ist, ist dennoch klar, dass im Rahmen dieser Erfindung gewisse Veränderungen und Modifikationen durchführbar sind, deren Grenzen einzig und allein durch den Umfang der beigefügten Ansprüche vorgegeben sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bilden nicht nur jene DNA-Moleküle, die mit konkreter Nucleotid-Sequenz angegeben sind und für ein Glutathion-S-Transferaee-Polypeptid kodieren, einen Bestandteil der Erfindung, sondern gleichermassen deren Varianten oder Mutanten, die für Polypeptide mit Glutathion-S-Transferase-Aktivität kodieren.

Claims (20)

  1. -56-
    Patentansprüche
    1. Verfahren zur Herstellung einer Herbiiid-toleranten Pflanze, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Pflanze mit einem rekombinanten DNA Molekül transformiert, das befähigt ist eine Herbizid-Toleranz, die auf der Detoxification des Herbizids beruht, auf eine Pflanze zu übertragen.
  2. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes rekombinantes DNA Molekül aus verschiedenen Sequenzabschnitten besteht, die sich von genomischer DNA und/oder cDNA ableiten und die zu einer •/ollständigen Gluthathion-S-Transferase kodierenden DNA Sequenz zusammengesetzt sind.
  3. 3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA Sequenzabschnitte sowohl aus genomischer DNA als auch aus cDNA zusammengesetzt sind.
  4. 4. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA Sequenzabschnitte aus Genfragmenten von mehreren Organismen, die verschiedenen Gattungen angehören, zusammengesetzt sind.
  5. 5. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA Sequenzabschnitte aus Genfragmenten von mehr als einem Stamm, einer Varietät oder einer Spezies des gleichen Organismus zusammengesetzt sind.
  6. 6. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA Sequenzabschnitle aus Anteilen von mehr als einem Gen desselben Organismus zusammengesetzt sind.
    ?. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid kodiert, von einem Säuger stammt.
    - 57 -
  7. 8. Verfahren gemäss feinem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid kodiert, von einer Ratte stammt.
  8. 9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid der Ratte kodiert, die folgende Nukleotid-Sequenz aufweist:
    40 50 60
    ATGCCTATGATACTGGGATACTGG MPMILGYW
    70 80 90 100 110 120
    AACGTCCGCGGGCTGACACACCCGATCCGCCTGCTCCTGGAATACACAGACTCAAGCTAT NVRGLTHPIRLLLEYTDSSY
    130 140 150 160 170 180
    GAGGAGAAGAGATACGCCATGGGCGACGCTCCCGACTATGACAGAAGCCAGTGGCTGAAT EEKRYAMGDAPDYDtSQWLN
    190 200 210 220 230 240
    gagaagttcaaactgggcctggacttccccaatctgccclxttaattgatggatcgcgc ekfklgldfpnlpylidgsr
    250 260 270 280 290 300 AAGATTACCCAGAGCAATGCCATAATGCGCTACCTi. JCCGCAAGCACCACCTGTGTGGA KITQSNAIMRYLARKHHLCG
    310 320 330 340 350 360 GAGACAGAGGAGGAGCGGATTCGTGCAGACATTGTGGAGAACCAG&TCATGGACAACCGC ETEEERIRADIVENQVMDNR
    370 380 390 400 410 420 ATGCAGCTCATCATGCTTTGTTACAACCCCGACTTTGAGAAGCAGAAGCCAGAGTTCTTG MQLIMLCYNPDFEKQKPEFL
    430 440 450 460 470 480 AAGACCATCCCTGAGAAGATGAAGCTCTACTCTGAGTTCCTGGGCAAGCGACCATGGTTT KTIPEKMKLYSEFLGKRPWF
    490 500 510 520 530 540 GCAGGGGACAAGGTCACCTATGTGGATTTCCTTGCTTATGACATTCTTGACCAGTACCAC AGDKVTYVDFLAYDILDQYH
    550 560 570 580 590 600 ATTTTTGAGCCCAAGTGCCTGGACGCCTTCCCAAACCTGAAGGACTTCCTGGCCCGCTTC IFEPKCLDAFPNLKDFLARF
    610 620 630 640 650 660 GAGGGCCTGAAGAAGATCTCTGCCTACATGAAGAGCAGCCGCTACCTCTCAACACCTATA EGLKKISAYMKSSRYLSTPI
    670 680 690 700 710 720 TTTTCGAAGTTGGCCCAATGGAGTAACAAGTAG
    FSKLAQWSNK
    - 58 -
    OSZG
  9. 10. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid der Ratte kodiert, üie folgende Nukleotid-Sequenz aufweist:
    1 10 13 0
    TAC AGC ATG GGG GAT GCT CCC GAC TAT GAC AGA AGC CAG Tyr Ser Met GIy Asp Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser GIn
    150 1 70
    TGG CTG AGT GAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG GAC TTC CCC AAT CTG 'irp Leu Ser GIu Lys Phe Lys Leu GIy Leu Asp Phe Pro Asn Leu
    19 0 210
    CCO TAC TTA ATT GAT GGG TCA CAC AAG ATC ACC CAG AGC AAT GCC Pro Tyr Leu lie Asp GIy Ser His Lys He Thr GIn Ser Asn AIa
    2 30 25 0 270
    ATC CTG CGC TAC CTT GGC CGG AAG CAC AAC CTT TGT GGG GAG ACA He Leu Arg Tyr Leu GIy Arg Lys His Asn Leu Cys GIy GIu Thr
    2 90 31 0
    GAG GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC GTT TTG GAG AAC CAG GCT ATG GIu GIu GIu Arg He Arg VaI Asp VaI Leu GIu Asn Gin AIa Met
    330 3 50
    GAC ACC CGC CTA CAG TTG GCC ATG GTC TGC TAC AGC CCT GAC TTT Asp Thr Arg Leu GIn Leu AIa Met VaI Cys Tyr Ser Pro Asp Phe
    37 0 390
    GAG AGA AAG AAG CCA GAG TAG TTA GAG GGT CTC CCT GAG AAG ATG GIu Arg Lys Lys Pro GIu Tyr Leu GIu GIy Leu Fro GIy Lys Met
    4 10 A3 0 450 AAG CTT TAC TCC GAA TTC CTG GGC AAG CAG CCA TGG TTT GCA GGG Lys Leu Tyr Ser GIu Phe Leu GIy Lys Gin Pro Trp Phe Ala GIy
    4 70 49 0
    AAC AAG ATT ACG TAT GTG CAT TTT CTT GTT TAC GAT GTC CTT GAT Asn Lys He Thr Tyr VaI Asp Phe Leu VaI Tyr Asp VaI Leu Asp
    510 5 30
    CAA CAC CGT ATA TTT GAA CCC AAG TGC CTG GAC GCC TTC CCA AAC Gin His Arg He Phe GIu Pro Lys Cys Leu Asp Ala Phe Pro Asn
    55 0 570
    CTG AAG GAC TTC GTG GCT CGG TTT GAG GGC CTG AAG AAG ATA TCT Leu Lys Asp Phe VaI AIa Arg Phe GIu GIy Leu Lys Lys He Ser
    5 90 61 0 630 GAC TAC ATG AAG AGC GGC CGC TTC CTC TCC AAG CCA ATC TTT GCA Asp Tyr Met Lys Ser GIy Arg Phe Leu Ser Lys Pro He Phe AIa
    6 50
    AAG ATG GCC TTT TGG AAC CCA AAG TAG
    Lys Met AIa Phe Trp Asn Pro Lys End
    - 59 -
  10. 11. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid der Ratte kodiert, die folgende Nukleotid-Sequenz aufweist:
    1 0 30
    ATG CCT ATG ACA CTG GGT TAC TGG GAC ATC CGT GGG CTG GCT CAC Met Pro Met Thr Leu GIy Tyr Trp Asp He Arg GIy Leu Ala His
    50 7 0 90
    GCC ATT CGC CTG TTC CTG GAG TAT ACA GAC ACA AGC TAT GAG GAC Ala He Arg Leu Phe Leu GIu Tyr Thr Asp Thr Ser Tyr GIu Asp
    1 10 13 0
    AAG AAG TAC AGC ATG GGG GAT GCT CCC GAC TAT GAC AGA AGC CAG Lys Lys Tyr Ser Met GIy Asp Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser GIn
    150 1 70
    TGG CTG AGT GAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG GAC TTC CCC AAT CTG Trp Leu Ser Glu Lys Phe Lys Leu GIy Leu Asp Phe Pro Asn Leu
    19 0 210
    CCC TAC TTA ATT GAT GGG TCA CAC AAG ATC ACC CAG AGC AAT GCC Pro Tyr Leu He Asp GIy Ser His Lys He Thr GIn Ser Asn AIa
    2 30 25 0 270
    ATC CTG CGC TAC CTT GGC CGG AAG CAC AAC CTT TGT GGG GAG ACA He Leu Arg Tyr Leu GIy Arg Lys His Asn Leu Cys GIy GIu Thr
    2 90 31 0
    GAG GAG GAG AGG ATT COT GTG GAC GTT TTG GAG AAC CAG GCT ATG GIu GIu GIu Arg He Arg VaI Asp VaI Leu GIu Asn Gin AIa Met
    330 3 50
    GAC ACC CGC CTA CAG TTG GCC ATG GTC TGC TAC AGC CCT GAC TTT Asp Thr Arg Leu GIn Leu AIa Met VaI Cys Tyr Ser Pro Asp Phe
    37 0 390
    GAG AGA AAG AAG CCA GAG TAC TTA GAG GGT CTC CCT GAG AAG ATG GIu Arg Lys Lys Pro Glu Tyr Leu GIu GIy Leu Pro GIu Lys Met
    4 10 43 0 450 AAG CTT TAC TCC GAA TTC CTG GGC AAG CAG CCA TGG TTT GCA GGG Lys Leu Tyr Ser Glu Fhe Leu Gly Lys GIn Pro Trp Phe Ala GIy
    4 70 49 0
    AAC AAG ATT ACG TAT GTG GAT TTT CTT GTT TAC GAT GTC CTT GAT Asn Lys He Thr Tyr VaI Asp Phe Leu VaI Tyr Asp VaI Leu Asp
    510 5 30
    CAA CAC CGT ATA TTT GAA CCC AAG TGC CTG GAC GCC TTC CCA AAC Gin His Arg He Phe Glu Pro Lys Cys Leu Asp Ala Phe Pro Asn
    55 0 570
    CTG AAG GAC TTC GTG GCT CGG TTT GAG GGC CTG AAG AAG ATA TCT Leu Lys Asp Phe VaI AIa Arg Phe Giu GIy Leu Lys Lys He Ser
    5 90 61 0 630 GAC TAC ATG AAG AGC GGC CGC TTC CTC TCC AAO CCA ATC VTT GCA Asp Tyr Met Lys Ser GIy Arg Phe Leu Ser Lys Pro He Phe AIa
    -60-
    6 50
    AAG ATG GCC TTT TCG AAC CCA MG TAG
    Lys Met Ala Phe Trp Asn Pro Lys End
  11. 12. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenz, dio für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid der Ratte kodiert, die folgende Nukleotid-Sequenz aufweist:
    10 30
    A GAC CCC AGC ACC ATG CCC ATG ACA CTG GGT TAC TGG GAC ATC Met Pro Met Thr Leu GIy Tyr Trp Asp He
    5 0 70
    CGT GGG CTA GCG CAT GCC ATC CGC CTG CTC CTG GAA TAC ACA GAC Arg GIy Leu Ala His Ala He Arg Leu Leu Leu GIu Tyr Thr Asp
    90 11 0 130
    TCG AGC TAT GAG GAG AAG AGA TAC ACC ATG GGA GAC GCT CCC GAC Ser Ser Tyr GIu GIu Lys Arg Tyr Thr Met GIy Asp Ala Pro Asp
    1 50 17 0
    TTT GAC AC-A AGC CAG TGG CTG AAT GAG MG TTC AM CTG GGC CTG Phe Asp Arg Ser GIn Trp Leu Asn GIu Lys Phe Lys Leu GIy Leu
    190 2 10
    GAC TTC CCC MT CTG CCC TAC TTA ATT GAT GGA TCA CAC MG ATC Asp Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Leu He Asp GIy Ser His Lys He
    23 0 250 2
    ACC CAG AGC MT GCC ATC CTG CGC TAT CTT GGC CGC MG CAC MC Thr GIn Ser Asn Ala He Leu Arg Tyr Leu GIy Arg Lys His Asn
    70 29 0 310
    CTG TGT GGG GAG ACA GM GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC ATT CTG Leu Cys GIy GIu Thr GIu GIu GIu Arg lie Arg VaI Asp He Leu
    3 30 35 0
    GAG MT CAG CTC ATG GAC MC CGC ATG GTG CTG GCG AGA CTT TGC GIu Asn GIn Leu Met Asp Asn Arg Met VaI Leu AIa Arg Leu Cys
    370 3 90
    TAT MC CCT GAC TTT GAG MG CTG MG CCA GGG TAC CTG GAG CM Tyr Asn Pro Asp Phe GIu Lys Leu Lys Pro GIy Tyr Leu GIu GIn
    41 0 430 4
    CTG CCT GGA ATG ATG CGG CTT TAC TCC GAG TTC CTG GGC MG CGG Leu Pro GIy Met Met Arg Leu Tyr Ser GIu Phe Leu GIy Lys Arg
    50 47 0 490
    CCA TGG TTT GCA GGG GAC MG ATC ACC TTT GTG GAT TTC ATT GCT Pro Trp Phe Ala GIy Asp Lys He Thr Phe VaI Asp Phe He AIa
    5 10 53 0
    TAC GAT GTT CTT GAG AGG MC CM GTG TTT GAG GCC ACG TGC CTG Tyr Asp VaI Leu GIu Arg Asn Gin VaI Phe GIu AIa Thr Cys Leu
    550 5 70
    GAC GCG TTC CCA MC CTG MG GAT TTC ATA GCG CGC TTT GAG GGC Asp Ala Phe Pro Asn Leu Lys Asp Phe He AIa Arg Phe GIu GIy
    - 61 -
    59 O
    CTG AAG AAG
    Leu Lys Lys
    AGA CCT CTG
    Arg Pro Leu
    CCT GAC AGG
    Pro Asp Arg
    ATC TCC GAC He Her Asp
    TTC ACA AAG Phe Thr Lys
    6 90
    TGG GCT TTA Trp AIa Leu
    610
    TAC ATG AAG Tyr Met Lys
    65 0
    ATG GCT ATT Met Ala He
    GGA GAA AGA GIy GIu Arg
    TCC AGC CGC Ser Ser Arg
    TGG GGC AGC Trp GIy Ser
    71
    TAC CAA ATC Tyr Gin He
    TTC CTC CCA Phe Leu Pro
    670
    AAG TAG GAC Lys End Asp
    TCC TGG GTT
    Ser Trp VaI
    730 7 50
    TGC CAA GAG CCC TAA GGA GCG GGC AGG ATT CCT GAG CCC CAG AGC
    Cys Gin GIu Pro End GIy Ala GIy Arg He Pro GIu Pro Gin Ser
    77 0
    CAT GTT TTC TTC CTT CCT
    His VaI Phe Phe Leu Pro
    CTC TCA TTT TTT GGT CAT
    Leu Ser Phe Phe GIy His
    8 70
    AAA GCC CTA GCA ACT CCT
    Lys AIa Leu AIa Thr Pro
    910 9 30
    TTA AAG TGC CCC GCC CCC ACC CCT CGA GCT CAT GTG ATT GGA TAG
    Leu Lys Cys Pro AIa Pro Thr Pro Arg Ala His VaI He GIy End
    95 0 970 9
    TTG GCT CCC AAC ATG TGA TTA TTT TGG GCA GGT CAG GCT CCC CGG
    Leu Ala Pro Asn Met End Leu Phe Trp Ala GIy Gin AIa Pro Arg
    90 101 0 1 030
    CAG ATG GGG TCT ATC TGG AGA CAG TAG ATT GCT AGC AGC TTT GAC
    GIn Met GIy Ser He Trp Arg Gin End He Ala Ser Ser Phe Asp
    10 50 107 0
    CAC CGT AGC CAA GCC CCT CTT CTT GCT GTT TCC CGA GAC TAG CTA
    His Arg Ser GIr1 AIa Pro Leu Leu Ala VaI Ser Arg Asp Ent: Leu
    1 090 11 10
    TGA GCA AGG TGT GCT GTG TCC CCA GCA CTT GTC ACT GCC TCT GTA
    End Ala Arg Cys Ala VaI Ser Pro AIa Leu VaI Thr AIa Sor VaI
    113 0 1 150 11
    ACC CGC TCC TAC CGC TCT TTC TTC CTG CTG CTG TGA GCT GTA CCT
    Thr Arg Ser Tyr Arg Ser Phe Phe Leu Leu Leu End Ala VaI Pro
    70 119 0 1 ?.1O
    CCT GAC CAC AAA CCA GAA TAA ATC ATT CTC CCC TTA AAA AAA AAA
    Pro Asp His Lys Pro GIu End He He Leu Pro Leu Lys Lys Lys
    AAA AAA AAA A
    Lys Lys Lys
    - 62 -
  12. 13. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenz, die für ein Glutathion-S-Transferase Polypeptid kodiert, in operabler Weise mit einem pflanzlichen Promotor und/oder einer Terminator-Region verknüpft ist und in der pflanzlichen Zelle exprimierbar ist.
    IA. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass besagte DNA-Sequenz heterologen Urspruchs ist in bezug auf den pflanzlichen
    Promotor.
  13. 15. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem pflanzlichen Promoter um einen Promotor, ausgewählt aus der
    Gruppe der nos-, ocs- und CaMV-Promotoren, handelt.
  14. 16. Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagtem pflanzlichen Promotor um den Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase der Sojabohne oder um den Promotor des Chlorophyll-a/b-Bindungsproteins handelt.
  15. 17. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagten Herbiziden um ein Chloracetamid, einen Sulfonylharnstoff, ein Triazi.n, einen Diphenylether, ein Imidazolinon oder um ein Thiocarbamat handelt.
  16. 18. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes rekombinantes DNA-Molekül mit Hilfe eines geeigneten Transformationsverfahrens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus direkten Transformations-Verfahren, Agrobaktfcrium-vermittelten Transformations-Verfahren, Virus-vermittelten Transformations-Vorfahren und Co-Transformatdonsverfahren in die pflanzliche Zelle oder Pflanze eingeschleust und die
    resultierende transgene Pflanzenzelle gegebenenfalls zu einer ganzen
    Pflanze regeneriert wird.
  17. 19. Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei besagten Pflanzenzellen um solche ausgewählt aus der Gruppe bestehand aus Tabak, Sojabohnen oder Baumwolle handelt.
  18. 20. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Herbizid-tolerante Pflanzen auch Mutanten und Varianten miteinschliessen.
  19. 21. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Herbizid-tolerante Pflanzen auch die Nachkommenschaft besagter Pflanzen miteinschliessen.
  20. 22. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Herbizid-tolerante Pflanzen auch Teile von Pflanzen miteinschliessen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blüten, Samen, Blätter, Zweige, Früch^.a, sofern diese Teile Herbizid-tolerante Zellen beinhalten.
    FO 7.5/WB/sm*
    /tr Ju -YS
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