JP3206813B2 - 除草剤代謝性チトクロムｐ４５０の発現 - Google Patents

除草剤代謝性チトクロムｐ４５０の発現

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Description

【発明の詳細な説明】 これは1990年１月12日提出の米国特許出願第07/464,4
99号の一部継続出願であり、後者は1989年９月11日提出
の米国特許出願第07/405,605号の一部継続出願である。
発明の分野 本発明はストレプトミセス・グリセオルス（Streptom
yces griseolus）からのDNA配列を植物および微生物の
中に導入し、こうして受容体の有機体がそれらの遺伝子
のタンパク質産生物を産生し、これにより除草剤を代謝
することができるようにすることに関する。これらのDN
A配列は、除草剤を代謝するチトクロムP450およびこれ
らのチトクロムP450に電子を与える鉄−硫黄タンパク質
をエンコードするものからなる。
発明の背景 雑草の制御における除草剤の使用は農業の実施におい
て広く受け入れられている。除草剤の代謝および変性の
われわれの理解は、なお、未熟であり、そして活動的に
研究がなされている。土の微生物は除草剤の分解に関係
する、ジョシ（Joshi）ら、ウィード・サイエンス（Wee
d Sci.）33:888−893、1985。スルホニル尿素の除草剤
は、土のバクテリアのストレプトミセス・グリセオルス
（Streptomyces griseolus）により同時に代謝される
ことが示された、ロウムサー（Romesser）ら、Abstr.An
n.Mtg.Am.Soc.Microbiol.p.248、1985。さらに、レト
（Leto）、プラント・フィジオロジープラント・フィジ
オロジー（Plant Physiol.）805:5347（1986）および
ロウムサー（Romesser）ら、バイオケミカル・アンド・
バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bi
ochem.Biophys.Res.Comm.）140:650−659（1986）に開
示されている研究が示すように、２つのチトクロムP450
酵素、P450SU1およびP450SU2と表示する、約45,000の分
子量のタンパク質を含有するヘム、は、それらをいくつ
かの除草剤のいずれかを含有する培地中で成長させると
き、バクテリアストレプトミセス・グリセオルス（S.gr
iseolus）の細胞の中で合成される。ストレプトミセス
・グリセオルス（S.griseolus）によるこれらのタンパ
ク質の合成は、ロウムサー（Romesser）ら、バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーション（Biochem.Biophys.Res.Comm.）140:650−65
9（1986）に記載されているUV/可視光の差の分光光度測
定、オ’キーフェ（O'Keefe）ら、プラント・フィジオ
ロジー（Plant Physiol.）805:5347（1986）に記載さ
れている分析用アニオン交換およびゲル濾過クロマトグ
ラフィーおよびレト（Leto）、プラント・フィジオロジ
ープラント・フィジオロジー（Plant Physiol.）805:5
348（1986）に記載されているLDSゲル電気泳動により検
出可能である。ロウムサー（Romesser）ら、バイオケミ
カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニ
ケーション（Biochem.Biophys.Res.Comm.）140−650−6
59（1986）およびオ’キーフェ（O'Keefe）ら、植物化
学における最近の進歩（Recent Advances in Phytoc
hemistry）21:151−173（1987）は、P450の存在をこの
有機体がある数のスルホニル尿素除草剤について種々の
代謝反応を実施する能力に相関関係づけた。さらに、ロ
ウムサー（Romesser）ら、バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Bioc
hem.Biophys.Res.Comm.）140:650−659（1986）に論考
されているように、ストレプトミセス・グリセオルス
（S.griseolus）からの粗製の細胞不含抽出物は、それ
らがある種のスルホニル尿素の存在下に成長させた細胞
からのものであるとき、スルホメツロンメチル（1001
0）ヒドロキシラーゼ活性を示し、そしてクロロスルフ
ロン（10013）またはスルホメツロン（10010）を添加す
るとき生ずる抽出物のスペクトルの差は、新しく現れる
チトクロムP450がチトクロムP450に結合する基質に類似
する方法でこれらの化合物に結合することを示唆する。
さらに、除草剤化合物の活性部分を分解させる遺伝子
は植物の中に組み込むことができ、そして前記植物を影
響を受けた除草剤に対して抵抗性となるようにさせる。
ストーカー（Stalker）ら、サイエンス（Science）242:
419−422（1988）は、除草剤ブロモキシニルを転化して
3,5−ジブロモ−４−ヒドロキシ安息香酸を代謝する特
定のニトリラーゼをエンコードする、クレブシエラ・オ
ザエナエ（Klebsiella ozaenae）からの遺伝子をタバ
コ植物の中に転移し、その結果タバコ植物はブロモキシ
ニルに対して抵抗性となることを記載している。
ここに記載する本発明の主要な目的は、２つのチトク
ロムP450をエンコードするDNA配列である。他の目的は
それらの鉄−硫黄タンパク質の電子供与体をエンコード
する配列である。本発明のこれらの配列はストレプトミ
セス・グリセオルス（Streptomyces griseolus）ATCC1
1796からのものである。これらの２つのチトクロムP450
はスルホニル尿素化合物および他の除草剤を代謝するこ
とができる。２つのチトクロムP450をP450SU1およびP45
0SU2と表示し、そして２つの鉄−硫黄タンパク質をFeS
−ＡおよびFeS−Ｂと表示した。
野生型ストレプトミセス・グリセオルス（Streptomyc
es griseolus）においては、チトクロムP450SU1、P450
SU2、および鉄−硫黄タンパク質FeS−ＡおよびFeS−Ｂ
はスルホニル尿素化合物の添加により誘導される。多数
のスルホニル尿素化合物をこれらのチトクロムP450によ
り代謝することができるが、すべてがこれらのタンパク
質のすぐれた誘導体であるわけではない。こうして、野
生型有機体による多数のスルホニル尿素化合物の最適な
代謝は、まず、チトクロムP450および鉄−硫黄タンパク
質をすぐれた誘導体であることが知られているスルホニ
ル尿素で誘発することによってのみ達成することができ
る。構成的にまたは光への暴露の結果P450酵素を産生す
る有機体は、スルホニル尿素で有機体を誘導して有機体
が前記スルホニル尿素を代謝できるようにする必要性を
排除する。
こうして、本発明の他の目的は、有機体（バクテリア
および植物）を除草剤を代謝するチトクロムP450の遺伝
子そして、必要に応じて、P450の酵素の構成的または光
誘導発現を可能とするプラスミドの中に含有された、そ
れらの鉄−硫黄タンパク質の電子供与体および、必要に
応じて、形質転換された有機体の中の鉄−硫黄タンパク
質で形質転換することによって、有機体の中で除草剤を
代謝するチトクロムP450およびそれらの鉄−硫黄タンパ
ク質の電子供与体を誘導する必要性を排除することであ
る。前記形質転換された有機体は、それらが除草剤に直
面するときごとに、すぐれた除草剤および劣った除草剤
の両者の除草剤を代謝することができる。
バクテリアからの典型的なチトクロムP450モノオイゲ
ナーゼ系は、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas p
utida）からのP450 CAM系に類似する［スリガー（Slig
ar）ら、チトクロムＰ−450の構造、メカニズムおよび
生化学（Cytochrome Ｐ−450 Structure,Mechanism
and Biochemistry）、オルチズ・デ・モンテラノ（Ort
iz de Montellano）編、プレナム・プレス（Plenum
Press）ニューヨーク（1986）pp.429−504］。この系は
黄色酵素のリダクターゼ（プチダレドキシンリダクター
ゼ）、低分子量の鉄−硫黄タンパク質（プチダレドキシ
ン）およびチトクロムＰ−450（Ｐ−450 CAM）から構
成されている。タンパク質のこの系は、還元性同等体を
還元したピリジンヌクレオチドから、順次にプチダレド
キシンリダクターゼから、プチダレドキシンに、次いで
Ｐ−450 CAMに転移する機能をする。しかしながら、基
質に対する酵素系の特異性はもっぱらＰ−450タンパク
質にあり、そしてリダクターゼおよび鉄−硫黄タンパク
質は、それらが還元性同等体を触媒反応に必要なＰ−45
0に提供するかぎり、はじめて重要ことに注意すること
が重要である。こうして、本発明の他の目的は他の有機
体の中のスルホニル尿素および除草剤の代謝の遺伝子を
置換し、こうしてこれらの有機体の中の還元性同等体の
存在する源を利用してチトクロムＰ−450の機能を促進
することである。
発明の要約 バクテリアのストレプトミセス・グリセオルス（Stre
ptomyces griseolus）は、除草剤化合物を代謝するあ
る種のP450酵素を産生する、２つの誘導可能な遺伝子を
含有する。２つの酵素をP450SU1およびP450SU2と呼ぶ。
これらの酵素は、ある種の鉄硫黄タンパク質が入手可能
であるとき、そして鉄硫黄タンパク質を電子を供与する
ことができるリダクターゼタンパク質が入手可能ときに
のみ、有効に働くことが知られている。ストレプトミセ
ス・グリセオルス（Streptomyces griseolus）の中の
鉄硫黄タンパク質のための遺伝子は、P450酵素のための
遺伝子に隣接しかつその下流に存在する。出願人はスト
レプトミセス・グリセオルス（S.griseolus）からDNA配
列を分離し、これらのDNA配列はP450酵素P450SU1および
P450SU2および隣接する鉄硫黄タンパク質、FeS−Ｂおよ
びFeS−Ａ、をエンコードする。鉄硫黄タンパク質のFeS
−ＡまたはFeS−Ｂのいずれかは還元性同等体をいずれ
かの酵素に転移することができることが発見された。P4
50SU1＋隣接する鉄硫黄タンパク質FeS−ＢについてのDN
A配列からなるDNA配列は、以後の第27〜31ページに詳述
されているように、塩基対番号128で開始しそして塩基
対番号1578で終わる。P450SU2＋隣接する鉄タンパク質F
eS−ＡについてのDNA配列からなるDNA配列は、以後の第
32〜36ページに詳述されているように、塩基対番号195
で開始しそして塩基対番号1646で終わる。出願人は、バ
クテリアを形質転換することができるP450SU1＋FeS−Ｂ
のためのDNA配列からなる新規なプラスミド（すなわ
ち、pCAO400、pCAO401、pCAO200SU1＃12、pCAO200SU1−
FeS−Ｂ＃９またはpPAT108）およびP450SU2＋FeS−Ａの
ためのDNA配列からなる新規なプラスミド（すなわち、p
CAO200SU2−FeS−Ａ＃11またはpCS325）を構成した。す
べてがP450SU1＋FeS−ＢをエンコードするDNA配列から
なるpCAO400、pCAO401、pCAO200SU1＃12、pCAO200SU1−
FeS−Ｂ＃９またはpPAT108から選択されるプラスミドで
形質転換されたバクテリア、好ましくはストレプトミセ
ス（Streptomyces）属、最も好ましくはストレプトミセ
ス・リビダンス（Streptomyces lividans）は、鉄硫黄
タンパク質のリダクターゼがこれらの細胞の中に導入さ
れていなくてさえ、P450SU1を構成的に産生し、そして
除草剤のスルホニル尿素化合物を代謝する。P450SU2＋
鉄硫黄タンパク質FeS−ＡをエンコードするDNA配列から
なる、プラスミドpCAO200SU2−FeS−Ａ＃11またはpCS32
5で形質転換されたバクテリアは、鉄硫黄タンパク質の
リダクターゼが添加されていなくてさえ、P450SU2を構
成的に産生しそして、また、除草剤のスルホニル尿素化
合物を代謝することができる。
本発明の他の実施態様は、スルホニル尿素または他の
除草剤化合物をpCAO400、pCAO401、pCAO200SU1−FeS−
Ｂ＃９、pCAO200SU2−FeS−Ａ＃11、pPAT108またはpCS3
25から選択されるプラスミドで形質転換されたバクテリ
ア、好ましくはストレプトミセス（Streptomyces）属の
バクテリアとインキュベーションすることからなる、除
草剤化合物の代謝物を調製する方法である。
本発明のなお他の実施態様は、植物の実生を土に移植
する前に、植物の実生をpCAO400、pCAO401、pCAO200SU1
−FeS−Ｂ＃９またはpCAO200SU2−FeS−Ａ＃11で形質転
換されたバクテリア、好ましくはストレプトミセス（St
reptomyces）属、最も好ましくはストレプトミセス・リ
ビダンス（Streptomyces lividans）のバクテリアの培
養物の中でソーキングすることからなる、阻害量の除草
剤化合物を含有する土の中で植物を保護する方法であ
る。本発明のそれ以上の実施態様は、バクテリアで被覆
された種子である。
そして、本発明の他の実施態様は、植物、とくに園芸
学的または耕種学的利用の植物をこれらの遺伝子で形質
転換して、スルホニル尿素の除草剤を植物が代謝するこ
とができるようにすることである。この目的で、P450SU
1および／またはFeS−Ｂをエンコードする配列およびP4
50SU1および／またはFeS−Ｂ配列の前および後のある種
の他のDNA配列からなる断片を利用するプラスミド（す
なわち、pSU18、pSSU−SU111、pSSU−SU121、pCab−SU1
11、pCab−SU121、およびpCab−SU131、pSUFe11、pSUFe
21、pSUFe31およびpSUFe41）を操作して、これらの遺伝
子で植物を形質転換した。これにより、化学物質をより
大きい植物毒性を示す化合物に代謝することによって、
除草活性を欠如するか、あるいは弱い除草活性のみを含
有する化学物質に対して感受性である、前記形質転換さ
れた植物をつくることができる。
形質転換された植物による除草剤の代謝は、それらの
植物を前記除草剤に対して抵抗性とし、そして植物の中
の除草剤の蓄積を減少することができる。低い毒性から
高い毒性へのスルホニル尿素のチトクロムP450仲介代謝
は、条件的に致死的な表現型を生じ、そして組織特異的
な殺しの用途に、あるいは遺伝子の発現を崩壊させる事
象の選択に多分使用することができる。
このような形質転換された植物は、P450SU1またはP45
0SU2遺伝子を使用するそれらの形質転換の前に、他の突
然変異の遺伝子を含有する植物を包含することができ
る。阻害を防止または減少する突然変異のアセトラクテ
ートシンターゼ酵素を含有する植物はとくに重要であ
る。この酵素は、植物および微生物の中でアミノ酸のバ
リン、ロイシン、およびイソロイシンの合成における第
１反応を触媒する。種々の植物および微生物の中のこの
酵素はスルホニル尿素による阻害に対して非常に感受性
であることが知られている。スルホニル尿素または他の
除草剤による酵素の阻害を減少または防止する突然変異
のアセトラクテートシンターゼ酵素および植物に除草剤
を代謝させるP450チトクロム酵素の両者は、突然変異の
アセトラクテートシンターゼ単独を含有する植物におい
て見られるより、なお大きい抵抗性を広範な種類のスル
ホニル尿素化合物に対してを示す植物を多分生ずるであ
ろう。
図面の簡単な説明 第１図は、プラスミドpUC18−SU1−BamH Iの、制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を示す、物理学的地図である。
第2A図および第2B図は、それぞれ、プラスミドpCAO40
0およびpCAO401の、制限エンドヌクレアーゼ部位を示
す、各物理学的地図である。
第3A図および第3B図は、それぞれ、プラスミドpCAO20
0SU1−FeS−Ｂ＃９およびpCAO2220SU1＃12の、制限エン
ドヌクレアーゼ部位を示す、各物理学的地図である。
第４図は、プラスミドpUC19−SU2−８の、制限エンド
ヌクレアーゼ部位を示す、物理学的地図である。
第５図は、次のようなウェスタン・ブロットを示す： レーン１、50ngの精製してチトクロムP450SU1、 レーン２、ブランク、 レーン３、スルホニル尿素の不存在下に成長したスト
レプトミセス・リビダンス（S.lividans）C37からのタ
ンパク質、 レーン４、120ppmの10001で６時間誘導したストレプ
トミセス・リビダンス（S.lividans）C37からのタンパ
ク質、 レーン５、スルホニル尿素の不存在下に成長したpCAO
400で形質転換されたストレプトミセス・リビダンス
（S.lividans）、 レーン６、120ppmの10001で６時間誘導したpCAO400で
形質転換されたストレプトミセス・リビダンス（S.livi
dans）、 レーン７、500ngの精製したチトクロムP450SU1。
第６図は、次のようなウェスタン・ブロットを示す： レーン１、pCAO401で形質転換しそして120ppmの10001
で24時間誘導したストレプトミセス・リビダンス（S.li
vidans）のタンパク質抽出物、 レーン２、pCAO401で形質転換しそして120ppmの10001
で６時間誘導したストレプトミセス・リビダンス（S.li
vidans）のタンパク質抽出物、 レーン３、pCAO401で形質転換しそして120ppmの10001
で３時間誘導したストレプトミセス・リビダンス（S.li
vidans）のタンパク質抽出物、 レーン４、pCAO401で形質転換しそして24時間成長さ
せたストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）のタ
ンパク質抽出物、 レーン５、pCAO400で形質転換しそして120ppmの10001
で24時間誘導したストレプトミセス・リビダンス（S.li
vidans）のタンパク質抽出物、 レーン６、pCAO400で形質転換しそして120ppmの10001
で６時間誘導したストレプトミセス・リビダンス（S.li
vidans）のタンパク質抽出物、 レーン７、pCAO400で形質転換しそして120ppmの10001
で３時間誘導したストレプトミセス・リビダンス（S.li
vidans）のタンパク質抽出物、 レーン８、pCAO400で形質転換しそして24時間成長さ
せたストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）のタ
ンパク質抽出物。
レーン９、100ngの精製したチトクロムP450SU1。
第７図は、次のようなウェスタン・ブロットを示す： レーン１、100ngの精製したチトクロムP450SU1、 レーン２、200ngの精製したチトクロムP450SU1、 レーン３、pCAO200SU1＃12で形質転換したストレプト
ミセス・リビダンス（S.lividans）の抽出物、 レーン４、pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９で形質転換され
たストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）の抽出
物。
第８図は、pCAO200SU2−FeS−Ａ＃11の、制限エンド
ヌクレアーゼ部位を示す、物理学的地図である。
第９図は、次のようなウェスタン・ブロットを示す： レーン１、100ngの精製したチトクロムP450SU2、 レーン２、スルホニル尿素の不存在下に成長したpCAO
200SU2−FeS−Ａ＃11で形質転換されたストレプトミセ
ス・リビダンス（S.lividans）の抽出物（30μｇのタン
パク質）、 レーン３、スルホニル尿素の不存在下に成長したpCAO
200SU1＃12で形質転換されたストレプトミセス・リビダ
ンス（S.lividans）の抽出物（30μｇのタンパク質）、 レーン４、スルホニル尿素の不存在下に成長したpCAO
200SU1−FeS−Ｂ＃９で形質転換されたストレプトミセ
ス・リビダンス（S.lividans）の抽出物（30μｇのタン
パク質）。
第10A図は、pSU17の制限エンドヌクレアーゼ部位を示
す物理学的地図である。
第10B図は、pSSU−SU11の制限エンドヌクレアーゼ部
位を示す物理学的地図である。
第10C図は、pSSU−SU12の制限エンドヌクレアーゼ部
位を示す物理学的地図である。
第10D図は、pCab−SU11の制限エンドヌクレアーゼ部
位を示す物理学的地図である。
第10E図は、pCab−SU12の制限エンドヌクレアーゼ部
位を示す物理学的地図である。
第10F図は、pCab−SU13の制限エンドヌクレアーゼ部
位を示す物理学的地図である。
第11図は、10015〜10014のＮ−脱アルキル化を描写す
る。
第12A図は、10015および10014標準についての紫外線
吸収スペクトルである。
第12B図は、葉から抽出した10015および葉から抽出し
た代謝物についての紫外線吸収スペクトルである。
第13A図は、形質転換されたタバコの葉の組織による1
0001の10003および10002への代謝を描写する。
第13B図は、10001の経時的消失を描写する。
第13C図は、10003の経時的消失を描写する。
第13D図は、10002の経時的消失を描写する。
第14図は、10015で噴霧後22日における形質転換およ
び非形質転換のタバコ植物の出現を描写する。
第15A図は、プラスミドpSUFe1の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す物理学的地図である。
第15B図は、プラスミドpSUFe2の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す物理学的地図である。
第15C図は、プラスミドpSUFe3の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す物理学的地図である。
第15D図は、プラスミドpSUFe4の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す物理学的地図である。
第15A図〜第15D図において、H3はHind IIIを表し、BM
1はBamH Iを表し、NC1はNco Iを表し、RIはEcoR Iを表
し、そしてBG2はBgl IIを表す。
第16A図は、プラスミドpPAT108の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す物理学的地図である。
第16B図は、プラスミドpCS325の制限エンドヌクレア
ーゼ部位を示す物理学的地図である。
第17A図〜第17D図は、プラスミドpSU17の構成を示す
線図である。
第18A図〜第18D図は、プラスミドpSUFe1の構成を示す
線図である。
第19A図および第19B図は、プラスミドpSSU−SU11およ
びpSSU−SU12の構成を示す線図である。
第20A図〜第20C図は、プラスミドpCab−SU11、pCab−
SU12およびpCab−SU13の構成を示す線図である。
第21A図〜第21D図は、プラスミドpSUFe3およびpSUFe4
の構成を示す線図である。
第22A図および第22B図は、プラスミドpSUFe2の構成を
示す線図である。
第23A図〜第23C図は、プラスミドpAGS501およびpAGS5
02の構成を示す線図である。
第24A図〜第24D図は、プラスミドpZ596の構成を示す
線図である。
第25A図は、プラスミドpZ6A−SU1の制限エンドヌクレ
アーゼ部位を示す物理学的地図である。
第25B図は、プラスミドpZ6AT−SU1の制限エンドヌク
レアーゼ部位を示す物理学的地図である。
第17図〜第22図において、P450SU1はチトクロムP450S
U1のための解読配列を表し、CaMV35SpはCaMVの35Sプロ
モーターであり、Cab2215′はCab22Lについてのペチュ
ニア遺伝子の５′−未翻訳配列配列であり、SSU301はSS
Uについてのペチュニア遺伝子のための解読配列であ
り、SSU3′はSSU301についてのペチュニア遺伝子の３′
−未翻訳配列であり、SSUpはペチュニアSSU301遺伝子の
プロモーターであり、SSU−ＴはペチュニアSSU301タン
パク質の葉緑体トランシットペプチドのための解読配列
であり、SSU−Ｍは成熟ペチュニアSSU301タンパク質の
ための解読配列であり、CabpはペチュニアCa22L遺伝子
のプロモーターであり、CabTは葉緑体トランシットの解
読配列であり、CabMはペチュニアCab22Lの成熟タンパク
質の解読配列であり、FeS−ＢはFeS−Ｂの解読配列であ
り、そしてnos3′はナポリンシンターゼ遺伝子からの
３′−未翻訳領域である。第23A図および第23B図におい
て、AMPはバクテリアにおけるアンピシリン抵抗性を意
味し、LBはＴ−DNAへりの境界を意味し、RBはＴ−DNAの
右へりを意味し、そしてNPTは植物におけるカナマイシ
ン抵抗性を意味する。
発明の詳細な説明 定義： PIPES:ピペラジン−N,N−ビス（２−エタンスルホン
酸） MOPS:3−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸 ATCC:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（American Type Culture Collection）、米国マ
リイランド州2058ロックビレ、パークロウンドライブ12
301。
HPLC:高性能液体クロマトグラフィー UV:紫外線 チトクロムP450SU1およびP450SU2:本発明の２つのチ
トクロムP450酵素に割り当てられた名称。
FeS−ＡおよびFeS−B:本発明の２つの鉄硫黄タンパク
質に割り当てられた名称。
10001:N−［（４−クロロ−６−メトキシ−ピリミジ
ン−２−イル）アミノカルボニル］−２−エトキシカル
ボニルベンゼンスルホンアミド、 10002:N−［（４−クロロ−６−ヒドロキシ−ピリミ
ジン−２−イル）アミノカルボニル］−２−エトキシカ
ルボニルベンゼンスルホンアミド、 10003:N−［（４−クロロ−６−メトキシ−ピリミジ
ン−２−イル）アミノカルボニル］−２−カルボキシベ
ンゼンスルホンアミド、 10004:2−ブチル−2,3−ジヒドロ−Ｎ−［（4,6−ジ
メトキシ−ピリミジン−２−イル）アミノカルボニル−
1,2−ベンズイソチアゾール−７−スルホンアミド−1,1
−ジオキシド、 10005:2−（３−ヒドロキシブチル）−2,3−ジヒドロ
−Ｎ−［（4,6−ジメトキシ−ピリミジン−２−イル）
アミノカルボニル］−1,2−ベンズイソチアゾール−７
−スルホンアミド−1,1−ジオキシド、 10006:N−［（４−メトキシ−６−メチル−1,3,5−ト
リアジニル）アミノカルボニル］−２−メトキシカルボ
ニルベンゼンスルホンアミド、 10007:N−［（４−ヒドロキシ−６−メチル−1,3,5−
トリアジニル）アミノカルボニル］−２−メトキシカル
ボニルベンゼンスルホンアミド、 10008:N−［（４−メトキシ−６−メチル−1,3,5−ト
リアジニル）アミノカルボニル］−２−ベンゼンベンゼ
ンスルホンアミド、 10009:N−［（４−メトキシ−６−ヒドロキシメチル
−1,3,5−トリアジニル）アミノカルボニル］−２−メ
トキシカルボニルベンゼンスルホンアミド、 10010:N−［（4,6−ジメチルピリミジン−２−イル）
アミノカルボニル］−２−メトキシカルボニルベンゼン
スルホンアミド、 10011:N−［（４−ヒドロキシメチル−６−メチル−
ピリミジン−２−イル）アミノカルボニル］−２−メト
キシカルボニルベンゼンスルホンアミド、 10012:N−［（４−カルボキシ−６−メチルピリミジ
ン−２−イル）アミノカルボイル］−２−メトキシカル
ボニルベンゼンスルホンアミド、 10013:N−［（４−メトキシ−６−メチル−1,3,5−ト
リアジニル）アミノカルボニル］−２−クロロベンゼン
スルホンアミド、 10014:2,3−ジヒドロ−Ｎ−［（4,6−ジメトキシピリ
ミジン−２−イル）アミノカルボニル］−1,3−ベンズ
イソチアゾル−７−スルホンアミド−1,1−ジオキシ
ド、 10015:2−メチルエチル−2,3−ジヒドロ−Ｎ−［（4,
6−ジメトキシピリミジン−２−イル）アミノカルボイ
ル］−1,3−ベンズイソチアゾル−７−スルホンアミド
−1,1−ジオキシド、 10016:N−［（４−メトキシ−６−メチルピリミジン
−２−イル）アミノカルボニル］−４−ジメチルアミノ
−１−ナフタレンスルホンアミド、 10017:3−シクロヘキシル−１−メチル−６−ジメチ
ルアミノ−Ｓ−トリアジン−2,4（1H,3H）ジオン、 10018:4−アミノ−６−ｔ−ブチル−３−（メチルチ
オ）−AS−トリアジン−５（4H）−オン、 10019:3−（３−クロロ−ｐ−トリル）−1,1−ジメチ
ル尿素、 10020:7−クロロ−５−フルオロ−４−（2,3,4,5,6,7
−ヘキサヒドロ−1,3−ジオキソ−1H−イソインドリル
−２−イル）−2,3−ジヒドロ−２−ベンゾフランカル
ボン酸、メチルエステル、 10021:2−［４−クロロ−６−（エチルアミノ−1,3,5
−トリアジン−２−イル）アミノ］−２−メチルプロパ
ンニトリル、 10022:1−メチル−２（1H）−ピリミジノン、 10023:3,5−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾニトリ
ル、 10024:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−２−エチル−2,3−ジヒドロ
−1,2−ベンズイソチアゾール−７−スルホンアミド−
1,1−ジオキシド、 10025:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−2,3−ジヒドロ−２−（フェ
ニルメチル）−1,2−ベンズイソチアゾール−７−スル
ホンアミド−1,1−ジオキシド、 10026:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−２−（２−フルオロメチル）
−2,3−ジヒドロ−1,2−ベンズイソチアゾール−７−ス
ルホンアミド−1,1−ジオキシド、 10027:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−2,3−ジヒドロ−２−プロピ
ル−1,2−ベンズイソチアゾール−７−スルホンアミド
−1,1−ジオキシド、 10028:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−2,3−ジヒドロ−２−（２−
プロペニル）−1,2−ベンズイソチアゾール−７−スル
ホンアミド−1,1−ジオキシド、 10029:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−２−メチル−2,3−ジヒドロ
−７−スルホンアミド−1,1−ジオキシド、 10030:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−2,3−ジヒドロ−２−（２−
メチルプロピル）−1,2−ベンズイソチアゾール−７−
スルホンアミド−1,1−ジオキシド、 10031:2−アセチル−Ｎ−［（4,6−ジメトキシピリミ
ジン−２−イル）アミノカルボニル］−2,3−ジヒドロ
−1,2−ベンズイソチアゾール−７−スルホンアミド−
1,1−ジオキシド、 10032:N−［（4,6−ジメトキシピリミジン−２−イ
ル）アミノカルボニル］−2,3−ジヒドロ−２−（トリ
メチルシリルメチル）−1,2−ベンズイソチアゾール−
７−スルホンアミド−1,1−ジオキシド、 10033:N−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−5,7
−ジメチル−1,2,4−トリアゾロ−1,5A−ピリミジン−
２−スルホンアミド、 10034:2−［（4,5−ジヒドロ−４−メチル−４−（１
−メチルエチル）−1H−イミダゾル−２−イル）１−５
−エチル−３−ピリジンカルボン酸、 10035:2−［4,5−ジヒドロ−４−メチル−４−（１−
メチルエチル）−５−オキソ−1H−イミダゾル−２−イ
ル］−３−キノリンカルボン酸、 10036:N−（2,6−ジクロロフェニル）−4,6−ジメチ
ル−２−ピリジンスルホンアミド。
この開示に関して、ある数の用語を利用する。ここで
使用するとき、用語「プロモーター」および「プロモー
ター領域」は、通常構造遺伝子のタンパク質解読配列に
対して上流（５′）の、DNAの配列を意味し、RNAポリメ
ラーゼの認識および／または正しい部位における転写の
開始に要求される他の因子を提供することによって、解
読領域の発現をコントロールする。プロモーター配列は
必要であるが、遺伝子の発現を推進するために常に十分
であるというわけではない。
「断片」は、特定の領域のDNA配列の分画を構成す
る。
「核酸」は、糖、ホスフェートおよびプリンまたはピ
リミジンを含有するモノマー（ヌクレオチド）から構成
される、一本鎖または二本鎖であることができる分子を
意味する。より高等の植物の中のバクテリアにおいて、
「デオキシリボ核酸」（DNA）は遺伝材料を意味する
が、「リボ核酸」（RNA）はDNAからタンパク質の中への
情報の翻訳に関係する。
「調節」および「調節する」は、主として、独占的で
はなく、遺伝子の転写開始に対して上流（５′）の位置
するDNA配列の要素によりコントロールされる遺伝子の
発現の変調を意味する。調節は刺激に対するすべての応
答を生ずるか、あるいは生じないことがあるか、あるい
は遺伝子の発現のレベルを変動することがある。
用語「解読配列」は、タンパク質、ポリペプチドまた
はその一部分をエンコードする遺伝子の部分を意味する
が、転写の開始を推進する調節配列を排除する。解読配
列は通常細胞の中に見いだされるものであることができ
るか、あるいはそれはそれが導入される細胞の位置にお
いて通常見いだされないものであることができ、この場
合においてそれは異種遺伝子と呼ばれる。異種遺伝子
は、バクテリアのゲノムまたはエピソーム、真核生物の
核またはプラスミドDNA、cDNA、または化学的に合成さ
れたDNAを包含する、この分野において知られている任
意の源から、全体がまたは一部分が誘導されることがで
きる。解読配列は中断されない解読領域を構成すること
ができるか、あるいはそれは適当なスライス接合により
拘束された１または２以上のイントロンを包含すること
ができる。解読配列は、天然に存在するか、あるいは合
成の異なる源から誘発されたセグメントの複合体である
ことができる。
「３′下流領域」（または「３′末端」）は、転写の
開始を推進する５′配列および遺伝子の解読配列を排除
っし、真核生物におけるポリアデニル化シグナルおよび
mRNAのプロセシングまたは遺伝子の発現に影響を与える
ことができる他の調節シグナルを含有する、DNAセグメ
ントからなる遺伝子の部分を意味する。真核生物におけ
るポリアデニル化シグナルは、通常、ポリアデニル酸の
領域のmRNA前駆体への付加に影響を与えることによって
特徴づけられる。ポリアデニル化シグナルは、通常、標
準の形態５′−AATAAA−３′に対する相同性の存在によ
り認識されるが、変動は異常ではない。
用語「構成」または「構成体」は、任意の源から誘導
された一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAの、線状また
は円形の、プラスミド、ウイルス、自律的に複製する配
列、ファージまたはヌクレオチド配列を意味し、ここで
ある数のヌクレオチド配列は独特の構成に接合または組
み換えられており、独特の構成は選択した遺伝子産生物
のプロモーター断片またはDNA配列を適当な３′−未翻
訳配列に沿って植物細胞の中に導入することができる。
ここで使用するとき、「植物」は植物全体または植物
誘導組織を意味する。
ここで使用するとき、「形質転換」は、核酸（通常二
本鎖DNA）の組み込み後、細胞の中に新しい遺伝子が獲
得されることである。
用語「操作的に連鎖した」は、適切な向きおよびリー
ディングフレームで機能的RNAの中に転写すべきDNAの２
つの断片の化学的融合を意味する。
用語「発現」は、ここで使用するとき、遺伝子産生物
の配列の遺伝情報を指定する遺伝子からの遺伝子産生物
の転写または翻訳を意味することを意図する。発現にお
いて、遺伝子産生物の配列の遺伝情報を指定するDNA鎖
は、まず、しばしばメッセンジャーRNAである相補的DNA
に転写され、次いで、こうして転写されたメッセンジャ
ーRNAは、遺伝子産生物がタンパク質である場合、前述
の遺伝子産生物に翻訳される。
「翻訳開始シグナル」は、タンパク質合成の開始を特
定する核酸の中の３つのヌクレオチド（コドン）のユニ
ットを意味する。
用語「プラスミド」は、ここで使用するとき、細胞の
中央の代謝の一部分でなく、通常円形の二本鎖のDNA分
子の形態である、遺伝子をしばしば有する余分の染色体
の要素を意味する。
用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、二本鎖DNA内の
特定のヌクレオチド配列内で結合および培養する酵素を
意味する。
用語「Ｔ−DNA」は、土のバクテリアのアグロバクテ
リウム（Agrobacterium）からその植物の宿主のゲノム
へ転移されたプラスミドからのDNAのセグメントであ
る。
本発明を通じて使用するDNAの組み換え技術は、当業
者に知られており、そして一般にマニアチス（Maniati
s）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・ハーバ
ー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、1982、に
記載されている。
物質および一般的方法 制限エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、DNAリガ
ーゼおよび他のDNA修飾酵素は、次の会社から購入し
た：ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda
Research Laboratoies）、マリイランド州20877ガイサ
ーバーグ；ニュー・イングランド・バイオラブス（New
England Biolabs）、マサチュセッツ州01915ベバリ
ー；およびベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ス（Boehringer Mannheim Biochemicals）、インジア
ナ州46250 培地 ストレプトミセス属（Streptomyces）培養物の成長培
地は、YEMEブロス、胞子形成ブロス、トリプチカーゼダ
イズブロスおよび最小培地である。
YEMEブロスは、１リットルの水の中に溶解した340gの
スクロース、3.0gの酵母エキス（Difco）、5.0gのペプ
トン（Difco）、3.0gの麦芽エキスブロス（Oxoid）およ
び10gのグルコースから成る。
胞子形成ブロスは、１リットルの水の中に溶解した1.
0gの酵母エキス（Difco）、1.0gのビーフエキス（Difc
o）、2.0gのトリプトース（Difco）、10gのグルコース
およびほぼ1mgのFeSO4から成る。
トリプチカーゼダイズブロスは、17.0gのカゼインの
膵臓消化物、ダイズ粉末の3.0gのパパイン消化物、5.0g
のNaCl、5.0gのK2HPO4、および2.5gのグルコース／リッ
トルの水から成る。
最小培地は、0.5gのK2HPO4、0.6gのＬ−アスパラギ
ン、0.3gのKOH、0.4gのMgSO4・7H2O、0.1gのFeSO4・7H2
O、3.07gのグリセロール／リットルのH2Oから成る。固
体培地を作るために、15gの寒天を培地の１リットル当
たりに添加する。
ストレプトミセス（Streptomyces）属の培養 ストレプトミセス（Streptomyces）属の培養は、胞子
形成、YEMEまたはトリプチカーゼダイズブロスの中で30
℃において震盪しながら150〜300rpmで軌道震盪機によ
り成長させる。
バクテリア細胞の収穫 バクテリア細胞は、それらを6,000〜12,000×ｇおよ
び４℃において10〜20分間遠心することによって収穫す
る。細胞を0.1モルのPIPES緩衝液pH7.0または0.1モルの
MOPS pH7.2の中で洗浄し、そしてそれらを再び6,000〜1
2,000×ｇおよび４℃において10〜20分間遠心すること
によって集める。
細胞抽出物 収穫した細胞を１〜３セル体積の0.1モルのPIPES緩衝
液pH6.8〜7.0の中に再懸濁し、そしてフレンチ（Frenc
h）圧力セル（20,000psi）によりそれらを崩壊すること
によって、ストレプトミセス（Streptomyces）属からの
細胞抽出物を得る。マイクロフーグ中で10,000〜12,000
×ｇおよび４℃において10〜20分間遠心することによっ
て、細胞の破片を除去する。各抽出物のタンパク質濃度
は、ブラッドフォード（Bradford）［アナリティカル・
バイオケミストリー（Anal.Biochem.）72:247−254（19
76）］。
ウェスタン・ブロット分析 タンパク質のウェスタン・ブロット分析は、タンパク
質をSDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動［ラエムリ
（Laemmli）、ネイチャー（Nature）227:680、1970、こ
こに引用によって加える］によりタンパク質を分離し、
次いで、トウビン（Towbin）ら、プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、76:4350−4354（1979）
およびバイオ−ラド（Bio−Rad）の社報885 85−0335
［バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Bio−Rad Laborato
ries）、カリフォルニア州94804リッチモンド］、各々
をここに引用によって加える、に記載されているよう
に、タンパク質をニトロセルロースのフィルターの移し
そして題のタンパク質をそのタンパク質に対して特異的
な抗体で検出することによって実施する。チトクロムP4
50SU1に対する抗血清は、オ’キーフェ（O'Keefe）ら、
植物化学における最近の進歩（Recent Advances in
Phytochemistry）21:151−173（1987）、ここに引用に
よって加える、に記載されているものであった。チトク
ロムP450SU2に対する抗血清はチトクロムP450SU1につい
てのように調製したが、ただしチトクロムP450SU2はチ
トクロムP450SU1をつくらない突然変異である、ストレ
プトミセス・グリセオルス（S.griseolus）PH2042から
分離した。
除草剤化合物のHPLC分析 除草剤およびそれらの代謝物は、ロウムサー（Romess
er）ら、BBRC 140:650−659（1986）、ここに引用によ
って加える、に記載されているようにHPLCにより測定
し、ただし0.1％のH3PO4を両者の溶媒の中に使用する。
除草剤およびそれらの生ずる代謝物のクロマトグラフィ
ーの同定および定量は、それらを真性標準化合物とクロ
マトグラフィー的に比較することによって決定する。生
ずる代謝物の同定は、また、紫外線分光学により確証さ
れる。
P450SU1をもたないストレプトミセス・グリセオルス
（S.griseolus）突然変異の分離 チトクロムP450SU1を作らないが、チトクロムP450SU2
を事実作るストレプトミセス・グリセオルス（S.griseo
lus）の突然変異は、ストレプトミセス・グリセオルス
（S.griseolus）ATCC11796の胞子を2mg/mlのニトロソグ
アニジンで室温において処理することによって分離し
た。突然変異誘発した胞子を希釈し、そして富んだ培地
上にプレンディングし、そして成熟コロニーが形成して
しまうまで、30℃においてインキュベーションした。次
いで、これらのプレートからの単一のコロニーを最小培
地上に寄せ集めた。コロニーを数日間インキュベーショ
ンし、次いで、20mg/mlの蛍光性スルホニル尿素10016を
含有する柔らかい寒天のオーバーレイを植物の上に注
ぎ、次いでさらに30℃においてインキュベーションし
た。次いで、プレートを短い波長の紫外線の下で見た。
スルホニル尿素を代謝した大部分のコロニーの回りに、
大きい非蛍光性のゾーンが観察された。10016を代謝す
る能力が減少した（すなわち、より小さい蛍光性ゾーン
が観察された）コロニーは、潜在的な突然変異であると
考えた。ある数のこのようなコロニーを分離し、そして
チトクロムP450SU2を作るが、チトクロムP450SU1を作ら
ないことが発見された。これらの突然変異、ストレプト
ミセス・グリセオルス（S.griseolus）PH2001、PH2003
およびPH2042を下に記載する実施例において使用した。
これらの突然変異は同様な性質を有する。
アミノ酸配列 チトクロムP450SU1およびP450SU2を、オ’キーフェ
（O'Keefe）ら、Arch.Microbiol.149:406−412（198
8）、ここに引用によって加える、に記載されている方
法を使用して精製した。精製した自然チトクロムP450SU
1およびP450SU2をヨード酢酸と反応させて、各タンパク
質のカルボキシメチル誘導体を生成し、引き続いて各誘
導体を当業者によく知られている方法に従いアミノ酸分
析および自動化エドマン（Edman）減成アミノ酸配列決
定した［タンパク質のマイクロ特性決定の方法（Method
s of Protein Microcharacterization）（1986）、
ヒュマナ・プレス・インコーポレーテッド（Humana Pr
ess,Inc.）、ニュージャージイ州クリフトン、J.E.シベ
リイ（Shively）編、ここに引用によって加える］。２
つの鉄硫黄タンパク質、FeS−ＡおよびFeS−Ｂは、チト
クロムP450SU1またはP450SU2およびホウレンソウのフェ
ロドキシン:NADPオキシドリダクターゼ（商業的に入手
可能）の存在下にチトクロムP450酵素活性の再構成にお
いて使用することができ、チトクロムP450SU1およびP45
0SU2の精製に使用したスルホニル尿素誘導ストレプトミ
セス・グリセオルス（S.griseolus）細胞の同一抽出物
から精製した。鉄硫黄タンパク質をP450の精製に使用し
たアニオン交換カラムからの単一のピークとして集め
［オ’キーフェ（O'Keefe）ら、Arch.Microbiol.149:40
6−412（1988）、ここに引用によって加える］、そして
460nmおよび420nmの両者においてほぼ等しい吸収を有す
るそれらのスペクトルの性質により検出した。このよう
にして分離した鉄−硫黄タンパク質を引き続いて限外濾
過により濃縮した。酸不安定な鉄および硫黄のイオンの
決定は、タンパク質が鉄−硫黄タンパク質であることを
確証した。鉄硫黄タンパク質のカルボキシメチル化およ
び逆相クロマトグラフィーは、鉄硫黄タンパク質の調製
物をFeS−ＡおよびFeS−Ｂと表示する２つの別々のアポ
タンパク質に分割し、FeS−ＡおよびFeS−Ｂは当業者に
よく知られている方法に従いアミノ酸分析および自動化
エドマン（Edman）減成アミノ酸配列決定した［タンパ
ク質のマイクロ特性決定の方法（Methods of Protein
Microcharacterization）（1986）、ヒュマナ・プレ
ス・インコーポレーテッド（Humana Press,Inc.）、ニ
ュージャージイ州クリフトン、J.E.シベリイ（Shivel
y）編、ここに引用によって加える］。P450SU1、P450SU
2、FeS−ＡおよびFeS−Ｂのアミノ末端のアミノ酸配列
およびアミノ酸組成を下に示す。
P450SU1のアミノ末端のアミノ酸配列 P450SU2のアミノ末端のアミノ酸配列 FeS−Ａのアミノ末端のアミノ酸配列 FeS−Ｂのアミノ末端のアミノ酸配列 チトクロムP450SU1、P450SU2、FeS−ＡおよびFeS−Ｂの
アミノ酸組成 ストレプトミセス・グリセオルス（Streptomyces gris
eolus）ATCC11796からのチトクロムP450SU1、チトクロ
ムP450SU2、FeS−ＡおよびFeS−Ｂのための遺伝子のク
ローニング チトクロムP450SU1のための遺伝子をエンコードするD
NAをストレプトミセス・グリセオルス（S.griseolus）D
NAからクローニングした。DNAの適切な配列を含有する
バクテリオファージは、まずSU1タンパク質を発現する
形質転換されたE.coliのクローンを同定することによっ
て得た。これはオ’キーフェ（O'Keefe）ら、植物化学
における最近進歩（Recnt Advances in Phytochemis
try）21:151−173（1987）に記載されているようにチト
クロムP450SU1に対して特異的な抗体を使用して、当業
者によく知られている方法により実施した［ヤング（Yo
ung）や、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA、80:1194−1198（1983）およびヤング（Youn
g）ら、サイエンス（Science）222:778−782（1983）、
それらの各々をここに引用によって加える］。制限エン
ドヌクレアーゼ地図［マニアチス（Maniatis）ら、分子
クローニング：実験室のマニュアル（Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・
ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、
コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harb
or）、ニューヨーク］を分離したストレプトミセス・グ
リセオルス（S.griseolus）DNAから作り、そしてそれら
は2.4kbのBamH I制限エンドヌクレアーゼ断片は完全な
チトクロムP450SU1の解読配列を含有するであろうこと
を示す。この2.4kbの制限エンドヌクレアーゼ断片をス
トレプトミセス・グリセオルス（S.griseolus）DNAから
プラスミドpSU18の中に、当業者によく知られている方
法に従いクローニングして［マニアチス（Maniatis）
ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・スプ
リング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pr
ess）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Sprin
g Harbor）、ニューヨーク；フリシャウフ（Frischau
f）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー（J.Mol.Biol.）170:827−842（1983）、それらの各
々をここに引用によって加える］プラスミドpUC18−SU1
−BamH Iを作った。下に示す引き続くDNA配列の分析
は、FeS−Ｂタンパク質のための解読配列が、また、こ
の2.4kbのBamH I断片上にエンコードされ、SU1のための
配列からちょうど下流に存在する。プラスミドpUC18−S
U1−BamH Iはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（the American Type Culture Collection）
に受託され、そしてATCC受け入れ番号67780を有する。p
UC18−SU1−BamH Iの制限エンドヌクレアーゼ地図を第
１図に示す。
チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂをエンコードする2.
4kbのBamH I断片に交差ハイブリダイゼーションしそし
てチトクロムP450SU2およびFeS−Ａをエンコードする、
2.0kbのBamH I制限エンドヌクレアーゼDNA断片を、スト
レプトミセス・グリセオルス（S.griseolus）PH2001か
ら得、そして当業者によく知られている方法によりクロ
ーニングした［マニアチス（Maniatis）ら、分子クロー
ニング：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A
Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバ
ー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コール
ド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、
ニューヨーク］。2.0kbのBamH I断片は、DNAのDNA配列
の分析により決定して、チトクロムP450SU2およびFeS−
Ａの両者をエンコードすることが示された。2.0kbのBam
H IのDNA断片をE.coliの中でプラスミドpUC19の中にサ
ブクローニングし、そしてアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（the American Type Culture
Collection）に受託され、そしてATCC受け入れ番号6778
1を有する。pUC19−SU2−８の制限エンドヌクレアーゼ
地図を第４図に示す。
チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂタンパク質の遺伝子の
DNA配列 さらに制限エンドヌクレアーゼ地図により、pUC18−S
U1−BamH Iの中の2.4kbのBamH I断片から誘導されたDNA
の2.0kbのSac I−BamH I断片は、チトクロムP450SU1お
よびFeS−Ｂタンパク質のための完全なDNA解読配列を含
有することが決定された。2.0kbの断片がチトクロムP45
0SU1およびFeS−Ｂタンパク質のための完全なDNA解読配
列を含有するということは、その断片のDNA配列により
エンコードされるすべての可能なタンパク質を、上に示
すように、P450SU1の分子量、アミノ酸組成、およびＮ
−末端のアミノ酸配列およびFeS−ＢのＮ−末端のアミ
ノ酸配列のアミノ酸組成を比較することによって決定し
た。2.0kbのSac I−BamH I断片のDNA配列は、当業者に
よく知られている方法［メッシング（Messing）、メソ
ッズ・イン・エンジモロジー（Methods in Enzymolog
y）101:20−78（1983）、ここに引用によって加える］
に従いBamH I部位を通してSac I部位の約100bp下流から
決定し、そして下に示すように、チトクロムP450SU1お
よびFeS−Ｂの解読配列をもち、これは示した塩基番号1
28で開始しそして塩基番号1578で終わる。
チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂのための解読配列を
含有するDNAのDNA配列 チトクロムP450SU2およびFeS−Ａタンパク質の遺伝子の
DNA配列 チトクロムP450SU2および鉄硫黄タンパク質FeS−Ａの
遺伝子を含有するpUC19−SU2−８で形質転換したストレ
プトミセス・グリセオルス（S.griseolus）分離分離し
た2.0kbのBamH I断片のDNA配列を、当業者によく知られ
ておりそしてメッシング（Messing）、メソッズ・イン
・エンジモロジー（Methods in Enzymology）101:20
−78（1983）に記憶されている方法により決定した。2.
0kbのBamH IのDNA断片がチトクロムP450SU2およびFeS−
Ａをエンコードするということは、DNA配列によりエン
コードされるすべての可能なタンパク質を、P450SU2の
既知の大きさ、アミノ酸組成、およびアミノ末端のアミ
ノ酸配列およびFeS−Ａの既知のアミノ酸組成およびア
ミノ末端のアミノ酸配列と比較することによって決定し
た。この断片のDNA配列は次のように示され、そして塩
基番号195で開始しそして塩基番号1646で終わる、チト
クロムP450SU2およびFeS−Ａのための解読配列の位置を
示す。
チトクロムP450SU2およびFeS−Ａのための解読配列配
列を含有する2.0kbのBamH I DNA断片のDNA配列 他の有機体の中のチトクロムP450SU1の構成的発現のた
めのプラスミド 他の有機体を形質転換してP450SU1単独およびP450SU1
およびFeS−Ｂを一緒に発現するために使用するプラス
ミドは、次のようにして作ることができる。２つの遺伝
子（すなわち、DNA配列）の発現は、ストレプトミセス
・グリセオルス（S.griseolus）からの遺伝子のプロモ
ーターおよび転写シグナルによるか、あるいは形質転換
すべき有機体の中の外因性解読配列の構成的発現を可能
とするプラスミドの１または２以上のプロモーターおよ
び翻訳シグナルにより推進することができる。ここにお
ける実施例により例示する他の有機体は、ストレプトミ
セス・リビダンス（S.lividans）において、ストレプト
ミセス・グリセオルス（S.griseolus）におけるそれら
の調節した発現と反対に、これらのプロモーターからの
遺伝子の非調節発現は、多分、ストレプトミセス・グリ
セオルス（S.griseolus）の中のチトクロムP450SU1およ
びFeS−Ｂの発現を通常調節する他の有機体の中に調節
因子（遺伝子）が存在しないためである。
pCAO400 チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂの両者の遺伝子を含
有するpUC18−SU1−BamH Iからの2.4kbのBamH I断片
を、pCAO170［オウマー（Omer）ら、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー（J.Bactriology）170:2174−2184
（1988）］の独特BamH I部位の中に、マニアチス（Mani
atis）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual）、コールド
・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harb
or Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold
Spring Harbor）、ニューヨーク、pp.390−400に記
載されている方法を使用して挿入することによって、こ
のプラスミドを作った。E.coli CE170の中のプラスミ
ドpCAO170は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（the American Type Culture Collectio
n）に受託され、そしてATCC受け入れ番号68085を有す
る。生ずるプラスミドをpCAO400と呼ぶ。
pCAO401 チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂの両者の遺伝子を含
有するpUC18−SU1−BamH Iからの2.0kbのBamH I−Sac I
断片を、BamH IおよびSac I制限エンドヌクレアーゼで
消化したpCAO170の中に、マニアチス（Maniatis）ら、
分子クローニング：実験室のマニュアル（Molecular C
loning:A Laboratory Manual）、コールド・スプリン
グ・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pres
s）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring
Harbor）、ニューヨーク、に記載されている方法を使
用して挿入することによって、このプラスミドを作っ
た。生ずるプラスミドをpCAO401と呼ぶ。
pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９ pCAO170［オウマー（Omer）ら、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（J.Bactriology）170:2174−2184（1
988）］から作ることができるpCAO200を2.5kbのBamH I
断片の受容体としてpCAO170の代わりに使用した以外、
このプラスミドは上のpCAO400の方法と同様な方法で作
った。
pCAO200SU1＃12 このプラスミドは、2.4kbのBamH I DNA断片からの完
全なFeS−Ｂタンパク質の解読配列を欠失することによ
って作った。欠失は記載するように作った［ヘニコッフ
（Henikoff）、遺伝子（Gene）、28:351−359（198
4）；メッシング（Messing）、メソッズ・イン・エンジ
モロジー（Methods in Enzymology）101:20−78（198
3）］。生ずる1.8kbのDNA断片は、SU1の上流の配列、完
全なチトクロムP450SU1解読配列、およびSU1の6bpの下
流をなお含有する。それをpUC118−SU−1.8と表示す
る。BamH I部位を含有するリンカーをP450SU1の解読領
域の下流のHind III部位に挿入し、そして生ずる断片を
pSU118の中に挿入してpSU118−SU1−1.8（Ｂ）を作っ
た。1.8kbのBamH I DNA断片をpSU118−SU1−1.8（Ｂ）
から分離し、そして当業者によく知られている方法によ
りpCAO200no BamH I部位の中に挿入した［マニアチス
（Maniatis）ら、分子クローニング：実験室のマニュア
ル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring
Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー
（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク、pp.390−40
0］の中に挿入してプラスミドpCAO200SU1＃12を作っ
た。
他の有機体の中のチトクロムP450SU2の構成的発現のた
めのプラスミド チトクロムP450SU2およびFeS−Ａのための遺伝子をス
トレプトミセス・リビダンス（S.lividans）の中に導入
するためのプラスミドは、次のようにして構成すること
ができる。チトクロムP450SU2およびFeS−Ａのための遺
伝子を含有するpUC19−SU2−８からの2.0kbのBamH I断
片は、この分野において知られている方法により、pCAO
200のBamH I部位の中にクローニングしてpCAO200SU2−F
eS−Ａ＃11を作ることができる［マニアチス（Maniati
s）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・
スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor
Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold S
pring Harbor）、ニューヨーク、pp.390−400］。この
断片は、また、他のベクターの中にクローニングするこ
とができる。
５つのプラスミド、pCAO400、pCAO401（第3A図および
第3B図）、pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９、pCAO200SU1＃12
（第4A図および第4B図）、およびpCAOSU2−FeS−Ａ（第
８図）を、ホップウッド（Hopwood）ら、ストレプトミ
セス属の遺伝子操作（Genetic Manipulation of Str
eptomyces）に記載されているように、ストレプトミセ
ス・リビダンス（S.lividans）JI1326の中に導入した。
実験室のマニュアル（Laboratory Manual）、ジョン・
インンス・ファンデイション（John Innes Foundatio
n）、英国ノルウィッチ。ストレプトミセス・リビダン
ス（S.lividans）JI1326は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（the American Type Culture
Collection）に受託され、そしてATCC受け入れ番号53
939を有する。プラスミド上にエンコードされるチオス
トレプトン抵抗性について形質転換体を選択した。これ
らのプラスミドは、SPL1プラスミドに基づき、ストレプ
トミセス・リビダンス（S.lividans）染色体の中の独特
位置の中に部位特異的に組み込み、そして１〜２コピー
／染色体の中に存在する［オウマー（Omer）ら、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bactriology）170:2
174−2184（1988）］。
ストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）は前述
のプラスミド（pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９、pCAO200SU2
−FeS−Ａ＃11、pCAO400およびpCAO401を包含する）に
より３親接合することができるが、これらのSLP1誘導プ
ラスミドの宿主範囲は制限される［キーゼル（Kiesel）
ら、1982、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Mol.Gen.Genet.）185:223−238］。広い宿
主範囲のプラスミド、例えば、プラスミドSCP2またはpI
J101から誘導されたプラスミドを使用して、他のストレ
プトミセス属（Streptomyces）種の中にこれらの遺伝子
を導入しそして遺伝子を発現することができる［リディ
エイト（Lydiate）ら、1985、遺伝子（Gene）35:223−2
35、キーゼル（Kiesel）ら、1982、モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Genet.）
185:223−238、ワード（Ward）ら、1986、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Ge
net.）203:468−478］。P450SU1およびFeS−Ｂのための
遺伝子を含有するpUC18−SU1−BamH Iからの2.4kgのBam
H I DNA断片を、当業者によく知られている方法によ
り、pIJ922のBamH I部位の中にクローニングして［マニ
アチス（Maniatis）ら、1982、分子クローニングに対す
るガイド：実験室のマニュアル（Ａ Guide Molecular
Cloning:A Laboratory Manual）］してpPAT108を作
ることができる（第16A図）。pUC19−SU2−８からの2.0
kbのBamH I DNA断片は、当業者によく知られている方
法により、pIJ425のBgl II部位の中にクローニングして
［マニアチス（Maniatis）ら、1982、分子クローニング
に対するガイド：実験室のマニュアル（Ａ Guide Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual）］してpCS32
5を作ることができる（第16B図）。プラスミドpPAT108
およびpCS325を種々のストレプトミセス（Streptomyce
s）属の種の中に形質転換することができ、そして形質
転換された株が除草剤化合物を構成的に代謝できるよう
にするであろう。
植物の形質転換のためのP450SU1を使用するプラスミド
の操作 植物の中の転写および翻訳のために、追加の配列をチ
トクロムP450SU1解読配列からなるDNA断片の５′末端お
よび３′末端に付加しなくてならならい。これはＡ）酵
素P450SU1をエンコードする2.4kbのBamH I断片のDNA断
片、酵素P450SU1をエンコードする2.0kbのSac I−BamH
I断片のDNA断片、酵素P450SU1をエンコードする1.8kbの
BamH I断片のDNA断片、またはストレプトミセス・グリ
セオルス（S.griseolus）突然変異PH2001から分離したP
450SU2をエンコードするする2.0kbのBamH I断片、Ｂ）
前記断片に操作可能に（operably）連鎖した、上流の植
物プロモーターのDNA配列、Ｃ）前記に操作可能に連鎖
した、上流のリボソーム結合部位を包含する５′−未翻
訳配列、Ｄ）プラスミドから転写されたmRNAをその３′
末端上でポリアデニル化可能とする、３′−未翻訳配列
の前記断片に操作可能に連鎖した、下流のDNAからなる
組み換えプラスミドを生ずる。
これは次の文献に記載されている標準の遺伝子工学技
術を使用して実施することができる：マニアチス（Mani
atis）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual）、コールド
・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harb
or Press）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold
Spring Harbor）、ニューヨーク、およびクンケル
（Kunkel）、T.A.ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.
Acad.Sci.）USA、82:488−492（1985）。
P450SU1遺伝子産生物をエンコードするDNA断片源は、
2.4kbのBamH I DNAまたはpUC18−SU1−BamH Iからの2.
0kbのBamH I−Sac IのDNA断片を包含する。P450SU2遺伝
子産生物をエンコードするDNA断片源は、ストレプトミ
セス・グリセオルス（S.griseolus）突然変異PH2001か
ら分離したpUC19−SU2−８の中の2.0kbのBamH I断片で
ある。P450SU1遺伝子産生物をエンコードする配列から
なるDNAの好ましい源は、pUC18−SU1−BamH Iからの2.4
kbのBamH I DNA断片である。同様なチトクロムP450遺
伝子のための別の源は、pUC19−SU2−８の中の2.0kbのB
amH I断面上にを含有されるP450SU2遺伝子であろう。
P450SU1解読配列へのプロモーターおよび５′−未翻訳
配列の付加 リポソーム結合部位を包含する植物のプロモーターお
よび５′−未翻訳配列を、チトクロムP450SU1をエンコ
ードするDNAの上流に付加して、植物の中のP450SU1遺伝
子の転写および翻訳を可能としなくてはならない。この
目的を満足するプロモーターおよび５′−未翻訳配列の
例は、次の通りである：カリフラワーのモザイク病ウイ
ルス（CaMV）からの35Sプロモーター［ハーブスター（H
arpster）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジ
ェネティックス（Mol.Gen.Genet.）212:182−190（198
8）、ペチュニアからの光誘導および組織特異的SSU301
遺伝子［ディーン（Dean）ら、モレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Genet.）206:
465−474（1987）］、ペチュニアからの光誘導および組
織特異的Cab22L遺伝子［ヅンスムイル（Dunsmuir）、核
酸の研究（Nucleic Acids Res.）13:2503−2518（198
5）およびハーブスター（Harpster）ら、モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Ge
net.）212:182−190（1988）］、およびコムギからの化
学的に誘導可能なアブシン酸調節したEmプロモーター
［マルコッテ（Marcotte）ら、植物細胞（The Plant
Cell）1:969−976（1989）］。植物遺伝子からの他のプ
ロモーターおよび５′−未翻訳配列を、また、使用する
ことができる。
P450SU1解読配列への３′−未翻訳配列の付加 配列をチトクロムP450SU1をエンコードするDNAの下流
に付加して、ベクターから転写した′をその３′末端上
でポリアデニル化することができるようにしなくてはな
らない。このようなDNAの好ましい源はペチュニアから
のSSU301遺伝子からである［ディーン（Dean）ら、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mo
l.Gen.Genet.）206:465−474（1987）］。これは、SSU3
01をP450SU1解読配列と一緒に同時転写するとき、mRNA
転写をエンコードするP450SU1上にポリＡ付加を提供す
る。他の植物遺伝子をこれらの3mRNA−未翻訳配列源と
して使用することができる。
植物細胞の葉緑体の中へのチトクロムP450SU1の輸送を
促進することができるペプチドをエンコードする配列の
チトクロムP450SU1解読配列への付加 植物のプロモーター、植物の５′−未翻訳配列、P450
SU1解読配列、および植物の３′−未翻訳配列から成る
プラスミドは、植物細胞の細胞質の中でチトクロムP450
SU1を発現するであろう。細胞質の代わりに葉緑体の中
でP450SU1を局在化すると、除草剤のよりすぐれた代謝
を得ることができる。なぜなら、電子と細胞質の中に存
在しないことがあるP450SU1へ電子を供給することがで
きる鉄硫黄タンパク質た存在するからである。植物の葉
緑体の中でチトクロムP450SU1タンパク質を発現するた
めに、構成は、前述の成分に加えて、チトクロムP450SU
1配列に融合してそのタンパク質を葉緑体の中に向ける
トランシットペプチドをエンコードする配列を必要とす
る。このような配列は通常植物の葉緑体の中に移入され
るタンパク質をエンコードする核遺伝子の、トランシッ
トペプチド配列の解読領域、またはトランシットペプチ
ド配列の解読領域＋成熟ポリペプチドの解読領域を使用
して操作することができる。これらの融合のための配列
のすぐれた源はリブロースビスホスフェートカルボキシ
ラーゼ（SSU）［ディーン（Dean）ら、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Gene
t.）206:465−474（1987）］およびクロロフィルa/b結
合性タンパク質［ヅンスムイル（Dunsmuir）、核酸の研
究（Nucleic Acids Res.）13:2503−2518（1985）］
両者ともペチュニアから、である。他の源は同様であ
り、葉緑体の中に輸送されるタンパク質をエンコードす
る他の植物からの核エンコーデッド遺伝子であろう。葉
緑体の中に輸送されるとき通常除去されるアミノ末端の
アミノ酸配列のみを付加する融合および通常除去された
ペプチド配列および成熟した輸送されたタンパク質の少
なくとも27までのアミノ酸を含有する融合は、機能的P4
50SU1タンパク質の発現を防止しないで、プロモーター
およびリボソーム結合部位から下流に、チトクロムP450
SU1のアミノ末端上に付加することができる。
この技術は、葉緑体のフェレドキシンが還元剤として
作用する任意の可溶性チトクロムP450酵素を植物の中に
導入するために有効であろう。
植物の形質転換のためのP450SU1およびFeS−Ｂをもつプ
ラスミドの操作 葉緑体のフェレドキシンはチトクロムP450SU1の還元
剤源であるが、別の源はP450SU1のための自然の還元剤
であるストレプトミセス・グリセオルス（S.griseolu
s）からのFeS−Ｂタンパク質である。こうして、植物細
胞の中への導入のとき、チトクロムP450SU1およびFeS−
Ｂの両者の発現を指令することができるプラスミドは有
用である。植物細胞の中で両者のタンパク質を発現する
ために、チトクロムP450SU1の発現に使用したものに類
似する修飾を、また、同一のプラスミドに実施してFeS
−Ｂタンパク質を発現することができる。このようなタ
ンパク質は、植物細胞の細胞質または葉緑体似向けるこ
とができる。
細胞質の中で発現を生ずるこのような組み換えプラス
ミドは、Ａ）チトクロムP450をエンコードするDNAまた
はチトクロムP450をエンコードするDNAおよびFeSタンパ
ク質をエンコードするDNA、Ｂ）前記エンコーディング
に操作可能に連鎖した、上流の植物プラスミドのDNA源
の１または２以上のセグメント、Ｃ）前記エンコーディ
ングに操作可能に連鎖した、上流のリボソーム結合部位
を包含する１または２以上の５′−未翻訳配列、および
Ｄ）プラスミドから転写されたmRNAをその３′末端上で
ポリアデニル化可能とする３′−未翻訳配列の、前記エ
ンコーディングに操作可能に連鎖した、下流の１または
２以上のDNA配列からなる。
あるいは、タンパク質を葉緑体にターゲッティングす
るプラスミドは、Ａ）チトクロムP450をエンコードする
DNAまたはチトクロムP450をエンコードするDNAおよびFe
Sタンパク質をエンコードするDNA、Ｂ）前記エンコーデ
ィングに操作可能に連鎖した、上流位置の植物プラスミ
ドのDNA源の１または２以上のセグメント、Ｃ）前記エ
ンコーディングに操作可能に連鎖した、上流位置のリボ
ソーム結合部位を包含する１または２以上の５′−未翻
訳配列、Ｄ）プラスミドから転写されたmRNAをその３′
末端上でポリアデニル化可能とする３′−未翻訳配列
の、前記エンコーディングに操作可能に連鎖した、下流
位置の１または２以上のDNA配列、およびＥ）１または
２以上のトランシットペプチド切断部位またはトランシ
ットペプチド解読配列およびさらに植物の葉緑体の中に
通常移入されるタンパク質をエンコードし、チトクロム
P450のアミノ末端をエンコードするDNAに、チトクロムP
450およびFeSタンパク質のアミノ末端をエンコードする
DNAに操作可能に連鎖し、プロモーターおよびリボソー
ム結合部位から下流の、核遺伝子の成熟解読配列からな
る。
植物細胞の細胞質および葉緑体の中のFeS−Ｂと一緒
にチトクロムP450SU1の発現に好ましいプラスミドは、
実施例19に記載する。植物遺伝子からのプロモーターを
もつ、チトクロムP450SU1、P450SU2、FeS−ＡまたはFeS
−Ｂを含有するDNAは、これらのDNAのアグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）から植物への転移を仲介するＴ−D
NAプラスミドの中にサブクローニングすることができる
［R.T.フラレイ（Fraley）ら、プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.）USA、80:4803−4807（1983）;H.ク
レー（Klee）ら、Annual Rev.Plant.Pyhsiol.38:476−
486（1987）およびその中の参照文献］。このサブクロ
ーニングは当業者によく知られている方法により実施す
ることができる［T.マニアチス（Maniatis）ら、分子ク
ローニング：実験室のマニュアル（Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・
ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、
コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harb
or）、ニューヨーク州（1982）およびT.A.クンケル（Ku
nkel）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）U
SA、82:488−492（1985）］。いくつかの異なるＴ−DNA
プラスミドをここに記載する実施例において使用した
が、pAGS502は独特Hind III、BamH IおよびEcoR I部位
をＴ−DNA領域の中に含有するので、それを実施例のす
べてについて使用した。他のＴ−DNAプラスミドは、適
当制限部位（すなわち、Hind III、BamH I、EcoR I）が
植物細胞の中に代謝されるプラスミドの領域の中に存在
するかぎり、また使用することができる。あるいは、Ｔ
−DNAプラスミドの中に挿入すべきDNA断片上の転写部位
を変化させるて［T.A.クンケル（Kunkel）、プロシーデ
ィングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、82:488−492（1
985）］Ｔ−DNAプラスミドの中のほとんどの任意の制限
エンドヌクレアーゼ部位の中への挿入を可能とすること
ができる。
プラスミドはアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）、例えば、アガロバクテリウム・ツメファシエンス
（A.tumefaciens）株LBA4404［ヘケマ（hoekema）ら、
ネイチャー（Nature）303:179−180、1983］中に、トリ
−ペアレントの交配［ルブキン（Ruvkin）およびアウス
ベル（Ausubel）、ネイチャー（Nature）289:85−88、1
981］または凍結−融解法［Plant Molec.Biol.Mnual、
S.B.ゲルビン（Gelvin）およびR.A.シルペルート（Schi
lperoot）編、A3:1−19、1988］を使用して代謝する。
次いで、生ずるアグロバクテリウム（Agrobacterium）
株を、バン・デル・エルゼン（van der Elzen）ら、
プラント・モレキュラー・バイオロジー（Plant Mol.B
iol.）5:149−154（1985）に記載されているよう原形質
体またはホルシュ（Hrsch）ら、サイエンス（Science）
227:1229−1231（1985）に記載されているように、ニコ
チアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）cv.Wisconsin
38および選択したカナマイシン抵抗性形質転換体の葉
のディスクと同時培養する。カナマイシン抵抗性の形質
転換されたタバコ植物を形質転換された原形質体または
葉のディスクから再生し、そして植物を花成させる。自
家受粉後、核植物から種子を得る。
ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）以外
の、園芸学および耕種学的利用の植物、例えば、野菜ま
たは他の作物を包含する植物を当業者に知られている方
法で形質転換することができる［ガッサー（Gasser）お
よびフラレイ（Fraley）、サイエンス（Science）244:1
293−1299（1989）］。DNAのアガロバクテリウム（Agro
bacterium）仲介Ｔ−DNA転移を使用して、プラスミドpS
U18、pSSU−SU111、pSSU−SU121、pCab−SU111、pCab−
SU121、pCab−SU131、pSUFe11、pSUFe21、pSUFe31およ
びpSUFe41は植物種の中に代謝することができ、このよ
うな植物種は、次のものを包含するが、これらに限定さ
れない：リコペルシコン・エスクレンツム（Lycopersic
on esculentum）（トマト）［ムコーミック（McCormic
k）ら、プラント・セル・リポーツ（Plant Cell Re
p.）］、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）［プア
（Pua）ら、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）
5:815−817（1987）］、ゴッシピウム・ヒルスツム（Go
syypium hirsutum）（ワタ）［ウンベック（Umbeck）
ら、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）5:263−2
66（1987）］、グリシン・マックス（Glysine max）
（ダイズ）［ヘンチェー（Hinchee）ら、バイオ／テク
ノロジー（Bio/Technology）6:915−921（1988）］、お
よびアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thalian
a）［バルベケンス（Valvekens）ら、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA85:5536−5540（198
8）］。プラスミドpSU18、pSSU−SU111、pSSU−SU121、
pCab−SU111、pCab−SU121、pCab−SU131、pSUFe11、pS
UFe21、pSUFe31およびpSUFe41は、イネ［オリザ・サチ
バ（Oryza sativa）］［トリヤマ（Toriyama）ら、バ
イオ／テクノロジー（Bio/Technology）6:1072−1074
（1988）］およびトウモロコシ［ゼア・マイス（Zea m
ays）L.］［ロウデス（Rhodes）ら、サイエンス（Scien
ce）140:204−207（1988）］について実証されているよ
うに、植物の原形質体の中に形質転換することができ
る。植物の中にプラスミドpSU18、pSSU−SU111、pSSU−
SU121、pCab−SU111、pCab−SU121、pCab−SU131、pSUF
e11、pSUFe21、pSUFe31およびpSUFe41を導入する追加の
別の方法は、「粒子ガン（particle gun）」［クレイ
ン（Klein）ら、ネイチャー（Nature）327:70−73（198
7）］を使用することによる。この方法はニコチアナ・
タバクム（Nicotiana tabacum）、タバコ［クレイン
（Klein）ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、85:8502−8505（1988）］およびグリシン・
マックス（Glysine max）、ダイズ［ムケイブ（McCab
e）ら、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）6:923
−926（1988）］について有効であることが示された
が、必ずしもこれらの種に限定されない。
前述の手順のいずれかによりプラスミドを植物細胞の
中に導入した後、プラスミドまたはこれらのプラスミド
の一部分を細胞の染色体DNAの中に安定に組み込むこと
ができる。植物が単細胞から再生される場合において、
再生された植物のすべての細胞は組み込まれたプラスミ
ドまたはプラスミドの一部分を有することが期待され
る。再生している多細胞内の単細胞を形質転換する場
合、形質転換された細胞から生ずる細胞は、組み込まれ
たプラスミドまたはプラスミドの一部分を有するセクタ
ー（sector）を生成するであろう。いずれの場合におい
ても、プラスミドまたはプラスミドの一部分を有する再
生された植物は一次形質転換体形質転換体と呼ぶ。種に
依存して、一次形質転換体は花成しそして配偶子を産生
し、これらの配偶子は自家受粉または同一種の他の植物
との異系統交により配融合して接合子を形成する。
一次形質転換体の自家受粉または異系統勾配から生ず
る選択は、一次形質転換体の子孫（progeny）である胚
を含有する。子孫植物の一部分は、一次形質転換体の中
に安定に組み込まれたプラスミドまたはプラスミドの一
部分のコピーの数、メンデルの分離、多数のコピーが存
在するプラスミドまたはプラスミドの一部分の間の連鎖
の関係、および組み込まれたプラスミドまたはプラスミ
ドの一部分を有するセクターから配偶子が産生したかど
うかに依存して、プラスミドまたはプラスミドの一部分
のコピーを有する染色体を受け取ることができる。同様
な方式において、これらの子孫は花成しそして、もとの
一次形質転換体の中に組み込まれたプラスミドまたはプ
ラスミドの一部分を有する種子および植物の引き続く世
代を生ずるすることができる。
同様な場合は、内乳から性的手段により形成すると
き、種子の内乳組織に関係する。
ハイブリッド種子の産生のための雄性不稔系 交雑において使用すべき雌の親を発生する植物におい
て雄性不稔を誘導してハイブリッド種子を産生する手段
は、非常に有用であろう。ハイブリッド種子の産生は、
所望の特性を耕種学的に価値ある作物植物の中に導入す
る重要な手段である。例えば、定性的特性、例えば、油
の含量、除草剤抵抗性、病気抵抗性、環境的条件への適
合性などは子孫においてハイブリダイゼーションし、こ
うしてその親の最も望ましい特性をもつ子孫を収穫する
ことができる。さらに、ハイブリッドの交雑からの子孫
は、２つの親の型の組み合わせから生ずる新しい価値、
例えば、雑種強勢として知られている現象から生ずる収
量の増大を有することができる。ハイブリッド種子を産
生するコントロールされた他家受粉は、大部分の作物植
物において起こる対抗する自家受粉のために、商業的に
達成することは困難である。
現在、ハイブリッドの種子の生産は、次の手段の１つ
により実施されている：（ａ）雄の器官を機械的に除去
またはカバーし、次いで雄の不能の植物を交雑に望む特
性を含有する雄の器官をもつ植物に暴露する、（ｂ）交
雑に望む特性を含有する繁殖能力のある雄の器官をもつ
植物の存在下に、遺伝的に雄性不稔の植物を成長させる
か、あるいは（ｃ）雄のか、あるいは選択的に不稔する
化学的ハイブリダイゼーション剤（CHA）で植物を処理
し、次いで雄の不能の植物を交雑に望む特性を含有する
繁殖能力のある雄の器官をもつ植物に暴露する。これら
の方法の各に対するいくつかの欠点は、次のものを包含
する：（ａ）これはわずかの作物、例えば、トウモロコ
シについてのみ可能である；ここで雄および雌の器官は
分離されている；そしてそれは労力を要しそしてコスト
がかる、（ｂ）遺伝子的に雄性不稔の系統は維持が面倒
であり、抵抗性の系統との交雑を必要とする、（ｃ）CH
Aは高度には有効ではない。次の方法は広い範囲の作物
に応用することができ、そして自殖が系統を維持できる
ようにする。
適当な雄器官特異的プロモーターの制御下にチトクロ
ムP450SU1またはSU2解読配列を導入することによって、
植物を雄性不稔誘導に対して受容的とする。生ずるトラ
ンスジェニック植物は、その雄器官においてのみチトク
ロムP450酵素を産生する。このようなトランスジェニッ
ク植物は、通常成長するとき、雄繁殖能性である。P450
を含有する未処理の繁殖能力のある植物は、遺伝的に交
雑させ、そして通常種子の産生により増殖する。しかし
ながら、通常の植物と異なり、これらの植物は、P450酵
素により活性な毒素に転化される無毒の化学物質に暴露
することによって、雄性不稔性とすることができる。雄
の器官の中に存在する毒素は、正常の花粉の発育を崩壊
し、植物を雄性不稔性とする。雄性不稔特性は、必要に
応じて、植物を選択した前毒素と接触することによって
のみ発現される；そうでなければ、トランスジェニック
植物は正常に挙動する。適当な前毒素は、10015および
チトクロムP450酵素により十分に10014に転化される他
の化合物を包含する。
実施例１〜３ pCAO400、pCAO401、pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９およびpCA
O200SU1＃12で形質転換されるストレプトミセス・リビ
ダンス（S.lividans）株の中のチトクロムP450SU1の構
成的発現の実証 ４つのプラスミドpCAO400、pCAO401、pCAO200SU1−Fe
S−Ｂ＃９およびpCAO200SU＃12の任意の１つで形質転換
されたストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）株
の培養物を、胞子形成ブロスまたはYEMEブロスの培地の
中で成長させた。培養物はほぼ24〜36時間30℃において
成長させた。細胞のアリコートをこの時間に取り出し
た。チトクロムP450SU1のスルホニル尿素の誘導を試験
すべき場合、約0.1〜0.15mg/mlの培養物中の最終濃度を
与えるスルホニル尿素10001の溶液を、アリコートの取
り出し後に残る培養物に添加した。記載したように、後
の24時間までの種々の間隔で誘導した培養物から細胞の
アリコートと取り出し、収穫し、そして洗浄する。
チトクロムP450SU1についてのウェスタン・ブロット
分析を、記載したように細胞抽出物について実施した。
実施例１ pCAO400で形質転換したストレプトミセス・リビダン
ス（以後、S.lividans）およびストレプトミセス・リビ
ダンスC37［オウマー（Omer）ら、ジャーナル・オブ・
バクテリオロジー（J.Bacteriology）170:2174−2184
（1988）、ここに引用によって加える］、プラスミドpC
AO106（pCAO400の誘導に使用したプラスミドのpCAO170
から）を含有する、前述の胞子形成ブロスの中の別々の
培養物として成長させた。細胞のアリコートを各培養物
から取り出した後、10001を0.12mg/mlの濃縮で細胞に添
加し、そして細胞の他のアリコートを10001の添加後に2
4時間において取った。ウェスタン・ブロットを細胞の
各アリコートからのほぼ25μｇのタンパク質について実
施し、そして記載したようにチトクロムP450SU1に対し
て抗血清によりチトクロムP450SU1の存在について分析
した。第５図のデータが示すように、ストレプトミセス
・リビダンス（S.lividans）C37（これはチトクロムP45
0SU1の遺伝子を含有しない）は、それが10001で誘導し
たか否かにかかわらず、チトクロムP450SU1を作らなか
った。チトクロムP450SU1は、pCAO400で形質転換された
ストレプトミセス・リビダンス（S.lividans）により、
それが10001で誘導したか否かにかかわらず、作られ
た。
実施例２ pCAO400を含有するS.lividansおよびpCAO401を含有す
るS.lividansを別々に使用して、200mlの胞子形成ブロ
スを接種し、そしてほぼ36時間成長させた。新鮮な胞子
形成ブロス（100ml）を各培養物に添加し、そして30ml
のアリコートを各々から取り出した。この時、36mlの10
001を各培養物に添加し、次いで３、６および24時間に3
0mlのアリコートを取り出した。前述したように、各ア
リコートの中の細胞を遠心により沈澱させ、そしてフレ
ンチ圧力セル中で破壊した。各アリコートからのほぼ25
μｇのタンパク質を、抗P450SU1抗体によるチトクロムP
450SU1についてのウェスタン・ブロット分析において使
用した。第６図の結果が示すように、チトクロムP450SU
1は、1001を添加したか否かにかかわらず、pCAO400を含
有するS.lividansおよびpCAO401を含有するS.lividans
の両者により産生された。
実施例３ pCAO200を含有するS.lividans、pCAO200SU1−FeS−Ｂ
＃９を含有するS.lividansおよびpCAO200SU1＃12を含有
するS.lividansを、別々に400mlのYEMEブロスの中で震
盪しながら30℃においてほぼ36時間成長させた。ストレ
プトミセス・グリセオルス（以後、S.griseolus）ATCC1
1796を400mlの胞子形成ブロスの中でほぼ30時間成長さ
せた。培養物から細胞を収穫する６時間前に、200mlのY
EMEをS.lividans細胞に添加した。収穫の６時間前に、
S.griseolus培養物を２つの200mlのアリコートに分割
し、そして100mlの新鮮な胞子形成ブロスを各々に添加
した。この時に、36mgの10001を、また、２つのS.grise
olus培養物の一方に添加した。５つの培養物の各からの
細胞の遠心により収穫し、50ミリモルのMOPS pH7.2で
２回洗浄し、そして収穫した細胞の前述のアリコートを
フレンチ圧力セルの中で破壊した。ほぼ30μｇのタンパ
ク質を、チトクロムP450SU1に対する抗血清を使用して
チトクロムP450SU1についてのウェスタン・ブロット分
析に使用した。結果を第７図に示す。pCAO200を含有す
るS.lividans細胞の中に、あるいは10001で誘導しなか
ったS.griseolus培養物の中に、チトクロムP450SU1は見
いだされなかった。チトクロムP450SU1は、pCAO200SU1
−FeS−Ｂ＃９またはpCAO200SU1＃12で形質転換したS.l
ividans培養物において、および10001で誘導したS.gris
eolus ATCC11796培養物において、検出された。
実施例４〜９ チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂのための遺伝子を含有
するS.lividans細胞によるスルホニル尿素化合物の代謝 実施例４ 0.12mg/mlの10001を含有する胞子形成ブロスの中のS.
lividans C35、pCAO400で形質転換したS.lividansまた
はpCAO401で形質転換したS.lividansを接種した別々の
培養物（50ml）を震盪しながら30℃において成長させ
た。各培養物のアリコートを接種後24、32、48および56
時間に取り出し、そして各アリコートの上澄み液をHPLC
によりその10001の濃度およびその代謝物10002または10
003について分析した。
各化合物の濃度（μモル）を表１に表す。
実施例５ 胞子形成ブロス中のS.griseolus ATCC1179の100mlの
培養物およびYEMEブロス中のpCAO400で形質転換したS.l
ividansの50mlの培養物を調製し、そして前述したよう
に24時間インキュベーションした。この時に、S.griseo
lusの培養物を２つの50mlのアリコートに分割し、そし
て新鮮な胞子形成ブロスを各々に添加し、そして9mgの1
0001をこれらの培養物の一方に添加して、チトクロムP4
50SU1の発現を誘導した。新鮮なYEMEブロス（25ml）を
S.lividans培養物に添加した。30℃においてさらに５時
間成長させた後、各培養物における細胞を前述したよう
に収穫し、MOPS（50ミリモル、pH7.2）で２回洗浄し、
そして再遠心した。細胞の沈澱を４細胞体積の0.2％の
グルコースおよび約100μg/mlの10004を含有するMOPS
（50ミリモル、pH7.2）の中に再懸濁させた。これらの
細胞懸濁液を30℃において震盪しながらインキュベーシ
ョンし、そしてアリコートを２および5.5時間において
取った。各アリコートの上澄み液をHPLCにより分析し、
そしてスルホニル尿素化合物10004およびその代謝物100
05の濃度を決定した。
各アリコートの上澄み液の中の10004および10005の濃
度（μモル）を表２に示す。
実施例６ それぞれ、pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９、pCAO200SU1＃1
2およびpCAO200で形質転換したS.lividansを、400mlのY
EMEブロス中で30℃において36時間培養した。S.griseol
us ATCC1179を400mlの胞子形成ブロス中で同様に培養
した。細胞の収穫の６週間前に、150mlの新鮮なYEMEブ
ロスをS.lividans細胞に添加し、そしてS.griseolus細
胞を２つの200mlの培養物に分割し、100mlの新鮮な胞子
形成ブロスを各々に添加した。10001（36mg）を２つの
S.griseolus培養物の一方に添加して、チトクロムP450S
U1を誘導した。細胞を実施例５に前述したように調製
し、そしてスルホニル尿素化合物10006およびその代謝
物10007、10008または10009の濃度を決定した。
各化合物の濃度（μモル）を表３に表す。
実施例７ 細胞を実施例６について前述したように調製し、そし
てスルホニル尿素化合物10001が化合物10011および1001
2にどの程度に代謝したかを決定した。各化合物の濃度
（μモル）を表４に表す。
実施例８ 細胞を実施例６について前述したように調製し、そし
てスルホニル尿素化合物10001が化合物10002および1000
3にどの程度に代謝したかを決定した。各化合物の濃度
（μモル）を表５に表す。
実施例９ 細胞を実施例６について前述したように調製し、そし
てスルホニル尿素化合物10004が化合物10005にどの程度
に代謝したかを決定した。各化合物の濃度（μモル）を
表６に表す。
実施例４〜９が実証するように、チトクロムP450SU1
およびFeS−Ｂの遺伝子は、S.lividans中で発現する
と、スルホニル尿素化合物をS.griseolus ATCC1179に
より産生されるのと同一生成物に代謝することができ
る。しかしながら、FeS−Ｂの存在または不存在下にチ
トクロムP450SU1の遺伝子を有するS.lividans株におけ
る発現は、構成的であり、10001のような化合物による
誘導を必要としない。チトクロムP450SU1を発現するS.l
ividans株の最適な代謝活性のためには、その電子供与
体のFeS−Ｂのための遺伝子は同様によく存在しなくて
はならない。実施例６〜９が実証するように、S.livida
ns中でP450SU1およびFeS−Ｂの両者の遺伝子を発現する
と、S.lividansは10001で前以て誘導しなかったS.grise
olus細胞より容易に、いくつかのスルホニル尿素化合物
を代謝することができる。このような株はS.griseolus
ATCC1179中のチトクロムP450SU1の劣った誘導体であ
るスルホニル尿素化合物の代謝に価値がある。なぜな
ら、それらは記載したS.lividans株により代謝されるこ
とができ、ここでまず10001または他のスルホニル尿素
で誘導し、次いで誘導化合物およびその代謝物を培養物
から除去しなくてよいからである。
実施例10 S.lividans中のチトクロムP450SU2およびFeS−Ａの構成
的発現 チトクロムP450SU2およびFeS−Ａの遺伝子を含有する
pUC19−SU2−８からの2.0kbのBamH I断片を、プラスミ
ドpCAO200SU2−FeS−Ａ＃11中で生じたpCAO200のBamH I
部位の中に結合することによって、下の実施例のための
プラスミドを作った。プラスミドpCAO200SU2−FeS−Ａ
＃11は、このプラスミドによりエンコードされる抗生物
質チオストレプトンに対する抵抗性について選択する方
法により、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyc
es lividans）の中に形質転換した［ホプウッド（Hopw
ood）ら、ストレプトミセス属の遺伝子操作（Genetic
Manupulation of Streptomyces）。実験質のマニュア
ル（Ａ Laboratary）、pp.12−14および104−109、ジ
ョン・インネス・ファンデイション（John Innes Fou
ndation）、英国ノーウィッチ、ここに引用によって加
える］。pCAO200SU2−FeS−Ａ＃11の制限酵素地図を第
８図に示す。
プラスミドpCAO200SU2−FeS−Ａ＃11を含有するS.liv
idansを、実施例１に記載するように、YEMEブロス中で3
0℃において成長させ、そしてチトクロムP450SU2のレベ
ルを実施例１〜３におけるようにウェスタン・ブロット
により分析した。結果を第９図に示す。見ることができ
るように、チトクロムP450SU2はpCAO200−SU2−FeS−Ａ
で形質転換したS.lividans中でスルホニル尿素の誘導の
不存在下に発現される。pCAO200で形質転換したS.livid
ans細胞は、チトクロムP450SU2を産生しない。
実施例11〜12 チトクロムP450SU2およびFeS−Ａの遺伝子を含有するS.
lividans細胞によるスルホニル尿素化合物の代謝 実施例11 pCAO200SU2−FeS−Ａ＃11で形質転換したS.lividans
およびpCAO200で形質転換したS.lividansを、400mlのYE
MEブロス中で30℃において36時間培養した。S.griseolu
s PH2001（SU1をもたない突然変異）を400mlの胞子形
成ブロス中で30℃において培養した。細胞の収穫の９時
間前に、S.griseolus PH2001を２つの200mlの培養物に
分割した。両者に100mlの新鮮な胞子形成ブロスを添加
し、そして一方に36mgの10001を添加してチトクロムP45
0SU2を誘導する。細胞を実施例６に前述したように調製
し、そしてスルホニル尿素化合物10001およびその代謝
物10002および1003の濃度を決定した。
各化合物の濃度（μモル）を表７に表す。
実施例12 細胞を実施例11について前述したように調製し、そし
てスルホニル尿素化合物10010が化合物10011にどの程度
に代謝したかを決定した。
各化合物の濃度（μモル）を表８に表す。
実施例10の結果（ウェスタン・ブロット分析）が示す
ように、チトクロムP450SU2遺伝子を含有するバクテリ
アはチトクロムP450SU2を構成的に産生した。これはS.g
riseolus株の場合と対照的であり、この場合においてP4
50SU2は誘導性スルホニル尿素化合物、例えば、10001の
添加でのみ検出可能な量で作られる［オ’ケーフェ（O'
Keefe）ら、植物化学における最近の進歩（Recent Ad
v.in Phytochemistry）21:151−137（1987）］。実施
例11および12の結果（代謝の実験）が示すように、S.li
vidans中のチトクロムP450SU2およびFeS−Ａ遺伝子の構
成的発現は、S.lividansがS.griseolus PH2001とほぼ
同程度にスルホニル尿素化合物を代謝できるようにす
る。また、pCAO200SU2−FeS−Ａ＃11で形質転換したS.l
ividansは、S.griseolus中でチトクロムP450SU2の劣っ
た誘導体であるスルホニル尿素10010を、非誘導S.grise
olus PH2001より容易に代謝する。
実施例13 植物の成長のスルホニル尿素の阻害の防止 S.lividans pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９の２リットル
の培養物を、培養物が成長の後期の対数期になりかつ60
0nMの波長における分光光度計の吸収を1.0〜1.3の間に
あるまで、YEME培地中で30℃において成長させた。トマ
トの実生（Lysopersicon esculentum cv.「Pixie」）
を土不含の培地の中に直接接種した。オアシス・ウェッ
ジズ（Oasis WedgesR（Smithers−Oasis、オハイオ州
ケント）、500ppmのペーターズ（Petes'R）（20:19:1
8）肥料を供給した；および300ppmの鉄を毎週添加し
た。トマト植物が発育するとき、根はオアシス・ウェッ
ジズ（Oasis WedgesR）を通して分岐した。トマト植物
は、それらが４インチの高さになったとき、次のように
してポットに移植した。
５インチの標準の丸いポット（孔をもたない）をサッ
サフラス・サンディイ・ローム（Sassafras sandy lo
am）（pH6.7、0.8％ OM）およびオアシス・キュウブ
（Oasis cube）を充填した。各ポットの内容物を、ト
マト植物の移植前に、25％の乾燥の流動性組成物（25D
F）中の10001、または10010 75DFで、16、32、64、125
または250gの活性成分／ヘクタール（ｇ ai/ha）の割
合で噴霧した。次いで、オアシス・キュウブを除去し、
そして水（処理Ａ）、YEME培地（処理Ｂ）または前述の
S.lividans pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９の培養物（処理
Ｃ）の中に浸漬した移植トマトを含有する他のもので置
換した。６つのトマト植物に３つの処理の各々を与え、
そして５つの移植トマト植物（対照として働く）は処理
しなかった。生ずるトマト植物を温室内で19日間成長さ
せ、そして毎日２回水をやり、次いでそれらを、水で浸
漬した除草剤を使用しない対照処理に関して、視的障害
について評価した（100＝完全な殺し、他の数＝対照に
関する障害の百分率［主観的に決定した］、０＝障害な
し）。植物をさらに１週間温室の中に放置し、次いで植
物の新しいシュートの重量を決定した。これらの処理を
受けた植物および対照をまた検査した。
移植の日数（DAT）19の視的検査により決定した移植
植物についての視的障害の等級を表９に示す。10001お
よび10010の中に移植したトマト植物は、それらが受け
た処理に依存して、異なる程度の障害を示す。処理Ｃで
処理したトマトは、10001を64、125および250g ai/ha
の割合で適用したとき、処理ＡまたはＢを受けたトマト
植物より、10001より障害が有意に低かった。10010の中
に移植したトマト植物は、それらが受けた処理に無関係
に同様な程度であった。
16および32g ai/haの10010を与えた植物および10001
を与えたすべての植物の重量を決定した（表10）。1001
0の中に移植し、水、YEMEまたはS.lividansの処理を受
けたトマトの新しいシュートの重量は、互いに有意に異
ならず（ｐ＝0.05）、そしてすべて除草剤を与えなかっ
たもよりかなり低かった。10001（64、125、または250g
ai/haの適用割合で）の中に移植したトマトのシュー
トは除草剤を与えなかったものよりかなり重量が低かっ
たが、それらを水またはYEMEで処理したときより、S.li
vidansの中に浸漬したとき、有意に多かった。pCAO200S
U1−FeS−Ｂ＃９の培養物の中に浸漬したトマトのシュ
ートの重量は、10001の250g ai/haの濃度においてほぼ
３〜４倍大きく、そして10001の125gの濃度において２
〜３倍大きかった。16または32g ai/haの適用割合で10
001を受けた植物からのシュートの重量の間の差は、ど
の追加の処理を受けたかに無関係に、有意ではなかっ
た。
選択した処理の根系の視的検査は、植物を水、YEMEま
たはpCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９の中に浸漬しそして除草
剤を与えなかったたとき、障害の徴候を示さなかった。
明らかにS.lividansは、根に対する損傷または異常な形
態の全体の徴候を生成しなかった。植物が10001を受け
たとき、それらのすべてはスルホニル尿素との接触から
生ずるものに典型的な損傷をもつ根（発育を止めた一次
の根、発育が劣った二次の根）を有した。多分、S.livi
dansの中の植物の浸漬は、土の溶液中の根付近における
10001のレベルを低下させ、そのレベルはあるシュート
の徴候を軽減するために十分に低いが、土と直接接触す
る根に対する損傷を緩和するためには不十分であった。
実施例14 pPAT108で形質転換したS.griseolus、S.griseus、S.amb
ofaciens、およびS.lividansによるスルホニル尿素化合
物の代謝の実証 S.griseolus PH2003、S.griseus PH4001、S.ambofa
ciens PH4002、およびS.lividans JI1326を、プラス
ミドpPAT108で形質転換した。形質転換されたS.griseol
us株PH3826を、150mlの胞子形成ブロス中で５μg/mlの
チオストレプトンとともに24時間培養した。形質転換さ
れたS.griseus株PH3832、および形質転換されたS.ambof
aciens株PH3834を、150mlのトリプチカーゼダイズブロ
ス中で５μg/mlのチオストレプトンとともに24時間培養
した。形質転換されたS.lividans株PH3822を、150mlのY
EMEブロス中で５μg/mlのチオストレプトンとともに同
様に培養した。細胞を収穫する３時間前に、50mlの同一
の型の新鮮な培地および５μg/mlのチオストレプトンを
各培養物に添加した。培養物の各々からの細胞を遠心に
より収穫し、50ミリモルのMOPS、pH7.2、で２回洗浄
し、そして0.2％のグルコースおよび120μg/mlのスルホ
ニル尿素10001を含有する５細胞体積のMOPSの中に再懸
濁した。細胞懸濁液を30℃において震盪しながらインキ
ュベーションし、そしてアリコートを0.5、１、２およ
び４時間に取り出した。各アリコートの上澄み液をHPLC
により分析し、そしてスルホニル尿素化合物10001およ
びその代謝物の濃度を決定した。
各化合物の濃度（μモル）を表11に表す。
実施例15 pCS325で形質転換したS.griseolus、S.griseus、S.ambo
faciens、およびS.lividansによるスルホニル尿素化合
物の代謝の実証 S.griseolus PH2003、S.griseus PH4001、S.ambofa
ciens PH4002、およびS.lividans JI1326を、プラス
ミドpCS325で形質転換した。S.griseolus PH3809、S.g
riseus PH3817、S.ambofaciens PH3818、およびS.liv
idans PH3816の形質転換された株の細胞を、実施例14
に記載するように、成長させそして試験し、そしてスル
ホニル尿素化合物10001およびその代謝物の濃度を決定
した。
各化合物の濃度（μモル）を表12に表す。
実施例14および15における結果が示すように、P450SU
1およびFeS−ＢまたはP450SU2およびFeS−Ａの遺伝子を
含有する広い範囲の宿主のプラスミドでストレプトミセ
ス属（Streptomyces）株を形質転換すると、これらの形
質転換された株はスルホニル尿素化合物を構成的に代謝
することができる。これらの形質転換された株がスルホ
ニル尿素化合物の代謝を実施することができる速度は、
触媒反応に要求されるP450に対する還元性同等体を提供
する内因性リダクターゼの能力、および形質転換された
株中のコピーの数に依存する。
実施例16 P450SU1またはP450SU2の遺伝子を含有するバクテリアに
よる非スルホニル尿素除草剤の代謝 S.lividans C37、pCAO200SU1−FeS−Ｂ＃９で形質転
換したS.lividans、S.griseolus ATCC11796、pIJ425で
形質転換したS.griseolus PH2003、またはpCS325で形
質転換したS.griseolus PH2003で接種した別々の培養
物（50ml）を、30℃において震盪しながら18時間培養し
た。次いで、各培養物を25mlの新鮮な胞子形成ブロスの
中に再懸濁し、そして3.0gの除草剤を添加した。S.gris
eolus ATCC11796の培養物の場合において、除草剤およ
び3.0mgの10001を含有する第２培養物を調製した。各培
養物を24時間再インキュベーションし、次いで培地のア
リコートを抜き出し、そしてHPLCにより分析した。除草
剤の百分率を決定した。
除草剤の転化率を表13に表す。表13の結果が示すよう
に、構成的に発現したP450SU1を含有するバクテリア
は、非スルホニル尿素の除草剤10017、10018、および10
019を代謝した。さらに、構成的に発現したP450SU2を含
有するバクテリアは、非スルホニル尿素の除草剤1002
0、10021、10017、10022、および10018を代謝した。
実施例17 10014に対する類似体の代謝−P450SU1による植物毒性代
謝物の形成 S.griseolus ATCC11796を胞子形成ブロス（50ml）中
で30℃において震盪しながら17時間培養した。次いで、
各培養物を25mlの新鮮な胞子形成ブロスの中に再懸濁
し、3.0mgのスルホニル尿素を添加し、そして培養物を
４日間再インキュベーションした。次いで、培地のアリ
コートをHPLCにより分析した。10015の代謝により形成
したそれに対する試験代謝物の保持時間および紫外線ス
ペクトルの類似性に基づいて、10014の形成を測定し
た。
スルホニル尿素の10014への転化率を表14に表す。表1
4の結果が示すように、P450SU1は非植物毒性のスルホニ
ル尿素10015、10024、10026、10027および10028を代謝
して植物毒性10014を生成した。
実施例18 植物成長のスルホニル尿素の阻害の防止 S.griseolus ATCC1179 S.lividans pCAO200、S.li
vidans pCAO200−＃９−SU1−FeS−ＢまたはS.lividan
s pCAO200−＃12−SU1の１リットルの培養物を、培養
物が成長の後期の対数期になりかつ600nMの波長におけ
る分光光度計の吸収を1.0〜1.3の間にあるまで、YEME培
地（S.griseolus培養物のための胞子形成ブロス）中で3
0℃において成長させた。トマトの実生（Lysopersicon
esculentum cv.「Pixie」）を土不含の培地の中に直
接接種した。オアシス・ウェッジズ（Oasis WedgesR）
（Smithers−Oasis、オハイオ州ケント）、500ppmのペ
ーターズ（Petes'R）（20:19:18）肥料を供給した；お
よび300ppmの鉄を毎週添加した。トマト植物が発育する
とき、根はオアシス・ウェッジズ（Oasis WedesR）を
通して分岐した。トマト植物は、それらが４インチの高
さになったとき、次のようにしてポットに移植した。
５インチの標準の丸いポット（孔をもたない）をサッ
サフラス・サンディイ・ローム（Sassafras sandy lo
am）（pH6.7、0.8％ OM）およびオアシス・キュウブ
（Oasis cube）を充填し、次いでクラシック（Classic
R）（10001）25DF（16、32、64、125または250gの活性
成分／ヘクタール［ｇ ai/ha］）またはオウスト（Ous
tR）75DF（４、８、16、32および64g ai/haの割合）、
両者の除草剤はイー・アイ・デュポン社、デラウェア州
ウィルミントン、で発芽前処理した。次いで、オアシス
・キュウブを除去し、そして前述の培養物S.griseolus
ATCC11796（処理Ａ）、S.lividans pCAO200（処理
Ｂ）、S.lividans pCAO200−＃９−SU1−FeS−Ｂ（処
理Ｃ）、S.lividans pCAO200−＃12−SU1（処理Ｄ）の
中にまたは水（処理Ｅ）の中に浸漬した移植トマトで置
換した。５つの移植植物を各適用割合で各処理について
試験した。ポットを温室のベンチ上に22日間配置し、そ
して毎日水をやり、次いで植物の新しいシュートの重量
を決定した。これらの処理を受けた植物および対照をま
た検査した。バクテリアの培養物で処理した植物、土お
よびポットを二重の袋に入れ、そして焼却により廃棄し
た。
移植後22日に決定した移植植物についての新しいシュ
ートの重量を表15に示す。新しい重量を比較すると、処
理Ｃ（S.lividans−＃９−SU1−FeS−Ｂ）による安全化
は明瞭である（Ｐ＝0.05）。処理Ｃは、水の対照（処理
Ｅ）より、32、64および125g ai/haの10001の割合で、
および16および32g ai/haの10010の割合で、有意に大
きい新しい重量を可能とした。これらの除草剤の適用割
合において、処理Ｃは処理Ａ、ＢおよびＤより大きい安
全化を同様によく与え、これは安全化を最良にするため
にはFeS−ＢをエンコードするDNAを含める必要性を実証
した。処理Ｃ（S.lividans pCAO200−＃９−SU1−FeS
−Ｂ）におけるトマトの新しいシュートの重量は、32、
64および125g ai/haの10001または16および32g ai/ha
の10010をもつ土の中に植えたとき、他の処理からのも
のよりほぼ２〜３倍大きかった。
他の除草剤の処理を受けた植物からのシュートの重量
の間の差は、水で処理したものと有意に異ならなかっ
た。
５つの処理のいずれかで処理した植物の根系の視的検
査は、植物が除草剤を受けなかったとき、障害の徴候を
示さなかった。植物を除草剤で処理したとき、すべては
スルホニル尿素との接触から生ずるものに典型的な損傷
をもつ根（発育を止めた一次の根、発育が劣った二次の
根）を有した。これが指摘するように、チトクロムP450
SU1およびFeS−Ｂの遺伝子を発現するS.lividansに移植
したキュウブ内の除草剤のレベルを減少することができ
るが、S.lividansは多分移植植物の根をコロニー化しな
かったので、根が処理した土と直接接触するようになっ
たとき、損傷はなお起こった。
実施例19 植物の形質転換のためのP450SU1およびFeS−Ｂの解読配
列をもつプラスミドの操作 配列をチトクロムP450SU1およびFeS−Ｂの解読配列の
５′末端および３′末端に付加して、植物中でチトクロ
ムP450SU1およびFeS−Ｂの転写および翻訳を実施しなく
てはならない。下に記載する10のプラスミドにおいて、
われわれはそのように実施した。これらの10プラスミド
の一般記載をまず与え、次いでこれらのプラスミドの作
る方法を詳細に説明する。
Ａ、 FeS−Ｂを含むか、あるいは含まないチトクロムP
450SU1の細胞質の発現のためのプラスミド カリフラワーのモザイク病ウイルス35Sおよびペチュ
ニアのクロロフィルa/b結合性タンパク質「Cab22L」
「ハープスター（Harpster）ら、モレキュラー・アンド
・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Genet.）22
1:182−190（1988）、ここに引用によって加える］から
の５′−未翻訳領域をもつP450SU1解読配列を、P450SU1
解読配列の上流に、含有するプラスミド、pSU17、を調
製した。ペチュニアからのリブロースビスホスフェート
カルボキシラーゼ（SSU）遺伝子「SSU301」［ディーン
（Dean）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス（Mol.Gen.Genet.）206:465−474（198
7）］の小さいサブユニットからの３′−未翻訳領域
を、P450SU1解読配列の下流に配置した。E.coli中の増
殖のために、pSU17はプラスミドpUC118の配列を含有し
た。pSU17の線図を第10A図に示す。構成体pSU17は、植
物細胞の中に導入したとき、細胞質中でチトクロムP450
SU1を発現した、 プラスミドは、反対方向の転写を促進する２つの隣接
するカリフラワーのモザイク病ウイルス（CaMV）35Sプ
ロモーター、およびペチュニアからのリブロースビスホ
スフェートカルボキシラーゼ（SSU）の小さいサブユニ
ットの５′−未翻訳領域を含有して、植物の細胞質中で
チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂを構成的に発現する。
両者の遺伝子の発現に使用した３′−未翻訳領域は、ア
ガロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacteriumt
umefaciens）のＴ−DNAから誘導したナパリンシンセタ
ーゼ（nos）のための遺伝子である［デピッカー（Depic
ker）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・
アプライド・ジェネティクス（J.Mol.Appl.Genet.）1:5
61−573（1982）］。pSUFe1の線図を第15A図に示す。
Ｂ、 植物細胞の葉緑体の中へのチトクロムP450SU1ま
たはFeS−Ｂの輸送を促進できるペプチドをさらに含有
するチトクロムP450SU1および／またはFeS−Ｂのタンパ
ク質をエンコードするプラスミド 植物の葉緑体中でチトクロムP450SU1またはFeS−Ｂの
タンパク質を発現するために、トランシットペプチドの
配列の解読領域およびある場合においてタンパク質をエ
ンコードする遺伝子の成熟解読配列の一部分を植物の葉
緑体の中に通常移入した。通常移入されたタンパク質の
ための遺伝子は、両者ともペチュニアからのリブロース
ビスホスフェートカルボキシラーゼ（SSU）およびクロ
ロフィルa/b結合性タンパク質（Cab）のためのものであ
った。葉緑体の中に輸送されるとき通常除去されるアミ
ノ末端のアミノ酸配列をP450SU1解読配列にのみ付加す
るプラスミド、および通常除去されるペプチドおよび成
熟した輸送された調製の27までのアミノ酸をP450SU1解
読配列に付加するプラスミドを構成した。FeS−Ｂ解読
配列をさらに含有するプラスミドは、葉緑体の中に輸送
するとき、通常除去されるペプチドをエンコードするDN
A配列のみを付加した。
１、pSSU−SU11。このプラスミドを調製し、そしてこれ
はP450SU1解読配列のNH2−末端上に付加された、ペチュ
ニアからのSSU301遺伝子［ディーン（Dean）ら、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.
Gen.Genet.）206:465−474（1987）、ここに引用によっ
て加える］（57アミノ酸の葉緑体のトランシットペプチ
ドおよび成熟SSU301の12アミノ酸］の最初の69アミノ酸
をエンコードするDNAを含有した。SSU301プラスミドお
よびSSU301遺伝子の５′および３′−未翻訳配列［ディ
ーン（Dean）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・
ジェネティックス（Mol.Gen.Genet.）206:465−474（19
87）］は、植物中にこのタンパク質の発現のための転写
および翻訳を提供した。E.coli中の増殖のために、pSSU
−SU11はプラスミドpUC118はプラスミドpUC118の配列を
包含した。pSSU−SU11の線図を第10B図に示す。
２、pSSU−SU12。このプラスミドはpSSU−SU11ど同様に
調製したが、ただしそれはP450SU1のアミノ末端上に付
加されたペチュニアSSU301遺伝子の57アミノ酸の葉緑体
のトランシットペプチドをエンコードするDNAのみを含
有した。pSSU−SU12の線図を第10C図に示す。
３、pCab−SU13。チトクロムP450SU1のNH2−末端上に付
加されたペチュニアのCab22L遺伝子［ヅンスムイア（Du
nsmuir）、核酸の研究（Nucleic Acids Res.）13:250
3−2518（1985）、ここに引用によって加える］（葉緑
体のトランシットペプチドの34アミノ酸および成熟Cab2
2Lタンパク質の27アミノ酸）の最初の61アミノ酸をエン
コードするDNAを含有する、このプラスミドを調製し
た。ペチュニアCab22L遺伝子のプロモーターおよび５′
−未翻訳領域［ギドニ（Gidoni）ら、モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mol.Gen.Gene
t.）211:507−514（1988）、ここに引用によって加え
る］およびペチュニアSSU301遺伝子の３′−未翻訳領域
は、植物細胞中の発現のための転写および翻訳のシグナ
ルを提供した。E.coli中の増殖のために、pCab−SU13は
プラスミドpUC118を包含した。pCab−SU13の線図を第10
F図に示す。
４、pCab−SU11。このプラスミドはpCab−SU13に類似す
るが、ただしそれはチトクロムP450SU1のNH2−末端上に
付加されたペチュニアCab22L遺伝子［ヅンスムイア（Du
nsmuir）、核酸の研究（Nucleic Acids Res.）13:250
3−2518（1985）］（葉緑体のトランシットペプチドの3
4アミノ酸および成熟Cab22Lタンパク質の14アミノ酸）
の最初の48アミノ酸をエンコードするDNAを含有する。
このプラスミドはpCab−SU13から部位特異的突然変異誘
発により調製することができ、ここでpCab−SU13の中に
見いだされるCab22Lタンパク質の13の追加のアミノ酸を
エンコードする39ヌクレオチドを当業者によく知られて
いる方法によりプラスミドから除去し［クンケル（Kunk
el）、T.A.ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、82:488−492（1985）］この区域をスパニン
グするDNA配列は、次の通りであることを知る： pCab−SU11の線図を第10D図に示す。
５、pCab−SU12。このプラスミドはpCab−SU13に類似す
るが、ただしそれはチトクロムP450SU1のNH2−末端上に
付加されたペチュニアCab22L遺伝子［ヅンスムイア（Du
nsmuir）、核酸の研究（Nucleic Acids Res.）13:250
3−2518（1985）］（葉緑体のトランシットペプチドの3
4アミノ酸および成熟Cab22Lタンパク質の19アミノ酸）
の最初の53アミノ酸をエンコードするDNAを含有する。
このプラスミドはpCab−SU13から部位特異的突然変異誘
発により調製することができ、ここでpCab−SU13の中に
見いだされるCab22Lタンパク質の８の追加のアミノ酸を
エンコードする24ヌクレオチドを当業者によく知られて
いる方法によりプラスミドから除去し［クンケル（Kunk
el）、T.A.ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、82:488−492（1985）］この区域をスパニン
グするDNA配列は上に示したものであることを知る。pCa
b−SU13の線図を第10E図に示す。
６、プラスミドpSUFe2は、反対方向の転写を指令する２
つの隣接するCaMV 35Sプロモーターならびにペチュニ
アからのSSUの５′−未翻訳領域からの60bpの領域を含
有する。しかしながら、チトクロムP450SU1およびFeS−
Ｂ解読配列は、各解読配列の開始に付加された57アミノ
酸の葉緑体のトランシットペプチドをエンコードする配
列を有する。FeS−Ｂ遺伝子はnos3′−未翻訳配列を含
有するが、P450SU1遺伝子はペチュニアSSUの３′−未翻
訳配列を含有する。この構成体はチトクロムP450SU1お
よびFeS−Ｂを構成的に発現し、そしてそれらの生ずる
タンパク質を植物の葉緑体またはプラスミドにターゲッ
ティングし、葉緑体の中に入りそしてトランシットペプ
チドをプロセシングすると、成熟P450SU1またはFeS−Ｂ
タンパク質は追加の配列をもたないで存在するであろ
う。pSUFe2の線図を第15B図に示す。
７、プラスミドpSUFe3は、反対方向の転写を指令する２
つの隣接するペチュニアからのSSUプロモーターを含有
する。これらの２つのプロモーターは、各解読配列の開
始に付加されたSSUからの57アミノ酸の葉緑体のトラン
シットペプチドをエンコードする配列を有した、チトク
ロムP450SU1およびFeS−Ｂ解読配列を発現する。FeS−
Ｂ遺伝子はnos3′−未翻訳配列を含有するが、P450SU1
遺伝子はペチュニアSSUの３′−未翻訳配列を含有す
る。この構成体は光依存的方式でチトクロムP450SU1お
よびFeS−Ｂを構成的に発現する。２つのタンパク質
は、また、葉緑体にターゲッティングされ、ここで、ト
ランシットペプチドのタンパク質分解的切断後、それら
は付加される追加の配列をもたないで存在する。pSUFe3
の線図を第15C図に示す。
８、プラスミドpSUFe4はpSUFe3に類似するが、ただし２
つのSSUプロモーターが互いに隣接する代わりに、nos
3′−未翻訳配列およびペチュニアSSU3′−未翻訳配列
は互いに隣接して存在する。２つのプラスミドの成分の
すべてはそれ以外は同一である。pSUFe4の線図を第15D
図に示す。
前述の７つのプラスミド、すなわち、細胞質の発現の
ための２つおよび葉緑体の発現のための５つは、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（American
Type Culture Collection）に次の受け入れ番号で受
託された。pCab−SU11およびpCab−SU12はpCab−SU13か
ら、当業者により前述したように、作ることができる。
pSUFe4はpSUFe3から、当業者により、後述するように作
ることができる。
P450SU1構成体 ATCC受け入れ番号 pSU17 67995 pSSU−SU11 67994 pSSU−SU12 67993 pCab−SU13 67992 pSUFe1 pSUFe2 pSUFe3 植物細胞のチトクロム中のFeS−Ｂを含むか、あるいは
含まないチトクロムP450SU1の発現のためのプラスミド １、 pSU17の構成体。フローダイヤグラムは第17A図〜
第17D図に示されている。
チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂの遺伝子の配列決定
において使用したプラスミドは、エクソヌクレアーゼII
欠失法［ヘニコッフ（Henikoff）、遺伝子（Gene）28:3
51−359、1984］により、これらの遺伝子を含有する2.4
kdのBamH I DNA断片のいずれかの末端から誘導した。
これらのプラスミドの１つ、pSU12−1.8は、P450SU1の
ための翻訳停止コドンから6gp下流のエンドポイントを
有したが、チトクロムP450SU1のための全体の解読配列
をなお含有する。このプラスミド、pSU12−1.8、を最初
に使用して、植物細胞中でP450SU1タンパク質を発現す
るDNA構成体を発生した。P450SU1解読配列の３′末端へ
配列を付加することは、植物中の翻訳のために必要であ
る。pSU12−1.8をHind IIIで消化し、そしてその部位を
DNAポリメラーゼＩのクレノー断片を使用してフィルイ
ンした［マニアチス（Maniatis）ら、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・
プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド・
スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニュ
ーヨーク（1982）］。このプラスミドをEcoR Iで切断
し、そしてほぼ1.3kgのEcoR I−平滑末端のDNA断片を含
有するP450SU1解読配列をEcoR I−Hinc II切断したpUC1
18の中にサブクローニングしてpSU14を作る。SSU301遺
伝子からの３′−未翻訳配列（ペチュニアからのリブロ
ースビスホスフェートカルボキシラーゼ［SSU］の小さ
いサブユニットをエンコードする）を、次のようにし
て、P450SU1解読配列の３′末端に融合した。pSSU303
3、SSUのための翻訳停止のTGA停止コドンにおいてBgl I
I部位をもつ配列遺伝子を含有するプラスミド［C.ディ
ーン（Dean）ら、植物細胞（The Plant Cell）1:201
−208（1989）］をBgl IIで切断し、そしてDNAポリメラ
ーゼＩのクレノー断片で平滑末端として［マニアチス
（Maniatis）ら、分子クローニング：実験室のマニュア
ル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring
Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー
（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（1982）］次
いでBamH Iで切断した。生ずるSSU301の３′末端を含有
する1.45kbの平滑末端−BamH I DNA断片をBamH I−Hin
c II切断pUC118の中にサブクローニングし、そして生ず
るプラスミドをpSSU3040と呼んだ。１、pSU14からのP45
0SU1解読配列（1.3kbのEcoR I−Pst I DNA断片）、
２、SSU301遺伝子からの1.45kbのPst I−BamH I DNA断
片）および３、BamH I−EcoR I切断したpUC118から成る
３つの成分の結合を実施して［マニアチス（Maniatis）
ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・スプ
リング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Pr
ess）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Sprin
g Harbor）、ニューヨーク（1982）］pSU15を作った。
試験管内突然変異誘発［クンケル（Kunkel）、T.A.PNAS
82:488−492（1985）］によりpSU15中のP450SU1のた
めに、Sca I部位をATG開始コドンに導入して： pSU16を作った。これはP450SU1「カッセット」を作り、
これをそれ以上の構成において使用して、植物中でP450
SU1遺伝子を発現した。カリフラワーのモザイク病ウイ
ルス（CaMV）35Sプロモーターおよびペチュニアのクロ
ロフィルa/b結合性タンパク質遺伝子「Cab22L」から
５′−未翻訳領域［ハープスター（Harpster）ら、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Mo
lecular and General Genetics）212:182−190、198
8］を含有するプラスミド、p35S（Ｊ）:Cab22L−CH、を
使用して、植物中のP450SU1の発現のためのプロモータ
ーを得た。p35S（Ｊ）:Cab22L−CHからの1.2kbのEcoR I
−Nco I（DNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末端
とした［マニアチス（Maniatis）ら、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・
プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド・
スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニュ
ーヨーク（1982）］を、Sca I（平滑末端）−EcoR I切
断pSU16に結合して、pSU17を作った。p35S（Ｊ）:Cab22
L−CHからのフィルインNco I部位およびpSU17からのSac
I部位をこの構成体中で一緒に融合したとき、チトクロ
ムP450SU1のためのATG開始コドンが再生された。この構
成体、pSU17、は、植物の中に導入したとき、植物細胞
の細胞質中でチトクロムP450SU1を発現した。
第17A図〜第17D図において、次の工程を矢印における
文字で表示した： 第17A図について： Ａ １）Hind IIIの切断およびクレノーを使用するフィ
ルイン Ｂ ２）EcoR Iの切断 第17B図について： Ｃ EcoR I＋Pst Iの切断 Ｄ BamH I＋EcoR Iの切断 Ｅ BamH I＋Pst Iの切断 Ｆ ３成分の結合 第17C図について： Ｇ １）Bgl IIおよびクレノーを使用するフィルイン ２）BamH Iの切断 Ｈ BamH I＋Hinc II Ｉ 結合 第17D図について： Ｊ P450SU1のATG開始部位→Sca I部位の部位特異的突
然変異 Ｋ １）Sca I ２）EcoR Iの切断 Ｌ １）Nco Iの切断およびクレノーを使用するフィル
イン ２）EcoR Iの切断 Ｍ 結合 ２、 プラスミドpSUFe1の構成。フローダイヤグラムを
第18A図〜第18D図に示す。
チトクロムP450SU1およびFeS−Ｂのための遺伝子の配
列決定において使用したプラスミドは、エクソヌクレア
ーゼIII欠失法［ヘニコッフ（Henikoff）、遺伝子（Gen
e）28:351−359、1984］により、これらの遺伝子を含有
する2.4kdのBamH I DNA断片のいずれかの末端から誘導
した。これらのプラスミドの１つ、pSU12−2.04は、FeS
−Ｂの停止コドンの数塩基対下流のエンドポイントを有
した。部位特異的突然変異誘発［クンケル（Kunkel）、
T.A.PNAS 82:488−492（1985）］により、Sca I部位を
ATG開始コドンに導入して、pFeSB−1.02を作りそして からの翻訳開始部位で配列を変化した。pFeSB−1.02か
らのFeS−Ｂ解読配列を含有する、0.24kgのSca I−Xba
I断片をNco I切断したp29593の中にクローニングし、末
端をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片［マニアチス（M
aniatis）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル
（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、コー
ルド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring
Harbor Press）、コールド・スプリング・ハーバー（C
old Spring Harbor）、ニューヨーク（1982）］でフ
ィルインし、次いでXba Iでサブカットして、pFeSB−３
を作った。p29593からのフィルインしたNco I部位はFeS
−ＢのためのATG開始コドンを再び作る。p29593は、CaM
V 35Sプロモーター［J.オウデル（Odell）ら、ネイチ
ャー（Nature）313:810−813（1985）］の転写開始点の
ほぼ190bp上流に［クンケル（Kunkel）、PNAS 83:488
−492（1985）］により導入した［R.C.ガードナー（Gar
dner）ら、核酸の研究（Nucleic Acids Res.）9:2871
−2888（1981）、ヌクレオチド7238GはＣに変化し、そ
してヌクレオチド723CはＴに変化した］Bgl II部位を有
するp35S（Ｊ）:Cab22L CH［ハープスター（Harpste
r）ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィックス（Mol.Gen.Genet.）212:182−190、1988］の誘
導体である。p29593は、カリフラワーのモザイク病ウイ
ルス（CaMV）の35Sプロモーターおよびアガロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）のＴ−DNAから誘導したナパリンシンセターゼ（no
s）のための遺伝子である［デピッカー（Depicker）
ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・アプラ
イド・ジェネティクス（J.Mol.Appl.Genet.）1:561−57
3（1982）］を含有する。上からのpSU17をBamH Iで消化
し、そしてXho Iで部分的に消化して、チトクロムP450S
U1解読配列およびペチュニアSSU遺伝子の３′−未翻訳
領域を含有する2.86kbのDNA断片を形成した。これをXho
Iで結合し、そしてBamH Iでp29593を消化してpSU20を
形成した。SSU遺伝子の３′−未翻訳領域は、pSU20か
ら、Pst Iで部分的に消化し、そしてT4 DNAポリメラー
ゼで平滑末端として［マニアチス（Maniatis）ら、分子
クローニング：実験室のマニュアル（Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・
ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）、
コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harb
or）、ニューヨーク（1982）］次いでBamH Iで消化し、
そして末端をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片でフィ
ルインする［マニアチス（Maniatis）ら、分子クローニ
ング：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A La
boratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー
・プレス（Cold Spring Harbor Press）、コールド
・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニ
ューヨーク（1982）］ことによって除去した。生ずるDN
Aは分子内で結合してpSU21を形成した。pSU21の2.6kbの
部分的にBgl II消化およびHinc II消化したDNA断片を分
離し、これはCaMV 35Sプロモーター、P450SU1解読配列
およびnos3′−未翻訳配列を含有した。このDNA断片
を、CaMV 35Sプロモーター、FeS−Ｂ解読配列およびno
s遺伝子の３′−未翻訳配列を含有するpFeSB−３の0.76
kbのHind III−Bgl II DNA断片に結合して、pSUFe1を
形成する。pSUFe1は２つのCaMV 35S解読配列を含有
し、その一方はFeS−Ｂ解読配列およびnos遺伝子３′−
未翻訳配列を転写し、そして他方はP450SU1解読配列お
よびnos遺伝子３′−未翻訳配列を転写する。プラスミ
ドpSUFe1は、植物細胞の中に形質転換したとき、細胞質
中のP450SU1およびFeS−Ｂの発現を推進する。
第18A図〜第18D図において、次の工程を矢印における
文字で表示した： 第18A図について： Ａ １）Xho Iの部分的切断 ２）BamH Iの切断 Ｂ Xho I＋BamH Iの切断 Ｃ 結合 第18B図について： Ｄ １）Pst Iの部分的切断、T4平滑末端 ２）BamH Iの部分的切断およびクレノーを使用する
フィルイン Ｅ 再環化 第18C図について： Ｆ １）Nco Iおよびクレノーを使用するフィルイン ２）Xba Iの切断 Ｇ FeS−ＢのATG開始部位→Sca I部位の部位特異的突
然変異 Ｈ Sca I＋Xba Iの切断 Ｉ 結合 第18D図について： Ｊ Bgl II＋Hind IIIの切断 Ｋ １）Bgl IIの部分的切断 ２）Hind IIIの切断 Ｌ Hind III切断したpUC118との結合 植物細胞の葉緑体に対するFeS−Ｂを含むか、あるいは
含まないチトクロムP450SU1の発現を指令するプラスミ
ド 植物の葉緑体中でチトクロムP450SU1またはFeS−Ｂを
発現するために、５′プロモーター領域、トランシット
ペプチドの解読配列、およびある場合において植物の葉
緑体の中に通常輸送されるタンパク質をエンコードする
遺伝子の成熟解読配列を使用して、プラスミドを構成し
た。これらのプラスミドにおいて使用した遺伝子を移入
した自然の葉緑体は、両者ともペチュニアからのリブロ
ースビスホスフェートカルボキシラーゼ（SSU）および
クロロフィルa/b結合性タンパク質（Cab）のためのもの
であった。葉緑体中への輸送のとき通常除去されるアミ
ノ末端のアミノ酸配列をエンコードするDNAを付加する
プラスミドを作った。葉緑体のトランシットペプチド、
およびチトクロムP450SU1をエンコードするDNA上の成熟
輸送タンパク質の27までのアミノ酸をエンコードするDN
Aを付加する、他のプラスミドを作った。
１、プラスミドpSSU−SU11およびpSSU−SU12の構成。フ
ローダイヤグラムを第19A図および第19B図に示す。
pSSU3019［ディーン（Dean）ら、植物細胞（The Pla
nt Cell）1:201−208（1989）］1.8kgのCla I（DNAポ
リメラーゼＩのクレノー断片で平滑末端した）−BamH I
DNA断片、５′および３′フランキング領域を含有す
るが、SSU301遺伝子のイントロンを欠如するクローンを
Sma I−BamH I切断pUC8を発生させた。pUC8のポリリン
カーを構成において使用すべきSSU301遺伝子のEcoR I上
に付加した。葉緑体のトランシットペプチドとP450SU1
との間の融合体を作るために、EcoR V部位を部位特異的
突然変異誘発［クンケル（Kunkel）、PNAS 82:488−49
2（1985）］により、アミノ酸12の後に成熟SSU301解読
配列の中に導入して、pSSU3044を作った。SSU301プロモ
ーターおよびSSU301のアミノ末端をエンコードするDNA
を含有するpSSU3044からの1.4kbのEcoR I−EcoR V DNA
断片を、EcoR I−Sca I切断pSU16の中にクローニングし
て、pSSU−SU11を作った。pSSU−SU11は、P450SU1タン
パク質のアミノ末端をエンコードするDNA上に付加され
たSSU301タンパク質からの葉緑体のトランシットペプチ
ドに加えて、12の余分のアミノ酸をエンコードする。葉
緑体のトランシットペプチド解読配列とP450SU1解読配
列との正確な融合体を作るために、オリゴヌクレオチド
指令部位特異的欠失［クンケル（Kunkel）、PNAS 82:4
88−492（1985）］を使用して、タンパク質とP450SU1の
アミノ末端との間の余分のヌクレオチドをループアウト
した。生ずるプラスミド、pSSU−SU12、は、SSU301遺伝
子のトランシットペプチドとP450SU1のアミノ末端との
間の完全な融合体を含有する。プラスミドpSSU−SU11お
よびpSSU−SU12は、植物細胞中で葉緑体にターゲッティ
ングされるチトクロムP450SU1を発現する。
第19A図および第19B図において、次の工程を矢印にお
ける文字で表示した： 第19A図について： Ａ １）Cla Iの切断およびクレノーを使用するフィル
イン ２）BamH Iの切断 Ｂ Sma I＋BamH Iの切断 Ｃ 結合 Ｄ 成熟SSU301タンパク質のアミノ酸12にEcoR V部位を
作る部位特異的突然変異誘発 第19B図について： Ｅ EcoR I＋EcoR Vの切断 Ｆ Sca I＋EcoR I Ｇ 結合 Ｈ SSU成熟ペプチドの12アミノ酸をエンコードする配
列のオリゴヌクレオチドのループアウト。
２、プラスミドpCab−SU11、pCab−SU12およびpCab−SU
13の構成。フローダイヤグラムを第20A図〜第20C図に示
す。
P450SU1に対するクロロフィルa/b結合性タンパク質を
作るために、Cab22Lプロモーター、葉緑体のトランシッ
トペプチド解読配列およびCab22L解読配列の一部分を含
有するペチュニアのCab22L遺伝子［ヅンスムイア（Duns
muir）、核酸の研究（Nucleic Acids Res.）13:2503
−2518（1985）］の950bpのBal I−Sac I DNA断片を、
Sma I−Sac I消化pBluescript KS＋［ストラタジーン
・インコーポレーテッド（Stratagene Inc.）、カリフ
ォルニア州92121サンディエゴ］の中にクローニングし
てpCab22LTを作った。pCab22LTの成熟Cabタンパク質の
アミノ酸のためのコドンの後に部位特異的突然変異誘発
により、Sca I部位を作ってpCab22LT1を生成した。Cab2
2Lプロモーター、トランシットペプチドをエンコードす
るコドンおよび成熟Cab22Lタンパク質の14アミノ酸を、
pCab22LT1の1.2kbのEcoR I−Sca I断片として、EcoR I
−Sca I切断pSU16の中にサブクローニングしてpCab−SU
11を作った。成熟Cab22Lタンパク質のアミノ酸15−27を
エンコードする39ヌクレオチド［クンケル（Kunkel）、
PNAS 82:488−492（1985）］を、Cab22L解読配列とP45
0SU1解読配列との間の接合の中にループインしてpCab−
SU13を作る、オリゴヌクレオチドを作った。pCab−SU13
は、Cab22Lの葉緑体のトランシットペプチド、P450SU1
タンパク質のアミノ末端に融合した成熟Cab22Lタンパク
質の27アミノ酸を含有するタンパク質をエンコードす
る。Sma I部位を部位特異的突然変異誘発［クンケル（K
unkel）、PNAS 82:488−492（1985）］によりpCab22LT
のアミノ酸19に作って、pCab22LT2を作った。Cab22Lプ
ロモーター、トランシットペプチドをエンコードするコ
ドンおよび成熟Cab22Lタンパク質の19のアミノ酸を、pC
ab22LT2の1.2kbのEcoR I−Sma I DNA断片として、EcoR
I−Sca I切断pSU16の中にサブクローニングしてpCab−
SU12を作った。プラスミドpCab−SU11、pCab−SU12およ
びpCab−SU13は、葉緑体に対してターゲッティングする
植物細胞中でチトクロムP450SU1を発現する。
第20A図〜第20C図において、次の工程を矢印における
文字で表示した： 第20A図について： Ａ Sma I＋Sac Iの切断 Ｂ 結合 Ｃ Cab−Ｍのアミノ酸14→Sca I部位の部位特異的突然
変異誘発 Ｄ Cab−Ｍのアミノ酸19→Sma I部位の部位特異的突然
変異誘発 第20B図について： Ｅ Sma I＋EcoR Iの切断 Ｆ EcoR I＋Sca Iの切断 Ｇ 結合 第20C図について： Ｆ EcoR I＋Sca Iの切断 Ｈ Sca I＋EcoR Iの切断 Ｉ 結合 Ｊ Cab成熟のアミノ酸15〜27の遺伝情報を指定する39
ヌクレオチドをSca Iにループインするためのオリゴヌ
クレオチドの使用３、プラスミドpSUFe3およびpSUFe4の
構成。フローダイヤグラムを第21A図〜第21D図に示す。
p29593（pSUFe1の構成を参照）をNco IおよびXba Iで
切断し、そしてFeS−Ｂ解読配列を含有するpFeSB−1.02
（pSUFe1の構成を参照）からの1kbのNco I−Xba I DNA
断片と結合する。これはプラスミドpFenos1を形成し、
そしてp29593からのnos遺伝子の３′−未翻訳領域をFeS
−Ｂ解読配列の下流に配置する。pFenos1をBgl IIで切
断し、0.75kgのBgl II DNA断片を除去し、そして残り
のBgl II DNA断片を再環化してpFenos2を作った。プロ
モーター、葉緑体のトランシット配列の遺伝情報を指定
する配列およびペチュニアのSSU301遺伝子の成熟タンパ
ク質の最初の12成熟アミノ酸を含有するpSSU3044（参
照、pSSU−SU11の構成）からの1.4kbのEcoR I−EcoR V
断片を分離した。この断片を、Sca Iで部分的に消化
し、そしてEcoR Iで完全に消化してpSFenos1を作った。
pSFenos1は、ペチュニアのSSU301遺伝子のプロモーター
ならびに葉緑体のトランシットペプチドをエンコードす
る配列およびFeS−Ｂ解読配列の開始上に付加された成
熟SSU301の最初の12アミノ酸を含有する。nos3′−未翻
訳配列をFeS−Ｂの停止コドン後に配置する。pSFenos1
中の成熟SSU301タンパク質の12アミノ酸をエンコードす
るDNA配列を部位特異的突然変異誘発（クンンケル）に
より除去して、pFenosを作った。pFenos2をHind IIIで
部分的に消化し、そしてHind III切断pGEM7Z（＋）［プ
ロメガ・コーポレーション（Promega Corporation）、
ウイスコンシン州53711マディソン］に結合して、BamH
I部位をnos遺伝子３′−未翻訳配列の下流に配置した。
このプラスミドをpSFenos3と命名する。pSFenos3をEcoR
IおよびBamH Iで切断して、FeS−Ｂ遺伝子を促進する
ペチュニアのSSU301を含有する約1.9kbのBamH I−EcoR
I DNAを得た。4.25kbのEcoR I−BamH I DNA断片を、
ペチュニアのSSU301プロモーター、葉緑体のトランシッ
トペプチドをエンコードするDNAおよびチトクロムP450S
U1解読配列をフランキングする３′−未翻訳領域を含有
するpSSU−SU12（参照、上のpSSU−SU12の構成）から分
離した。これらの２つのBamH I−EcoR I DNA断片を、E
coR I消化したpUC118に沿って、一緒に結合してpSUFe3
を作った。同一の２つのBamH I−EcoR I DNA断片を、B
amH I消化したpUC118に沿って、一緒に結合してpSUFe4
を作った。
pSUFe3およびpSUFe4の両者は、次のプロモーターを含
有する:1）ペチュニアSSU301プロモーター、こうして植
物において、それはFeS−Ｂの解読配列に結合したSSU30
1葉緑体のトランシットペプチドをエンコードする配列
およいnos遺伝子３′−未翻訳配列を転写する、および
２）第２ペチュニアのSSU301プロモーター、こうしてそ
れはチトクロムP450SU1の解読配列に結合したSSU301葉
緑体のトランシットペプチドをエンコードする配列およ
びSSU301遺伝子３′−未翻訳配列を転写する。pSUFe3
は、２つのSSU301プロモーターが互いに隣接するような
向きで、２つのセグメントを有する。pSUFe4は、nos遺
伝子３′−未翻訳配列およびSSU3013′−未翻訳配列が
互いに隣接するような向きで、これらの２つのセグメン
トを有する。
第21A図〜第21D図において、次の工程を矢印における
文字で表示した： 第21A図について： A.pFeSB−1.02のNco I＋Xba Iの消化 B.p29593のNco I＋Xba Iの消化 C.1）Bgl IIの消化、および ２）pFenos1の再環化 第21B図について： D.pFenos2のSca Iの部分的消化およびEcoR I消化 E.pSSU3044のEcoR I＋EcoR Vの消化 F.SSU成熟配列をエンコードするヌクレオチドの部位特
異的ヌクレオチド指令欠失 第21C図について： G.pSFenos2の部分的Hind III消化 H.pGEMY7ZF（＋）のHind III消化 第21D図について： I.pSFenos3のEcoR I＋BamH Iの消化 J.pSSU−SU12のEcoR I＋BamH Iの消化 K.pUC118のEcoR Iの消化 L.pUC118のBamH Iの消化 M.3成分の結合 N.3成分の結合 ４、pSUFe2の構成。フローダイヤグラムを第22A図およ
び第22B図に示す。
p29593をBamH Iで切断し、そしてEcoR I−BamH Iアダ
プター［ニュー・イングランド・バイオラブス・インコ
ーポレーテッド（New England Biolabs Inc.）、マ
サチュセッツ州ベアリリイ］に結合し、引き続いてp295
93−１を形成した。これはp29593−１中のEcoR I部位を
p29593中のBamH I部位の位置に配置する。CaMV 35Sプ
ロモーターおよびペチュニアのCab22Lの５′−未翻訳配
列を含有する約2.2kbのEcoR I−Bgl II DNA断片をp295
93に結合し、EcoR Iで切断し、そしてBgl IIで部分的に
消化して、p29593−２を形成する。p29593−２は２つの
隣接するCaMV 35SプロモーターおよびペチュニアのCab
22Lの５′−未翻訳配列を含有し、これらは２つのプロ
モーターからの転写は反対方向にある。次いで、２つの
CaMV 35プロモーターおよびCab22Lの５′−未翻訳配列
を含有するp29593−２からの1.3kbのNco I断片を、部分
的Nco I消化により除去したその２つのペチュニアSSU30
1を有するpSUFe3に結合してpSUFe2を形成することがで
きる。pSUFe2はpSUFe1に類似するが、ただし両者のチト
クロムP450SU1およびFeS−Ｂはそれらに融合したペチュ
ニアSSU301遺伝子の葉緑体のトランシットペプチドのた
めの配列を有する。
第22A図および第22D図において、次の工程を矢印にお
ける文字で表示した： 第22A図について： A.1）BamH Iの消化およびBamH I−EcoR Iアダプターのp
29593への付加 ２）再環化 B.Bgl IIの部分的に消化およびp29593のEcoR Iの消化 C.p29593−１のBgl II＋EcoR I消化 第22B図について： D.p29593−２のNco I消化 E.pSUFe3のNco Iの部分的に消化 C.T−DNAプラスミド中の構成体の導入 P450SU1解読配列および植物遺伝子からのプロモータ
ーを含有する６つの構成体（すなわち、pSU17、pSSU−S
U11、pSSU−SU12、pCab−SU11、pCab−SU12およびpCab
−SU13）を、BamH Iで消化し、そしてプラスミドpAGS13
5中のその独特BamH I部位に導入した。プラスミドpAGS1
35をpAGS112［P.バン・デン・エルゼン（van Elzen）
ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Plant M
ol.Biol.）5:149−154、1985、ここに引用によって加え
る］から、pAGS112 DNAをXho Iで消化した後、Ｔ−DNA
の右へりのXho I部位の外側を除去し、そしてDNAポリメ
ラーゼＩのクレノー断片で処理して平滑末端とし、次い
で自己結合することによって誘導した。プラスミドpAGS
112は、広い宿主範囲のベクターpLAFR［フリードマン
（Friedman）ら、遺伝子（Gene）18:288−296、ここに
引用によって加える］から、Ｔ−DNAのへりが植物中の
カナマイシン抵抗性を発現する遺伝子をフランキングす
るEcoR I断片および多数のクローニング部位を挿入する
ことによって誘導した。pAGS501、pAGS502およびpZS96
は、植物中でカナマイシン抵抗性を発現するプラスミド
を含有するＴ−DNAのへりであることにおいて、pAGS135
に類似する。
pAGS501、pAGS502およびpZS96を作る方法の要約を下
に記載する。
pAGS501および502は次のようにして構成した。pRK290
［G.ディッタ（Ditta）ら、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）USA、77:7347−7351（1980）］をEc
oR Iで切断し、そして末端をDNAポリメラーゼＩのクレ
ノー断片でフィルインした［T.マニアチス（Maniatis）
ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Molecula
r Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・スプ
リング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨ
ーク（1982）］。pAGS111［P.J.ヴァン・デン・エルゼ
ン（van den Elzen）ら、プラント・モレキュラー・
バイオロジー（Plant Mol.Biol.）5:149−154（198
5）］をEcoR IおよびHind IIIで切断し、そして末端をD
NAポリメラーゼＩのクレノー断片でフィルインした［T.
マニアチス（Maniatis）ら、（1982）］。Ｔ−DNAの左
および右のへりおよびノパリンシンセターゼプロモータ
ー制御下にカナマイシンヌクレオチジルホスホトランス
フェラーゼを含有するpAGS111からのDNA断片を、pRK290
DNAの結合してp1881を作った。p1881をXho Iで切断
し、末端をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平滑末
端とし、そして円形的に結合してp1882を作った。p1882
をBamH Iで切断し、そしてXba I、Hind III、Xho I、Ec
oR IおよびHpa I部位を含有する二本鎖のオリゴヌクレ
オチドに結合した。二本鎖のオリゴヌクレオチドの末端
は、BamH I切断p1882に結合したとき、一方の末端がBam
H Iを再び作るが、他方の末端は作らないようなもので
ある。プラスミドpAGS501およびpAGS502はこのような結
合の２つの可能な結果である。両者のプラスミドは、Ｔ
−DNAのへりの間にBamH I、Hind IIIおよびEcoR I部位
を含有し、これらの部位は植物の中に代謝すべきDNAの
クローニング部位として使用することができる。
第23A図および第23B図において、次の工程を矢印にお
ける文字で表示した： 第23A図について： A.1）pAGS111のHind III＋EcoR Iの消化 ２）DNAポリメラーゼＩのクレノー断片による制限エ
ンドヌクレアーゼ末端のフィルイン B.1）pRK290のEcoR Iの消化 ２）pRK290の制限エンドヌクレアーゼ末端のフィルイ
ン ３）pRK290とpAGS111の約6.7kbのＴ−DNA断片との結
合 C.1）p1881のXho Iの消化 ２）p1881の制限エンドヌクレアーゼ末端のフィルイ
ン ３）p1881の分子内結合 D.1）p1882の分子内結合 ２）Hpa I、EcoR I、Hind III、Xba I、Bgl IIオリゴ
ヌクレオチドとp1882との結合。
pZS96は次のようにして構成した。このプラスミド
は、アグロバクテリウム（Agrobacterium）において使
用するpVS1の複製および安定性機能を利用する［イトウ
（Itoh）ら、プラスミド（Plasmid）、11:206−220（19
84）］。pVS1の誘導体、pGV910［J.レマスン（lemans）
ら、遺伝子（Gene）19:361−364（1982）］をBamH Iお
よびSal Iで切断し、そして複製由来および安定性機能
を含有する8.0kbのHamH I−Sca I DNA断片をpBR322か
らの4.1kbのBamH I−Sal I断片［ボリバー（Bolivar）
ら、遺伝子（Gene）2:95−113（1977）］に結合してpZS
67を作った。pZS67をSac Iおよびpvu IIで切断し、そし
てT4 DNAポリメラーゼ［T.マニアチス（Maniatis）
ら、1982］で平滑末端とし、8.6kbのプラスミドpZS68を
作った。pZS68をBamH Iで切断し、そして末端をDNAポリ
メラーゼＩのクレノー断片［T.マニアチス（Maniatis）
ら、1982］でフィルインし、そして再環化してpZS69を
作った。Pst I部位を含有するアンピシリン抵抗性遺伝
子内の222bpのAva II−Ava II断片を、Pst Iを含有しな
いpUC19からの同様な断片［C.ヤニシューペロン（Yanis
ch−Peron）ら、遺伝子（Gene）33:103−119（1985）］
と交換することによって、pZS69中の独特Pst I部位を除
去してpZS71を作った。pAGS111のＴ−DNA領域［P.J.キ
ャン・デン・エルゼン（can den Elzen）ら、（198
5）］を5.7kbのEcoR I−Hind III断片を切り出し、そし
てEcoR I−Hind III切断pZS71の中にクローニングしてp
ZS73（12.3kb）を作った。pZS73をEcoR Iで切断し、末
端をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片［T.マニアチス
（Maniatis）ら、1982］でフィルインし、そしてプラス
ミドを再環化してpZS74を形成した。pZS74をEcoR Iで切
断し、末端をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片［T.マ
ニアチス（Maniatis）ら、1982］でフィルインし、そし
てプラスミドを再環化してpZS75を形成した。その末端
がT4 DNAポリメラーゼ［T.マニアチス（Maniatis）
ら、1982］で平滑末端されたポリリンカー領域を含有す
るpUC19からの444bpのHae II−Hae II DNA断片を、ポ
リリンカー領域ではないBamH Iで切断したpZS75の中に
クローニングした。これは、別々のKpn I、Sal Iまたは
BamH Iの部分的消化、DNAポリメラーゼＩのクレノー断
片またはT4 DNAポリメラーゼ［T.マニアチス（Maniati
s）ら、1982］の末端のフィルインおよびプラスミドの
再環化の順次の工程で達成された。
第24A図において、次の工程を矢印における文字で表
示した： A.1）pGV910およびpBR322のBamH I＋Sal Iの消化 ２）4.1kbのBamH I−Sal I pBR322と8.0kbのBamH I
−Sal I pGV910との結合 B.1）pZS76のpvu II＋Sac IIの消化 ２）T4 DNAポリメラーゼによるエンドヌクレアーゼ
末端の平滑化 ３）分子内結合 第24図において、次の工程を矢印における文字で表示
した： C.1）pZS68のBamH I消化 ２）DNAポリメラーゼＩのクレノー断片によるエンド
ヌクレアーゼ末端の平滑化 ３）分子内結合 D.pUC19のAva II消化 E.1）pZS69のAva II消化 ２）pUC19の22bpのAva II断片とpZS69の11.9kbのAva
II断片との結合 第24C図において、次の工程を矢印における文字で表
示した： F.pAGS111のHind III＋EcoR I消化 G.1）pZS71のEcoR I＋Hind III消化 ２）pAGS111の約5.7kbのHind III−EcoR I断片とHind
III−EcoR I切断pZS71との結合 H.1）pZS73のHind III消化および制限末端のフィルイン ２）分子内結合 ３）２）からのEcoR I消化 ４）分子内結合 第24D図において、次の工程を矢印における文字で表
示した： I.1）pUC19のHae II断片およびT4 DNAポリメラーゼに
よる末端の平滑化 ２）pZS75のBamH I消化および制限末端のフィルイン ３）消化したpZS75と約pUC19の440bpのHae II断片 J.1）Kpn I消化、T4 DNAポリメラーゼによる末端の平
滑化 ２）分子内結合 ３）２）からのプラスミドのSal I部分的消化、DNAポ
リメラーゼＩのクレノー断片による末端の平滑化 ４）分子内結合 ５）４）からのプラスミドのSal I部分的消化、DNAポ
リメラーゼエのクレノー断片による末端の平滑化 これらのプラスミドを次のように使用して、植物におい
てチトクロムP450SU1およびFeS−Ｂを発現することがで
きるpSUFe1、pSUFe2、pSUFe3およびpSUFe4をクローニン
グした。２つのCaMV 35Sプロモーターおよびnos3′−
未翻訳配列ならびにチトクロムP450SU1およびFeS−Ｂ解
読配列を含有する約3.4kbのHind III断片をHind III切
断pAGS502の中にクローニングして、pSUFe1を作った。
各々がSSU301遺伝子の葉緑体のトランシットペプチドを
エンコードする配列に連鎖した２つのCaMV 35Sプロモ
ーター、nos3′−未翻訳配列、SSU301の３′−未翻訳配
列およびP450SU1およびFeS−Ｂの解読配列を含有するpS
UFe2の約4.75kbのBamH I断片をBamH I切断pAGS501の中
にクローニングして、pSuFe21を作った。各々がSSU301
遺伝子の葉緑体のトランシットペプチドをエンコードす
る配列に連鎖した２つのペチュニアSSU301プロモータ
ー、nos3′−未翻訳配列、SSU301の３′−未翻訳配列お
よびP450SU1およびFeS−Ｂの解読配列を含有するpSUFe3
の約6.3kbのBamH I断片をBamH I切断pZS96 DNAの中に
クローニングして、pSuFe31を作った。各々がSSU301遺
伝子の葉緑体のトランシットペプチドをエンコードする
配列に連鎖した２つのペチュニアSSU301プロモーター、
nos3′−未翻訳配列、SSU301の３′−未翻訳配列および
P450SU1およびFeS−Ｂの解読配列を含有するpSUFe4の約
6.3kbのBamH I断片をEcoR I切断pZS96 DNAの中にクロ
ーニングして、pSuFe41を作った。前述の発現構成体お
よびpAGS135、pAGS501、pAGS502またはpZS96の中にクロ
ーニングしたとき作られたプラスミドの名称を下に記載
する。
P450SU1の構成体 プラスミド pSU17 pUC18 pSSU−SU11 pSSU−SU111 pSSU−SU12 pSSU−SU121 pCab−SU11 pCab−SU111 pCab−SU12 pCab−SU121 pCab−SU13 pCab−SU131 pSUFe1 pSUFe11 pSUFe2 pSUFe21 pSUFe3 pSUFe31 pSUFe4 pSUFe41 D.アグロバクテリウム（Agrobacterium）およびタバコ
の中への転移 上に列挙したプラスミドをアグロバクテリウム（Agro
bacterium）株LBA4404/pAL4404［ヘケマ（Hoekema）
ら、ネイチャー（Nature）303:179−180、1983、ここに
引用によって加える］の中に、３親交配［ルブキン（Ru
vkin）およびアウスベル（Ausbel）、ネイチャー（Natu
re）289:85−88、1981、ここに引用によって加える］を
使用して移動化させた。次いで、生ずるアグロバクテリ
ウム（Agrobacterium）株をニコチアナ・タバクム（Nic
otiana tabacum）cv.Wisconsin38の原形質体［バン・
デン・エルゼン（van den Elzen）ら、プラント・モ
レキュラー・バイオロジー（Plant Mol.Biol.）5:149
−154］または葉のディスク［ホルシュ（Horsch）ら、
サイエンス（Science）227:1229−1231,1985］とともに
培養し、そしてカナマイシン抵抗性形質転換体を選択し
た。
カナマイシン抵抗性に形質転換されたタバコ植物を形
質転換された葉のディスクから再生し、そして植物の葉
をP450SU1およびFeS−Ｂ解読配列のmRNA発現についてプ
ライマーの発現により試験した。中程度〜高いレベルの
mRNAを示す植物を花成させ、自家受粉させ、そして各々
から種子を得た。各P450SU1発現構成体から由来するい
くつかのDNA断片独立の形質転換された植物を分離し
た。下表16は、親の構成体、使用したプロモーターおよ
び使用した各植物系統についてのP450SU1解読配列への
付加を記載する。
実施例20 形質転換されたタバコの組織中のP450酵素活性 A.実験方法： 植物を自家受粉した形質転換された植物により産生さ
れたタバコの種子からメトロ−ミックス（Metro−Mi
xR）350中の16時間の光（ポットのレベル、22℃および8
0％の相対湿度において、400μアインシュタイン／秒/m
2の光の強度）次いで８時間の暗所（18℃および70〜80
％の相対湿度）下で成長させ、そして1/2強度のホアグ
アンド（Hoagland）溶液で毎日３回水をやった。個々の
植物中のP450タンパク質の存在は、スルホニル尿素の代
謝についての試験前に、ウェスタン・ブロット分析によ
り確証した。
成長の間に、タバコ植物は主要な茎に結合した葉を産
生し、それらのいずれも同一の年令または大きさではな
かった。各植物の主要な茎に結合した葉を除去すると、
横のシュートの成長が強制され、引き続いてシュートは
実験に必要な同様な大きさおよび年令の多数の葉を産生
した。葉を水の下でメスで切除した。これらの葉を吸収
溶液（１ミリモルのリン酸カリウム緩衝液、pH7.0、中
の20ppmのスルホニル尿素）を含むカップに移し、そし
て光（200μアインシュタイン／秒/m2）中で22℃および
86％の相対湿度において２時間の間切断した葉の基部を
通して溶液を吸収させた。吸収期間の終わりにおいて、
試料の葉を液体窒素の中で凍結させ、そして−20℃にお
いて貯蔵する（「吸収後０時間の試料」と表示する）
か、あるいはリン酸塩緩衝液を含むカップに移して、凍
結前、光の中でさらに５時間インキュベーションした
（「吸収後５時間の試料」と表示する）。10001の実験
において、いくつかの葉を連続的光（200μアインシュ
タイン／秒/m2、22℃および63％の相対湿度）の下に吸
収後21時間インキュベーションした。
個々の葉をソーバル・オムニ−ミキサー（SorvallROm
ni−Mixer）の中で30mlのアセトン／水（80％/20％、容
量）で１分間抽出した。ブライを遠心して組織の破片を
除去した。上澄み液中のアセトンを窒素の流れ下に除去
した。生ずる水性抽出物を硫酸でpH2〜３に酸性化し、
次いで塩化メチレンで３回抽出した。一緒にした塩化メ
チレン抽出物を回転蒸発器で30〜40℃において減少乾固
した。乾燥残留物をバイアルへ移るためにアセトン中に
溶解した。いったん移されると、アセトンを窒素の流れ
下に蒸発により除去した。HPLC分析の前に、乾燥した試
料を1.0mlのアセトニトリル／水（25％/75％）の中に再
び溶解する。HPLCの分離をゾルバックス（ZorbaxR）ODS
カラム（4.6mm×250mm）を45℃において1.4ml/分の流速
で実施した。抽出成分の分離を５〜80％のアセトニトリ
ルの勾配（0.1％のギ酸；残部は水であった）および25
分の展開時間で達成した。10001およびその代謝物を254
nmにおいて検出したが、14C−10001およびその代謝物を
ラジオマチック・フロ−ワン（Radiomatic Flo−On
eR）検出器で検出した。ダイオードの列の検出器を別の
実験において使用して、いくつかの抽出物のHPLC分析に
おける10015代謝物および10014標準の吸収スペクトルを
得た［HPLC法は、ロウメッサー（Romesser）ら、バイオ
ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーション（Biochem.Biophys.Res.Comm.）140:650
−659（1986）に記載されている］。代謝物の吸収スペ
クトルを10014のそれと比較すると、代謝物の同一性が
確証された。
B.10015の代謝 S.griseolusチトクロムP450（SU1）を葉緑体Ｎ−脱ア
ルキル化10015−10014に向けるように操作されたプラス
ミド受け取った形質転換されたタバコ植物（SSU−SU11
1.5、SSU−SU121.3およびCAB−SU131.5）の子孫のみか
らの葉組織（第11図）。結果を表17に示す。
代謝物（10014）は、HPLC分析における10014標準との
その同時移動により、および代謝物の吸収スペクトルと
10014標準のそれとの比較により同定された。吸収スペ
クトルは同一であった（第12A図および第12B図）。葉中
の10014のレベル（表17）は、２時間の吸収期間の間に
葉の中に負荷された10015の10〜20％の代謝的転化を表
す（吸収された10015溶液の体積からの計算に基づ
く）。吸収後の０および５時間のインキュベーションを
含めて、代謝の反応速度論を見た。10014の産生の変動
性のために、反応速度定数は計算しなかった。
子孫の植物の型、Wisconsin38タバコ、およびpAGS112
プラスミド（バクテリアのチトクロムP450SU1遺伝子を
もたないプラスミド）で形質転換したタバコの子孫から
の葉の組織は、検出可能な10014および10015を産生する
ことができなかった（表17）。これが示すように、1001
5を10014に代謝するトランスジェニックタバコの能力
は、植物中のバクテリア遺伝子の発現のためであり、そ
してタバコの自然の能力のためではなかった。
プラスミドpSU18で形質転換した植物（すなわち、植
物系統SU18.14およびSU18.15）の子孫からの葉の組織
を、また、10015を10014に代謝するそれらの能力につい
て試験した。実験条件下に、10015の10014への転化は検
出されなかった（表17）。
カルボキシラーゼの小さいサブユニット（SSU形質転
換体）からまたはクロロフィルa/bタンパク質（Cab形質
転換体）からのトランシット配列を操作したプラスミド
の中に含めて、細胞質の中で合成後、チトクロムP450SU
1タンパク質を葉緑体の中に向けた。SSU−SU111.5形質
転換体のための成熟チトクロムP450SU1タンパク質は、R
uBPカルボキシラーゼの小さいサブユニットの14アミノ
酸断片を含有した。SSU−SU121.3形質転換体のmntチト
クロムは、追加のアミノ酸の付加をもっていなかった。
Cab−SU131.5形質転換体は、クロロフィルa/bタンパク
質からの追加の27アミノ酸を有した。形質転換体の中で
産生された10014のレベルの検査（表17）が示すよう
に、チトクロムP450SU1に付加された14または27のアミ
ノ酸は、トランスジェニックタバコ葉組織中の10015の1
0014への代謝を防止しなかった。
C.10001の代謝 pAGS112、チトクロムP450SU1をエンコードするDNAを
含有しないプラスミド、は、10001を10002および10003
に、それぞれ、Ｏ−脱メチル化および脱エステル化によ
り、代謝した（第13A図）。10001の代謝はタバコの自然
の代謝能力であると仮定した。しかしながら、それはプ
ラスミド（pSU18、pSSU−SU111、pSSU−SU121、およびp
Cab−SU131）を含有するチトクロムP450SU1で形質転換
した植物からの組織の10001の代謝活性の評価を複雑に
した。制限された数の試料を試験した（各時点は試験し
た２枚の結合の平均を表す）が、結果（第13A図、第13B
図および第13C図）が示すように、21時間後、10001は有
意に代謝され、そしてpAGS112で形質転換した植物から
の葉の組織においてより多くの10002は、プラスミドpSS
U−SU111およびpCab−SU131で形質転換した植物からの
葉の組織において産生された。結果が示すように、チト
クロムP450SU1はトランスジェニックタバコにおいて100
01を活性的に代謝していた。
形質転換体、SU18.8およびSU18.14、の子孫からの葉
の組織を10001を10002および10003に代謝する能力につ
いて試験した。タバコの10001を代謝する自然の能力の
ために、バクテリアの酵素の代謝への寄与が存在するか
どうかを決定することは困難であった。
実施例21 P450SU1で形質転換したタバコ植物による10015の代謝 スルホニル尿素化合物10015は広範な種類の植物種に
対して低い植物毒性を示す。この化合物はP450SU1のた
めのきわめてすぐれた基質であり、P450SU1はそれを高
度に植物毒性の化合物10014に転化する（第11図）。こ
うして、P450SU1を含有するように形質転換されそして
通常毒性以下の割合の10015で噴霧されたタバコ植物
は、植物の組織内に毒性化合物10014の蓄積を可能とす
るために十分な量の機能的P450SU1を含有する場合、非
常に損傷されるであろう。
プラスミドpAGS112、pSU18、pSSU−SU111、pCab−SU1
21またはpCab−SU131（単一に）で形質転換しそしてP45
0SU1タンパク質を蓄積するタバコ植物（Nicotiana tab
acum cv.Wisconsin 38）を、ウェスタン・ブロット分
析により同定した。AGS112、SU18.8、SU18.14、SSU−SU
111.5、Cab−SU111.8、およびCab−SU131.5と表示する
個々の一次形質転換体の自家受粉から生ずる種子は、こ
の実施例に記載する植物を生じた。一次AGS112およびCa
b−SU121.5形質転換体を単一コピーのカナマイシン抵抗
性を離した。対照的に、P450SU1を含有するプラスミド
で形質転換した植物（Cab−SU121.5以外）の子孫はマル
チコピーnoカナマイシン抵抗性を分離した、こうして、
この実施例におけるP450SU1をエンコードする遺伝子を
含有しそして10015で噴霧した大部分の植物は、P450SU1
の少なくとも１つのコピー、多くの場合において多数の
コピーを含有するように思われるが、非常にわずかの個
体はP450SU1をエンコードする遺伝子のコピーを含有し
ないようであった。
形質転換されたおよび形質転換されないタバコ植物か
らの種子を、商用ポッティングミックスのメトロ−ミッ
クス（Metro−MixR）350中で25日間発芽させた。次い
で、個々の植物をメトロ・ミックス（Metro MixR）を
含有する４インチ×４インチのポットに移し、そして温
室内でさらに22日間成長させ、この時ほとんどの植物は
４〜５の完全に拡張した葉を含有した。植物の発育的に
均一な集団をから選択し、次いで個々の植物をスルホニ
ル尿素化合物10015を１、４、または16g/ヘクタール（g
/ha）の濃度で含有するAGWT（90.2％のアセトン、:4.8
％のグリセロール:4.8％の水:0.24％のツイーン20、容
量）の担体溶液で噴霧した。噴霧した植物を温室に戻
し、そして22日後障害について等級づけた。
噴霧の１〜２日前に、各植物からの１枚の葉を−80℃
においてP450SU1含量の分析のために貯蔵した。アッセ
イにおいて、融解した葉を0.1モルのナトリウムトリシ
ンpH7.8、10ミリモルの塩化ナトリウム、および５ミリ
モルの塩化マグネシウムを含有する緩衝液の中で粉砕し
た。抽出液を28,000〜33,000×ｇで１時間遠心すること
によって透明にし、そして上澄み液分画中のタンパク質
を濃縮した。各葉からの上澄み液分画の相対的P450SU1
含量を「イムノスロットブロット」により推定し、ここ
で各葉からの抽出液を鋳型の中に配置し、鋳型は抽出液
をニトロセルロース紙上の個々の「スロット」または狭
いレーン上に堆積させた。ニトロセルロースに結合した
タンパク質をP450SU1特異的抗体とインキュベーション
し、引き続いてウェスタン・ブロット手順について前述
したように処理した。
10015を1g/haの割合で葉に適用する（表18）と、非形
質転換植物（W38）およびプラスミドpAGS112で形質転換
した植物の子孫への損傷は最小であった。対照的に、P4
50SU1を葉緑体に向ける構成体で形質転換した植物（SSU
−SU111.5、Cab−SU111.8、Cab−SU121.5およびCab−SU
131.5）は、1g/haで化合物10015を適用することによっ
て、厳しく障害された。第14図に示すように、P450SU1
を含有する植物への損傷は事実劇的であり、植物の成長
の厳しい阻害ばかりでなく、かつまた葉のクロロシスお
よびシュートの先端付近で生ずる新しい葉の全体の形態
学的変形を生じた。第14図における非形質転換（W38）
植物の子孫およびpAGS112で形質転換した植物の間の高
さの差は、未処理の移植したタバコ植物の発生後に期待
される通常の変動の範囲内であった。
イムノスロットブロット分析において、障害した植物
は噴霧時にP450SU1タンパク質を含有したことが確証さ
れた。何も含有しないものの期待したレベルより低い
（Cab−SU121.5−19）または同一族における厳しく障害
された植物より低い（Cab−SU131.15）P450SU1のレベル
を示した。これらの植物はP450SU1をエンコードする遺
伝子の、それぞれ、コピーを含有しないか、あるいは１
つのコピーを含有する分離体であることができる。pAGS
112一次形質転換体から生ずる対照植物は、カナマイシ
ン抵抗性について個々に型別されなかった。しかしなが
ら、これらの植物は３つの抵抗性を分離した:1カナマイ
シン上で発芽する能力についての感受性、pAGS112で形
質転換した少なくとも１つの植物を1g/haの10015の最適
な区別的な割合でサンプリングされた確率は＞98％であ
る。
この実験を化合物10015の4g/haのより高い適用割合で
反復したとき、P450SU1を葉緑体に向ける構成体で形質
転換された大部分の植物は再び厳しく障害された（表1
9）。非形質転換植物および一次AGS112形質転換体から
の子孫植物はこのより高い適用割合において多少のバッ
クグラウンドの損傷を示したが、この損傷は葉緑体局在
化P450SU1を含有するように形質転換された植物が経験
するものより低いことは明らかであった。この実験にお
いて、P450SU1を含有する２つの例外的な植物（Cab−SU
111.8;Cab−SU131.5−21）は、期待した植物毒的損傷よ
り低い損傷を示した。これらのプラスミドで形質転換さ
れそしてP450SU1を発現する植物が化合物10015の1g/ha
のより低い適用割合で厳しく損傷されることが与えられ
ると（表18）、これらの２つの例外的な植物は処理の間
に減少した投与量の10015を受けたか、あるいはイムノ
スロットブロット分析の間に誤って型別されたようであ
る。
細胞質的に向けられたP450SU1を含有するいくつかの
形質転換体（SU18.8、SU18.14）は、非形質転換植物よ
り厳しく損傷されたが、葉緑体局在化P450SU1を含有す
る形質転換体より低い程度に損傷された。これは化合物
10015の4g/haの処理割合においてことに明らかであった
（表19）。細胞質的に局在化されたP450SU1および葉緑
体局在化P450SU1の間の活性の差は、葉緑体に向けられ
た構成体におけるP450SU1のより高い蓄積を常に反映す
るということはない（SU18.8、SU18.14とCab−SU111.8
およびCab−SU121.5との比較、表19）。これが示唆する
ように、P450SU1は細胞質におけるより葉緑体において
より効率的に機能する。
10015を16g/haの濃度で適用するとき、形質転換され
た植物および非形質転換植物の両者は広範に障害されそ
して有用な情報は得られなかった。
これらのデータが実証するように、P450SU1は形質転
換された植物の子孫において全植物レベルで機能的に活
性である。P450SU1タンパク質を葉緑体に向けらるよう
に設計した構成体の場合において、実施例18に記載する
ようにP450SU1にアミノ末端の伸長を含めることは、完
全な植物におけるP450SU1の活性を防止しなかった。
実施例22〜23 形質転換されたタバコの種子の組織培養成長 ムリシゲ（Murishige）最小有機培地［ギブコ・ラボ
ラトリーズ（Gibco Laboratories）、ニューヨーク州
グランドアイランド］、8g/、にＴビタミン類（50ppb
のビオチン、0.5ppmのピリドキシンHCl、0.5ppmのチア
ミンHCl、5ppmのニコチン酸、0.5ppmの葉酸、2ppmのグ
リシン、100ppmのミオ−インソトール）を補充し、滅菌
し、そして無菌のプラントコン（PlantCon）組織培養容
器［フロー・ラボラトリーズ（Flow Laboratories）、
バージニア州マクリーン］の中に入れて、成長培地を調
製した。一次形質転換体の自家受粉から得られたタバコ
種子は、20％の塩素漂白剤、0.1％のドデシル硫酸ナト
リウムの中で30分以下の処理により表面滅菌し、次いで
蒸留水ですすぎ、そして無菌の容器内の培地の表面上に
配置した。この処理後、種子を発芽させ、そして照明
（100マイクロアインシュタイン/m2/秒）下に22℃にお
いて成長させた。
形質転換されたタバコの遺伝子座の数の決定 タバコのゲノムの中にＴ−DNAが組み込まれた位置の
数は、子孫の次の世代におけるカナマイシン抵抗性の分
離分析により決定した。一次形質転換体の自家受粉から
の種子を、前述したように、200ppmの硫酸カナマイシン
を補充した培地（Sigma）上に成長させた。21日後、抵
抗性（形質転換された）植物は対照と比較して影響を受
けなかったが、感受性植物はより小さく、部分的に黄白
化し、そして根形成に劣った。一次形質転換体の遺伝子
座の数の決定は、カナマイシン抵抗性の特性の分離に基
づいた。
実施例22 スルホニル尿素処理によるＰ−450表現型の検出 10014の植物毒性が10015のそれを越えて増加するため
に、10015を含有する培地中で成長する植物は、それら
が活性なチトクロムP450SU1を含有する場合、成長が阻
害されるであろう。これを試験するために、タバコの種
子を50ナノモルの化合物10015を補充した組織培地の中
で成長させ、そして結果を表20に示す。 表20 植物の系統 遺伝子座の数ａ 阻害ｂ AGS112（対照） １ １ SU18.8 ＞２ １ SU18.14 ２ ２ SU18.15 ＞２ ２ SSU−SU111.5 ３ ３ Cab−SU111.8 ＞２ ３ Cab−SU121.5 ２ ３ Cab−SU131.5 N.D.c ３ ａ 遺伝子座の数は＞100の種子の分離分析により決定
した。
ｂ ６個体の成長の阻害を視的に等級づけた。１＝わず
かの阻害または阻害なし;2＝中程度の阻害;3＝厳しい阻
害、子孫は拡張するが、成長は起こらない。
ｃ 遺伝子座の数は決定することができなかった。
この表中のデータが示すように、P450を含有する植
物、ことに成熟タンパク質が葉緑体に向けられている植
物は、化合物10015による阻害に対して感受性であっ
た。これらの植物の親の大部分の遺伝子座の高い数（＞
１）は、サンプリングした６植物のすべてがP450遺伝子
を有することを保証する。
P450＋FeSを含有する植物のスルホニル尿素の選択 上の結果が実証するに、50ナノモルの化合物10015の
存在下に植物を成長させることによって、P450遺伝子の
選択可能なマーカーとして使用することができる。この
技術を使用して、SU1およびFeS−Ｂの両者の遺伝子で形
質転換した植物の子孫を分析し、そして結果を表21に示
す。
カナマイシン抵抗性および化合物10015の感受性につ
いての結果は、結果／合計の植物を実証する植物として
表される。コピーの数の決定は、約100の種子のカナマ
イシン感受性の分離の分析からである。
化合物10015に対する感受性を示す植物は、培地の表
面から実生を引き抜き、そしてそれらを10015を含有し
ない新鮮な培地の中に入れることによって、この処理か
ら救うことができるであろう。数週の成長後、植物から
の葉を集め、ホモジナイゼイションし、そしてウェスタ
ン・ブロット分析によりチトクロムP450SU1抗原の存在
について分析した。系統SuFe21.5、SuFe21.6、SuFe21.
7、およびSuFe21.8からの10015抵抗性および10015感受
性の両者の分析において、10015抵抗性として特徴づけ
られた８植物のうちで、ウェスタン・ブロット上に検出
可能なレベルのP450SU1は存在しなかったが、10015に対
して感受性の21植物のうちで18はウェスタン・ブロット
上に検出可能なレベルのP450SU1を有することが実証さ
れた。
これらの結果が実証するように、P450SU1の発現は陰
性の選択可能な表現型に導く。成熟タンパク質を葉緑体
にターゲッティングしたとき、この選択はカナマイシン
による陽性の選択に匹敵した。
実施例23 トランスジェニックタバコ系統SuFe31およびSuFe41のス
ルホニル尿素の選択 プラスミドpSUFe31およびpSuFe41で形質転換した植物
を、実施例19に記載するように、プライマー伸長分析に
よりP450SU1およびFeS−Ｂの高い発現について選択し、
そして自家受粉して種子を産生した。この種子は50ナノ
モルの化合物10015を含有する培地上で発芽し、そして
実施例22におけるようにこの化合物に対する感受性（活
性なチトクロムP450SU1酵素の存在を示す）について分
析した。
SuFe31.13、SuFe31.28およびSuFe41.37における化合
物10015感受性の特性の分離が実証するように、感受性
植物は酵素的に活性なチトクロムP450SU1を発現してお
り、そしてこれらの植物は単一の座で形質転換されたヘ
テロ接合体の植物の子孫である。
実施例24 スルホニル尿素の形質転換されたタバコの解毒 いくつかのP450SU1およびP450SU1＋FeS−Ｂの構成体
で形質転換した植物からのタバコの種子を、化合物1000
1を補充した組織培地上で成長するそれらの能力につい
て試験した。種子は０、５、10、20、および40ナノモル
の化合物10001を含有する培地上に配置した。100日後、
植物を除草剤処理に対するそれらの抵抗性（除草剤の解
毒による）について視的に等級づけた。除草剤の不存在
下に成長したすべての植物および最低のレベル（５ナノ
モルおよび10ナノモル）の10001で処理した植物は、非
常に大きく成長したので、比較的等級づけは不可能であ
った。厳しく成長を阻害された植物（20ナノモルおよび
40ナノモルの化合物10001の存在下に成長した植物）を
表23中のAGS502（P450遺伝子で形質転換しなかった）と
比較することによって、それらにスコアを付けた。
スコアのシステム：均一に出現するAGS502に対する視
的比較： 20ナノモル 約1cmの高さ、６枚の葉 約1cmの直径 40ナノモル 約0.5cmの高さ、６枚の葉 約0.3cmの直
径、白化 等級:0＝対照のAGS502と本質的に同一； １＝AGS502より限界的に大きい（≧1.2×）;2＝AGS502
より明瞭に大きい（1.2〜２×）;3＝AGS502より実質的
に大きい（＞２×）。
実施例25 FeS−ＡおよびFeS−Ｂの互換性 FeS−ＡまたはFeS−Ｂの両者が還元性同等体をP450SU
1またはP450SU2に転移する能力を検査した。精製したタ
ンパク質の混合物を、FeS−Ａおよび／またはFeS−Ｂが
NADPHおよびホウレンソウ（Spinach）フェレドキシン:N
ADPオキシドリダクターゼからチトクロムP450SU1または
P450SU2への電子の転移を実施するかどうかを見るため
に試験した。これらのFeSタンパク質が還元性同等体を
転移する能力は、チトクロムP450の触媒活性のそれらの
包含について前提条件である。
この実験は室温において、0.1モルのMOPS−NaOH（pH
7.0）、0.2モルのNaCl、10ミリモルの化合物10013（ク
ロロスルフロン）、および50ナノモルのフェレドキシ
ン:NADPオキシドリダクターゼ［ゼネッチ（Zanetti）お
よびクルチ（Curti）、メソッズ・イン・エンジモロジ
ー（Methods in Enzymology）、1980、Vol.69、pp.25
0−255、ここに引用によって加える］から成る緩衝液の
中で実施した。この混合物に、FeS−ＡまたはFeS−Ｂ
（表24に示すように）、0.03ミリモルのNADPHを添加
し、そして10分間インキュベーションした。吸収スペク
トルを測定し（Hewlett−Packerd 8450A型 紫外線／
可視光線の分光光度計）、P450タンパク質を添加し、試
料をCOで30秒間バブリングし、そして１分および５分後
に吸収を再び測定した。約450nmにおける吸収バンドの
出現は、FeSタンパク質によりチトクロムの減少を示し
た。
表24中のデータが実証するように、FeSタンパク質は
電子のチトクロムP450への転移に参加し、そしてそれら
は互換的に使用することができ、FeS−ＡまたはFeS−Ｂ
およびSU1あるいはFeS−ＡまたはFeS−ＢおよびSU2を使
用することができる。
実施例26 トランスジェニックアラビドプシス（Arabdopsis）中の
陰性の選択系 解読領域を欠如する実生に可視の作用をもたない濃度
でスルホニル尿素10015を含有する培地上で発芽させた
とき、チトクロムP450SU1解読配列を有するアラビドプ
シス（Arabdopsis）のシュートの成長は阻止され、こう
して導入した遺伝子を発現する植物のための陰性の選択
系を提供する。遺伝子の発現を欠如する植物は生存する
が、遺伝子を発現する植物のシュートの成長は止まっ
た。
プラスミドpSU18、pSSU−SU111、およびpCab−SU111
を、実施例19の節Ｃに記載されているように、アグロバ
クテリウム（Agrobacterium）株LBA4404/pAL4404［ヘケ
マ（Hoekema）ら、ネイチャー（Nature）303:179−18
0、1983］の中に、凍結−融解法［Plant Molec.Biol.M
anual、S.B.ゲルビン（Gelvin）およびR.A.シルペパー
ルート（Schilperoot）編、A3:1−19、19988、ここに引
用によって加える］を使用して直接形質転換し、そして
50mg/のリファンピシンおよび5mg/のテトラサイク
リンを含むYEME培地（表25）上で選択した。選択したク
ローン中のプラスミドDNAの存在は制限消化により評価
した。
無菌の培地および異種生物を混じない植物／バクテリ
アの培養物の操作の標準の無菌的技術に従い、このよう
な技術はすべての転移のために層状流れのフードを包含
した。培地の組成物を表25に列挙する。特記しない限
り、25×100mmのペトリ皿を植物組織の培養に使用し
た。植物組織の培養物のインキュベーションは、特記し
ない限り、23℃において混合蛍光および「グロー・アン
ド・ショウ（Gro and Sho）」プラントのライト（Gen
eral Electric）で一定に照明下に実施した。
外植体源をアラビドプシス・タリアナ（Arabdopsis
theliana）（Ｌ）Heynh、地理的品種Wassilewskijaの試
験管内で成長した植物であった。種子を50％の塩素漂白
剤および0.1％のドデシル硫酸ナトリウムの溶液中で10
分間滅菌し、無菌の蒸留水で３〜５回すすぎ、無菌の濾
紙上の完全に乾燥し、次いでGM培地上にまいた。プレー
トをフィルターテープ（Carolina Biologicals、米国
ノースカロライナ州バーリントン）でシールし、そして
前述したように７日間インキュベーションした。実生を
25×150mmのペトリ皿中のGMに、36〜40/プレートで移し
た。プレートをフィルターテープでシールし、そして２
〜３嵩週インキュベーションした。
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の接種する前
に、根の組織をカルス誘導培地（MSKig）上で４日間培
養した。根系はピンセットを使用して寒天の中から外に
小植物を引き、根をMSKig培地上に根を横たえ、次いで
メスでシュートを切断した。ペトリ皿をフィルターテー
プでシールし、そして４日間インキュベーションした。
プラスミドの各々を含有するアグロバクテリウム（Ag
robacterium）の細胞の培養物を、2mg/のテトラサイ
クリンを含有する5mlのYEPブロスの中で成長させた。培
養物を28℃に維持したニュー・ブルンスウィック（New
Brunkswick）プラットホームのシェイカー（225rpm）
中のガラス培養管中でほぼ17〜20時間成長させた。一次
培養物した根全体を0.5cmのセグメントに切断し、そし
てトリ−ポウア（Tri−Pour）ビーカー（VWR Scientif
ic、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）および10
0μｍのメッシュから作られ、ペトリ皿の中にセットし
た、100μｍのフィルターに入れた。根のセグメントを
一夜のアグロバクテリウム（Agrobacterium）の培養物
の1:20希釈物の30〜50mlの中で、周期的におだやかに混
合しながら、数分間接種した。接種した根を無菌の濾紙
に移して、液体の大部分を抜き取った。いくつかの根の
セグメントから成る、根の小さい束を、100ミリモルの
アセットシリンゴン:3′,5′−ジメトキシ−４′−ヒド
ロキシアセトフェノン、Aldrich Chemical Co.、米国
ウイスコンシン州ミルウォーキイ）を含有するMSKig上
に配置した。ペトリ皿をパラフィルムまたはフィルター
テープでシールし、そして２〜３日間インキュベーショ
ンした。
接種後、根のセグメントをすすぎ、そして抗生物質を
含有するシュート誘導培地に移した。根の束を100μｍ
のフィルターユニット（前述）の中に入れ、そして30〜
50mlの液状MSKig培地ですすいだ。フィルターを溶液の
中で激しく震盪してアグロバクテリウム（Agrobacteriu
m）の除去を促進し、きれいなペトリ皿に移し、そして
再びすすいた。根を無菌の濾紙上でブロッティングし、
そして根の束を500mg/のバンコマイシンを含有する
が、50mg/のカナマイシンを含有しないMSg培地上に配
置した。プレートをフィルターテープでシールし、そし
て12〜21日間インキュベーションした。
緑の節および小さいシュートの原子細胞は約２週で可
視であった。外植体は完全なままに放置下か、あるいは
多数の片に破壊し、そしてさらにシュートの発育のため
に200〜300mg/のバンコマイシンを含有するGM培地上
に配置した。プレートを２片のテープまたはフィルター
テープでシールした。それらが発育するにつれて、個々
のシュートをカルスから分離し、そして100mg/のバン
コマイシンMSRg培地上に配置した。皿を前述したように
シールし、そして４〜７日間インキュベーションした。
次いで、シュートを25×100mmのペトリ皿またはプラン
トコン（plantCon）容器（Flow Laboratories、バージ
ニア州マクリーン）中の100〜200mg/のバンコマイシ
ンを含有するGM培地に移した。個々の容器に移した多数
の一次形質転換体は種子を発育させた（T2）。
T2種子を選択した推定上の形質転換体から収穫し、そ
して50mg/のカナマイシンを含有しそして5ppbの10001
5を含有するGM培地上にまいた。プレートをフィルター
テープでシールし、２またはそれ以上の日数の間４℃に
おいて冷時処理し、次いで前述したように一定の照明下
に23℃において10〜20日間インキュベーションした。実
生を抵抗性（緑、真の葉の発育）および感受性（真の葉
の発育なし）としてスコアを付けた。表26は、カナマイ
シンおよび10015に対して抵抗性である実生の数および
百分率を示す。抵抗性実生の百分率は、２つの選択と逆
比例する。カナマイシンは外来DNAを有する実生につい
て陽性の選択である。したがって、この逆の関係が示す
ように、10015はP450SU1遺伝子を発現する実生を陰性的
に選択する、すなわち、その実生のシュートの成長を阻
止したが、P450SU1遺伝子を発現しない実生が生き残っ
た。
カナマイシン抵抗性である選択したT2実生を土に移植
し、そして65〜80％の相対湿度において21℃に日中（14
時間）18℃の夜中（10時間）成熟に成長した。T3種子を
集め、滅菌し、そして50mg/のカナマイシンを含有し
そして5ppbの10015を含有するGM培地上で発芽した。植
物をフィルターテープでシールし、４℃において２また
はそれ以上の日数の間冷時処理し、次いで前述したよう
に一定の照明下に23℃において10〜20日間インキュベー
ションした。実生を抵抗性および感受性としてスコアを
つけ、そして結果を表27に示す。６つの植物のうちで２
つはカナマイシンに対して100％抵抗性でありそして100
15に対して選択的である；それらは挿入されたDNAにつ
いてホモ接合性である。他の４つの親はヘテロ接合性で
あり、そしてカナマイシンおよび10015抵抗性の実生の
逆比例を示す。こうして、異種遺伝子を有する実生の成
長は、10015を含有する培地上で成長させるとき、阻止
されたが、その遺伝子を含有しない実生の成長は影響を
受けなかった。したがって、P450SU1遺伝子を発現する
実生は陰性的に選択することができる。
植物組織の選択的破壊は、10015を含有する培地上で
成長する実生中で示された。P450SU1遺伝子の発現は、
植物の緑の組織の中で発現されるcab遺伝子からの組織
特異的プロモーターによりコントロールされた。5ppbの
10015上で成長したT3実生は、前述したように、根の成
長を示したが、シュートの成長は阻害された。こうし
て、P450SU1を発現するシュートのみは、10015の適用に
より破壊された。
種々の濃度上の10015についてのホモ接合性種子の発
芽アッセイは、３つの異なるプロモーターによりおよび
独立の形質転換体の間で産生される10015に対する相対
的感受性をアッセイするために実施した。種子を、前述
したように、滅菌し、０、0.5、１、２、５、10および2
0ppbの10015を有するGM培地上にまき、インキュベーシ
ョンし、そしてスコアを付けた。さらに、実生を成長量
について１〜３の目盛りで等級づけた。結果を表27Aに
示す。これらの結果が示すように、独立の形質転換体は
10015に対して異なる感受性を示す。
チトクロムP450SU1解読領域を含有しない実生あるい
は遺伝子産生物のより低い活性を示す実生を選択するこ
とができるかどうかを試験するために、野生型種子を10
0ppbの10015を含有するGM培地上の特定した区域に配置
した。P450SU1解読領域に対してホモ接合性である500を
越える種子を同一プレート上にまいた。前述したよう
に、プレートをシールし、冷時処理し、そしてインキュ
ベーションした。プレートを観測して、野生型の種子お
よび10015の活性化を示す種子の間に差が存在するかど
うかを決定した。野生型の実生を形質転換された実生を
乾燥することによって影響を受けなかった。さらに、ホ
モ接合性Cab−SU111植物の10,000より大きい数の種子
を、前述したように、10ppbの10015を有するGM培地上に
まき、冷時処理し、そしてインキュベーションし、18の
実生は10015に対して抵抗性であり、そして付近の実生
により影響を受けなかった。
解読配列の組み込みは、カナマイシン抵抗性および10
015感受性を示す選択した子孫のサザンブロット分析に
より確証する。サザンブロットは、サムブルック（Samb
rook）ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual）第２版（コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・ニュー
ヨーク州、1989、ここに引用によって加える］に記載さ
れているように実施する。植物のDNAは導入されたDNAか
らのDNA配列を含有するDNA断片の産生に適当な酵素で消
化し、そして適当なプローブを使用してこの断片を検出
する。
実施例27 種々のFeSタンパク質により支持されたスルホニル尿素
のチトクロムP450SU1の代謝 この実施例の目的は、試験管内実験からの結論に基づ
いて、スルホニル尿素の最適な代謝を生ずる、チトクロ
ムP450SU1と他のタンパク質との組み合わせを明らかに
することであった。これらの実験において、精製された
チトクロムP450SU1により仲介される、10015から10014
への代謝速度を試験して、最良の直接の電子供与体とし
てのFeSタンパク質の機能を見いだした。
アッセイは、表28に示すように、0.1モルのMOPS−NaO
H（pH7.0）、0.2モルのNaCl、0.2ミリモルの10015、２
μモルの精製したチトクロムP450SU1、ホウレンソウの
フェレドキシン:NADPオキシドレダクターゼ（FNR）、表
28に示すように種々のFeSタンパク質、および５ミリモ
ルのグルコース−６−ホスフェート、および５ユニット
/mlのロイコノストク・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）グルコース−６−ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼから成るNADPH再生系を含有する0.025mlの
緩衝液中で実施した。この反応はNADPHを0.03ミリモル
の最終濃度に添加することによって開始した。15分後、
この反応を0.25mlのH2O:アセトニトリル:H3PO4（80:19:
1）の添加により停止した。この混合物を0.2μｍのフィ
ルターを通して濾過後、形成した代謝物の量をHPLCによ
り分析した。
これらの結果が実証するように、FeS−Ａ、FeS−Ｂお
よびホウレンソウのフェレドキシン（FeSタンパク質）
は10015の代謝の間にP450SU1の直接の還元剤として機能
した。FNR濃度の10倍の増加はFeS−Ｂまたはホウレンソ
ウのフェレドキシンで代謝速度を増加しなかったので、
FNRはそれらの反応の速度を制限しないことが明らかで
あり、そして代謝の全体の速度をP450のFeS還元により
決定した。２μモルのFNRにおいて、速度はFNRにより多
少制限されたが、４μモルのFeS−Ａが存在するとき、
代謝速度は同一濃度のFeS−Ｂを使用するときよりなお
少なくとも８倍速かった。
スルホニル尿素の代謝を支持する２つのS.griseolus
FeSタンパク質の能力のこの差が精製の間に起こるFeS
−Ｂに対する何らかの損傷であったかどうか、あるいは
同一の能力の差が内因性リダクターゼタンパク質を使用
して生体内で起こるかどうかはわからない。それにもか
かわらず、これらの試験管内の結果が示唆するように、
P450SU1およびFeS−Ａは最大p450SU1代謝活性のために
最適な組み合わせであり、そしてこれらの２つのタンパ
ク質の共同した発現を生ずるDNAの組み合わせを好まし
い構成体としての請求の範囲を支持する。
実施例28 チトクロムP450SU1解読配列をタバコ植物の葯組織の
中で特別に発現した。タバコの葯のタペータム組織にお
いてのみ天然に発現される遺伝子である、タバコTA29遺
伝子から誘導されたプロモーター領域を使用した。タバ
コTA29遺伝子は、ゴールドバーグ（Goldberg）、サイエ
ンス（Science）240、pp.1460−1467（1988）および欧
州特許出願（EPA）第89−344029号に記載された。TA29
プロモーター断片は、TA29遺伝子のクローンから1500bp
のCla I−Hind III断片を分離し、その間にCla I末端は
フィルインされ、そしてこれをM13mp19のHinc II（平
滑）およびHind III部位の中にクローニングすることに
よって、調製した。翻訳開始ATGを取り囲むDNAの配列
は、サンガー（Sanger）ら、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）USA、74:5463−5467（1977）の方法
に従い、U.S.バイオケミカル・コーポレーション・シー
クエナーゼ（Biochemical Corporation sequenase）D
NA配列決定キットを使用しそして製造業者のプロトコル
に従い決定した。次いで、ビイタネン（Viitanen）ら、
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.
Biol.Chem.）263:15000−15007（1988）に記載されてい
るように、部位特異的突然変異誘発により、それを変更
してこのATGにNco I部位をつくった。突然変異誘発は、
アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystem
s）DNA合成装置および製造業者の手順に従い合成した配
列AGAAATTAGCTACCATGGTAGCTCCAAAATのオリゴヌクレオチ
ドを使用して実施した。次いで、新しいNco I部位を含
有するTA29プロモーター断片をSma I−Hind III断片と
して除去し、Sma I部位をM13mp19ポリリンカーから誘導
し、Sma IおよびHind III消化したpTZ19（Pharmacia）
の中に入れてpTZALを作った。
TA−29プロモーターおよびSU1解読領域、引き続いて
非翻訳のペチュニアのルビスコ（Rubisco）の小さいサ
ブユニット遺伝子２つのキメラ遺伝子およびポリアデニ
ル化領域（「SSU301 ３′」）を含有する、２つのキメ
ラ遺伝子を構成した。一方のキメラ遺伝子は、また、ル
ビスコの小さいサブユニットの葉緑体トランシット配列
を含有し、そして他方は含有しなかった。これらのキメ
ラ遺伝子を、それぞれ、Ａ−Ｔ−SU1およびＡ−SU1と呼
んだ。Ａ−SU1を構成するために、Sca I−BamH I断片を
分離し、この断片はATCCに受託されそして受け入れ番号
67995を有するクローンpSU17の中に存在するのと同一の
SU1解読領域および「SSU301」ポリアデニル化領域を含
有する。断片のSal I末端をTA29プロモーターの３′末
端にフィルインされたNco I部位に接合した。T29プロモ
ーター断片を含有するプラスミドを、また、BamH Iで消
化してSU1断片の３′末端を収容した。生ずるプラスミ
ドをpTZA−SU1と呼んだ。
Ａ−Ｔ−SU1の構成において、トランシット配列に隣
接するSU1解読配列源は、ATCCにpSSU−SU11として受託
されそして受け入れ番号67994を有するSSu−SS11であっ
た。トランシット配列およびSU1の５′末端を含有するN
co I断片ならびにSU1の３′領域およびSSU301遺伝子か
らの多少のポリアデニル化領域を含有するNco I−Hind
III断片を精製した。Nco I−Hind III3′断片を、ま
ず、前述のNco IおよびHind III切断pTZALと結合した。
次に、Nco I断片を生ずるプラスミドのNco I部位の中に
結合し、そして正しい向きにこの断片を含有するクロー
ンはSph Iで消化することによって同定された。生ずる
クローンから、TA29プロモーター、トランシット配列、
およびSU1解読配列の一部分を含有するSma I−Dra I断
片を、Sma IおよびDra I消化したpTZA−SU1の中にクロ
ーニングし、両者の中のSma I部位はpTZ19ポリリンカー
の中に存在した。この工程を実施してプロモーター、ト
ランシット、および５′SU1の配列を完全なSSU301ポリ
アデニル化領域に隣接して配置した。生ずるプラスミド
をpTZA−Ｔ−SU1と呼んだ。
SU1キメラ遺伝子の各々をAsp718−BamH I断片として
分離し、Asp718はpTZ19のポリリンカーから来た。それ
らをAsp718およびBamH III消化したpZS96の中に結合し
た。pZS96実施例19に記載するように調製した。pZS96プ
ラスミドの中に存在するＡ−SU1キメラ遺伝子をもつ生
ずるプラスミドはpZ6A−SU1であり、そして第25A図に示
す。pZS96プラスミドの中に存在するＡ−Ｔ−SU1キメラ
遺伝子をpZ6A−SU1と呼び、そして第25B図に示す。
pZ6A−SU1およびpZ6A−Ｔ−SU1の各々をアグロバクテ
リウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacie
ns）株LBA4404の中に、植物の分子生物学のマニュアル
（Plant Molecular Biology Mnual）、SBゲルビン
（Gelvin）ら編、クルワー・アカデミック・プレス（Kl
uwer Academic Press）PMAN−A3/7、1988、ここに引
用によって加える、に記載されている手順に従い、直接
のDNAの吸収により形質転換した。100μg/mlのカナマイ
シンおよび100μg/mlのカルベニシリンを含有し、スク
ロースを含むミニＡ培地上で選択したアグロバクテリウ
ム（Agrobacterium）のコロニーの中の各完全なベクタ
ーの存在を、ミニプレプDNAの制限酵素の消化により評
価した。Nicotiana tabacum cv.Xanthiの葉のディス
クを、構成したプラスミドを有するアグロバクテリウム
（Agrobacterium）で接種し、そしてカナマイシン抵抗
性の植物を前述したようにして得た。
Ａ−Ｔ−SU1遺伝子で形質転換した21の植物およびＡ
−SU1遺伝子で形質転換した15の植物を成熟まで成長さ
せた。各植物から、花弁がまだ分離していない早期の発
育段階の蕾の５つから葯を切除し、そして液体窒素の中
で凍結させた。ベルウェード（Verwoerd）ら、核酸の研
究（Nucleic Acids Res.）17:2362、1989の手順に従
いRNAを調製し、そして植物の中に導入されたキメラSU1
遺伝子により産生されたメッセンジャーRNA（mRNA）の
存在についてノザンブロット上で分析した。ノザンブロ
ットはレイブ（Rave）ら、核酸の研究（Nucleic Acids
Res.）6:3559−3569、1979、ここに引用によって加え
る、に従い調製し、そしてマニアチス（Maniatis）ら、
分子クローニング：実験室のマニュアル（Molecular C
loning:A Laboratory Manual）、コールド・スプリン
グ・ハーバー、ニューヨーク州、ここに引用によって加
える、に記載されているようにしてプロービングした。
使用したプローブの断片は、トランシット配列の一部分
およびSU1解読配列を含有するSSU−SU114から分離したP
st I断片であった。このプローブはＡ−SU1およびＡ−
Ｔ−Su1 mRNAならびにルビスコの小さいサブユニット
のmRNAを検出した（トランシット配列との相同性のため
に）。
いくつかの植物において、SU1 mRNAは葯の中に検出
されず、そしてこれらの植物はそれ以上分析しなかっ
た。葯中のSU1 mRNAの発現を示す植物をさらに分析し
て、SU1 mRNAの発現が葯特異的かどうかを決定した。
葉のDNAを各植物から調製し、そして同一植物から分離
した葯のDNAとノザンブロット上で比較した。各植物か
らの葉の中のSU1 mRNAおよび葯のRNA試料のレベルを比
較して、葯のSU1 mRNAが葉のSU1 mRNAより大きい頻度
で存在する植物を区別した。「葯特異的」は、ここで使
用するとき、葯特異的プロモーターにより調節される遺
伝子の発現が主として所望の葯の組織の中であることを
意味する。葯の中でＡ−Ｔ−SU1 mRNAを発現する14植
物のうちで、71％は葯特異的発現を示した。「葯」は物
理学的に花粉を含有する花の部分を呼ぶ。発育のすべて
の段階にある、花粉の粒子は葯の一部分であると考え
る。簡素化を目的として、この用語は配偶子を同様に包
含する。「配偶子」とは、他の配偶子との融合により新
しい個体を形成することができる成熟ゲルン（gern）細
胞を意味する。葯の中でＡ−SU1 mRNAが発現する12植
物のうちで、42％は葯特異性を示した。こうして、TA29
プロモーターにより調節されるSU1解読領域を受け取る
植物の間でいくつかの変動性が存在したが、P450SU1遺
伝子の葯特異的発現を有する植物がつくられた。
生ずるデータは次の通りであった： Ａは葯を意味し、Ｌは葉を意味する。
Ａ−Ｔ−SU1植物:A＞＞L:17A,33A,41A,43A,56A Ａ＞L:13A,24A,28A,31B,38A Ａ＝L:61A,63A,64B Ａ＜L:52B no A:7A,12A,23A,37A,59A,62B 植物65Aは蕾を産生しなかった。
Ａ−SU1植物:A＞＞L:19A,31A,34A Ａ＞L:26A,56A Ａ＝L:36C,52A,59A Ａ＜L:11B,32A,40A,64B no A:3A,8A 植物14Aは蕾を産生しなかった。
化合物10015の適用は次の通りであった。葯の芽胞嚢
細胞は発育する花粉を取り囲み、そして成熟花粉の発育
を支持に役立つ。こうして、芽胞嚢細胞の中の毒素の産
生は正常の成熟花粉の発育を崩壊することが期待され
た。無毒の化合物10015を、P450SU1 mRNAの葯特異的発
現を有する、花成するトランスジェニック植物上に噴霧
した。植物は、14〜25mlの5.3〜95μgmlの10015から成
る、４〜128g/ヘクタールの割合で手で噴霧した。10015
を、まず、0.8mlまでの0.01Nの水酸化アンモニウムの中
に溶解し、次いでAGWT（90.2％のアセトン:4.8％のグリ
セロール:4.8％の水:0.24％のツイーン20、容量）の中
に希釈した。32g/haより低い割合を適用したとき、効果
はほとんど見られなかった。32g/haまたはそれ以上にお
いて、試験管内で発芽する花粉の能力について効果が見
られた。新しく開いた蕾を、噴霧後１時間〜23日の間の
時間間隔で集めた。葯を除去し、そして花粉をブレウベ
イカー・アンド・クワク（Brewbaker and Kwak）培地
（15％のスクロース、200ppmのクエン酸カルシウム、10
0ppmのホウ酸）の中にブラシで入れた。花粉から管の成
長は、発芽を示し、４時間インキュベーション後に顕微
鏡観察により評価した。
10015の適用後に集めたトランスジェニック植物のい
くつかからの花粉は、試験管内発芽する能力の減少を示
した。Ａ−Ｔ−SU1遺伝子の葯特異的発現を有する２つ
の植物（41Aおよび56A）からの植物の発芽は、32g/haの
10015（20ml中の0.59mg）の適用後７〜11日に０％に減
少した。発芽はこれらの植物の１つについて18日を通じ
て、そして他の植物について13日を通じて0.1％より小
に停止した。これらの他の植物（31B、43B、24A）は、
また、数日〜１週の期間の間に０〜２％の間で変化する
花粉発芽速度の減少を有した。10015の同一適用を受け
た対照の非形質転換植物からの花粉は、この時間の期間
にわたって50％〜90％（蕾の間で変化する）の速度で発
芽した。100g/ha（24ml中の1.85mg）を噴霧した２つの
他のトランスジェニック植物は大きく影響を受けた：一
方（植物28A）は処理後７〜14日に花粉の発芽をもた
ず、そして21日に0.1％より小さい発芽を有し、他方
（植物38A）は７〜11日に花粉の発芽をもたなかった
が、14日に１〜25％（蕾の間で変化する）に増加した。
こうして、Ａ−Ｔ−SU1の葯特異的発現を有する10植物
のうちで７植物は、10015の適用後試験管内の花粉の生
活可能性を減少し、そして３植物は１週またはそれ以上
の間花粉の生活可能性のほとんど完全な不存在を示し
た。
Ａ−SU1を発現するトランスジェニック植物は10015の
適用により影響を受けなかった:2植物は花粉の生活可能
性のほんのわずかの減少を示しただけであった。
こうして、試験管内の花粉の発芽のアッセイにより、
TA29プロモーターからのp450SU1遺伝子を発現し、そし
てp450SU1 mRNAの葯特異的発現を示すトランスジェニ
ック植物に10015を適用すると、花粉の生活可能性は実
質的に減少することが実証された。処理した植物からの
花粉の生体内で機能する能力は、それを使用して、対照
の未処理植物の除雄した花を交雑受精することによって
試験している。処理した植物の雌受精は、未処理対照植
物からの花粉でこれらの植物の除雄した花を交雑受精す
ることによって試験している。前述の10015の適用によ
り最も影響を受けた３植物は、試験管内の花粉の発芽が
最低であるときの時間期間の間、雄不稔の、雌受精植物
として挙動することが期待される。
実施例29 p450SU1の遺伝子を含有するバクテリアによる非スルホ
ニル尿素の除草剤の代謝 この実験は、実施例17におけるように、次の変化を用
いて実施した。S.lividans C37、pCAO200SU1−FeS−Ｂ
＃９で形質転換したS.lividans、またはS.griseolus A
TCC11796とインキュベーションした別々の培養物（50m
l）を、胞子形成ブロスの中で18時間30℃において震盪
しながら培養した。次いで、各培養物を25mlの新鮮な胞
子形成ブロスの中に再懸濁し、そして3.0mgの除草剤を
添加した。各培養物を18時間再インキュベーションし、
次いで培地アリコートを抜き出し、そしてHPLCにより分
析した。除草剤の転化率を決定した。
除草剤の転化率を表29に表す。表29の中のデータが示
すように、構成的に発現したP450SU1を含有するバクテ
リアは非スルホニル尿素除草剤10033、10034、10035お
よび10036を代謝した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ５６９，７８１ (32)優先日 平成２年８月23日(1990．8．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 レト，ケネス・ジヨセフ アメリカ合衆国デラウエア州19810ウイ ルミントン・マジエステイツクドライブ 2640 (72)発明者 リクトナー，フランシス・トーマス，ジ ユニア アメリカ合衆国デラウエア州19701ベア ー・グリーンスプリングドライブ620 (72)発明者 オデル，ジヨーン・テレフセン アメリカ合衆国ペンシルベニア州19375 ユニオンビル・モニタープレイス127 (72)発明者 オキーフ，ダニエル・パトリツク アメリカ合衆国ペンシルベニア州19078 リドリーパーク・シヨーロード328 (72)発明者 オマー，チヤールズ・アンソニー アメリカ合衆国ペンシルベニア州19335 ダウニングタウン・ノーウツドロード 406 (72)発明者 ロームサー，ジエイムズ・アラン アメリカ合衆国デラウエア州19810ウイ ルミントン・フオレストロード1804 (72)発明者 ラツセル，サンドラ・ホフ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19311 エイボンデイル・クツクコート９ (72)発明者 テツパーマン，ジエイムズ・マイケル アメリカ合衆国カリフオルニア州94610 オークランド・ベルビユーアベニユー 393 (56)参考文献 特開 昭64−2585（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏ ｌ．261，Ｎｏ．３（1986）ｐ．1158− 1163 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/53 C12N 9/02 A01H 5/00 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ａ）ｉ）次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU1をコードするD
    NA配列； ii）次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU2をコードするD
    NA配列： iii）上記ｉ）のチトクロムP450酵素P450SU1をコードす
    るDNA配列または上記ii）のチトクロームP450酵素P450S
    U2をコードするDNA配列のいずれかと、次の配列： を含んでなる鉄硫黄タンパク質FeS−ＢをコードするDNA
    配列との組合わせ； および iv）上記ｉ）のチトクロムP450酵素P450SU1をコードす
    るDNA配列またはチトクロムP450酵素P450SU2をコードす
    るDNA配列のいずれかと、次の配列： を含んでなる鉄硫黄タンパク質FeS−ＡをコードするDNA
    配列との組合わせ よりなる群から選ばれるセグメント、 Ｂ）各該DNA配列の上流に操作可能に結合した植物プロ
    モーター配列、 Ｃ）各該DNA配列の上流に操作可能に結合した５′−非
    翻訳配列、ならびに Ｄ）各該DNA配列の下流に操作可能に結合した、組換え
    プラスミドから転写されるmRNAをその３′末端上でポリ
    アデニル化させうる３′−非翻訳配列 を含んでなる組換えプラスミド。
  2. 【請求項２】プロモーターが、カリフラワーモザイク病
    ウイルス（Cauliflower Mosaic Virus）からの35Sプロ
    モーター、ペチュニアからのSSU301遺伝子からのプロモ
    ーター、ペチュニアからのCab22L遺伝子からのプロモー
    ターおよび組織特異性プロモーターよりなる群から選ば
    れる請求項１記載のプラスミド。
  3. 【請求項３】３′−非翻訳配列が、ペチュニアからのSS
    U301遺伝子およびアグロバクテリウム・ツメファシエン
    ス（Agrobacterium tumefa ciens）のＴ−DNAから誘導
    されるノパリンシンセターゼのための遺伝子のものより
    なる群から選ばれる請求項１記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】プロモーターおよび５′−非翻訳配列がカ
    リフラワーモザイク病ウイルスからの35Sプロモータ
    ー、ペチュニアからのSSU301遺伝子からのプロモーター
    またはペチュニアからのCab22L遺伝子からのプロモータ
    ーのものであり、そして３′−非翻訳配列がペチュニア
    からのSSU301遺伝子のものである請求項１記載のプラス
    ミド。
  5. 【請求項５】該プラスミドが （ｉ） トランジットペプチドコード配列、および （ii） 葉緑体に移入されるタンパク質をコードする核
    遺伝子の成熟コード配列 よりなる群から選ばれる核酸コード配列を含んでなり、
    該核酸コード配列がチトクロムP450のアミノ末端をコー
    ドするDNA、あるいはチトクロムP450およびFeSタンパク
    質のアミノ末端をコードするDNAに操作可能に結合して
    いる請求項１記載のプラスミド。
  6. 【請求項６】トランジットペプチドコード配列が、ペチ
    ュニアのリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ
    遺伝子からのものまたはペチュニアのクロフィルa/b結
    合タンパク質遺伝子からのものよりなる群から選ばれる
    請求項５記載のプラスミド。
  7. 【請求項７】Ａ）次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU1および鉄硫黄
    タンパク質FeS−ＢをコードするDNA配列；または Ｂ）次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU2および鉄硫黄
    タンパク質FeS−ＡをコードするDNA配列 を含んでなる形質転換された双子葉植物。
  8. 【請求項８】Ａ）次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU1をコードするD
    NA配列と次の配列： を含んでなる鉄硫黄タンパク質FeS−ＡをコードするDNA
    配列との組合わせ；または Ｂ）次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU2をコードするD
    NA配列と次の配列： ValGluAspThrGlu を含んでなる鉄硫黄タンパク質FeS−ＢをコードするDNA
    配列との組合わせ で形質転換された双子葉植物。
  9. 【請求項９】請求項１または５のいずれかに記載のプラ
    スミドで形質転換された双子葉植物。
  10. 【請求項１０】双子葉植物に請求項１または５のいずれ
    かに記載のプラスミドを導入し、そして除草剤化合物を
    代謝しうる植物を選択することを特徴とする、除草剤化
    合物を代謝するように双子葉植物を形質転換する方法。
  11. 【請求項１１】除草剤がスルホニル尿素である請求項10
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】除草剤が、３−シクロヘキシル−１−メ
    チル−６−ジメチルアミノ−Ｓ−トリアジン−2,4（1H,
    3H）ジオン;4−アミノ−６−tert−ブチル−３−（メチ
    ルチオ）−AS−トリアジン−５（4H）オン;7−クロロ−
    ５−フルオロ−４−（2,3,4,5,6,7−ヘキサヒドロ−1,3
    −ジオキソ−1H−イソインドール−２−イル）−2,3−
    ジヒドロ−２−ベンゾフラン−カルボン酸、メチルエス
    テル;2−［（４−クロロ−６−（エチルアミノ−1,3,5
    −トリアジン−２−イル）−アミノ］−２−メチルプロ
    パンニトリル;1−メチル−２（1H）−ピリミジノン;3−
    （３−クロロ−ｐ−トリル）−1,1−ジメチルウレア;N
    −（２−クロロ−６−メチルフエニル）−5,7−ジメチ
    ル−1,2,4−トリアゾロ−1,5A−ピリミジン−２−スル
    ホンアミド;2−［（4,5−ジヒドロ−４−メチル−４−
    （１−メチルエチル）−1H−イミダゾール−２−イ
    ル）］−５−エチル−３−ピリジンカルボン酸;2−
    ［（4,5−ジヒドロ−４−メチル−４−（１−メチルエ
    チル）−５−オキソ−1H−イミダゾール−２−イル］−
    ３−キノリンカルボン酸；またはＮ−（2,6−ジクロロ
    フエニル）−4,6−ジメチル−２−ピリミジンスルホン
    アミドよりなる群から選ばれる請求項10記載の方法。
  13. 【請求項１３】親双子葉植物を請求項１または５のいず
    れかに記載のプラスミドで形質転換して除草剤化合物を
    代謝するP450SU1酵素を発現する子孫植物を生産するこ
    とを特徴とする双子葉植物、子孫および種子中の除草剤
    の残留を減少させる方法。
  14. 【請求項１４】除草剤がスルホニル尿素である請求項13
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】除草剤が、３−シクロヘキシル−１−メ
    チル−６−ジメチルアミノ−Ｓ−トリアジン−2,4（1H,
    3H）ジオン;4−アミノ−６−tert−ブチル−３−（メチ
    ルチオ）−AS−トリアジン−５（4H）オン;7−クロロ−
    ５−フルオロ−４−（2,3,4,5,6,7−ヘキサヒドロ−1,3
    −ジオキソ−1H−イソインドール−２−イル）−2,3−
    ジヒドロ−２−ベンゾフラン−カルボン酸、メチルエス
    テル;2−［（４−クロロ−６−（エチルアミノ−1,3,5
    −トリアジン−２−イル）−アミノ］−２−メチルプロ
    パンニトリル;1−メチル−２（1H）−ピリミジン;3−
    （３−クロロ−ｐ−トリル）−1,1−ジメチルウレア;N
    −（２−クロロ−６−メチルフエニル）−5,7−ジメチ
    ル−1,2,4−トリアゾロ−1,5A−ピリミジン−２−スル
    ホンアミド;2−［（4,5−ジヒドロ−４−メチル−４−
    （１−メチルエチル）−1H−イミダゾール−２−イ
    ル）］−５−エチル−３−ピリジンカルボン酸;2−
    ［（4,5−ジヒドロ−４−メチル−４−（１−メチルエ
    チル）−５−オキソ−1H−イミダゾール−２−イル］−
    ３−キノリンカルボン酸；またはＮ−（2,6−ジクロロ
    フエニル）−4,6−ジメチル−２−ピリミジンスルホン
    アミドよりなる群から選ばれる請求項13記載の方法。
  16. 【請求項１６】次の配列 を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU1および鉄硫黄
    タンパク質FeS−Ｂをコードする単離されたDNA分子。
  17. 【請求項１７】次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU1をコードする
    単離されたDNA分子。
  18. 【請求項１８】次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU2および鉄硫黄F
    eS−ＡをコードするDNA分子。
  19. 【請求項１９】次の配列： を含んでなるチトクロムP450酵素P450SU2をコードする
    単離されたDNA分子。
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8610785D0 (en) * 1986-05-02 1986-07-09 Vickers Plc Attachment for armoured vehicle
US5240831A (en) * 1991-01-10 1993-08-31 Board Of Regents, The University Of Texas Methods and compositions for the expression of biologically active eukaryotic cytochrome p45os in bacteria
US5420027A (en) * 1991-01-10 1995-05-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the expression of biologically active fusion proteins comprising a eukaryotic cytochrome P450 fused to a reductase in bacteria
GB9103314D0 (en) * 1991-02-16 1991-04-03 Imp Cancer Res Tech Assay systems
USRE36449E (en) * 1991-03-05 1999-12-14 Rhone-Poulenc Agro Chimeric gene for the transformation of plants
DE4126414A1 (de) * 1991-08-09 1993-02-11 Hoechst Ag Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
EP0618972A1 (en) * 1991-12-16 1994-10-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company CONSTITUTIVE EXPRESSION OF P450SOY AND FERREDOXIN-SOY IN $i(STREPTOMYCES), AND BIOTRANSFORMATION OF CHEMICALS BY RECOMBINANT ORGANISMS
WO1994000576A1 (en) * 1992-06-25 1994-01-06 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Vitamin d hydroxylase gene
GB9216151D0 (en) * 1992-07-29 1992-09-09 Ici Plc Containment of plant germplasm
US5409823A (en) * 1992-09-24 1995-04-25 Ciba-Geigy Corporation Methods for the production of hybrid seed
EP0701619A1 (en) * 1993-06-08 1996-03-20 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
EP0628635A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-14 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
WO1995030745A1 (en) * 1994-05-10 1995-11-16 Cornell Research Foundation, Inc. CYTOCHROME P4501pr GENE AND ITS USES
US5824859A (en) * 1994-07-08 1998-10-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Blue light photoreceptors and methods of using the same
US6121512A (en) * 1997-10-10 2000-09-19 North Carolina State University Cytochrome P-450 constructs and method of producing herbicide-resistant transgenic plants
US6054638A (en) * 1997-12-03 2000-04-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean ADP ribosylation factor
WO2000000502A1 (en) * 1998-06-26 2000-01-06 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois MAIZE CYTOCHROME P450 MONOOXYGENASE cDNA (CYP71C3v2)
US6380465B1 (en) * 1998-07-12 2002-04-30 University Of Kentucky Research Foundation Cytochrome P450 enzymes and related compounds and methods
WO2000012732A2 (en) * 1998-08-28 2000-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Organelle targeting sequences
CN1301759A (zh) * 1999-12-27 2001-07-04 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人铁硫蛋白10和编码这种多肽的多核苷酸
BRPI0213411B1 (pt) * 2001-10-19 2015-11-03 Sumitomo Chemical Co dna codificando uma proteína de metabolização de herbicida, seu uso, vetor e micro-organismo transgênico compreendendo o mesmo, métodos de produção de um transformante, da referida proteína, de obtenção e detecção do referido dna e de identificação de uma célula compreendendo o referido dna
DE10204843A1 (de) * 2002-02-06 2003-08-14 Gsf Forschungszentrum Umwelt Arabidopsis Thaliana-Array
JP4736480B2 (ja) 2004-05-17 2011-07-27 住友化学株式会社 雑草防除方法
JP4720223B2 (ja) * 2004-05-18 2011-07-13 住友化学株式会社 除草活性化合物耐性植物
US20060211553A1 (en) * 2005-03-16 2006-09-21 Cantor Zachary M Balance platform method and apparatus
US8097774B2 (en) * 2007-05-30 2012-01-17 Syngenta Participations Ag Cytochrome P450 genes conferring herbicide resistance
WO2011068567A1 (en) 2009-07-10 2011-06-09 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
CA2749524C (en) 2009-01-22 2021-07-06 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
EP2521441A4 (en) 2010-01-07 2013-10-23 Basf Agro B V Arnhem Nl Zuerich Branch HERBICID TOLERANT PLANTS
TWI667347B (zh) 2010-12-15 2019-08-01 瑞士商先正達合夥公司 大豆品種ｓｙｈｔ０ｈ２及偵測其之組合物及方法
AR100017A1 (es) 2013-08-12 2016-09-07 Basf Se Hidroxifenilpiruvato dioxigenasas resistentes a herbicidas
US11248234B2 (en) 2015-02-11 2022-02-15 Basf Se Herbicide-resistant hydroxyphenylpyruvate dioxygenases
CR20180597A (es) 2016-05-20 2019-05-07 Basf Agro Bv Péptidos de tránsito dual para el direccionamiento a polipéptidos
WO2018019860A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 BASF Agro B.V. Plants having increased tolerance to herbicides
UA127971C2 (uk) 2017-11-29 2024-02-28 Басф Се Спосіб контролю за небажаною рослинністю на ділянці вирощуванння рослини
AU2022340861A1 (en) 2021-09-03 2024-03-14 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Plants having increased tolerance to herbicides

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX7065E (es) * 1980-06-06 1987-04-10 Sankyo Co Un procedimiento microbiologico para preparar derivados de ml-236b
US4720454A (en) * 1984-04-18 1988-01-19 White Perrin C Genetic probe used in the detection of adrenal hyperplasia
EP0215665B1 (en) * 1985-09-13 1991-11-21 Sankyo Company Limited Hydroxy-ml-236b derivatives, their preparation and use
JPS63162563A (ja) * 1986-12-25 1988-07-06 大日本インキ化学工業株式会社 セメント分散剤
US5169755A (en) * 1986-12-30 1992-12-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for inducing cytochrome P-450 enzymes in streptomyces bacteria and determining the mutagenicity of chemicals
DE3850589T2 (de) * 1987-02-02 1995-04-27 Sankyo Co Cytochrom-P-450-Enzyme.
EP0331083A3 (de) * 1988-03-02 1990-11-28 Schweizerische Eidgenossenschaft Eidgenössische Technische Hochschule (Eth) Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊ．Ｂｉｏｌ．．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６１，Ｎｏ．３（１９８６）ｐ．１１５８−１１６３

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CA2065439A1 (en) 1991-03-12
DE69024979T2 (de) 1996-10-17

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