DK175642B1 - Planteceller frembragt ved genetisk konstruktion, som er resistente over for glutaminsyntetaseinhibitiorer - Google Patents

Description

DK 175642 B1

Den foreliggende opfindelse angår non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf, som udviser resistens mod glutaminsyntetase-inhibitorer, samt passende DNA-fragmenter og -rekombinanter indeholdende nukleotidsekvenser, der koder for resistens 5 mod glutamin-^syntetase-inhibitorer.

Glutamin-syntetase (herefter kort betegnet GS) udgør i de fleste planter et af de essentielle enzymer for udviklingen og levedygtigheden af planteceller. Det er kendt at GS omdanner glutamat til glutamin. GS er involveret i en effektiv rute (den eneste i dag kendte) i dé fleste 10 planter til detoksificering af ammoniak frigjort ved nitratreduktion, aminosyrenedbrydning eller fotorespiration. Virkningsfulde inhibitorer for GS er derfor meget toksiske for planteceller. Der er blevet udviklet en særlig gruppe af herbicider, baseret på den toksiske virkning som følge af inhiberingen af GS i planter.

15 Disse herbicider omfatter som aktiv bestanddel en GS-inhibitor.

Der findes mindst to mulige måder, som kan føre til planters resistens mod inhibitorerne af glutamin-syntetasens virkning. (1) Ændring af målet. Det kan forstås, at mutationer i GS-enzymet kan føre til in-sensitivitet mod herbicidet. (2) Inaktivering af herbicidet. Nedbrydning 20 eller modifikation af herbicidet inde i planten kunne føre til resistens.

Bialaphos og phosphinothricin (herefter kort betegnet PPT) er to sådanne inhibitorer for virkningen af GS (ref. 16, 17), og de er blevet påvist at besidde fremragende herbicide egenskaber (se mere specielt 25 ref. 2 med hensyn til Bialaphos).

Bialaphos har følgende formel (I): ch3 nh2 ch3 ch3

HO - P - CH2 - CH2 - C - CONH - C - CONH - C - C00H

30 0 Η Η H

PPT har følgende formel (II):

I DK 175642 B1 I

i 2 I

I CH3 nh2 I

I HO - P - CH2 - CH2 - CH - I

I O COOH I

I 5 Den strukturelle forskel mellem PPT og Bialaphos ligger således i I

I fraværet af to alanin-aminosyrer i tilfælde af PPT. H

I Disse to herbicider er non-selektive. De inhibirer vækst af alle I

I de forskellige plantearter, som er til stede på jorden og bevirker såle- I

I des deres totale destruktion. r---· I 10 Bialaphos blev først beskrevet som i besiddelse af antibiotiske I egenskaber, hvilket muliggjorde, at forbindelsen kunne anvendes som et

pesticid eller et fungicid. Bialaphos kan fremstilles i henhold til den I

I i US patent nr. 3.832.394, overdraget til Meiji Seika Kaisha Ltd., be- I

I skrevne fremgangsmåde, hvilket patentskrift herved inkorporeres med hele

15 sit indhold. Fremgangsmåden omfatter dyrkning af Streptomvces hvorosco- I

picus. såsom den staimne, der er tilgængelig fra American Type Culture I

I Collection under ATCC nr. 21.705, og Bialaphos udvindes fra dens dyrk- I

I ningsmedium. Andre stammer, såsom Stretomvces viridochromoqenes produce-

I rer imidlertid også denne forbindelse (ref. 1). I

I 20 Andre tripeptid-antibiotika, som indeholder en PPT-del, findes I

1igeledes eller kunne blive opdaget i naturen, fx phosalasin (ref. 15). I

PPT opnås også ved kemisk syntese og distribueres kommercielt af I

firmaet Hoechst. I

Der er blevet beskrevet et antal Streptomyces-arter, som produce- I

25 rer stærkt aktive antibiotika, der vides at inhabilitere procaryotiske I

cellefunktioner eller enzymer. Streptomycesarterne, der producerer disse I

antistoffer, ville i sig selv blive ødelagt, hvis ikke de havde en selv- I

I forsvarsmekanisme mod disse antibiotika. Denne selvforsvarsmekanisme er I

H i adskillige tilfælde blevet fundet at omfatte et enzym, der er i stand I

30 til at inhibere den antibiotiske virkning og således undgå autotoksici- I

tet for den pågældende Streptomyces-art. Denne modifikation reverseres I

generelt, når molekylet eksporteres fra cellen. I

Eksistensen af et gen, som koder for et enzym, der er i stand til I

at modificere antibiotiket, således at det inhiberer den antibiotiske I

35 virkning mod værten, er blevet påvist i adskillige Streptomyces, der I

producerer antibiotika, fx i S. fradi ae. S. azureus. S. vinaceus. 5L I

ervthreus. der producerer hhv. neomycin- thiostrepton-, viomycin- og I

3 DK 175642 B1 MLS- (Macrolid Lincosamid Streptogramin) antibiotika (ref. 4), (ref. 5), (ref. 6), (ref. 14 af Chater et al, 1982, beskriver standardteknikker, som kan anvendes til at fremkalde disse virkninger).

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse har det vist 5 sig, at Streptomvces hvoroscopicus ATCC 21.705 også besidder et gen, der koder for ét enzym, som e.r ansvarligt for inaktiveringen af de antibiotiske egenskaber af Bialaphos. Forsøg udført af ansøgerne har ført til isolering af et sådant gen og dets anvendelse i en fremgangsmåde til kontrol af virkningen af GS-inhibitorer, baseret på PPT eller afledte 10 produkter.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer hidtil ukendte non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf, som udviser resistens mod glutaminsyntetase-inhibitorer (GS-inhibitorer) i frø, planteceller og planter.

15 Opfindelsen tilvejebringer ligeledes non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf omfattende DNA-fragmenter og DNA-rekom-binanter, især modificerede vektorer indeholdende disse DNA-fragmenter, hvilke DNA-fragmenter indeholder nukleotidsekvenser, der ved inkorporering i frø, planteceller og planter er i stand til at beskytte disse mod 20 virkningen af GS-inhibitorer.

Opfindelsen tilvejebringer endvidere non-biologisk transformerede frø, planteceller og planter, der er i stand til at neutralisere eller inaktivere GS-inhibitorer.

Opfindelsen tilvejebringer yderligere non-biologisk transformerede 25 frø, planter og celler deraf, som er selektivt beskyttede mod herbicider af en GS-i nhi bi tortype.

Mere specielt tilvejebringer opfindelsen et DNA-fragment, der kan overføres til planteceller og til hele planter, og som er i stand til at beskytte disse mod de herbicide virkninger af Bialaphos samt af struk-30 turelt analoge herbicider.

Yderligere tilvejebringer opfindelsen planteceller, der er resistente mod produkterne af den klasse, der eksemplificeres af Bialaphos, hvilke produkter har PPT-enheden i deres struktur.

I en foretrukket udførelsesform er planterne forsynet med et 35 heterologt DNA-fragment med en fremmed nukleotid sekvens, der er i stand til at blive udtrykt i form af et protein i disse planteceller og planter, under sådan betingelse, at det heterologe DNA-fragment bringes

I DK 175642 B1 I

i I

I til at blive stabilt integreret gennem generationer i planternes celler,

I og hvor proteinet har en enzymatisk aktivitet, der er i stand-til at I

I inaktivere eller neutralisere glutamin-syntetase-inhibitoren.

I Et foretrukket DNA-fragment er et, som afledes af en antibiotika I

I 5 producerende Streptomyces stamme (eller en sekvens omfattende en nukleo- I

I tidsekvens, der koder for den samme aktivitet), og som koder for resi- I

I stens mod disse GS-inhibitorer. I

I Foretrukne nukleotidsekvenser til anvendelse i forbindelse med den I

I foreliggende opfindelse koder for et protein, der har acetyl-transfera- I

10 se-aktivitet med hensyn til GS-inhibitorerne. I

I Et yderligere foretrukket DNA-fragment ifølge opfindelsen omfatter

I en nukleotid sekvens, der koder for et polypeptid med en PPT-acétyl- I

I transferase-aktivitet. I

I Et særligt foretrukket DNA-fragment ifølge den foreliggende I

15 opfindelse til den efterfølgende transformering af planteceller, består I

I af en nukleotid sekvens, der koder for i det mindste en del af et I

I polypeptid med følgende sekvens:

I 20 X SER PRO GLU I

I I

ARG ARG PRO ALA ASP ILE ARG ARG ALA THR GLU ALA ASP MET PRO I

I 228 I

B ALA VAL CVS THR ILE VAL ASN HIS TYR ILE GLU THR SER THR VAL I

B 25 273 I

B ASN PHE ARG THR GLU PRO GLN GLU PRO GLN GLU TRP THR ASP ASP I

B 318 I

B LEU VAL ARG LEU ARG GLU ARG TYR PRO TRP LEU VAL ALA GLU VAL I

B 363 ' I

B 30 ASP GLY GLU VAL ALA GLY ILE ALA TYR ALA GLY PRO TRP LYS ALA I

B 408 I

B ARG ASN ALA TYR ASP TRP THR ALA GLU SER THR VAL TYR VAL SER I

B 453 I

B PRO ARG HIS GLN ARG THR GLY LEU GLY SER THR LEU TYR THR HIS I

B 35 498 I

B LEU LEU LYS SER LEU GLU ALA GLN GLY PHE LYS SER VAL VAL ALA I

B 543 I

5 DK 175642 B1 VAL ILE GLY LEU PRO ASN ASP PRO SER VAL ARG MET HIS GLU ALA 588 ~ LEU GLY TYR ALA PRO ARG GLY MET LEU ARG ALA ALA GLY PHE LYS 633 5 HIS GLY ASN TRP HIS ASP VAL GLY PHE TRP GLN LEU ASP PHE SER 678 LEU PRO VAL PRO PRO ARG PRO VAL LEU PRO VAL THR GLU ILE 723 10 hvori X betegner MET eller VAL, hvilken del af polypeptidet er af tilstrækkelig længde til at bevirke beskyttelse mod Bialaphos hos planteceller ved genetisk inkorporering og ekspression deri, dvs. med - som i det følgende kaldet - "plantebeskyttende evne" mod Bialaphos.

Endnu et særligt foretrukket DNA-fragment består af følgende 15 nukleotid sekvens: GTG AGC CCA GAA 183

CGA CGC CCG GCC GAC ATC CGC CGT BCC ACC GAB GCB GAC ATB CCB

20 228 GCG GTC TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC GAG ACA AGC ACB GTC 273 AAC TTC CGT ACC GAG CCG CAG GAA CCG CAG GAG TGG ACG GAC GAC 318 25 CTC GTC CGT CTG CGG GAG CGC TAT CCC TGG CTC GTC GCC GAG GTB 363 GAC GGC GAG GTC GCC GGC ATC GCC TAC GCG GGC CCC TGG AAG GCA 408

CGC AAC GCC TAC GAC TGG ACG GCC GAG TCG ACC GTG TAC GTC TCC

30 453 CCC CGC CAC CAG CGG ACG GGA CTG GGC TCC ACG CTC TAC ACC CAC 498 CTG CTG AAG TCC CTG GAG GCA CAG GGC TTC AAG AGC GTG GTC GCT 543 35 GTC ATC GGG CTG CCC AAC GAC CCG AGC GTG CGC ATG CAC GAG GCG 588

CTC GGA TAT GCC CCC CGC GGC ATG CTG CGG GCG GCC GGC TTC AAG

6 I

DK 175642 B1 I

633 I

CAC GGG AAC TGG CAT GAC GTG GGT TTC TGG CAG CTG GAC TTC AGC - I

678 I

CTG CCG GTA CCG CCC CGT CCG GTC CTG CCC GTC ACC GAG ATC I

5 723 I

eller af en del deraf, der udtrykker et polypeptid med plantebeskyttende I

evne mod Bialaphos. I

Opfindelsen angår endvidere non-biologisk transformerede'frø, I

10 planter og celler deraf omfattende et vilkårligt DNA-fragment, som afvi- I

ger fra det ovenfor angivne foretrukne fragment ved erstatning af enhver I

af dets nukleotider med andre, dog uden at modificere den genetiske I

information af den ovenfor omtalte foretrukne DNA-sekvens (normalt inden I

for betydningen af den universelle genetiske kode) og yderligere enhver I

15 ækvivalent DNA-sekvens, som ville kode for et polypeptid med de samme I

egenskaber, især en Bialaphos-resistens-aktivitet. I

I Det vil kunne forstås, at fagmanden let vil være i stand til at I

H fastlægge de dele af nukleotidsekvenserne, som vil kunne fjernes fra en I

H vilkårlig side af ethvert af DNA-fragmenterne ifølge opfindelsen, fx ved I

H 20 at fjerne terminale dele på enhver side af DNA-fragmentet, såsom ved I

hjælp af et exonukleolytisk enzym, fx Bal31, ved rekloning af det til- I

bageblevne fragment i et passende plasmid og ved at undersøge det modi- I

ficerede plasmids evne til at transformere passende celler og til at I

beskytte det mod Bialaphos-antibiotiket eller -herbicidet som senere I

25 forklaret, uanset hvilken prøve, der er passende. I

Af sproglige nemhedsgrunde vil disse DNA-fragmenter herefter blive I

betegnet som "Bialaphos-resistens DNA". På tilsvarende måde vil det I

tilsvarende polypeptid blive betegnet som "Bialaphos-resistens enzym". I

Selv om der i den foregående diskussion er blevet lagt særlig vægt I

30 på DNA-fragmenter, der ved indføring i planteceller og planter er i . I

stand til at bibringe disse beskyttelse mod Bialaphos eller PPT, skal I

det forstås, at opfindelsen på ingen måde er begrænset til sådanne DNA- I

fragmenter. I

H På samme måde angår opfindelsen DNA-fragmenter, der ved indføring - I

35 i sådanne planteceller også vil bibringe disse en beskyttelse mod andre I

GS-inhibitorer, fx af mellemprodukter, der er involveret i den naturlige I

biosyntese af phosphinotricin, såsom de forbindelser, der betegnes ved I

I DK 175642 B1 forkortelserne MP101 (II), MP102 (IV), hvis formler er angivet nedenfor: 0 nh2 HO - P - CH2 - CH2 - CH - COOH (III)

5 H

o nh2 10 HO - P - CH2 - CH2 - CH -CO-Ala-Ala (IV)

Mere alment har opfindelsen åbnet vejen for fremstillingen af DNA-fragmenter, der ved passende inkorporering i planteceller og planter kan 15 beskytte disse mod GS-inhibitorer, når de bringes i kontakt dermed, således som dette vil blive vist på detaljeret måde i relation til Bialaphos og PPT i efterfølgende eksempler.

Når dette er fastslået, vil det kunne indses, at ethvert fragment, der koder for en enzymatisk aktivitet, der vil beskytte planteceller og 20 planter mod GS-inhibitorerne, ved inaktivering, bør betragtes som ækvivalent til de foretrukne fragmenter, der er omtalt ovenfor. Dette vil især gælde ethvert DNA-fragment, der vil fremkomme som følge af genetisk screening af de genome DNA'er af stammer, især af antibiotika producerende stammer, der kan formodes at besidde gener, der, uanset strukturel 25 forskellighed, vil kode for lignende aktivitet med hensyn til Bialaphos eller PPT, eller endog med hensyn til andre GS-inhibitorer. Dette gælder for ethvert gen i andre stammer, der producerer et PPT derivat.

Det skal derfor forstås, at udtrykkene "Bialaphos-resistens DNA" eller "Bialaphos-resistens enzym", som anvendt af bekvemmeligheds grunde 30 i det følgende, har'til hensigt ikke blot at vedrøre DNA'erne og enzymerne som specifikt har at gøre med resistens mod PPT eller mest direkte beslægtede derivater, men mere generelt med andre DNA'er og enzymer, der vil være i stand til under samme omstændigheder at inaktivere virkningen i planter af GS-inhibitorer.

35 Opfindelsen angår non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf omfattende DNA rekombinanter indeholdende de ovenfor definerede Bialaphos resistens DNA-fragmenter, rekombineret med

I DK 175642 B1 I

I 8

I heterolog DNA, hvilken heterolog DNA indeholder reguleringselementer, og I

I hvor Bialaphos resistens DNA'en er under kontrol af disse regale-

I ringselementer på en sådan måde, at den kan udtrykkes i fremmede cellu- I

I lære omgivelser, der er forenelige med disse reguleringselementer. Især I

I 5 er de ovenfor nævnte Bialaphos-resistens DNA-fragmenter, som er inde- I

holdt i disse DNA-rekombinanter, uden nogen DNA-region involveret i bio-

I syntesen af Bialaphos, når selve Bialaphos-resistens DNA-fragmentet, I

I hidrører fra Bialaphos producerende stammer. I

Med udtrykket "heterolog DNA" menes en DNA af en anden oprindelse

I 10 end den, hvorfra Bialaphos resistens DNA'en hidrørte, fx forskellig fra I

den fra en Streptomvces hvoroscopicus eller Streptomvces viridochro- I

moqenes eller endog mere foretrukket en fra Streptomvces DNA fremmed I

I DNA. De nævnte reguleringselementer er især sådanne, der er i stand til I kontrollere transkriptionen og oversættelsen af DNA sekvenser, som nor- 15 malt er associeret dermed i de fremmede omgivelser. "Cellulær" refererer

H både til mikroorganismer og cellekulturer. I

Denne heterologe DNA kan være en bakteriel DNA, især når det I

ønskes at fremstille en stor mængde af rekombinant-DNA'en, såsom til I

forøgelsesformål. I denne henseende består en foretrukket heterolog DNA I

H 20 af DNA af E. Coli eller af med E. coli forenelig DNA. Det kan være DNA I

af samme oprindelse som de pågældende cellers eller anden DNA, fx viral I

eller plasmid DNA, som vides at være i stand til at replikere i de I

betragtede celler. I

Foretrukket rekombinant DNA indeholder heterolog DNA, som er I

25 forenelig med planteceller, især Ti-plasmid DNA. I

Særligt foretrukne rekombinanter er sådanne, der indeholder GS- I

i nhi bi tor-i naktiverende DNA under kontrol af en promotor, som genkendes I

H af planteceller, især de planteceller, som bibringes inaktivering af GS- I

inhibitorer. I

30 Foretrukne rekombinanter ifølge den foreliggende opfindelse vedrø- I

rer endvidere modificerede vektorer, især plasmider indeholdende den GS- I

inhibitor-inaktiverende DNA, således placeret med hensyn til regule- I

ringselementer, herunder især promotor elementer, at de muliggør, at den I

GS-inhibitor inaktiverende DNA kan transkriberes og oversættes i det I

35 cellulære miljø, der er foreneligt med den heterologe DNA. Fordelagtige I

vektorer ér sådanne, der er opbygget således at de er i stand til at I

bevirke stabil inkorporering af den GS-inhibitor-inaktiverende DNA i I

9 DK 175642 B1 fremmede celler, især t deres genome DNA. Foretrukne modificerede vektorer er sådanne, der er i stand til stabil transformering-af planteceller, og som bibringer de tilsvarende celler evnen til inaktivering af GS-inhibitorer.

5 Som beskrevet nedenfor ser det ud til, at initieringskodonen for

Bialaphos-resistens-genet i den her anvendte Streptomvces hvoroscopicus stamme er en GTG-kodon. I foretrukne rekombinant-DNA'er eller -vektorer er Bialaphos resistensgenet dog modificeret ved at substituere en ATG initieringskodon for initieringskodonen GTG, hvilken ATG muliggør 10 oversættelsesinitiering i planteceller.

I det følgende eksempel udgjordes den anvendte plantepromotor-sekvens af en promotor af 35 S blomkålsmosaikvirus. Det skulle være unødvendigt at bemærke, at fagmanden vil være i stand til at udvælge andre piantepromotorer, når sådanne vil være mere passende i relation 15 til de betragtede plantearter.

Ifølge en anden foretrukket udførelsesform af opfindelsen, især når det ønskes at opnå transport af enzymet, som kodes af Bialaphos-resistens DNA'en til chloroplasterne, fusioneres det heterologe DNA fragment til et gen eller DNA-fragment, som koder for et transit-peptid, 20 hvilket sidstnævnte fragment dernæst indføres mellem det GS-inhibitor-inaktiverende gen og den valgte plantepromotor.

Med hensyn til midler, der gør det muligt at opnå sådanne konstruktioner, kan henvises til GB patentansøgninger nr. 8432757 indleveret 28. december 1984 og 8500336 indleveret 7. januar 1985 samt de 25 beslægtede ansøgninger indleveret i USA (nr. 755.173 indleveret 15. juli 1985) ved den europæiske patentmyndighed (nr. 85402596.2 indleveret 20. december 1985), i Japan (nr. 299.730, indleveret 27. december 1985), i Israel (nr. 77.466 indleveret 27. decémber 1985) og i Australien (nr. 5.165.485, indleveret 24. december 1985), der alle herved inkorporeres 30 med hele deres indhold.

Der kan endvidere henvises til den videnskabelige litteratur, især følgende artikler:

Van den Brock et al, 1985, Nature, 313, 358-363;

Schreier et al., Embo. J., bind 4, nr. 1, 25-32.

35 Disse artikler inkorporeres ligeledes her med hele deres indhold.

For en ordens skyld skal der her erindres om, at der med udtrykket "transitpeptid" henvises til et polypeptid-fragment, der normalt er as-

I DK 175642 B1 I

I 10 I

I socieret med et chloroplast-protein eller en chloroplast-protein- H

I subenhed i et prækursor-protein kodet ved hjælp af planteceller nukleær H

I DNA. Transitpeptidet skiller dernæst fra chloroplast-peptidet eller H

I fjernes proteolitisk under translokationsprocessen for det sidstnævnte

I 5 protein i chloroplasterne. Eksempler på egnede transitpeptider er sådan- H

ne, der er associerede med den lille subenhed af ribulpse-l,5-bisphoshat H

I (RuBP) carboxylase eller som er associeret med de chlorophyl a/b

I bindende proteiner. H

I Der tilvejebringes således DNA-fragmenter og DNA rekombinanter, H

10 der er egnede til non-biologisk transformation af frø, planter og H

I celler. H

I Mere specielt angår opfindelsen også non-biologisk transformerede H

I frø, planter og celler deraf, inklusiv reproduktionsmateriale for H

sådanne planter, omfattende et heterologt genetisk materiale, som er I

I 15 stabilt integreret og i stand til at kunne udtrykkes i planterne eller I

I reproduktionsmaterialet i form af et protein, der er i stand til at I

I inaktivere eller neutralisere aktiviteten af en glutaminsyntetase- I

I inhibitor, hvilke frø, planter eller celler deraf transformeres ved en H

I fremgangsmåde omfattende non-biologiske trin til frembringelse af I

I 20 planteceller eller plantevæv, herunder det heterologe genetiske I

materiale fra udgangspianteceller eller -plantevæv, som ikke er i stand I

I til at udtrykke den pågældende inhiberende eller neutraliserende I

I aktivitet, regenerering af planter eller reproduktionsmateriale for I

disse planter, eller begge dele, fra disse planteceller eller plantevæv I

I 25 indeholdende det genetiske materiale, og eventuelt biologisk replikering I

af de sidstnævnte planter eller reproduktionsmateriale, eller begge I

I dele, hvorved de non-biologiske trin i fremgangsmåden til frembringelse I

af plantecellerne eller plantevævet, herunder det heterologe genetiske I

materiale, omfatter, at man transformerer udgangspiantecellerne eller - I

I 30 plantevævet med en DNA-rekombinant indeholdende en nukleotid sekvens, I

I som koder for proteinet, samt de regulerende elementer udvalgt blandt I

sådanne, der er i stand til at muliggøre ekspressionen af I

I nukleotidsekvensen i plantecellerne eller plantevævet, og bevirke den I

stabile integrering af nukleotidsekvensen i plantecellerne og -vævet,

I 35 samt i planten og reproduktionsmaterialet frembragt deraf gennem I

generationer. I

Opfindelsen angår ligeledes cellekulturerne indeholdende I

11 DK 175642 B1

Bialaphos-resistens DNA eller mere alment den GS-inhibitor inaktiverende DNA, hvilke cellekulturer har den egenskab, at de er resistente mod en komposition indeholdende en GS-inhibitor, når de dyrkes i et medium indeholdende en sådan komposition i doser, der ville være destruktive 5 for non-transformerede celler.

Opfindelsen angår mere specielt sådanne planteceller eller cellekulturer, hvori Bialaphos-resistens DNA'en er stabilt integreret, og som forbliver til stede over successive generationer af plantecellerne. Resistensen mod en GS-inhibitor, mere specielt Bialaphos eller PPT, kan 10 således også betragtes som en måde, hvorpå man kan karakterisere plantecellerne ifølge opfindelsen.

Eventuelt kan man gribe til hybridiseringsforsøg mellem den genome DNA opnået fra plantecellerne med en probe indeholdende en GS-inhibitor inaktiverende DNA-sekvens.

15 Mere alment vedrører opfindelsen planteceller, reproduktionsmate riale, især frø, samt planter indeholdende et fremmed eller heterologt DNA-fragment stabilt integreret i deres respektive genome DNA'er, hvilke fragmenter overføres gennem generationer af sådanne planteceller, reproduktionsmateriale, frø og planter, og hvori DNA-fragmentet koder for et 20 protein, som inducerer en non-varietetsspecifik enzymatisk aktivitet, som er i stand til at inaktivere eller neutralisere GS-i nhi bitorer især Bialaphos og PPT, mere specielt at bibringe sådanne planteceller, reproduktionsmaterialer, frø og planter, en tilsvarende non-varietetsspecifik phenotype resistens mod GS-inhibitorer.

25 "Non-varietetsspecifik" enzymatisk aktivitet eller phenotype skal referere til det forhold, at de ikke er karakteristiske for specifikke plantegener eller arter, således som det på en ikke begrænsende måde vil blive nærmere belyst i de følgende eksempler. De induceres i plantematerialerne ved i det væsentlige non-biologiske processer, der kan anvendes 30 på planter hørende til arter, der normalt er ubeslægtede med hinanden og omfatter inkorporeringen i plantemateriale af heterolog DNA, fx bakteriel DNA eller kemisk syntetiseret DNA, som ikke normalt optræder i plantematerialet, eller som ikke normalt kan inkorporeres deri ved naturlige forædlingsprocesser, og som alligevel bibringer disse en fælles 35 phenotype (fx herbicid resistens).

De non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf har særligt fordelagtige anvendelser i fremgangsmåder til beskyttelse af

I DK 175642 B1 I

I I

I markkultiverede plantearter mod ukrudt, hvilke fremgangsmåder omfatter H

I det trin, at marken behandles med et herbicid, fx Bialaphos el-ler PPT i H

I en dosis, der er effektiv til dræbe ukrudtet, og hvor de dyrkede H

I plantearter i deres genom indeholder et DNA-fragment, som koder for et H

I 5 protein med en enzymatisk aktivitet, der er i stand til at neutralisere H

I eller inaktivere GS-inhibitoren. H

I Til udelukkende illustration varierer effektive doser til anven- H

I delse i den ovennævnte fremgangsmåde fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/hektar H

I Bialaphos eller PPT. . I

I 10 I det følgende beskrives, hvorledes det ovenfor beskrevne H

I foretrukne DNA-fragment i soleredes ud fra den Streptomyces hygroscopicus H

stamme, der er tilgængelig fra American Type Culture Collection under H

I deponeringsnr. ATCC 21 705, hvilket udelukkende skal tjene til eksempli- H

I ficering. H

15 Den følgende beskrivelse viser også den teknik, som kan anvendes I

I på andre stammer, der producerer forbindelser med en PPT-del. I

Beskrivelsen vil dernæst blive kompletteret med beskrivelsen af

I indføringen af et foretrukket DNA-fragment, der bibringer de transforme- H

I rede celler evnen til at inaktivere Bialaphos og PPT. Det Bialaphos H

I 20 inaktiverende DNA-fragment, der herefter betegnes Bialaphos-resistens I

I gen eller "sfr"-gen, isoleret ved hjælp af den foran beskrevne teknik i I

I pi asmider, som kan anvendes til transformering af planteceller og I

I bibringe disse en resistens mod Bialaphos, gives således også alene som I

M eksempel til ikke-begrænsende illustrationsformål. I

M 25 I det følgende henvises til tegningen, hvor I

I figur 1 viser et restriktionskort for et plasmid indeholdende et

M Streptomyces hygroscopicus DNA-fragment, der koder for Bialaphos-resi- I

M stens, hvilket plasmid, der herefter kaldes pBGl, er blevet konstrueret I

M i overensstemmelse med den følgende beskrivelse, I

30 figur 2 viser nukleotid sekvensen af et mindre fragment opnået fra I

I pBGl, subklonet til et andet plasmid (pBG39) og indeholdende resistens- H

I genet, I

figur 3 viser konstruktionen af en serie af plasmider givet som H

I eksempler, hvilke plasmider skal tilvejebringe passende adaptionsmidler I

I 35 til indføringen deri af Bialaphos resistensgenet eller "sfr"-genet, I

figur 4A og 4B viser konstruktionen af en serie af plasmider givet I

I som eksempler, hvilke plasmider indeholder passende plantecelle-promo- I

13 DK 175642 B1 tor-sekvenser, der er i stand til at initiere transkription og ekspression af det fremmede gen, som er indført under deres kontrol i pi asmiderne, figur 5A viser et bestemt fragment af nukleotid sekvensen af plas-5 midet opnået i figur 3, . figur 5B viser rekonstruktionen af de første kodoner af et Bialaphos resistens-gen fra et Fokl/Bol11 fragment opnået fra pBG39 og substitueringen af en ATG-initieringskodon for GTG initieringskodonen i det naturlige "sfr"-gen, - 10 figur 5C viser rekonstruktionen af hele "sfr"-genet, nemlig de sidste kodoner deraf og dets indføring i et plasmid opnået i figur 4A og 4B, figur 6A viser en ekspressionsvektor indeholdende "sfr"-genet placeret under kontrol af en plantecellepromotor, 15 figur 6B viser en anden ekspressionsvektor afledt fra den i figur' 6A viste ved substituering af nogle nukleotider, figur 7 viser konstruktionen af en serie af pi asmider givet som eksempler til den endelige fremstilling af plasmider indeholdende promotorregionen og transitpeptidsekvensen for et bestemt plantecellegen, for 20 indføringen af "sfr"-genet under kontrol af promotorregionen og downstream for transitpeptidsekvensen, og figur 8-11 vil blive omtalt nedenfor.

Det følgende forsøg udformedes med henblik på at isolere et Bialaphos-resistens gen fra S. hvgroscopicus i henhold til standardtek-25 nik for kloning i Streptomyces.

2, 5 /xg S. hvgroscopicus genomisk DNA og 0,5 øg Streotomvces vektor piJ61 spaltedes med Pstl i henhold til den i ref. 6 beskrevne fremgangsmåde. Vektorfragmenterne og de genome fragmenter blandedes og splejsedes (4 timer ved,10°C fulgt af 72 timer ved 4°C i splejs-30 ningssalte, der indeholder 66 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA, 10 mM MgCl-, 10 mM 2-mercaptoethanol og 0,1 mM ATP) ved en total DNA koncen-tration på 40 ug ml med T4 DNA-ligase. Splejsningsproduktet indførtes

Q

i 3 x 10 S. lividans stamme 66 protoplaster ved en transformationsprocedure, der medieredes af polyethylen-glycol (PEG) som beskrevet i det 35 følgende. Disse protoplaster gav anledning til 5 x 107 kolonier og 4 x 10^ pocks efter regenerering på 20 plader af R2 agar indeholdende 0,5%

Difco gærekstrakt (R2 YE). Fremstilling og sammensætning af de forskel-

I DK 175642 B1 I

I 14 I

I lige medier og puffere, som anvendtes i de beskrevne forsøg, omtales I

I nærmere i det følgende. Når disse vækster repl ika-planteredes-på minimal I

I mediumplader indeholdende 50 μς ml’^ Bialaphos, fremkom stofresi stente I

kolonier med en frekvens på 1 pr. 10 transformanter. Efter rensning af

I 5 de stofresistente kolonier isoleredes deres pi asmide DNA og anvendtes I

I til retransformering af S. lividans protoplaster. Non-selektiv regenere-

I ring efterfulgt af replikation til Bi alaphos- hol digt medium viste en I

I 100% korrelation mellem pocks og Bialaphos-resistens vækst. Rekombi- I

I nantplasmiderne af adskillige resistente kloner indeholdt alléen 1,7 Kb

I 10 PstI indføring (se figur 1). I

I Subkloninq af herbicid-resistens genet I

I 1,7 Kb PstI indføringen subklonedes dernæst i højkopi-antal strep- I

I tomycet-vektor PiJ385 til generering af plasmid pBG20. S. lividans stam- I

mer, der indeholdt pBG20, var mere end 500 gange mere resistente mod I

I 15 Bialaphos. S.lividans vækst inhiberes normalt i minimalt medium indehol- I

I dende 1 μg/m^ Bialaphos, mens vækst af transformanter indeholdende pG20 I

I ikke inhiberedes bemærkelsesværdigt i et medium indeholdende 500 mg/ml I

Bialaphos. Pst! fragmentet subklonedes også i vilkårlig orientering i I

I PstI-positionen for plasmid pBR322 til frembringelse af pi asmider pBGl I

I 20 og pBG2 i henhold til deres orientering. En test på minimal M9 medium I

I vi iste, at E. coli E8767 indeholdende pBGl eller pBG2 var resistent mod

I Bialaphos. I

I Et + 1,65 Kb PstI - BamHI fragment subklonedes fra pBGl til plas- I

I mid pUC19 til dannelse af plasmid pBG39 og bibragte Bialaphos resistens I

I 25 til E. coli. W3110, C600 og JM83. I

Under anvendelse af et in vitro koblet transskriptions-oversættel- I

I sessystem (ref. 5) fra S. lividans ekstrakter vistes det, at 1,65 Kb I

I PstI - BamHI fragmentet i pBG39 styrer syntesen af et 22 Kd protein. I

det følgende indeholder denne 1,65 Kd indføring et fragment, der koder I

I 30 for et 22 Kd protein, og som vil blive kaldt "sfr" gen. I

I Finbestemmelse oa sekventerinq af genet. I

I Et 625 bp Sau3A fragment subklonedes fra pBG39 til pUC19 og I

bibragtes stadig Bialaphos resistens til en E. coli W 3110 vært. De I

I resulterende kloner var pBG93 og pBG94 i henhold til orienteringen. I

35 Genets orientering i Sau3A fragmentet blev angivet ved forsøg, som I

I har vist, at Bialaphos resistens kunne induceres med IPTG fra pUC19 lac I

I promotor i pBG93. I nærvær af IPTG (0,5 mM) øgedes resistensen af I

15 DK 175642 B1 pBG93/W3110 fra 5 til 50 fig/ml på et M9 medium indeholdende Bialaphos.

W3110 værten fri for pBG93 voksede ikke på M9 medium indeholdende 5 /ig/ml Bialaphos. Disse forsøg viste, at Sau3A fragmentet kunne subklones uden tab af aktivitet. De tilvejebragte også den korrekte orientering 5 som vist i vedlagte figur 2. Proteinet, som disse kloner kodede for, blev detekteret ved anvendelse af koblede transkriptionsoversættelses-systemer, afledt af ekstrakter fra $. lividans (ref. 7). Afhængig af orienteringen af Sau3A fragmentet observeredes forskellige størrelser af oversættelsesprodukter; 22 Kd for pBG94 og + 28 Kd for pBG93. Dette 10 viste, at Sau3A fragmentet ikke indeholdt det fuldstændige resistensgen, og at et fusionsprotein blev dannet, som inkluderede en polypeptidse-kvens, der resulterede fra oversættelsen af en pUC19 sekvens.

For at opnå store mængder protein blev et 1,7 Kb PstI fragment fra pBGl klonet i det høje kopiantal Streptomycet replikon pIJ385. Det opnå-15 ede plasmid, pBG20, anvendtes til at omdanne S. hygroscopicus. Trans-formanter, som indeholdt dette plasmid, havde mere end 5 gange så meget PPT acetyleringsaktivitet og havde også øgede mængder af et 22 kd protein på natrium-dodecylsulfat geler (SDS geler). Endvidere fremkom både acetyl transferasen og 22 kd proteinet, da produktionen af Bialaphos 20 begyndte. Korrelationen af in vitro data, syntesekinetik og forstærket ekspression associeret med pBG20 transformanter antydede kraftigt, at dette 22 kD bånd var genproduktet.

Den fuldstændige nukleotide sekvens af 625 bp Sau3A fragmentet bestemtes såvel som sidesekvenser. Computeranalyse afslørede tilstedevæ-25 reisen af en åben læseramme over hele længden af Sau3A fragmentet.

Karakterisering af "sfr"-genproduktet.

En serie forsøg blev udført for at fastslå, at den åbne læseramme af "sfr"-genet virkelig kodede for Bialaphos-resistens enzymet. For at bestemme 5'enden på resistensgenet, bestemtes NH^-terminal sekvensen af 30 enzymet. Hvad især angår den teknik, der blev anvendt til at bestemme denne sekvens, henvises til den teknik, der er udvilket af J.

Vandekerckhove, Eur. J. Bioc. 152, p. 9-19, 1985, og til de franske patentansøgninger nr. 8514579 indleveret 1. oktober 1985 og nr. 8513046, indleveret 2. september 1985, som alle inkorporeres heri med hele deres 35 indhold.

Denne teknik muliggør immobilisering af proteiner og nukleidsyrer, tidligere separeret på en natriumdodecylsulfat indeholdende polyacryl-

I DK 175642 B1 I

I I

I amidgel, på glasfibre belagt med den polykvaternære amin, der fås i han- I

I delen under det registrerede varemærke POLYBRENE. Overførslen-udføres i I

I det væsentlige som for proteinbi otti ngen på nitrocellulosemembraner I

I (ref. 8). Dette muliggør bestemmelsen af aminosyrekomposi tionen og par- I 5 tiel sekvens af de immobil i serede proteiner. Den del af arket, der bærer I det immobil i serede 22 kd protein produceret af $. hyqroscopicus pBG20,

I blev skåret ud, og skiven blev monteret i reaktionskammeret i en gas- I

B fase sekvenator for at underkaste det giasfiberbundne 22 Kd protein den I

I Edman'ske nedbrydningsprocedure. Følgende aminosyresekvens blev opnået:

B 10 Pro-Glu-Arg-Arg-Pro-Ala-Asp-Ile-Arg-Arg I

B Denne sekvens passede til en aminosyresekvens, som blev udledt fra I

B den åbne læseramme af 625 bp Sau3A fragmentet. Dette svarede til stræk-

B ningen fra kodon 3 til kondon 12. I

B NH^-terminus af 22 Kd proteinet var således upstream for denne I

B 15 sekvens. Det blev bestemt, at oversættelsen af det pågældende protein

B sandsynligvis skulle initieres 2 aminosyrer tidligere på en GTG initie- I

B ringskodon. GTG anvendes ofte som initiatorkodon i Streptomyces og over- I

B sættes som methionin. Proteinet oversat fra GTG initieringskodonen ville I

B være 183 aminosyrer lang og ville have en molekylevægt på 20 550. Dette I

B 20 var i god overensstemmelse med den observerede tilnærmede molekylevægt I

I på 22 000. I

Endvidere lokaliseredes terminationskodonen TGA netop downstream I

for Sau3A positionen. Kloning af 625 bp Sau3A fragmentet i en BamHI po- I

H sition fordøjet pUC19 resulterede ikke i rekonstruktion af slutkodonen. I

25 Dette forklarede fusionsproteinerne, som blev observeret i in vitro I

transkriptions-oversættelsesanalysen. I

Mekanisme ved PPT-resistens I

Efter at en første phenotype og nogle af de fysiske kendetegn for I

resistensgenet og dets genprodukt var defineret, udførtes en serie for- I

H 30 søg for at forstå den mekanisme, ved hvilken det bibringer resistens. I

Som beskrevet ovenfor er PPT den del af Bialaphos, som inhiberer glut- I

H aminsyntetase (GS), og N-acetyl PPT er ikke en inhibitor. Idet der I

anvendtes en standardprøve (ref. 9), vistes S. hyqroscopicus ATCC 21 705 I

derivater at indeholde et PPT acetyl transferase, som ikke fandtes i S. I

35 1ividans. Aktiviteten acetylerede ikke Bialaphos tripeptidet. _L. I

1ividans. der bærer resistensgenet klonet i pBG20 eller pBG16 (et I

plasmid indeholdende 625 bp Sau3A fragmentet klonet i en anden strepto- I

17 DK 175642 B1 mycetvektor, piJ680) indeholdt også den aktivitet, der kunne acetylere PPT, men ikke Bialaphos. Det PPT afledte reaktionsprodukt produceret af ekstrakter af pBG20/S. lividans i soleredes for at bekræfte, at det virkelig var acetyl-PPT. Analyse ved massespektroskopi viste, at molekyl-5 vægten var øget i forhold til PPT med ækvivalenten af én acetylgruppe.

Det blev således konkluderet, at 625 bp Sau3A fragmentet indeholdt sekvenser, som koder for PPT acetyl transferase.

Forsøgsbetingelserne og reagenserne, der blev anvendt i de ovennævnte teknikker er som følger: :·" 10 Fremstilling og komposition af de ovenfor anvendte medier og puf fere 1) P medium: 10,3 g saccharose, 0,025 g I^SO^, 0,203 g MgCl2.6H20 og 0,2 ml sporelementopløsning opløses i 80 ml destilleret vand og autoklaveres. Derefter tilsættes i rækkefølge 1 ml KH^PO^ (0,5%), 10 ml 15 CaCl2.2H20 (3,68%), og 10 ml TES puffer (0,25 M), (pH: 7,2). Sporelementopløsning (pr. liter): ZnCl2, 40 mg; FeCl^^H^, 200 mg; CuCl2.H20, 10 mg; MnCl2.4H20, 10 mg; Na2B407.10H20, 10 mg; (NH4)6Mo7024. 4H20, 10 mg.

2) R2YE: 10,3 g saccharose, 0,025 g K2S04, 1,012 g MgCl2-6H20, 1 g 20 glucose, 0,01 g Difco casaminosyrer og 2,2 g Difco agar opløses i 80 ml destilleret vand og autoklaveres. Derefter tilsættes sekventielt 0,2 ml sporelementopløsning, 1 ml KH2P04 (0,5%), 8,02 ml CaCl2.2H20 (3,68%), 1,5 ml L-prolin (20%), 10 ml TES puffer (0,25 M), (pH: 7,2), 0,5 ml (1 M) NaOH, 5 ml gærekstrakt (10%).

25 3) TE: 10 mM TRIS HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0.

4) YEME: Difco gærekstrakt (0,3%), Difco pepton (0,5%), oxoid maltekstrakt (0,3%), glucose (1%).

Transformation af S. lividans protoplaster 1. En kultur dannet af 25 ml YEME, 34% saccharose, 0,005 M MgCl2, 30 0,5% glycin i en 250 ml afbøjet kolbe centrifugeres i 30-36 timer.

2. Tabletten opløses i 10,3% saccharose og centrifugeres. Denne udvaskning gentages én gang.

3. Myceliet suspenderes i 4.ml lysozymopløsning (1 mg/ml i P medium med CaCl2 og MgCl2 koncentrationer reduceret til 0,0025 M) og inkubere- 35 des ved 30°C i 15-60 minutter.

4. Opløsningen blandes ved pipettering tre gange i en 5 ml pipette og inkuberedes yderligere 15 minutter.

DK 175642 B1 I

5. P medium (5 ml) tilsættes og blandes ved pipettering som under j I

trin 4. I

6. Opløsningen filtreres gennem bomuld, og protoplaster sedimenteres I

forsigtigt i en bordcentrifuge ved 800 x G i 7 minutter. I

5 7. Protoplaster suspenderes i 4 ml P medium og centrifugeres igen. I

8. Trin 7 gentages, og protoplaster suspenderes i den dråbe af P me- I

dium, der er tilbage efter borthældning af supernatanten (til tranforma- I

tion). . I

9. DNA tilsættes i mindre end 20 μg TE. I

10 10. 0,5 ml PEG 1000 opløsning (2,5 g PEG opløst i 7,5 ml 2,5% I

saccharose, 0,0014 K^SO^, 0,1 M CaC^, 0,05 M TRIS maleinsyre, Ph 8,0, I

plus sporelementer) tilsattes øjeblikkeligt og pipetteres en gang for at I

blande bestanddelene. I

11. Efter 60 sekunder tilsættes 5 ml af P medium, og protoplasterne I

15 sedimenteres ved forsigtig centrifugering. I

12. Tabletten suspenderes i P medium (1 ml). I

13. 0,1 ml udstryges på R2YE plader (til transformation tørres plader I

til 85% af deres oprindelige vægt, fx i et tørreskab med laminær I

luftstrøm). I

20 14. Inkubation ved 30°C. I

A - Konstruktion af en "sfr” gen-kassette I

En "sfr" gen-kassette konstrueredes for at muliggøre efterfølgende I

I kloning i planteekspressionsvektorer. I

Isolering af et Fokl-BgUI fragment fra plasmidet pBG39 indehol- I

I 25 dende et "sfr" genfragment førte til tabet af de første kodoner, omfat- I

I tende initieringskodonen, samt af de sidste kodoner, omfattende stopko- I

I donen. I

I Dette fragment af "sfr"-genet kunne rekonstrueres in vitro med I

syntetisk oligonukleotider, som koder for passende aminosyrer. I

I 30 De komplementære syntetiske oligonukleotider var 5'CATGAGCCCAGAAC I

I og 3'TCGGGTCTTGCTGC. I

I Ved anvendelse af sådanne syntetiske oligonukleotider kunne 5'en- I

den af "sfr"-genet gendannes, og GTG initieringskodonen substitueres for I

en kodon, der var godt oversat af planteceller, især en ATG kodon. I

35 DNA-fragmentet indeholdende de til "sfr"-genet forbundne I

H oligonukleotider blev derefter indsat i et passende plasmid, som I

indeholdt en bestemt nukleotidsekvens, der derefter blev betegnet af et I

19 DK 175642 B1 "adapter"-fragment.

Dette adapter fragment omfattede: en TGA terminationskodon, som muliggjorde, at de sidste kodoner af "sfr"-genet kunne blive gendannet; 5 passende restriktionspositioner, som muliggjorde indføring af det fragment af nukleotidsekvensen, der omfatter det med de syntetiske oligonukleotider delvis gendannede "sfr-"gen; denne indføring resulterede i rekonstruktionen af et intakt "sfr-"-gen; passende restriktionspositioner for isoleringeen af hele"sfr"- 10 genet.

"sfr"-genet blev derefter indført i et andet plasmid, som indeholdt en passende plantepromotorsekvens. Plantepromotorsekvensen bestod af blomkålsmosaikvirus promotorsekvens (p35S). Naturligvis er opfindelsen ikke begrænset til anvendelsen af denne særlige promotor. Andre 15 sekvenser kunne vælges som promotorer egnede i planter, fx TR l'-2'pro-motorregionen og promotorfragmentet af en Rubisco lille subunitgen fra den herefter beskrevne Arabidopsis thaliana.

1. Konstruktion af plasmid PLK56.2 (figur 31

Konstruktionen af plasmid pLK56.2 tilsigtede opnåelsen af en pas-20 sende adaptor omfattende følgende sekvens af restriktionspositioner:

Smal, BamHI, Ncol, Kgnl, Bglll, Ml_ul, BamHI, Hindi 11 og Xbal.

De til denne konstruktion anvendt udgangspi asmider pLK56, pJB64 og pLK33 er dem, der kendes fra Botterman-(ref. 11).

De herefter beskrevne DNA-fragmenter i soleredes og separeredes fra 25 lavtsmeltende agarose (LGA).

Plasmidet pLK56 spaltedes af enzymerne BamHI og Ndel. Et Ncol-Ndel fragment (vist i tegningen ved bue "a" i brudt linie) opnået fra plasmid pJB64 blev substitueret i pLK56 for BamHI-Ndel fragmentet vist ved "b". Splejsning var mulig efter fyldning i de fremstående ender af BamHI og 30 Ncol med DNA polymerase I af E. coli (Klenows fragment).

Recirkulering fandt især sted ved hjælp af T4 DNA ligase. Et nyt plasmid pLK56.3 opnåedes.

Dette plasmid blev spaltet af enzymerne Xbal og PstI.

BamHI-PstI fragmentet af pLK33 (c) (i figur 3) blev substitueret 35 for Xbal-PstI fragmentet (d) af pLK56.3, efter reparation af deres respektive ender med Klenows fragment.

Efter recirkulari sering ved hjælp af T4 DNA ligase indeholdt det

I DK 175642 B1 I

I I

I opnåede plasmid pLK56.2 en nukleotid sekvens, som omfattede de nødvendi- I

I ge restriktionspositioner for den efterfølgende indføring af -sfr"- I

I genet. I

2. Konstruktion af plasmid pGSHl50 (figur 4aI I

I 5 Parallelt med den sidst anførte konstruktion blev der fremstillet I

I et plasmid indeholdende en promotorsekvens, genkendt af polymeraserne af I

I planteceller og omfattende passende restriktionspositioner, downstream I

I for nævnte promotorsekvens i transskriptionsretningen, hvilke restrik- I

I tionspositioner derefter er beregnet at muliggøre tilpasningraf "sfr"- I

I 10 genet, der da fås fra pLK56.2, under kontrol af nævnte plantepromotor. I

I Plasmid pGV825 beskrives af Deblaere et al (ref. 10). Plasmid

I pJB63 kendes fra Botterman (ref. 11). I

I pGV825 blev lineariseret med PvuII og recirkulari seret med T4 DNA I

I ligase, hvilket resulterede i udslettelse af et internt PvuII fragment I

I 15 vist ved (e), (plasmid pGV956). I

I pGV955 spaltedes derefter af BamHI og BolII.

I BamHI-BolII fragmentet (f) opnået fra pJB63 dephosphoryleredes med I

kalveintestinphosphatase (CIP) og substitueredes for BamHI-BglII frag- I

I mentet af pGV956. I

I 20 Plasmid pGV1500 opnåedes efter recirkulari sering ved hjælp af T4 I

I DNA ligase. I

I Et EcoRI-HindUI fragment opnået fra plasmid pGSHBO blev renset. I

I Sidstnævnte plasmid bar det duale TR Γ-2'promotorfragment beskrevet i I

I Velten et al (ref. 13). Dette fragment blev indført i pGV1500, opløst I

I 25 med Hpal og HindiII og gav pGSH150. I

I Dette plasmid indeholder promotorfragmentet foran 3'enden af T-DNA I

I transcript 7 og BamHI og Cl_al positioner til kloning. I

I 3. Konstruktion af plasmid PGSJ26Q ffiour 4B1 I

I CP3 er et plasmid afledt fra pBR322, og som indeholder 35S promo- I

I 30 torregionen af blomkålsmosaikvirus inden i et BamHI fragment. I

I pGSHl50 blev skåret med BamHI og gglll. I

I BamHI-BolII fragmentet (h) af CP3, som indeholdt den nukleotide I

I sekvens af p35S promotor, blev substitueret for BamHI-BalII fragmentet I

I (i) i position pGSH150 til dannelse af plasmid pGSJ250. pGSJ250 blev - I

I 35 derefter åbnet ved dets Bol 11 restriktionsposition. I

I Et BamHI fragment opnået fra mGV2 (ref. 12) blev indsat i pGSJ250 I

I ved BglH positionen til dannelse af plasmid pGS0260. I

21 DK 175642 B1

Inden indføringen af det fra pLK56.2 opnåelige "sfr-"-gen i plasmid pGSJ260, var det imidlertid stadig ønskeligt at modificere førstnævnte yderligere for at muliggøre indføringen på en mere praktisk måde. pLK56.2 blev således yderligere modificeret som anført nedenfor 5 til at give pGSRl.

Startende fra plasmid pGSJ260 blev der fremstillet to plasmidkon-struktioner til efterfølgende transformationer af planteceller: et første plasmid, der muliggør ekspression af "sfr"-genet i cytoplasmaet af planteceller, og 10 et andet plasmid, der er således modificeret, at der opnås tran sport af Bialaphos-resistens enzymerne til chloroplasterne af plantecellerne.

Første tilfælde: plasmid, der muliggør ekspression af "sfr"-genet i cytoplasmaet af planteceller.

15 Kloning af "sfr" gen-kassetten i en planteekspressionsvektor (PGSR21 figur 51.

I figur 5a vises den nukleotide sekvens af adaptoren af pLK56.2.

Især vises beliggenhederne af BamHI, Ncol, Bgl_II restriktionspositionerne.

20 Dette adaptorfragment blev spaltet af enzymerne Ncol og BolII.

Figur 5B viser Fokl-BglII fragmentet (j) opnået fra pBG39. Beliggenhederne for disse to restriktionspositioner er vist i figur 2.

Ved anvendelse af syntetiske oligonukleotider blev de første kodoner af "sfr"-genet gendannet, især 5'enden af genet, hvori en ATG initi-25 eringskodon blev substitueret for det initiale GTG kodon.

Dette Fokl-Bglll fragment, kompletteret med de syntetiske oligonukleotider, blev derefter substitueret i pLK56.2 for Ncol-Bglll fragmentet af adaptoren. 3'enden af genet blev således også gendannet, efter recirkulari sering med T4 DNA ligase. Det opnåede plasmid pGSRl indeholdt 30 således hele "sfr"-genet indført i dets adaptor.

Plasmidet pGSJ260 blev derefter åbnet af BamHI (figur c), og BamHI fragmentet opnået fra pGSRl, som indeholdt hele "sfr"-genet, blev indført i pGSJ260.

Det opnåede plasmid, pG$R2 (se figur 6A) indeholdt et pBR322 35 replikon, et bakterielt streptomycin resistens gen (SDM-SP-AD-transfera-se) og en fremstillet T-DNA bestående af: grænsefragmenter af T-DNA;

I DK 175642 B1 I

I 22 I

I et chimerisk kanamycingen, som tilvejebragte en dominerende I

udvælgelig markør i planteceller; og I

I en chimerisk "sfr"-gen.

I Den chimeriske "sfr"-gen bestod af: · I

I 5 promotorregionen af blomkålsmosaikvirus (p35S); I

I "sfr"-gen kassetten som beskrvet i figur 5;

I den 3'uoversatte region, omfattende polyadenyleringssignalet af T- I

I DNA transcript 7. I

I pGSR2 blev indført i Aorobacterium tumefaciens recipient I

I 10 C58C1Rif^ (pGV2260) ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet af I

I Deblaere et al (ref. 10). I

I Denne stamme blev anvendt til at indføre det chimeriske wsfr"-gen I

I i N. tabacum SRj planter. I

To variantplasmider afledet fra pGSR2, nemlig pGSFR280 og I

I 15 pGSFR281, er blevet konstrueret. De er forskellige i den uoversatte

I sekvens, der følger efter transskriptionsinitieringspositionen. I pGSR2 I

består dette fragment af følgende sekvens: I

I GAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCGGATCCATG: I

I I

I mens den består af I

I GAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTACAAATCGATCCATG: I

I 25 i pGSR280 og af I

I GAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTTCACAAATCGMG ' I

I i pGSFR281, med en ATG kodon, der er initieringskodon for "sfr"-genet.

30 "sfr"-genet fusioneres også til TR1'-2'promotoren i plasmidet pGSH150 I

I (figur 4A), hvilket frembringer pGSFR160 og pGSFR161 (figur 6B). Disse I

I plasmider indeholder små forskelle i pTR2 "sfr"-gen konfigurationen: I

I "sfr"-genet fusioneres korrekt til det endogene gen 2'ATG i pGSFR161 I

I (for sekvenser se ref. 13), hvorimod fire ekstra basispar (ATCC) er til - I

I 35 stede lige foran ATG kodonen i pGSFR160. Ellers er pi asmiderne p65FR161 I

og p65FR160 fuldstændigt identiske. I

I Alle plasmider indføres i Aorobacterium ved cointegration i accep- I

23 DK 175642 B1 torpi asmiderne pGV2260, der giver de respektive plasmider pGSFR1280, pGSFRl281, pGSFR1160 og pGSFR1161.

Andet tilfælde: Konstruktion af et plasinid indeholdende "sfr"-- genet downstream for en DNA sekvens, der koder for et transitpeptid og 5 er egnet til opnåelse af efterfølgende translokation af "sfr"-gen ekspressionsproduktet i piantecelle-chloroplaster.

I et andet sæt forsøg blev den nukleotide sekvens, som indeholdt "sfr"-genet, fusioneret til en DNA sekvens, der koder for et transitpeptid for at muliggøre dets transport til chloroplaster.

10 Et fragment af "sfr"-genet blev isoleret fra adaptorfragmentet beskrevet ovenfor og fusioneret til et transitpeptid. Med syntetiske oligonukleotider blev hele "sfr"-genet rekonstrueret og fusioneret til et transitpeptid.

Plasmidet (plasmid pATS3 nævnt nedenfor), som indeholdt den nukle-15 otide sekvens, der koder for transitpeptidet, omfattede også promotorsekvensen heraf.

Konstruktion af plasmidet pGSR4. som indeholder "sfr"-genet fusioneret til en DNA sekvens, der koder for transitpeptid (figur 7).

Plasmid pLK57 er fra Botterman (ref. 11). Plasmid pATS3 er en 20 pUC19 klon, som indeholder et 2 Kb EcoRI genomisk DNA-fragment fra Ara-bidopsis thaliana omfattende promotorregionen og transitpeptid nukleotid sekvensen af genet, ekspressionen deraf er den lille subunit af ribulose biphosphat carboxylase (ssu). Den lille subunit A. thaliana blev isoleret som et 1 500 bp EcoRI-Sohl fragment. Sphl spaltningspositionen frem-25 kommer nøjagtigt på den position, hvor koderegionen for det modne ssu protein starter.

PI asmiderne pLK57 og pATS3 blev åbnet med EcoRI og Sghl. Efter recirkulari sering ved hjælp af T4 DNA ligase blev der opnået et rekombinant plasmid pLKABl, der indeholder den sekvens, der koder for 30 transitpeptidet (Tp) og dets promotorregion (Pssu).

For at fusionere "sfr"-genet korrekt på signalpeptidets spaltningsposition, blev N-terminal gensekvensen først modificeret. Da det observeredes, at N-terminal genfusioner med "sfr"-genet bevarer deres enzymatiske aktivitet, blev den anden kodon (AGC) modificeret til GAC, 35 hvilket gav en Ncol positionsoverlapning med ATG initiatorpositionen. Et nyt plasmid, pGSSFR2, blev opnået. Det er kun forskelligt fra pGSRl (figur 5B) ved denne mutation. NcoI-BamHI fragmentet opnået fra pGSFR2 blev

DK 175642 B1 I

fusioneret til Sfihl enden af transitpeptid sekvensen. På samme måde blev I

"sfr"-genet fusioneret korrekt til ATG initiatoren af ssu-genet (ikke

vist i figurer). I

Introduktion af "sf^'-genet i en anden planteart. I

5 Bialaphos-resistens indført i planter ved ekspression af chimeri- U

ske gener, når de sidstnævnte er blevet omdannet med passende vektorer I

indeholdende nævnte chimeriske gener, er blevet demonstreret som følger. I

Rekombinantplasmiderne indeholdende "sfr"-genet blev indført separat ved I

R

bevægelse ind i Aorobacterium stamme C58Cj Rif (pGV2260) ifølge den 10 fremgangsmåde, der er beskrevet af Deblaere et al., Nuel. Acid. Res.,

13, p 1477, 1985. Rekombinantstammer indeholdende hybrid Ti plasmider I

blev dannet. Disse stammer blev brugt til at inficere og omdanne blad- I

skiver af forskellige plantearter ifølge en fremgangsmåde i det væsent- I

lige beskrevet af Horsh et al, 1985, Science, vol. 227. Disse forskelli- 15 ge plantearters transformationsprocedure, anført som eksempel, beskrives

1 det følgende. I

1. Bladskivetransformation i Nicotiana tabaeum I

Anvendte medier beskrives i det følgende: I

Aj MS salt/2 + 1% saccharose I

20 0,8% agar I

pH 5,7 I

A10 B5-medium + 250 mg/1 NH^NOj I

750 mg/1 CaCl22H20 I

25 0,5 g/1 2-(N-morpholino)-ethan- I

sulfonsyre (MES) pH 5,7 I

30 g/1 saccharose

Ajj B5-medium + 250 mg/1 NH4N03 I

30 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

2 % glukose 0,8% agar

40 mg/1 adenin I

35 + 1 mg/1 6-benzylaminopurin (BAP) I

0,1 mg/1 indol-3-eddikesyre (IAA) I

500 mg/1 Claforan I

25 DK 175642 B1 A12 B5- medium + 250 mg/1 NH^NOg 0.5 g/1 MES pH 5,7 2% glukose 5 0,8% agar 40 mg/1 adenin

+ 1 mg/1 BAP

200 mg/1 Claforan 10

Aj^ MS salt/2 + 3% saccharose 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,7% agar 200 mg/1 Claforan 15

Bakterielt medium = min A: (Miller 1972) 60 mM

K2HP04, 3H20, 33 mM KH2P04; 7,5 mM (NH4)2S04 1,7 M trinatriumcitrat; 1 mM 20 MgS04; 2 g/1 glukose; 50 mg/1 vitamin Bl Plantemateriale:

Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI 25 Planterne anvendes 6-8 uger efter subkultur på medium Aj

Infektion: - De midterste ribber og kanter fjernes fra bladene.

- Resterende dele skæres i segmenter på ca. 0,25 cm og anbringes i infektionsmediet AjQ (ca. 12 segmenter på en 9 cm petriplade indehol- 30 dende 10 ml A1Q).

- Segmenter inficeres derpå med 25 /il pr. petriskål af en sen logkultur af Aorobacterium stamme dyrket i min A medium.

- Petriplader inkuberes 2-3 dage ved lav lysintensitet.

- Efter 2-3 dage fjernes mediet og erstattes med 20 ml medium AJ0 35 indeholdende 500 mg/1 clarofan. !

Selektion og skudinduktion - Bladskiverne anbringes på medium A11 ndeholdende et selektivt

I DK 175642 B1 I

I 26 I

I middel: I

I 100 mg/1 kanamycin og I

I 10-100 mg/1 phosphinotricin. I

I - Bladskiverne overføres hver uge til et frisk medium. I

5 - Efter 2-3 uger opstår regenererede call i. De adskilles og I

I anbringes på medium Aj2 med den samme koncentration af selektivt middel I

I som anvendt til selektionen. I

I Rodfæste I

- Efter 2-3 uger dækkes call i med skud, som kan isoleres-og over- I

10 føres til rodmediet (uden selektion). I

- Rodfæstet tager 1-2 uger/ I

I - Efter et par uger mere formeres disse planter på medium Aj. I

I 2. Rodknoldinfektion på Solanum tuhernsnm (kartoffel)

I I

I Anvendte medier beskrives i det følgende: I

I Cj B5-medium + 250 mg/1 NH4N03 I

I 300 mg/1 (CaCH2P04)2 I

I 20 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 polyvinylpyrrolidon (PVP) I

I 40 g/1 mannitol (=0,22M) I

I 0,8% agar I

I 40 mg/1 adenin I

I 25 I

I C2 B5-medium + 250 mg/1 NH4NQ3 I

I 400 mg/1 glutamin I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 PVP I

I 30 40 g/1 mannitol I

I 40 mg/1 adenin I

I 0,8% agar I

0,5 mg/1 transzeatin I

I 0,1 mg/1 IAA I

I 35 500 mg/1 clarofan I

27 DK 175642 B1

Cg MS salt/2 + 3% saccharose 0,7% agar - - pH 5,7 5 Cy B5-medium + 250 mg/1 NH^NO^ 400 mg/1 glutamin 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP 20 g/1 mannitol 10 20 g/1 glukose 40 mg/1 adenin 0,6% agarose + 0,5 mg/1 transzeatin

15 0,1 mg/1 IAA

500 mg/1 clarofan

Cg B5-medium + 250 mg/1 NH^NO^ 400 mg/1 glutamin 20 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP 20 g/1 mannitol 20 g/1 glukose 40 mg/1 adenin 25 0,6% agarose + 200 mg/1 clarofan 1 mg/1 transzeatin 30 Cg B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg 400 mg/1 glutamin 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP 20 g/1 mannitol 35 20 g/1 glukose 40 mg/1 adenin 0,6% agarose

I DK 175642 B1 I

I 28 I

I +1 mg/l transzeatin I

I 0,01 mg/l gibberellicsyre I

I <“3> I

I 5 100 mg/1 clarofan I

I MS salt/2 + 6% saccharose I

I 0,7% agar I

I 10 Bakterielt medium = min A: (Miller 1972) 60 mM I

I K2HP04, 3H20, I

I 33 mM KH2P04; 7,5 mM (NH4)2S04 I

I 1,7 M trinatriumcitrat; 1 mM H

I MgS04; I

I 15 2 g/1 glukose; 50 mg/l vitamin Bl I

PIantemateriale:

Rodknolde af Solanum tuberosum c.v. Berolina

I c.v. Désirée I

I 20 I

I Infektion: I

I - Kartoflerne skrælles og vaskes med vand. I

I - Derefter vaskes de med koncentreret kommercielt blegemiddel i 20 I

I minutter, og I

I 25 - skylles 3-5 gange med sterilt vand. I

I - De yderste lag fjernes (1-1,5 cm)

I H

- Den centrale del skæres i skiver på ca. 1 cm og 2-3 mm tykke.

I - Skiverne anbringes på medium Cj (4 stykker i en 9 cm petriskål). I

I - 10 /il af en sen log kultur af en Aorobacterium stamme dyrket i I

I 30 min A medium anvendes til hver plade. I

I - Pladerne inkuberes i 2 dage ved lav lysintensitet. I

I Selektion og skudinduktion I

I - Skiverne tørres på et filterpapir og overføres til medium C2 med I

I 35 100 mg/l kanamycin. I

I - Efter en måned fjernes små call i fra skiverne og overføres til medium I

C? indeholdende 50 mg/l kanamycin. I

29 DK 175642 B1 - Efter yderligere nogle få uger overføres call i til medium Cg indeholdende 50 mg/1 kanamycin.

- Hvis små skud begynder at udvikles, overføres call i til elongation smed i um Cg indeholdende 50 mg/1 kanamycin.

5

Rodfæste - Langstrakte skud fraskilles og overføres til rodmediet Cjj.

- Skud med rødder formeres på medium Cc.

O

10 3. Bladpladeinfektion i Lvcopersicum esculentum (tomat)

Anvendte medier beskrives i det følgende:

Aj MS salt/2 + 1% saccharose 15 0,8% agar pH 5,7

Bj B5-medium + 250 mg/1 NH4N03

0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP

20 300 mg/1 Ca(H2P04)2 2% glukose 40 mg/1 adenin 40 g/1 mannitol

25 B2 B5-medium + 250 mg/1 NH^NO

0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP 400 mg/1 glutamin 2% glukose 30 0,6% agarose 40 mg/1 adenin 40 g/1 mannitol + 0>5 mg/1 transzeatin 35 0,01 mg/1 IAA 500 mg/1 clarofan

I DK 175642 B1 I

I 30 I

I B3 B5-medium +250 mg/Ί NH^NOg I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 PVP I

I 400 mg/1 glutamin

I 5 2% glukose I

I 0,6% agarose H

I 40 mg/1 adenin H

I 30 g/1 mannitol

10 +0,5 mg/1 transzeatin H

0,01 mg/1 IAA

I 500 mg/1 clarofan

I B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg I

I 15 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 PVP I

I 400 mg/1 glutamin H

I 2% glukose I

0,6% agarose

I 20 40 mg/1 adenin H

20 g/1 mannitol H

I +0,5 mg/1 transzeatin H

I 0,01 mg/1 IAA I

I 25 500 mg/1 clarofan I

I B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg I

I 0,5 g/1 MES pH 5,7 I

I 0,5 g/1 PVP

30 400 mg/1 glutamin I

I 2% glukose H

I 0,6% agarose H

40 mg/1 adenin

10 g/1 mannitol H

I 35 I

I +0,5 mg/1 transzeatin I

I 0,01 mg/1 IAA I

31 DK 175642 B1 500 mg/1 clarofan

Bg B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg

0,5 g/1 MES pH 5,7 5 0,5 g/1 PVP

400 mg/1 glutamin 2% glukose 0,6% agarose 40 mg/1 adenin 10 + 0,5 mg/1 transzeatin 0,01 mg/1 IAA 200 mg/1 clarofan 15 B^ B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP 400 mg/1 glutamin 2% glukose 20 0,6% agarose 40 mg/1 adenin + 1 mg/1 transzeatin 200 mg/1 clarofan 25

Bg MS salt/2 + 2% saccharose 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,7% agar 30 Bg B5-medium + 250 mg/1 NH^NOg 0,5 g/1 MES pH 5,7 0,5 g/1 PVP 2% glukose 0,6% agarose 35 40 mg/1 adenin + 1 mg/1 transzeatin

I DK 175642 B1 I

I 32 I

I 0,01 mg/1 GA^ I

I Bakterielt medium = min A: (Miller 1972) 60 mM I

I K2HP04. 3H20, I

I 5 33 mM KH2P04; 7,5 mM (NH4)2S04 I

I 1,7 M trinatriumcitrat; 1 mM I

I MgS04; I

I 2 g/1 glukose; 50 mg/1 vitamin Bl I

I 10 Plantemateriale: I

I Lycopersicum esculentum cv. Lucullus. I

I Planterne anvendes 6 uger efter subkultur på medium Aj. I

I 15 Infektion: I

I - Midterribbe fjernes fra bladene. I

- Blade skæres i segmenter på ca. 0,25 til 1 cm (bladkanterne

I beskadiges ikke, således at maksimalt 3 sider af bladstykkerne beskadi- I

I ges). I

I 20 - Segmenterne anbringes i medium Bj (oversiden nedad), ca. 10 seg- I

menter i en 9 cm petriskål.

I - Segmenterne inficeres derefter med 20 μΐ pr. petriskål af en sen I

I log kultur af Agrobacterium stammen dyrket i min A medium.

- Petriskåle inkuberer 2 dage ved lav lysstyrke. I

25 - Medium fjernes efter 2 dage og erstattes af 20 ml medium Bj I

indeholdende 500 mg/1 clarofan.

I Selektion og skudinduktion I

I - Bladskiverne anbringes i medium B2 + 50 eller 100 mg/1 kanamy- I

I 30 I

I - Efter 5 dage sænkes mediets osmotiske tryk ved at sænke manni-

I tolkoncentrationen, overførsler udføres efter hinanden til medium B3, I

I Β4» B5 og Bg. I

I - Efter en måned fjernes små call i med meristem fra bladskiverne og I

I 35 anbringes på medium B^ med 50 eller 100 mg/1 kanamycin. I

I - Når der er dannet små skud, overføres call i til elongationsmedium Bg I

I med 50 eller 100 mg/1 kanamycin. I

33 DK 175642 B1

Rodfæste - Langstrakte skud fraskilles og overføres til rodmediet Bg til rodsiagning.

5 - Planter formeres på medium Aj.

Væksthusforsøq for herbicid resistens

Materiale og metode , :. - 10 I dette forsøg anvendes to herbicider omfattende phosphinotricin som aktivt middel.

Disse forbindelser er tilgængelige i handelen under de registrerede varemærker BASTAR og MEIJI HERBIACE R.

Disse produkter fortyndes med 2% ledningsvand. Sprøjtning udføres på et 2 15 areal på 1 m fra fire hjørner. Vækthustemperaturen er ca. 22°C for tobak og tomat, og over 10°C til 15°C for kartoffel.

Resultater - Tobak sprøjteforsøg.

20 a) Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SRI planter omdannet med de chimeriske "sfr"-gener som til stede i pGSFRl161 eller pGSFR1282 såvel

som uomdannede kontrol planter (fra 10 cm til 50 cm høje) behandles med R

20 1 BASTA /ha. Kontrol SRI planter dør efter 6 dage, mens transformere-

O

de planter er fuldt resistente over for 20 1 BASTA og fortsætter 25 væksten uden at kunne skelnes fra ubehandlede planter. Ingen synlig skade detekteres, selv om behandlingen gentages hveranden uge. Behandlingen har ingen effekt på den følgende blomstring. Den anbefalede dosis BASTAR herbicid i landbrug er 2,5-7,5 1/ha.

b) Et lignende forsøg udføres under anvendelse af 8 1/ha MEIJA 30 HERBIACEp. De transformerede planter (de samme som ovenfor) er fuldt resistente og fortsætter væksten uden at kunne skelnes fra ubehandlede planter. Ingen synlig skade kan detekteres.

- Kartoffel sprøjteforsøg.

Utransformerede og transformerede kartoffel planter (Solanum 35 tuberosum cv. Berolina) (20 cm høje) med det chimeriske "sfr"-gen som til stede i pGSFRl161 eller pGSFR1281 behandles med 20 1 BASTAR/ha. Kontrolplanter dør efter 6 dage, mens de transformerede planter ikke viser

I DK 175642 B1 I

I I

I nogen synlig skade. De vokser uden at kunne skelnes fra ubehandlede I

planter. I

I - Tomatsprøjteforsøg. I

I Utransformerede og transformerede tomatplanter nvcopersium escu- I

I 5 lentum c.v. luculus) (25 cm høje) med det chimeriske "sfr"-gen som til I

I stede i pGSFRl161 og pGSFR1281 behandles med 20 1 BASTAR/ha. Kontrol- - I

I planter dør efter 6 dage, mens transformerede planter er fuldt resisten-

I te. De viser ingen synlig skade og vokser uden at kunne skelnes fra ube- I

I handlede planter. I

I 10 Vækstkontrol af phytopathogene fungi med transformerede planter. I

I I et andet sæt eksperimenter dyrkes kartoffel planter udtrykkende I

I chimeriske "SFR"-gener som til stede i pGSFRl161 eller pGSFRl281 i en I

I væksthusafdeling ved 20°C under høj fugtighed. Planter inokuleres ved I

I sprøjtning med 1 ml suspension af 106 Phytophtora infestans sporer pr. I

I 15 ml. Planter gror i vækstkamre (20°C, 95% fugtighed, 4000 lux), indtil I

I svampesygdomssymptomer er synlige (en uge). Et sæt planter sprøjtes på I

I dette tidspunkt med Bialaphos i en dosis på 81/ha. To uger senere er I

I ubehandlede planter fuldstændigt indficeret af svampen. Væksten af I svampen standses på Bialaphos behandlede planter, og ingen yderligere

I 20 sygdomssymptomer udvikles. Planterne er effektivt beskyttet af I

I Bialaphos' fungicide virkning.

I - Overførsel af PPT resistens gennem frø. I

I Transformerede tobaksplanter udtrykkende det chimeriske "SFR"-gen I

I som til stede i pGSFRl161 og pGSFR1281 bringes til blomstring i vækst- I

I 25 huset. De viser normal frugtbarhed. I

I Ca. 500 F1 frø af hver plante sås i jord, F1 betegnende frø af den I

første generation, dvs. direkte stammende fra de oprindeligt transforme-

rede planter. Når frøplanterne er 2-3 cm høje, sprøjtes de med 81 I

Ir H

BASTA /ha. 7 dage senere kan sunde og beskadigede planter adskilles i

I 30 forholdet ca. 3:1. Dette viser, at PPT resistens nedarves som en domi- I

I nant markør indkodet af en enkel locus. I

I 10 resistente F1 frøplanter dyrkes til modenhed, og frø høstes. F2 I

I frøplanter dyrkes som beskrevet ovenfor og testes for PPT-res i stens ved I

R I

sprøjtning med BASTA i en dosis på 8 1/ha. Nogle af F1 planterne I 35 producerer F2 frøplanter, som alle er PPT-resistente, hvilket viser at

I disse planter er homozygotiske over for resistensgenet. Opfindelsen I

angår også planteceller og planter, der er non-essentielt-biologisk- I

35 DK 175642 B1 transformerede med et GS-inhibitor-inaktiverende-gen ifølge opfindelsen.

I en foretrukket udførelsesform af opfindelsen er planteceller og planter non-biologi sk-transformerede med det ovenfor beskrevne "sfr"-gen.

5 Sådanne planteceller og planter har, stabilt integreret i deres genom, en non-varietet-specifik karakter, som gør dem i stand til at producere detekterbare mængder af phosphinotricin-acetyl transferase.

Denne karakter tildeler de transformerede planteceller og planter en non-varietet-specifik enzymatisk aktivitet, der er i stand til at 10 inaktivere eller neutralisere GS-inhibitorer som Bialaphos og PPT.

I overensstemmelse hermed gøres planteceller og planter, der er transformeret ifølge opfindelsen, resistente over for herbicide virkninger af Bialaphosog beslægtede forbindelser.

Da Bialaphos først var beskrevet som et fungicid, kan transforme-15 rede planter også beskyttes mod svampesygdomme ved sprøjtning flere gange med forbindelsen.

I en foretrukket udførelsesform anvendes Bialaphos eller beslægtede forbindelser flere gange, især med tidsintervaller på ca. fra 20 til 100 dage.

20 Opfindelsen angår også non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf, som er selektivt beskyttede mod svampesygdomme og tillader selektiv ødelæggelse af ukrudt i en mark ved behandling af marken med et herbicid, fortrinsvis en GS-inhibitor, idet plantearten i sit genom indeholder et DNA-fragment, der koder for et protein med 25 enzymatisk aktivitet, der er i stand til at neutralisere eller inaktivere det anvendte herbicid, særligt en GS-inhibitor, eller et herbicid omfattende en GS-inhibitor som aktiv bestanddel.

Det vil forstås, at non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf ifølge opfindelsen kan anvendes med samme effektivitet 30 enten med det formål kun at ødelægge ukrudt i en mark, hvis planter ikke er inficeret med svampe, eller til kun at standse udviklingen af svampe, hvis sidstnævnte viser sig efter destruktionen af ukrudt.

I en foretrukket udførelsesform er de non-biologisk transformerede frø, planter og celler deraf transformeret med et DNA-fragment 35 omfattende "sfr"-genet som ovenfor beskrevet, og det anvendte herbicid er PPT eller en beslægtet forbindelse.

I overensstemmelse hermed anvendes en opløsning af PPT eller en

DK 175642 B1 I

beslægtet forbindelse på marken, fx ved sprøjtning, flere gange efter H

fremkomst af den planteart, der skal dyrkes, indtil tidligt eller sent I

spirende ukrudt er ødelagt.

Det er ganske klart, at før emergens af den planteart, der skal H

5 dyrkes, kan marken behandles med en herbicid komposition for at ødelægge H

ukrudt.

På samme måde kan marker behandles også før såning af den plante- I

art, der skal dyrkes. H

Før emergens af den ønskede planteart kan marker behandles med et H

10 hvilket som helst herbicid, inklusive herbicider af Bialaphos-typen. H

Efter emergens af den ønskede planteart, kan Bialaphos eller en H

beslægtet forbindelse anvendes flere gange.

I en foretrukket udførelsesform anvendes herbicidet med tidsinter- H

valler på ca. fra 20 til 100 dage. H

15 Da planter, der skal dyrkes, transformeres på en sådan måde, at de I

er resistente over for den herbicide virkninger af herbicider af I

Bialaphos-typen, kan marker også behandles efter fremkomsten af de dyr- I

kede planter. H

Dette er særligt nyttigt til fuldstændigt at ødelægge tidligt og H

20 sent spirende ukrudt uden nogen virkning på de planter, der skal produ- I

ceres. I

Fortrinsvis anvendes Bialaphos eller en beslægtet forbindelse i en H

dosis, der går fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/ha, og fortyndet i en væske- H

bærer til en koncentration, der muliggør dens anvendelse i marken i en H

25 mængde, der går fra ca. 2 til ca. 8 1/ha. I

I det følgende gives illustrative eksempler på nogle udførelses- I

former med forskellige plantearter. H

- Sukkerroer I

Den nordeuropæiske sukkerroe plantes fra 15. marts til 15. april, I

30 afhængig af vejrforholdene, og mere nøjagtigt af nedbør og gennemsnits- I

temperatur. Ilkrudtsproblemerne er mere eller mindre de samme i hvert I

land og kan forårsage vanskeligheder, indtil afgrøden dækker jorden I

omkring midten af juli. I

Ukrudtsproblemer kan adskilles i tre situationer: I

35 - tidlig spiring af græsukrudt, I

- tidlig spring af bredbladet ukrudt, I

- sen spring af bredbladet ukrudt. I

37 DK 175642 B1

Indtil nu er der med held blevet anvendt præ-emergens herbicider. Sådanne forbindelser kan fås i handelen under de registrerede varemærker: PYRAMINR, G0LTIXR og VENZEAR. Disse produkters følsomhed over for tørvejrbetingelser samt manglen på restaktivitet til kontrol af sent 5 spirende ukrudt har imidlertid fået landmanden til at anvende post-emergens produkter ud over præ-emergens produkterne.

Tabel (I) herefter viser de aktive bestanddele indeholdt i de herbicide kompositioner anført i de følgende eksempler.

10 TABEL fil

Handelsnavn Aktiv bestanddel Formel AVADEXR Dial 1 at EC 400 g/1 15 AVADEX BWR Tri al lat EC 400 g/1 G0LTIXR Metamitron WP 70% R00NEETR Cycloat EC 718 g/1 TRAMATR Ethofumerat EC 200 g/1 FERVINALR Alloxydim-natrium SP 75% 20 BASTAR Phosphinotricin 200 g/1 PYRAMIN FLR Chloridazon SC 430 g/1

Ifølge opfindelsen består post-emergens herbicider af Bialaphos eller beslægtede forbindelser, som giver et godt niveau for kontrol af 25 etårige græsser (Bromus, Avena spp., Alopecurus. POA) og bladbredede (Galium. Polygonum. Senecio, Solanum. Mercurial i si.

Post-emergens herbicider kan anvendes på forskellige tidspunkter for sukkerroens vækst; på et kotyledon niveau, to-bladet niveau eller på et firbladet niveau.

30 Tabel (II) herefter repræsenterer mulige systemer for markbehand ling, givet som eksempel.

I disse eksempler er det anvendte post-ermergens herbicid af Bia-laphosklassen BASTA i kombination med forskellige præ-emergens herbici der. Koncentrationer anføres i 1/ha eller kg/ha.

I DK 175642 B1 I

I 38

b cc al H

° x σι x <Γ^ »—4 V *—t CT>

cn l_ t— .x H

+-> _j cu _i b O) O O cm

<W Ό CD CD

*» \ \

5“ — ' I < I ct: c C£ I i . ^B

<1> -O < < ^B

o O) *”— — >- S- 00 </>

y~ c oj C ro M

Q> M— CO CO Η H ·*-> C7>

I I

^ -»-> r— X

g* « σ E σ

ε lt> i— .x <v .x ^B

Λ/ ** ^ *J 4J

°ζ__ S- ·—· O CM a> ·—

<C +·> +J OS H

i— a> \ \ \

82 "σ a: cc cc cc s_ oz ai ^B

S tv <t c <c c « σ < < m <— I— ·“ ' f—r— I— i— 1—1— I N .X I— r- 1— I—

-Q o oo oo oo c oo oo H

O <n <(0 <fO <M <D ·—i c ro <C CO

*-> CQ CO CO CO ;> CO CO ^B

I C7)^> 3 09

s—er M

B o\ M

a>

-oj _x ^B

I “·.

I +J <U S- ε ^ ® r— (U rt -

S- >— c s_ —< ^B

CL) <U O H

B ΙΛ Ό

I Γβ 1— tu CC CO CO OC

H -O i— <t <t <ί C

>o I—i— (— i— \— ,— I— ,— ^B

---- +f o oo oo oo

b ° 3; ^ <fO <ro <ro H

<** <U -X 00 CQ CO CO H

O -1— ί_ 1-

S- <w H

o) .x B jc··-

-X E

H 3 a>

B vi jc ^B

H i— <u c H

+-> <u s- c σι α> > s_ o:

ew <v cc cooicj) oc cn z H

<WCE X X x .X X _X I—I H

+> -p σι i—i σι »—i σι »—i »—i j· H

y1 >2 i— -x i— -X i— m i—to i c i— >oX> s- _i _i _i - _i - 2 to-ι- O o 'd- O LO o CM ON >- tr> t- CO CD OS CD ol

J- i- H

-M O

(= <4- H

o H

-X i- to a> +j >

Ό O

s

i- οι σι H

-b -e £ cc

I aiccctxcxaco: h! I

^ ί 2" 2" t t 5 S 3- ' ·— 8! b <-<-ZZC S <t- .H?1 >CO D>CO 0*3· O QiLiO >-VO 1—100

Σ U ^ CcCOCCOt— CL Q

*··'······ O

·-'CMoo-ii-uouD r^-coen—i H

39 DK 175642 B1 - Kartofler

Kartofler dyrkes i Europa på ca. 8 x 10^ ha. De vigtigste produkter, der anvendes til ukrudtskontrol, er Linuron/monolinuron eller den forbindelse, der fås i handelen under betegnelsen METRABUZIN.

5 Disse produkter fungerer godt over for de fleste ukrudtsarter.

Imidlertid kontrolleres ukrudt såsom Galium og Solanum plus sent spirende Chenopodium og Polygonum ikke altid effektivt, mens kontrollen med etårige græsser også nogen gange er tilfældig.

Sent spirende bredbladet ukrudt kan kun kontrolleres med~post- p 10 emergens anvendelser af herbicider såsom BASTA .

Tabel (III) herefter repræsenterer eksempler på markbehandling i tilfælde af kartofler.

TABEL (III) 15

R

Ukrudtskontrolsystemer i kartofler, baseret på anvendelse af BASTA , forudsat kartofler, der er gjort resistente over for BASTA .

Linuron + monominuron (375 g + 375 g/ha) før emergens.

20 BASTAR 3-4 1/ha efter emergens (5-15 cm) BASTAR/fluazifop-butyl 3-4 1/ha + 21/ha efter emergens (5-15 cm)

Linurin WP 50% (AFAL0NR) 25 Monolinurin WP 47,5% (ARESSINR) fluazifop-butyl EL 250 g/1 (FUSILADER)

De ovenfor anvendte stammer pGSJ260 og pBG39 er blevet deponeret 12. december 1985 hos "German Collection of Micro-Organisms" (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) i Gottingen, Tyskland. De har fået hhv.

30 deponeringsnr. DSM 3606 og DSM 3607.

Yderligere udførelsesformer for opfindelsen beskrives herefter med henvisning til figurerne, hvori figur 8 viser restriktionskortet for et plasmid pJSl indeholdende 35 et andet Bialaphos-resistensgen, figur 9 viser nukleotid sekvensen af "sfrsv"-genet indeholdende resistensgenet,

I DK 175642 B1 I

I I

I figur 10 viser aminosyrehomologien for "sfrsv"-genet og "sfr"- I

genet, I

figur 11 viser konstruktionen af et plasmid, givet som eksempel, I

I som indeholder "sfrsv"-genet og er egnet til transformation of plante- I

I 5 celler.

Et andet Bialaphos-resistensgen er blevet isoleret fra en anden I

I Bialaphos-producerende stamme, dvs. streptomvces virido chromooenes. I

I Dette andet resistensgen er derefter betegnet "sfrsv"-gen. I

I Dette andet foretrukne DNS fragment ifølge opfindelsen, til efter- I

I 10 følgende transformation af planteceller, består af en nukleotidsekvens,

I der koder for mindst en del af et polypeptid med følgende sekvens: I

I 15 VSPERRPVEIRPATAADM I

I aavcdivnhyietstvnp I

I 20 RTEPQTP^EWIDDLERL Q I

I DRY PWLVAEVEG VVAGIA I

I 25 I

yagpwkarnaydwtvest

I VYV SHRHQ.RLGLGSTLYT I

I 30 I

I HILKSMEAQ.GFKSVVAVI I

I CLPNDPSVRlHEALGYTA I

I 35 I

I rgtlraagykhggwhdvg I

41 DK 175642 B1

FWQ.RDFELPAPPRPVRPV

5 T Q I * 10 hvilken del af nævnte polypeptid er af tilstrækkelig længde til at tilvejebringe beskyttelse mod Bialaphos-"plante-beskyttelsesevne-" til planteceller, når den er inkorporeret genetisk og udtrykt deri.

Herefter vil henvisning også blive givet til den "plante-beskyttende-evne" mod Bialaphos af ovennævnte nukleotide sekvens.

15 Betydningen af enkeltbogstavsbetegnelsen for aminosyrer gives i det følgende:

Alanin A Leucin L

Arginin R Lysin K

20 Asparagin N Methionin M

Asparaginsyre D Phenylalanin F

Cystein C Prolin P

Cystin C Serin S

Glycin G Threonin T

25 GIutaminsyre E Tryptophan W

Glutamin Q Tyrosin Y

Histidin H Valin V

Isoleucin I

30 Dette andet foretrukne DNA-fragment består af følgende nukleotid sekvens:

TAAAGAGGTGCCCGCCACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAGACCACAC

35 GTGAGCCCAGAACGACGCCCGGTCGAGATCCGTCCCGCCACCGCCGCCGA

CATGGCGGCGGTCTGCGACATCGTCAATCACTACATCGAGACGAGCACGG

DK 175642 B1 I

TCAACTTCCGTACGGAGCCGCAGACTCCGCAGGAGTGGATCGACGACCTG I

5 GAGCGCCTCCAGGACCGCTACCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGAGGGCGT I

cgtcgccggcatcgcctacgccggcccctggaaggcccgcaacgcotacg I

actggaccgtcgagtcgacggtgtacgtctcccaccggcaccagoggctc I

ggactgggctccaccctctacacccacctgctgaagtccatggaggccca

gggcttcaagagcgtggtcgccgtcatcggactgcccaacgacccgagcg I

tgcgcctgcacgaggcgctcggatacaccgcgcgcgggacgctgcgggca I

15 H

gccggctacaagcacgggggctggcacgacgtggggttctggcagcgcga I

cttcgagctgccggccccgccccgccccgtccggcccgtcacacagatct I

t

20 gagcggagagcgcatggc I

25 eller af en del deraf udtrykkende et polypeptid med plantebeskyttel- I

sesevne mod Bialaphos; I

Herefter følger beskrivelsen af forsøg udført til isolering af I

"sfrsv"-resistensgenet, konstruktionen af ekspressionsvektorer, som I

indeholder resistensgenet og som muliggør efterfølgende transformation I

30 af planteceller for at gøre dem resistente over for GS-inhibitorer. I

Kloning af Bialaphos-resistens-"sfrsv"-qenet fra Streptomvces

viridochromoqenes. H

Stammen Streptomvces viridochromoqenes DSM 40736 (ref. 1) dyrkedes I

og total DNA af denne stamme blev fremstillet i henhold til standardtek- I

35 nikker. DNA prøver blev nedbrudt med hhv. PstI, Smal og Sau3AI i tre I

forskellige reaktioner og separeret på en agarose gel sammen med plasmid I

DNA fra pGSRI (figur 5B) nedbrudt med BamHI. I en "Southern" analyse I

43 DK 175642 B1 udførtes DNA blotting på et nitrocellulosefilter, og der hybridiseredes med det mærkede BamHi fragment fra pGSRl indeholdende "sfr"-genet. I alle fire baner på gelen viste et restriktionsfragment stærkt homologi . med proben: et PstI fragment på ca. 3 kb, et Smal fragment på ca. 1,2 5 kb og Sau3AI fragment på ca. 0,5 kb. For at klone dette gen, klonedes PstI restriktionsfragmenter direkte i Escherichia col i vector pUC8. 3000 kolonier opnået efter transformation blev overført til nitrocellulosefiltre og hybridiseret med "sfr"-proben. Positive kandidater testedes yderligere for deres vækst på minimal medium plader 10 indeholdende 300 /zg/ml PPT. En transformant, som voksede på PPT- indeholdende medium analyseredes yderligere. PIasmidkortet og relevante piasmidpositioner for dette plasmid pJSl er vist i figur 8. Stammen MC1051 (pJSl) er blevet deponeret 6. marts 1987 hos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) under deponeringsnr. DSM 4023.

15 Klonrestriktionsfragmentet er blevet sekventeret ifølge Maxam og Gilberts metode, og genets koderegion kunne identificeres gennem homologi. Sekvensen af "sfrsv"-genet er vist i figur 9, og homologien på nukelotid og aminosyresekvens niveauet med "sfr"-gen er vist i figur 10. Ekspression af "sfrsv"-qenet 20 En "sfrsv"-gen kassette" blev også konstrueret for at muliggøre efterfølgende kloning i planteekspressionsvektorer. Et Ban11—BolII fragment indeholdende "sfrsv"-koderegionen uden initieringskodonen GTG blev isoleret fra pJSl. Dette fragment splejsedes i den med Ncol og BqlII nedbrudte vektor pLK56-2 sammen med en syntetisk oligonukleotid 25 5'-CATGACCC-3', på lignende måde som den for "sfr"-genet beskrevne og vist i figur 5. Konstruktionen af pGSRISV er vist skematisk i figur 11.

Da lignende kassetter af begge gener er til stede i hhv. pGSRl og pGSRISV, kan de tidligere beskrevne konstruktioner for ekspressionen af "sfr"-genet i planter gentages.

30 Enzymatisk analyse af rå ekstrakter fra E. coli stammer bærende plasmid pGSRISV viste syntesen af en acetyl ase, som kunne acetylere PPT.

Dette vistes med tyndlagskromotografi forx reaktionsprodukterne.

"sfrsv"-genet blev derefter indsat i plasmidvektoren pGSJ260 (figur 4B) under kontrol af CaMV 35s promotor, til at give et plasmid 35 pGS2SV, svarende til pGSR2 (figur 6A) med undtagelse af, at "sfrsv"-genet er substitueret for "sfr"-genet.

Det er klart, at herbicidresistensgener af ovennævnte type kan fås

I DK 175642 B1 I

I I

I fra mange andre mikroorganismer, som producerer PPT eller PPT derivater.

I Herbicidresistensgen kan derefter inkorporeres i planteceller med H

I henblik på at beskytte dem mod virkningen af sådanne glutamin syntetase H

I inhibitorer. Et Bialaphos-resistens-gen kan fx opnås fra Kitasotosporia H

I 5 (ref. 15). I

I Transformerede planteceller og planter som indeholder "sfrsv"-re- H

I sistensgenet kan opnås med plasmid pGSR2SV ved anvendelse af det samme H

I Agrobacterium-medierede-transformationssystem som beskrevet ovenfor for H

I transformation af forskellige plantearter med "sfr"-genet. H

I 10 Planter regenereres og testes for deres resistens med lignende

I sprøjtetests som beskrevet ovenfor. Alle planter opførte sig på lignende H

I måde og viste resistens mod herbicider bestående af glutaminsyntetasein- H

I hibitorer. H

Endelig angår opfindelsen også kombinationen af planter, der er H

I 15 resistente over for en inhibitor af glutaminsyntetase som defineret H

I ovenfor, med den tilsvarende inhibitor af glutaminsyntetase til brug ved H

I produktionen af kulturer af nævnte planter fri for ukrudt. H

1 20 I

1 25 I

I 30 I

I I

45 DK 175642 B1

REFERENCER

1. BAYER et al.,. HELVETICA CHEMICA ACTA, 1972 2. WAKABAYASHI K. and MATSUNAKA S., Proc. 1982, British Crop 5 Protection Conference, 439-450 3. M. Mason et al., PHYTOCHEMISTRY, 1982, vol. 21, n° 4, p.

855-857.

4. C. J. THOMPSON et al., NATURE, July 31, 1980, vol. 286, n° 5 772, p. 525-527 : " 10 5. C. J. Thompson et al., JOURNAL OF BACTERIOLOGY, August 1982, p. 678-685 6. C. J. THOMPSON et al., GENE 20, 1982, p. 51-62 7. C. J. THOMPSON et al., MOL. GEN. GENET., 1984, 195, p. 39-43 8. TOWBIN et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 1979, 76, p. 4 10. 9.

15 METHODS OF ENZYMOLOGY, VXLIII, p. 737-755 10. DEBLAERE H. et al., 1985, Nuel. Acid. Res., 13, 1 477 11. BOTTERMAN J., February 1986, Ph. D. Thesis, State University of Ghent 12. DEBLAERE R., February 1986, Ph. D. Thesis, Free University of 20 Brussels, Belgium 13. VELTEN et al, EMBO J. 1984, vol. 3, n° 12, p. 2 723-2 730 14. CHATER et al, Gene cloning in Streptomyces. Curr. Top.

Microbiol. Immunol., 1982, 96, p. 69-75 15. OMURA et al, J. of Antibiotics, Vol. 37, 8, 939-940, 1984 25 16. MURAKAMI et al, Mol. Gen. Genet., 205,42-50, 1986 17. MANDERSCHEID and WILD, J. Plant Phys., 123, 135-142, 1986

Claims (37)

1. DNA-fragment til efterfølgende transformation af planteceller og kodende for et I I polypeptid med fosfinotricinacetytransferaseaktivitet, som består af en I I 5 nukleotidsekvens, der koder for følgende aminosyresekvens: I I VSPERRPVEIRPATAADM I I AAVCDIVNHY. IETSTVNF I I RTEPQTPQEWIDDLERLQ I I 10 DRYPWLVAEVEGVVAGIA I I YAGPWKARNAYDWTVEST I I VYVSHRHQRLGLGSTLYT I I HLLKSMEAQGFKSVVAVI I I . GLPNDPSVRLHEALGYTA I I 15 RGTLRAAGYKHGGWHDVG I FWQRDFELPAPPRPVRPV I I T Q I I I eller for en del af nukleotidsekvensen med tilstrækkelig længde til at kode for et polypeptid, I I 20 der stadig har fosfinotricinacetyltransferaseaktivitet. I

2. DNA-fragment ifølge krav 1, som omfatter følgende nukleotidsekvens: I I TAAAGAGGTGCCCGCCACCCGCTTTCGCAGAACACCGAAGGAGACCACAC I I 25 GTGAGCCCAGAACGACGCCCGGTCGAGATCCGTCCCGCCACCGCCGCCGA I CATGGCGGCGGTCTGCGACATCGTCAATCACTACATCGAGACGAGCACGG I TCAACTTCCGTACGGAGCCGCAGACTCCGCAGGAGTGGATCGACGACCTG I I GAGCGCCTCCAGGACCGCTACCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGAGGGCGT I CGTCGCCGGCATCGCCTACGCCGGCCCCTGGAAGGCCCGCAACGCCTACG I I 30 ACTGGACCGTCGAGTCGACGGTGTACGTCTCCCACCGGCACCAGCGGCTC I I GGACTGGGCTCCACCCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCATGGAGGCCCA I I GGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCCGTCATCGGACTGCCCAACGACCCGAGCG I TGCGCCTGCACGAGGCGCTCGGATACACCGCGCGCGGGACGCTGCGGGCA I DK 175642 B1 GCCGGCTACAAGCACGGGGGCTGGCACGACGTGGGGTTCTGGCAGCGCGA CTTCGAGCTGCCGGCCCCGCCCCGCCCCGTCCGGCCCGTCACACAGATCT GAGCGGAGAGCGCATGGC 5 eller for en del deraf udtrykkende et polypeptid med fosfinotrioinacetyltransferase aktivitet.

3. Fragmentet ifølge krav 2, hvor initieringskodonen ATG substitueres for initieringskodonen GTG. 10

4. Fremgangsmåde til at kontrollere virkningen i planteceller, og planter omfattende sådanne celler, af en glutaminsyntetaseinhibitor, når førstnævnte bringes i kontakt med sidstnævnte, hvilken fremgangsmåde omfatter forårsagelse af den stabile integration i det genome DNA af disse planteceller af et heterologt DNA inklusive en 15 promoter genkendt af plantecellernes polymeraser og en fremmed nukleotidsekvens, der er i stand til at blive udtrykt i form af et protein i plantecellerne, og hvor proteinet har en enzymatisk aktivitet, der er i stand til at forårsage inaktivering eller neutralisering af glutaminsyntetaseinhibitoren, kendetegnet ved, at den fremmede nukleotidsekvens er nukleotidsekvensen eller 20 DNA-fragmentet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3.

5. Fremgangsmåde til at producere en plante eller reproduktionsmateriale af denne plante inklusiv et heterologt genetisk materiale, der er stabilt integreret deri og i stand til at blive udtrykt i planterne eller reproduktionsmaterialet i form af et protein, 25 der er i stand til at inaktivere eller neutralisere glutaminsyntetaseinhibitoraktiviteten, hvilken fremgangsmåde omfatter transformation af planteceller eller plantevæv med en DNA rekombinant indeholdende et heterologt DNA samt reguleringselementeme valgt blandt sådanne, der er i stand til at forårsage stabil integration af det heterologe DNA i plantecellerne eller plantevævet og muliggøre ekspressionen af 30 den fremmede nukleotidsekvens i plantecellerne eller plantevævet, regeneration af planter eller reproduktionsmateriale af disse planter, eller begge dele, fra plantecellerne eller -vævet, der er transformeret med det heterologe DNA I DK 175642 B1 I I 48 I og, eventuelt, biologisk replikation af sidstnævnte planter eller I I reproduktionsmateriale, eller begge dele, I I kendetegnet ved, at det heterologe DNA har nukleotidsekvensen af DNA- I I fragmentet ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3 eller af den del, der koder for I I 5 et protein med fosfinotricinacetyltransferaseaktivitet. I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor det rekombinante DNA er en vektor, der er I I egnet til transformation af plantecellerne. I I 10

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, hvor vektoren omfatter en I I nukleotidsekvens, der koder for en transitpeptid indskudt mellem I I plantepromoterregionen og det rekombinante DNA-fragment. I

8. Fremgangsmåden ifølge krav 7, hvor transitpeptidet er valgt blandt ribulose-1,5- I I 15 bifosfat carboxylase og klorofyl a/b bindende proteiner. I

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6 til 8, hvor vektoren er et I I Ti plasmid. I

10. Planteceller, der er non-essentielt biologisk transformeret, som besidder, stabilt I I integreret i deres genom, det heterologe DNA ifølge et hvilket som helst af kravene I I 1 til 3. I

11. Planteceller ifølge krav 10, som kan regenereres til en plante, der er i stand til at I I 25 producere frø. I

12. Planteceller ifølge et hvilket som helst af kravene 10 og 11, som producerer I I påviselige mængder af fosfinotricinacetyltransferase. I I 30

13. Frø, der besidder, stabilt integreret i deres genom, et DNA-fragment som I I defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 3. I DK 175642 B1

14. Frø ifølge krav 13, som er i stand til at spire til en plante, der er i stand til at producere frø med en non-varietet-specifik enzymatisk aktivitet, der er i stand til at inaktivere eller neutralisere glutaminsyntetaseinhibitorer.

15. Frø ifølge krav 13 eller 14, som er transformeret ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 4 til 8.

16. Planter, der er non-essentielt biologisk transformeret, som besidder, stabilt integreret i deres cellers genom, et heterologt DNA som defineret i et hvilket som 10 helst af kravene 1 til 3.

17. Planter ifølge krav 16, som er i stand til at producere frø.

18. Planter ifølge krav 16 eller 17, som er transformerede ved fremgangsmåden 15 ifølge krav 5.

19. Fremgangsmåde til selektiv beskyttelse af en planteart og selektiv ødelæggelse af ukrudt på en mark omfattende behandling af marken med et herbicid, hvor plantearten i 20 deres genom indeholder et heterologt DNA som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 3, og hvor det anvendte herbicid er en glutaminsyntetaseinhibitor.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 18 eller 19, hvor plantearten er transformeret ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 4 til 8. 25

21. Fremgangsmåde ifølge krav 18 eller 19, hvor en opløsning af en glutaminsyntetaseinhibitor anvendes flere gange på marken efter fremkomst af den dyrkede planteart, i særdeleshed med tidsintervaller på ca. fra 20 til 100 dage, indtil tidligt- og sent-spirende ukrudt er ødelagt. 30

22. Fremgangsmåde ifølge krav 18 eller 19, hvor glutaminsyntetaseinhibitorer omfatter Bialaphos, fosfinotricin og beslægtede forbindelser. ____ I DK 175642 B1 I I 50 I

23. Fremgangsmåde til selektiv beskyttelse af en planteart på en mark mod I I svampesygdomme omfattende behandling af en mark med et herbicid bestående af I I en glutaminsyntetaseinhibitor, hvor plantearten i sine cellers genom indeholder et I I heterologt DNA som defineret i et hvilket som helst af kravene 1 til 3, og hvor det I I 5 anvendte herbicid er en glutaminsyntetaseinhibitor. I

24. Fremgangsmåde ifølge krav 23, hvor plantearten er transformeret ved I I fremgangsmåden ifølge krav 5. I I 10

25. Fremgangsmåde ifølge krav 23 eller 24, hvor en opløsning af en I glutaminsyntetaseinhibitor anvendes flere gange i en mark efter fremkomst af den I I dyrkede planteart, i særdeleshed i tidsintervaller på ca. fra 20 til 100 dage, indtil I I svampene er ødelagt. I I 15

26. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 23 til 25, hvor I glutaminsyntetaseinhibitor er valgt blandt en gruppe omfattende Bialaphos, I I fosfmotricin og beslægtede forbindelser. I

27. Fremgangsmåde ifølge krav 22 eller 26, hvor Bialaphos, PPT eller den I I 20 beslægtede forbindelse anvendes i en dosis i området fra ca. 0,4 til ca. 1,6 kg/ha. I

28. Fremgangsmåde ifølge krav 27, hvor Bialaphos, PPT eller den beslægtede I I forbindelse fortyndes i en fluid bærer til en koncentration, der muliggør anvendelse i I I marken i en mængde i området fra ca. 2 l/ha til ca. 8 l/ha. I I 25 I

29. Fremgangsmåde ifølge krav 27 eller 28, hvor selektivt beskyttede plantearter I I omfatter sukkerroe, ris, kartoffel, tomat, majs, tobak. I

30. Vektor indeholdende et DNA-fragment som defineret i et hvilket som helst af I I 30 kravene 1 til 3. I

31. Vektor ifølge krav 30, som er egnet til transformation af planteceller og planter. I DK 175642 B1

32. Vektor ifølge krav 31, hvor DNA-fragmentet er under kontrol af en plantepromoterregion og af reguleringselementer, der tillader ekspression af DNA-fragmenterne i planteceller, når sidstnævnte senere transformeres med vektoren.

33. Vektor ifølge krav 32, som bibringer resistens mod Bialaphos til de transformerede planteceller.

34. Vektor ifølge krav 33, hvor en sekvens, der koder for et transitpeptid, er indskudt mellem plantepromoterregionen og DNA-fragmentet. 10

35. Vektor ifølge krav 34, hvor transitpeptidet er valgt blandt ribulose-1,5-bifosfat carboxylase og klorofyl a/b bindende proteiner.

36. Vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 31 til 35, hvor vektoren er et 15 modificeret Ti plasmid.

37. Vektor ifølge krav 30, hvor DNA-fragmentet er under kontrol af replikonelementer, der er egnet til transformation af bakterier, i særdeleshed E. coli. 20