JPH05500156A - 膜結合した硝酸レダクターゼ活性 - Google Patents
膜結合した硝酸レダクターゼ活性Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称:膜結合した硝酸レダクターゼ活性発明の分野
本発明は、植物、特にオオムギ苗の硝酸レダクターゼ活性に関する。さらに、本
発明は、この活性を発現する組換え分子、この活性を発現する形質転換植物、お
よび農業においてこの活性を利用することに関する。
本発明は、その一部にはNational Aeronautics and
5pace Administration(N A S A)の認可NCC2
−99の支援を得て為されたものである。政府は本発明に権利を有している。
発明の背景
硝酸塩(NO3つは高等植物の主な窒素供給源である。この硝酸塩がアミノ酸中
に導入されるためには、それが植物細胞中に輸送され、次いでアンモニアまで化
学的に還元されなければならない。
従って、根によるNO3−の輸送が植物におけるNO3−同化の過程の第1の1
秋である。輸送はNo3−によって誘導さtiSRNAとタンパク質合成の両方
を必要とする。これが、特異的なN0s−@送タンパク質が合成されるというJ
ackson、 IF、 A、ら[Plant Physiol、 52+12
0−127 (1973)]の提案を導いた。NO3−輸送物質の活性について
多くのことが知られているがJGoyal、 S、 S、ら、 Plant P
hysiol、 82:1051−1056 (1986))、X等M物!、:
おいてNo3−輸送タンハク質ハイまだ同定されていない。
硝酸塩が植物中に輸送されると、多酵素の過程でアンモニアに還元される。硝酸
塩の還元はかなりのエネルギーを必要とし、還元の最終産物であるアンモニアは
蓄積されると毒性であるので(従って、過剰に存在するときにはそれ自体が輸送
されなければならない)、この硝酸塩の還元は厳密に調節されている。
この硝酸塩還元経路の第1の酵素は、「硝酸レダクターゼ」(または、これと等
しく rNR活性」)と呼ばれている[Guerrero、 M、 G。
は、一般に細胞質に局在化されていると考えられている[Ritenour。
G、 L、ら、Plant Physiol、42: 233−237 (19
66); Dalling、M、J、ら、旦iochim、Biophys、A
cta 283: 513−519 (1972); 5uzuki、D、A、
ら、巴凹!!月51: 457−461 (1981); 0aks、A、ら、
Ann、Rev、Plant Physiol、36・ 345−365 (1
985)コ。
いくつかの報告により、全植物硝酸レダクターゼ活性の一部が細胞質ゾル性では
ないことが示唆されている。例えば、Miflin、 B、 J。
は初めて、全オオムギ根NR活性をミトコンドリアに富む分画中に少ない割合で
発見した[Miflin、B、J、、 Nature 214: 1133−1
134 (1967)〕。続いて、Miflin、 B、 J、は、膜結合した
NR活性がミトコンドリアとは別個の未同定の顆粒分画中に局在化されているこ
とを報告した[Miflin、B、J、、 Manta 93: 160−17
0 (1970月。Blevinsら[Plant−Physiol、 57:
458−459 (1976)コは後に、オオムギの根から調製した顆粒分画
中に見い出されるNR活性が、細菌汚染によることもありうることを示した(特
に、苗を低02の下で成長させたとき)。Lips。
S、 H,は、NR活性がタバコの葉の細胞微小体の膜に局在化されていること
、および可溶性分画中に検出されるNR活性が組織抽出中に膜から遊離したもの
であることを示唆した[Lips、 S、 H,、Eur、 J、 BiocN
R活性の存在を提示した。Lopez−Ruizら[Plant Physio
l、 79: 1006−1010 (1985)]は、緑藻類のNR活性をピ
レノイド中に位置決定した。
さらに、いくつかの観察によって、このような非−細胞質ゾル性NR活性が細胞
の原形質膜(PM)に存在していることもあることが示唆されている。例えば、
Ruftyら[Plant Physiol、 82: 675−680 (1
986)]は、機能的なNR活活性タンパクセNR活性誘導系の受容体の両方が
根細胞のPMに結合していることもある可能性を議論している。Butz、 R
,G、ら[Phytochemistry 13: 409−417 (197
7)っけ、トランスメンブランNR活性がNO3−輸送の担体として機能するの
であろうと提案した。硝酸レダクターゼ活性は、Neurospora cra
ssaの細胞壁−PM領域中に、およびトノブラスト膜中に見い出されてぃる[
Roldan、 J、 M、ら、Plant Physiol、70: 872
−874 (19g2)コ。しかし、硝酸レダクターゼ活性は高等植物の原形質
膜に存在していることは見い出されていない。
NH,とNO3−輸送の両方は、NO3−によって同時に誘導され、タンパク質
およびRNA合成阻害物質によって阻害され、そして根にグルコースを与えるこ
とによって活性が増加するので、Butz、 R,G。
らは、膜結合したNR活性がNO3−輸送の担体として機能することを提案した
[Butz、 R,G、ら、 Phytochem、16: 409−417
(1977)コ。
発明の要約
潜在的な硝酸レダクターゼ活性(NR活性)がトウモロコシ根ミクロソーム分画
に検出された[Zea ways L、、 Golden Jubilee]。
ミクロソーム結合性のNR活性はトリトンX−100(オクチルフェノキシポリ
エトキシエタノール)によって20倍まで刺激されたが、可溶性のNR活性は1
.2倍まで増加したにすぎなかった。ミクロソーム結合性のNR活性は、全種N
R活性の19%までを示した。
水性の2相分配によるミクロソーム分画の分析によって、膜−結合性のNR活性
が第2の上相(U2)に存在していることがわかった。
マーカー酵素による分析によって、このU2分画が原形質膜(PM)であること
が示された。このPM結合性のNR活性は1.0MまでのNaC1で小胞を洗浄
することによっては除去されなかったが、0゜05%トリトンX−100により
PMから可溶化した。対照的に、バナデート感受性のATPアーゼ活性は0.1
%トリトンX−100による処理によってPMから可溶化されなかった。これら
の結果は、硝酸塩を還元することができるタンパク質がトウモロコシ根のPMの
疎水性領域中に存在していることを示すものである。
膜結合性の硝酸レダクターゼ(NR)が、水性2相分配によってオオムギ(Ho
rdeum vulgare L、 var CM 72)の根から単離した原
形質膜(PM)分画中に検出された。このPM結合性のNRは、500mMNa
C1および1mMEDTAを用いて小胞を洗浄することによっては除去されず、
全種のNR活性の4%までを示した。PM結合性のNRはトリトンX−100に
よって20倍まで刺激されたが、可溶性NRは1.7倍増加したにすぎなかった
。その潜在性は、膜からのNRの可溶化の関数であった。トリトンX−100に
よってPM分画から可溶化したNRは、Chlorella 5orokini
ana NRに対する抗血清によって不活性化された。抗−NR血清から精製さ
れた抗−NR免疫グロブリンG(IgG)フラグメントはNO3−の取込みを9
0%以上阻害したが、NO2−の取込みには作用を有していなかった。
この阻害作用は部分的に可逆的であるにすぎなかった(根を徹底的にすすいだ後
に、対照の50%まで取込みが回復した)。プレ免疫血清IgGフラグメントは
NO3−の取込みを36%阻害したが、この作用はすすぎによって完全に可逆的
であった。無傷のNR抗血清はNo3−の取込みに全(作用を有していなかった
。本発明は、オオムギ根のPMにおけるNo3−の取込みとNO3−の還元が関
連していることを示すものである。
本発明は、高等植物から得ることができる「非−細胞質ゾル性」の「膜結合性」
の硝酸レダクターゼ活性に関する。本発明はオオムギの非−細胞質ゾル性の膜結
合性の硝酸レダクターゼ活性を基に説明されているが、本発明が他の植物由来の
他の非−細胞質ゾル性かつ膜結合性の硝酸レダクターゼ活性の同定および単離を
可能にするものであり、また、このような活性およびそれらの使用が本発明の等
価の範囲内にあることは容易に理解されるであろう。
本明細書において用いる「硝酸レダクターゼ」またはrNRJなる用語は、硝酸
塩の還元を触媒することができる酵素を指すものとする。このような酵素は、そ
の物理的性質、即ちアミノ酸配列、天然または変性後の分子量など、またはそれ
と等しくその機能的性質、即ち速度定数(v、、、、K、、ターンオーバー数な
ど)、基質の選択性もしくは特異性、産生される産物、反応条件の選択性(即ち
、熱、pH1イオン性、補助因子、補酵素など)のいずれかによって言及するこ
とができる。「活性」なる用語は、その機能的性質によって酵素を指し、言及す
るものである。
酵素は、それが天然に産生される細胞の細胞質中に通常は存在しないか、または
実質的に存在しないときに、「非−細胞質ゾル性」である。即ち、非−細胞質ゾ
ル性の酵素とは、それが通常かつ天然に産生される細胞の細胞質に存在するか、
または存在しうる酵素である。
酵素は、それが天然に産生される細胞の原形質膜に結合しているか、または天然
に結合することができるときに、「膜結合性」である。即ち、膜結合性の酵素と
は、それが通常かつ天然に産生される細胞の原形質膜に結合した状態で存在する
か、または存在しつる酵素である。
■、原形質膜分画の単離
原形質膜に非常に富む供給源は、種々の植物組織のいずれかから得ることができ
る。原形質膜の好ましい供給源は、トウモロコシの根から単離した粗製の膜調製
物から得ることができる。水性の2相分配[Larsson、C,H,、Mod
ern Methods of Plant Analysis、 N、S、シ
リーズ、細胞成分、第1巻中、 85−104頁、 Lin5kensら編、
Springer−Verlag、 Berlin、 Eleidelberg
、 New York (1985): Hodges、T、に、おP、ら、
Plant Physiol、 85: 693−698 (1987)]を用
いて、高度に豊富化されたPM分画を得た。膜結合性のNR活性はこのPM中に
存在で成長させるのが好ましい。種子口を、好ましくは通常の漂白剤から調製し
た1、5%容量/容量のNa0C1で15分間処理し、蒸留水ですすぎ、暴気し
た蒸留水中、室温で発芽させる。約24時間後に、この発芽させた種子を、暴気
した0、2mMのCa C12溶液(5L)の表面から約1cm上のステンレス
スチール・スクリーン上に広げる。
この種子をプラスチック包装で覆い、25℃の暗所に置く。このプラスチック包
装を3日後に除去し、さらに2日後に、好ましくは苗を窒素を欠(暴気した0、
1強度のHoagland溶液No、 1 [Hoagland、 D。
Rら、 Ca1.Agric、Exp、5tat、C1rc、 No、347
(1950)コに移し、制御された環境の生育室に置(。好ましくは、生育条件
を60〜65%の相対湿度、25℃および連続光としてNR活性のレベルに及ぼ
す周期の影響を最小にする。苗天蓋の光子東密度は、Licor 190Sセン
サーにより400〜700nmで測定して約400μモルm−2s−’であり、
好ましくは白熱および自冷蛍光ランプによりそれぞれ1:5の比で供給する。好
ましくは、5ylvania Lighting System (Danve
rs。
MA)からライトを入手する。連続光中で2日の後に、1mMのKNO3を含有
する0、1強度のHoagland溶液N001に24時間、苗を移してNR活
性を誘導することができる。
9日経過のトウモロコシ苗から根(約25g)を切り取り(好ましくは、種子の
すぐ下)、はさみで1cm片に切る。次いで、冷却した乳鉢と乳棒を用いて、ま
たは他の適当な手段を用いて、適当な量の冷粉砕緩衝液(即ち、60m1)中で
苗をすり砕く。適当な粉砕緩衝液は、250mMスクロース、3mMエチレンジ
アミン四酢酸酢酸DTA)、50mM2−アミノ−2−(ヒドロキシメチル)−
1,3−プロパンジオール(トリス−HClXpH8,0)、0.05%(w/
w根)ポリビニル−ポリピロリドン、1mM ジチオトレイトール(DTT)、
3mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、1gM Na2M。
Oa (H20) z、および5μMフラビンーアデニンジヌクレオチド(FA
D)からなるのが好ましい。PMSFは、好ましくはイソプロパツール中の0.
1M保存液として調製し、0.75ml PMS F : 25m1粉砕緩衝液
の比で加える。DTTは脱イオン水中の1.0M保存液として調製し、0.02
5ml DTT : 25ml粉砕緩衝液の比で加える。粉砕緩衝液中に使用し
た全ての化学物質は、Sigma Chewical Co、 (St、 Lo
uis、 MO,USA)から入手することができる。ホモジネートを好ましく
は4層のチーズクロスで濾過し、好ましくは12、000gで10分間遠心する
。この12. OO0g遠心後の分画を酵素分析用に蓄えておいてもよい。この
上清を好ましくは120゜000gで20分間遠心する。得られたペレットはミ
クロソーム分画、即ち粗製の膜分画である。この120. OO0g遠心後の分
画を酵素分析用に用いることもできる。
NR活性を測定するために、上で得たミクロソームのペレットを好ましくは再懸
濁緩衝液中に懸濁し、20m1に希釈し、120,000gで20分間遠心する
。再懸濁緩衝液は、2mMl−リス−HCI(pH8,2)、1μM NazM
oO4(H2O)z、5gM FAD、3+aMPMSFおよび1mMDTTを
含有しているのが好ましい。好ましくはこの工程を3回以上繰返し、最初のミク
ロソーム分画を含む各々の膜ベレットから得た試料をNR活性の測定のために蓄
えた。
これとは別に、ミクロソームのペレットを好ましくは25’OmMスクロース、
5mMK−ホスフェ h(pH7,8)および1mMPMSFの溶液(2,2m
1)中に再懸濁し、Larssonらが詳述している水性ポリマー2相系[原形
質膜: Modern l!ethods of Plant Analysi
s、 New 5eries、Vol、 1. Ce1l Component
s、HF Linksensら編、Springer−Verlag、 Ber
lin、 pp、 85−104 (1985)]で分配した。この方法の全て
の工程を4℃で行なうのが好ましい。
好ましくは、適当な量の再懸濁されたミクロソーム分画(1〜5m1)を、6.
5%(w/w)デキストランT 500 (Pharmacia Fine C
hemicals、 Piscataway、 NJ、 USA)、6.5%(
w/w)ポリエチレングリコール3350 (Sigma Chemical
Co、、 St、 Louis、 MO,USA)、領33Mスクロース、3m
MKClおよび5mMK−ホスフェート(pH7゜8)を含む2相系(約8m1
)に加える。この試験管の内容物を40〜50回の反転によって混合し、スイン
グ・パケット・ローター(swinging−bucket rotor)にて
1.200gで5分間遠心する。
上側の相を集め、Sandstromら[Plant Physiol、 85
: 693−698 (1987)]が記載しているようにして新鮮な下側の相
の上に再分配した。
残存しているミクロソーム(U2)および最初の下側相(Ll)分画を集め、各
々を適当な量(例えば、20m1)の再懸濁緩衝液で希釈し、120、000g
で20分間遠心した。U2ペレットを再懸濁緩衝液に懸濁し、20m1に希釈し
、再び120,000gで20分間遠心した。
得られたペレットを懸濁し、タンパク質濃度が120,000g遠心後の分画に
等しくなるまで再懸濁緩衝液で希釈し、これを酵素分析に直接用いることができ
る。
2回遠心したU2分画をQ 、 5 mg、 ml−、タンパク質濃度となるま
で再懸濁緩衝液で希釈し、最終濃度がQ、5ml中O〜0.1MNaC1となる
ようにする。全ての分画を30秒間激しく混合し、氷上に置(。塩処理した分画
を、例えばアメリカン・ブランド(American Brand)ソニケータ
ー(American 5cientific Product、 McGra
w Park、 IL、 USA)中、氷上にて超音波処理する。20分後に、
分画を再懸濁緩衝液(8ml)で希釈し、150. OOOgで15分間遠心す
る。この再懸濁ペレットにおいて硝酸レダクターゼ活性を測定することができる
。
これとは別に、2度ペレット化したU2分画を再懸濁緩衝液で05mg/mlの
タンパク質となるまで希釈し、全量3.5ml中でO〜01%トリトンX−10
0(オクチルフェノキンポリエトキシエタノール: Sigma Chemic
al Co、、 St、 Louis、 MO,USA)となるようにする。
次いで、好ましくはこの材料を約30秒間激しく混合し、氷上に置く。15分後
に、分画を希釈せずに150.000gで15分間遠心する。これら再懸濁され
たペレットおよび可溶性の分画において、バナデート(Vanadate)感受
性のATPアーゼ活性およびNR活性を測定する。
種々の酵素(その使用は本発明を容易にする)の活性は、次のようにして測定す
ることができる。トリトンX−100刺激されたヌクレオントシホスファターゼ
(UDPアーゼ)活性は、Nagahashi、 J、ら[Protoplas
n+ 112: 167−173 (1982)]に従って測定するのが好まし
い。
トリオースリン酸イソメラーゼ活性は、Gibbs、 M、らの方法[解糖酵素
、 HF Linksens、 BD Sanwal、 M Tracey編、
Modern Methods of Piant Analysis、Vo
l、7. Springer Verlag Berlin、p、520 (1
964)コに従って測定するのが好ましい。チトクロムCオキシダーゼ(EC1
,9゜3、1. )は、Hodges、 T、 K、らの方法[Methods
Enzymol 32: 392−406 (1974)]に従って測定する
のが好ましい。アンチマイシンA非感受性NADHCyt cレダクターゼ(E
C1,6,99,3)活性は、Lordら[J、Ce1lBio1.57: 6
59−667 (1973)]およびHodges、 T、 K、ら[Meth
ods Enzym。
132: 392−406 (1974)]の記載のように測定するのが好まし
い。バナデート感受性のATPアーゼ(EC3,6,1,3)活性は、トリトン
X−のが好ましい。アルコールデヒドロゲナーゼ(EC1,1,1,1)は、S
uzuki、 Y、らの方法[Physiol、 Plant 27: 121
−125 (1972)]に従って測定するのが好ましい。硝酸レダクターゼ活
性(EC1,6,6,1)は、測定容量を500μmまで減少させることを除き
、種々の濃度のトリトンX−100(既知のTap比)の存在下に、Aslam
らの方法[Plant Physiol、 83: 579−584 (198
7)コに従って測定するのが好ましい。すべての酵素の比活性をmg膜タンパク
質基づいて報告する。
タンパク質の濃度は、Bradfordの方法[Bradford、M、M、、
Anal、Bi。
chem、 72: 248−254]の改良法を用いて測定するのが好ましい
。この方法では、0.2%のトリトンX−100(60μm)を各々の試験管に
入れて膜タンパク質を可溶化した。結晶性ウシ血清アルブミン(Sigma C
hemical Co、、 St、Louis9Mo、 USA)を標準として
用いた。
上記の方法を用いて、トウモロコン根から単離した粗製の膜分画において硝酸レ
ダクターゼ活性を検出した。捕捉された可能性のある可溶性NR活性を遊離させ
るために、膜ペレットを低張性緩衝液[Pupillo、 P、ら、 Plan
ta 151: 506−511 (1981)コ中で好ましくは4回洗浄する
。最初の洗浄によりNR活性の約20〜25%が可溶性分画に放出される。これ
は、恐らく、膜小胞内にゆるく結合していたかまたは捕捉されていた可溶性NR
活性であろう。膜ベレットを引き続き洗浄すると、さらにわずかなNR活性が放
出される。このことは、洗浄された膜ペレット中に検出されたNR活性が膜結合
性であることを示すものである。通常、膜分画を低張性緩衝液で少なくとも2回
洗浄して、ゆるく結合している可溶性NR活性を除去するのが好ましい。
■、膜結合性の硝酸レダクターゼの遺伝子操作本発明は、さらに、膜結合性の硝
酸レダクターゼをコードしている遺伝子配列、この遺伝子配列を含有する発現媒
体、この媒体で形質転換された宿主、この形質転換された宿主の発現によって産
生された硝酸レダクターゼ、およびこの硝酸レダクターゼの使用を包含するもの
である。
種々の方法のいずれかを用いて硝酸レダクターゼをコードしている遺伝子配列を
クローニングすることができる。このような方法の1つは、cDNA挿入体のシ
ャトルベクターライブラリー(硝酸レダクターゼを発現する細胞から導()を、
硝酸レダクターゼの遺伝子配列を含有している挿入体の存在について分析するこ
とを必要とする。この分析は、細胞をベクターでトランスフェクトし、次いでN
Rの発現を調べることによって行なうことができる。硝酸レダクターゼの遺伝子
配列をクローニングするための方法の1つは、酵素分子のアミノ酸配列を決定す
ることを必要とする。この課題を達成するためには、NR膜タンパク質精製しく
上記の試験を用いて)、分析して、タンパク質のアミノ酸配列を決定する。この
ような配列を解明することができる任意の方法を用いることができるが、Edm
an分解法が好ましい。自動配列決定機を用いることが特に好ましい。
酵素の全アミノ酸配列を決定することも可能であるが、分子のペプチドフラグメ
ントの配列を決定し、この配列データを用いて全NR遺伝子配列を単離するのに
用いることができるオリゴヌクレオチドプローブを調製するのが好ましい。NR
ペプチドフラグメントは、臭化シアンまたはプロテアーゼ類(パパイン、キモト
リプシンまたはトリプシンなど)と共に無傷分子をインキュベートすることによ
って得ることができる[0ike、 Y、ら、 J、Biol、Chem、 2
57: 9751−9758 (1このペプチドが10アミノ酸より長いときに
は、通常、この配列の情報は遺伝子配列(硝酸レダクターゼをコードしている配
列など)をクローニングすることを可能にするに十分である。
このアミノ酸配列の情報を用いて、それをコードしつるDNA配列を調べて硝酸
レダクターゼをコードしている遺伝子配列をクローニングする。遺伝暗号は縮重
しているので、特定のアミノ酸をコードするのに1以上のコドンを用いることが
できる[Watson、J、D、、 M。
1ecular Biology of the Gene 5equence
、第3版中、 356−357頁、W。
A、Benjamin、Inc、、Menlo Park、CA (1977)
コ。
ときにはアミノ酸配列が唯一のオリゴヌクレオチドによってコードされているこ
ともあるが、アミノ酸配列は1組の類似オリゴヌクレオチドのいずれかによって
コードされていることが多い。重要なことは、この組の構成員のすべてがペプチ
ドフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチドを含んでいるが、
即ちペプチドフラグメントをコードしている遺伝子配列と同一のオリゴヌクレオ
チド配列を潜在的に含有しているが、この組の構成員の1つだけが遺伝子配列の
ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含有していることである。この構
成員がこの粗生に存在し、この組の他の構成員の存在下であってもDNAにハイ
ブリダイズすることができるので、ペプチドをコードしている遺伝子配列をクロ
ーニングするために単一のオリゴヌクレオチドを用いるのと同じ方法で、1組の
未分画のオリゴヌクレオチドを用いることができる。
遺伝暗号[Watson、 J、 D、 、 Mo1ecular Biolo
gy of the Gene 5equence、第3版中、 W、A、Be
njamin、Inc、、 Menlo Park、 CA (1977)]を
用いて、1またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができる
(そのそれぞれがNRペプチドをコードすることができる)。
特定のオリゴヌクレオチドが実際に現実の硝酸レダクターゼをコードしている配
列を構成する可能性は、真核細胞において特定のアミノ酸をコードするのに実際
に用いられる特定コドンの頻度および異常な塩基対合の関係を考慮することによ
って評価することができる。
このような「コドン使用規則」は、Lathe、 R,ら[J」olec、Bi
ol、 183: 1−12 (1985)]が開示している。Latheの「
コドン使用規則」を用いて、NRペプチド配列をコードしうる理論的に「最も可
能性の高い」ヌクレオチド配列を含む1個のオリゴヌクレオチドまたは1組のオ
リゴヌクレオチドを同定する。
この硝酸レダクターゼ遺伝子配列フラグメントをコードしうる理論的に「最も可
能性の高い」配列を含む1個のオリゴヌクレオチドまたは1組のオリゴヌクレオ
チドを用いて、「最も可能性の高い」1個の配列または1組の配列にハイブリダ
イズしうる相補性の1個のオリゴヌクレオチドまたは1組のオリゴヌクレオチド
の配列を同定する。このような相補性の配列を含むオリゴヌクレオチドをプロー
ブとして用いてNR遺伝子配列を同定し、単離することができる[Maniat
is、 T、ら、 Mo1ecular Cloning A Laborat
ory Manual、 ColdSpring Harbor Press、
Co1d Spring Harbor、 NY (1982)]。
即ち、まとめると、NRペプチド配列の実際の同定が、該ペプチドをコードしう
る理論的に「最も可能性の高い」1個のDNA配列または1組のDNA配列の同
定を可能にする。この理論的な配列に相補性のオリゴヌクレオチドを作成するこ
とによって(または、1組の「最も可能性の高い」オリゴヌクレオチドに相補性
の1組のオリゴヌクレオチドを作成することによって)、NR遺伝子配列を同定
および単離するためのプローブとして機能しうる1個のDNA分子(または、1
組のDNA分子)を得る。
本発明に従って硝酸レダクターゼを遺伝子操作するための方法は、硝酸レダクタ
ーゼをコードしうる遺伝子配列をクローニングすることによって、およびこの遺
伝子配列を発現させることによって促進される。本明細書で使用する「遺伝子配
列」なる用語は、核酸分子(好ましくは、DNA)を指すものとする。硝酸レダ
クターゼをコードしうる遺伝子配列は種々の供給源から得ることができる。これ
ら供給源には、ゲノムDNA、cDNA、合成りNA、およびこれらの組合せが
含まれる。
ゲノムDNAは天然のイントロンを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい
。さらに、このゲノムDNAを、NR遺伝子配列の5゛プロモーター領域と結合
させて得ることもできる。宿主細胞がタンパク質の発現に関与する転写調節およ
び翻訳開始シグナルを認識することができるなら、この5°領域を保持し、転写
および翻訳開始の調節に用いてよい。
cDNAについては、このcDNAをクローニングし、得られたクローンを所望
の配列をコードしているcDNA用の適当なプローブてスクリーニングしてよい
。所望のクローンが単離されたなら、このcDNAをゲノムDNAの場合と実質
的に同じ方法で操作することができる。しかし、cDNAを用いるとイントロン
または介在配列は全く存在しないであろう。このため、硝酸レダクターゼをコー
ドしているcDNA分子が本発明の好ましい遺伝子配列である。
ゲノムDNAまたはcDNAはいくつかの方法で得ることができる。ゲノムDN
Aは、当分野で周知の手段によって適当な細胞から抽出し、精製することができ
る。別法によれば、mRNAを硝酸レダクターゼを産生ずる細胞から単離し、こ
れを用いて当分野で周知の手段によりcDNAを調製することができる。このよ
うな適当なDNA調製物を酵素によって切断するか、またはランダムに剪断し、
組換えベクターに連結して遺伝子配列ライブラリーを得る。次いで、これらベク
ターを上記のオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングして、NRをコード
している配列を同定することができる。
上記の操作によって同定された適当な1個のオリゴヌクレオチドまたは1組のオ
リゴヌクレオチド(NR遺伝子配列のフラグメントをコードすることができるか
、または1個のオリゴヌクレオチドまたは1組のオリゴヌクレオチドに相補性で
ある)を合成し、NR遺伝子配列を発現しうる細胞から得たDNAまたはさらに
好ましくはcDNA調製物に対して、当分野で周知の手段によりハイブリダイズ
させる。使用するDNAまたはcDNAの供給源は、NR配列を豊富化したもの
であるのが好ましい。このような豊富化は、高レベルのNR遺伝子配列を生じる
細胞からRNAを抽出することによって得たcDNAによって得るのが最も容易
である。核酸ハイブリダHarbor、 NY (1982)]、およびHay
mes、 B、 D、ら[Nucleic Ac1d Hybrid85)]が
開示している(これら文献は本明細書の一部を構成する)。
所望のNRをコードしている配列の検出を容易にするため、上記のDNAプロー
ブを検出可能なグループでラベルすることができる。
このような検出可能なグループは、検出可能な物理的または化学的性質を有する
任意の物質であってよい。このような物質は免疫検定の分野で多く開発されてお
り、通常、この方法において有用な任意のラベルの大部分を本発明に適用するこ
とができる。特に有用なラベルは、酵素的に活性なグループ、例えば酵素[C1
1n、 Chem、η:1243 (1976)を参照]、酵素基質[英国特許
5pec、 1,548,741を参照コ、補酵素[米国特許No、 4.23
0.797および4.238.565を参照]および酵素阻害物質[米国特許N
o、 4.134.792を参照コ;蛍光物質[Cl1n、Chem、 25:
353 (1979)を参照];発色物質:発光物質、例えば化学発光物質お
よび生物発光物質[C11n、Chem、 25: 512 (1979)を参
照]:特異的に結合しうるリガンド:近接相互作用する対、ならびに放射性同位
体、例工1f3H,”S、 ”P、 ” I オヨU14(、ct)ル。コノヨ
ウナラベルおよびラベル対を、それら自身の物理的性質(例えば、蛍光物質、発
色物質および放射性同位体)またはそれらの反応もしくは結合の性質(例えば、
酵素、基質、補酵素および阻害物質)に基づいて検出する。例えば、補助因子ラ
ベルされたプローブは、酵素(そのラベルが補助因子である)とこの酵素の基質
を加えることによって検出することができる。例えば、基質に作用して測定可能
な物理的性質を有する産物を与える酵素を用いることができる。この例には、β
−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが含まれ
るが、これらに限定はされない。
次いで、ハイブリダイズしうろことがわかった上記の遺伝子配列ライブラリーの
構成員を分析して、それらが含有しているNRコード化配列の長さと性質を調べ
る。
NR遺伝子配列をクローニングする別の方法においては、NRを発現することが
できる細胞由来のDNAまたはより好ましくはcDNAを発現ベクター中にクロ
ーニングすることによって発現ベクターのライブラリーを調製する。次いで、こ
のライブラリーをスクリーニングして、抗−NR抗体と結合するタンパク質を発
現することができ、かつ、NRまたはNRのフラグメントと同一のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードしうるヌクレオチド配列を有する構成員を選択す
る。
上記の方法によって得たクローン化した硝酸レダクターゼコード化配列を発現ベ
クターに機能的に結合させ、細菌または真核細胞に導入して、NRまたはその機
能的誘導体を産生させる。このような操作のための方法はManiatis、
T、ら(上記)が開示しており、当分野では周知である。
このように、上記の方法は硝酸レダクターゼまたはそのフラグメントをコードし
うる遺伝子配列を同定することができる。この遺伝子配列の特徴をさらに調べる
ためには、この配列がコードしているNRを発現させ、それがNRの性質を保持
していることを確認するのが望ましい。このような性質には、抗−NR抗体と特
異的に結合する能力、NRと結合しうる抗体の産生を誘導する能力、受容細胞に
硝酸レダクターゼ活性を与える能力などが含まれる。
上記の組換え法を用いる代わりに、合成法(例えば、有機合成法)を用いること
により、NRをコードしている遺伝子配列を調製することができる。
(以下、余白)
■、硝酸レダクターゼおよびその機能的誘導体の発現上記の方法によって得た硝
酸レダクターゼをコードしている配列を発現ベクターに機能的に連結し、原核ま
たは真核細胞中に導入して、硝酸レダクターゼまたはその機能的誘導体を産生さ
せることができる。本発明は、この無傷の硝酸レダクターゼおよびこの硝酸レダ
クターゼの機能的誘導体の両方に関するものである。硝酸レダクターゼの「機能
的誘導体」とは、硝酸レダクターゼの生物学的活性に実質的に類似した生物学的
活性(機能的に、または構造的に)を保持する化合物である。この「機能的誘導
体」なる用語は、分子の「フラグメント」、「変異体」、「類似体」または「化
学的誘導体」を含むことを意図している。硝酸レダクターゼなどの分子の「フラ
グメント」とは、該分子の任意のポリペプチド小集団を指すことを意味する。硝
酸レダクターゼなどの分子の「変異体」とは、完全分子またはそのフラグメント
のいずれかに構造および機能が実質的に類似している分子を指すことを意味する
。2つの分子が実質的に類似した構造を有しているとき、または2つの分子が類
似した生物学的活性を保持しているときに、一方の分子は他方の分子に「実質的
に類似」していると言われる。即ち、2つの分子が類似の活性を保持しているな
らば、一方の分子の構造が他方に見い出されないときであっても、あるいはアミ
ノ酸残基配列が同一ではないときであっても、この用語を本明細書で用いるとき
にはこれら2分子は変異体であるとみなされる。硝酸レダクターゼなどの分子の
「類似体」とは、完全分子またはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に
類似している分子を指すことを意味する。本明細書では、分子が通常はその分子
の一部ではない別の化学的部分を含有しているときに、ある分子は別の分子の「
化学的誘導体」であると言われる。このような部分は、分子の溶解性、吸収性、
生物学的半減期などを改善する。
このような作用を媒介することができる部分は、Remington’ s P
harmaceutical 5ciences (1980)に開示されてい
る。この部分を分子に結合させるための方法は当分野で周知である。
硝酸レダクターゼまたはその機能的誘導体をコードしているDNA配列を、常法
に従ってベクターDNAと結合させることができる。
これには、連結のための平滑末端化または付着末端化、適当な末端を得るための
制限酵素消化、適切な付着末端の充填、所望ではない結合を避けるためのアルカ
リホスファターゼ処理、および適当なりガーゼによる連結が含まれる。このよう
な操作のための方法は、Maniatis、 T、ら(上記)が開示しており、
当分野では周知である。
DNAなどの核酸分子は、それが転写および翻訳調節の情報を含むヌクレオチド
配列を含有し、この配列がポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に「
機能的に連結」しているときにポリペプチドを「発現することができる」と言わ
れる。機能的な結合とは、調節DNA配列および発現させようとするDNA配列
が、遺伝子配列を発現させるような仕方で結合している結合を指す。遺伝子配列
の発現に必要な調節領域の正確な性質は生物の種類によって変わるであろうが、
プロモーター領域を含んでいるのが普通であろう。原核生物では、このプロモー
ター領域は、プロモーター(RNA転写の開始を指令する)ならびにRNAに転
写されたときに硝酸レダクターゼ合成の開始を合図するであろうDNA配列の両
方を含んでいる。通常、このような領域は転写および翻訳の開始に関与している
5゛−非暗号配列、例えばTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列
などを含有しているであろう。
所望なら、硝酸レダクターゼをコードしている遺伝子配列の3゛側の非暗号領域
を、上記の方法によって得ることができる。この領域を、終止およびポリアデニ
ル化などの転写終止調節配列用に保持させることもできる。即ち、硝酸レダクタ
ーゼをコードしているDNA配列に天然に隣接している3゛−領域を保持させる
ことによって、転写終止シグナルを付与することができる。この転写終止シグナ
ルが発現宿主細胞において十分に機能しないときには、この宿主細胞において機
能する3′−領域を置換してもよい。
2つのDNA配列(例えば、プロモーター領域の配列と硝酸レダクターゼをコー
ドしている配列)の間の結合の性質が次のようであるときに、これら2つのDN
A配列は機能的に結合していると言われる:(1)フレームシフト突然変異を導
入する結果にならない;(2)硝酸レダクターゼの遺伝子配列の転写を指令する
プロモーター領域配列の能力に悪影響を及ぼさない;または(3)プロモーター
領域配列によって転写させようとする硝酸レダクターゼの遺伝子配列の能力に悪
影響を及ぼさない。即ち、プロモーターがDNA配列を転写させることができる
なら、該プロモーター領域は該DNA配列に機能的に結合している。
このように、硝酸レダクターゼを発現させるためには、適当な宿主によって認識
される転写および翻訳シグナルが必要である。
本発明は、原核または真核細胞のいずれかにおいて硝酸レダクターゼタンパク質
(または、その機能的誘導体)を発現させることを包含する。好ましい原核性宿
主には、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス属、シュードモナス属、サルモネ
ラ属、セラッチア属などの細菌が含まれる。最も好ましい原核宿主は大腸菌であ
る。特に重要な細菌宿主には、大腸菌に12株294 (ATCC31446)
、大腸菌X1776 (ATCC31537)、大腸菌W3110(F\λ\原
栄養性) (ATCC27325)、および他の腸内細菌(Salmonell
a typhimuriumまたは5erratia marcescensな
ど)、および種々のシュードモナス種が含まれる。
このような条件のもとでは、硝酸レダクターゼはグリコジル化されないであろう
。原核宿主は、発現プラスミド中のレプリコンおよびコントロール配列に適合す
るものでなければならない。
原核細胞(例えば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属、ストレプトマイセス属
など)中で硝酸レダクターゼ(または、その機能的誘導体)を発現させるために
は、硝酸レダクターゼをコードしている配列を機能的な原核性プロモーターに機
能的に結合させることが必要である。このようなプロモーターは構成性またはよ
り好ましくは調節可能(即ち、誘導可能または抑制解除可能)のいずれであって
もよい。構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのintプロモー
ター、pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のblaプロモーター、およ
びpPR325のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列
のCATプロモーターなどが含まれる。誘導可能な原核性プロモーターの例には
、バクテリオファージλの主右側および左側プロモーター(PLおよびPR)、
大腸菌のtrp。
recA、 1acZ、 1acTおよびgalプロモーター、枯草菌のα−ア
ミラーゼプロモーター[Ulmanen、 1.ら、 J、Bacteriol
、162+ 176−182 (19: 11−20 (1984)]、バシラ
ス属のバクテリオファージのプロモーター [Gryczan、 T、J、 、
The Mo1ecular Biology of the Bacill
i中、 Academic Press、Inc、、 NY (1982)]、
ならびにストレプトマイセス属のプロモーター[1fard、 J、 M、ら、
Mo1.Gen、Genet、 203: 468−478 (1986)]
(1986)]およびGottesman、S、 [Ann、Rev、Gene
t、 18: 415−442 (1984)]によって概説されている。
また、原核細胞における適切な発現には、遺伝子配列をコードしている配列の上
流にリポソーム結合部位の存在が必要である。この好ましい真核宿主には、酵母
、菌類、昆虫細胞、哺乳動物細胞(インビボまたは組織培養のいずれか)が含ま
れる。宿主として有用な哺乳動物細胞には、線維芽細胞起源の細胞、例えばVE
ROまたはCHO−Kl、またはリンパ様細胞起源の細胞、例えばバイブリド−
vSP210−AG14またはミエローマP3X63Sg8、およびこれらの誘
導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、5P210およびJ558L
、ならびに神経芽細胞腫セルライン、例えば1MR332(正しい翻訳後プロセ
ッシングの比較的高い能力を付与する)が含まれる。
哺乳動物宿主のためには、いくつかの可能なベクター系を硝酸レダクターゼの発
現のために利用することができる。宿主の性質に依存して、多種多様の転写およ
び翻訳調節配列を用いることができる。
この転写および翻訳調節配列は、ウィルス供給源から、例えばアデノウィルス、
ウシ乳頭腫ウシ、サルウィルスなどから得ることができ、ここで調節シグナルは
高レベルで発現する特定の遺伝子配列に結合している。別法では、アクチン、コ
ラーゲン、ミオシンなどの哺乳動物遺伝子産物由来のプロモーターを用いること
ができる。抑制または活性化を行なう転写開始調節シグナルを選択して、遺伝子
配列の発現を変調させることができる。温度感受性であって温度を変えることに
より発現を抑制または開始させることができる調節シグナル、または化学物質(
中間代謝物など)による調節を受ける調節シグナルが重要である。
酵母は、翻訳後のペプチド修飾をも行ないうるという重要な利点を与える。酵母
において所望のタンパク質を産生させるために利用することができる高コピー数
のプラスミドと強力なプロモーター配列を用いる多数の組換えDNA法が存在す
る。酵母はクローン化した哺乳動物遺伝子配列生成物のリーダー配列を認識し、
リーダー配列を保持するペプチド(即ち、プレーペプチド)を分泌する。
酵母をグルコースに富む培地中で増殖させたときに大量に産生されるグルコース
分解酵素をコードしている活発に発現される遺伝子配列からのプロモーターおよ
び終止要素を導入した一連の酵母遺伝子配列発現系のいずれかを利用することが
できる。さらに、既知のグルコース分解の遺伝子配列は、極めて効率的な転写コ
ントロールシグナルをも与えることができる。例えば、ホスホグリセレートキナ
ーゼの遺伝子配列のプロモーターおよびターミネータ−シグナルを利用すること
ができる。
別の好ましい宿主は昆虫細胞、例えばショウジヨウバエ(Drosophila
)幼虫である。宿主として昆虫細胞を用いると、ショウジヨウバエのアルコール
デヒドロゲナーゼプロモーターを利用することができる[Rubin、G、M、
、 5cience 240: 1453−1459 (1988)コ。別の方
法によれば、バキュロウィルスベクターを操作して、昆虫細胞において中、 S
etlow、J、にら編、 Plenum、第8巻、 277−297頁(19
86)]。
上記のように、真核宿主において硝酸レダクターゼを発現させるためには真核性
調節領域の使用を必要とする。通常、このような領域は、RNAの合成の開始を
指令するに十分なプロモーター領域を含んでいるであろう。好ましい真核性プロ
モーターには、マウスメタ−[McKnight、 S、 、 Ce1l 31
: 355−365 (1982)] ; S V 40の初期プロモーター[
Benoist、 C,ら、 Nature(London) 290: 30
4−310 (1981)];および酵母のga14遺伝子配列のプロモーター
[Johnston、 S、 A、ら。
Proc、 Natl、Acad、 Sci、 (USA) 79: 6971
−6975 (1982); 5ilver、 P、 A、轣B
Proc、 Natl、 Aead、 Sci、 (USA) 81: 595
1−5955 (1984)コが含まれる。
広く知られているように、真核性mRNAの翻訳は第1のメチオニンをコードし
ているコドンから始まる。このため、硝酸レダクターゼ(または、その機能的誘
導体)をコードしているDNA配列と真核性プロモーターの間の結合がメチオニ
ンをコードしうる介在コドン(即ち、AUG)を全く含まないことを確実にする
のが好ましい。
このようなコドンの存在は、融合タンパク質の生成(AUGコドンが、硝酸レダ
クターゼをコードするDNA配列と同じリーディング・フレーム中にあるとき)
、またはフレームシフト突然変異(AUGコドンが、硝酸レダクターゼをコード
する配列と同じリーディング・フレーム中にないとき)の結果を与える。
硝酸レダクターゼをコードしている配列および機能的に結合させたプロモーター
を、直線分子またはより好ましくは共有結合によって閉環した分子のどちらであ
ってもよい非複製DNA(または、RNA)分子として、受容原核細胞または真
核細胞のどちらかに導入することができる。このような分子は自律的に複製する
ことができないので、硝酸レダクターゼの発現は導入した配列の一時的な発現に
よって起こるであろう。別法によれば、導入された配列を宿主染色体中に組込む
ことによって永久的な発現が起こる。
1つの態様では、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中に組込むことができるベ
クターを使用する。導入されたDNAを染色体中に安定に組込んだ細胞は、発現
ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする1またはそれ以上のマーカーを
も導入することによって選択することができる。このマーカーは、栄養要求変異
種にプロトトロフィーを与えるであろう[例えば、抗生物質または重金属(銅な
ど)などの生物致死剤耐性コ。選択マーカーの遺伝子配列を、発現させようとす
るDNA遺伝子配列に直接結合させるか、または同時トランスフェクションによ
って同じ細胞に導入することができる。さらに、別の要素が1本鎖結合タンパク
質mRNAの最も望ましい合成のために必要となるであろう。これらの要素には
、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサ−および終止シ
グナルが含まれるであろう。このような要素を導入したcDNA発現ベクターに
は、Okayama、H,[Mo1ec、Ce11.Biol、 74: 28
0 (1983)]が開示したものが含まれる。
好ましい態様においては、導入した配列を、受容宿主における自律的な複製が可
能なプラスミドまたはウィルスベクターに導入する。
この目的に多種多様のベクターの任意のものを用いることができる。
特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択する際の重要な因子には次のも
のが含まれる:即ち、ベクターを含んでいる受容細胞を、ベクターを含んでいな
い受容細胞から認識および選択する際の容易さ;特定の宿主において望ましいベ
クターのコピー数;ならびに、異なる種の宿主細胞の間でベクターを「往復」さ
せうろことが所望であるか否かなどである。好ましい原核性ベクターには、大腸
菌中で複製することができるプラスミド、例えば、pBR322、CoIEl、
psclol、pAcYc184、πvXなどが含まれる。
pring Harbor、 NY (1982)]が開示している。バシラス
属プラスミドにはpC194、pC221、pT127などが含まれる。このよ
う適当なストレプトマイセス属プラスミドには、p I J 101 [Ken
dall、 K、 J、ら、 J、Bacteriol、 169: 4177
−4183 (1987)コ、およびφC31などのストレプトマイセスバクテ
リオファージ[Chater、 K、 F、ら。
5ixth International Symposium on Act
inomycetales Biology中。
Akademiai Kaido、 Budapest、 Hungary (
1986)、 pp、45−54]が含まれ−742(1978)コが概説して
いる。
好ましい真核性プラスミドにはBPV、ワクシニア、SV40.2−ミクロンサ
ークルなど、またはそれらの誘導体類が含まれる。
構築物(群)を含むDNA配列またはベクターが発現用に調製されたなら、この
DNA構築物(群)を種々の適当な手段、例えば形質転換、トランスフェクショ
ン、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リン酸カルシウム沈
澱、直接的なマイクロインジェクションなどのいずれかによって適当な宿主細胞
中に導入してよい。
ベクターを導入した後に、ベクター含有の細胞の増殖を選択する選よって、硝酸
レダクターゼまたは硝酸レダクターゼのフラグメントが産生される結果になる。
これは、形質転換された細胞そのままで起こりうるし、また、この細胞を誘導し
て分化させた後に起こりつる(例えば、神経芽細胞腫の細胞にブロモデオキシウ
ラシルを与えることなどによって)。
発現されたタンパク質は、抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、電気泳動など、通常の条件に従って単離および精製してもよ
い。
■、遺伝的に修飾された植物への硝酸レダクターゼの使用硝酸レダクターゼの遺
伝子配列を遺伝子操作法によって植物中に導入することができる。これは、植物
細胞中で産生されたときに、植物による窒素の固定化を容易にするための手段と
して用いることができ、従って植物の還元窒素に対する要求を減少させるか、ま
たは不要にすることができる。従って、肥料に対する依存性が比較的小さく、か
つ劣悪な栽培条件のもとて比較的生存しつる植物を得ることが可能になる。即ち
、本発明の別の態様においては、NR遺伝子配列を植物の形質転換に用いて、こ
の植物に硝酸レダクターゼ活性を付与するか、またはそれを高める。
本発明において使用してよいNR遺伝子配列の暗号領域は、この遺伝子配列の完
全長または部分的な活性長のものである。しかし、この硝酸レダクターゼをコー
ドしている遺伝子配列は、得られた植物細胞中で機能的な硝酸レダクターゼとし
て発現され、産生されることが必要である。
硝酸レダクターゼの遺伝子配列をコードしているゲノムDNAおよびcDNAな
らびに合成りNAに由来するDNAを本発明に用いることができる。また、硝酸
レダクターゼの遺伝子配列を、部分的にcDNAクローンから、部分的にゲノム
クローンから、部分的に合成遺伝子から、ならびにこれらの種々の組合せから構
築してもよい。さらに、硝酸レダクターゼの遺伝子配列をコードしているDNA
は、種々の種からの部分からなっていてもよい。
別の態様においては、本発明は、
(a)ある植物細胞において発現したときに硝酸レダクターゼに対して機能的で
ある、硝酸レダクターゼをコードしている第1の遺伝子配列;
(b)この硝酸レダクターゼの暗号領域のどちらかの側に機能的に連結した1ま
たはそれ以上の付加的な遺伝子配列;を含有するキメラの遺伝子配列を包含する
。これらの付加的な遺伝子配列は、プロモーター(群)またはターミネータ−(
群)のための配列を含んでいる。植物の調節配列は宿主細胞に対して異種または
同種のどちらであってもよい。
好ましい態様においては、硝酸レダクターゼの遺伝子配列のプロモーターを用い
てキメラ遺伝子配列を発現させる。この遺伝子配列に用いることができる他のプ
ロモーターには、nos、 ocsおよびCaMVプロモーターが含まれる。使
用することができる効率的な植物プロモーターは過産生植物プロモーターである
。硝酸レダクターゼの遺伝子配列と機能的に結合したこのプロモーターは、硝酸
レダクターゼの発現を促進することができるはずである。本発明に用いることが
できる通産生植物プロモーターには、大豆由来のりブロース−1,5−ビホスフ
ェートカルポキシラーゼの小サブユニット(SS)のプロモーター[Berry
−Loveら、 JlMolecular and App、 Gen、、l:
483−498 (1982)]およびクロロフィルa/b結合タンパク質のプ
ロモーターが含まれる。これら2つのプロモーターは、真核植物細胞中で光誘導
されることが知られている[例えば、Genetic Engineering
of Plants、 an Agricultural Perspecti
ve、 A、 Cashmore、 Plenum。
New York (1983)、 pages 29−38; Corruz
i、G、ら、J、 of Biol、 Chem、、 258: 1399 (
1983):およびDunsmuir、 P、ら、 J、 of Mo1. a
nd Applied Genet、、 2: 285 (1983)を参照コ
。
さらに別の好ましい態様においては、硝酸レダクターゼの遺伝子配列を含有する
キメラの遺伝子配列の発現を、植物プロモーターと、および遺伝子配列分泌シグ
ナル配列と正しいリーディングフレーム中に機能的に結合させる。
植物プロモーターおよび好ましい態様では分泌シグナル配列に機能的に結合させ
た硝酸レダクターゼ遺伝子配列を含有するキメラ遺伝子配列を、適当なりローニ
ングベクターに連結することができる。
通常は、宿主細胞に適合する種から導いたレプリコンおよびコントロール配列を
含むプラスミドまたはウィルス(バクテリオファージ)ベクターを用いる。通常
、クローニングベクターは、複製起点、ならびに形質転換された宿主細胞におい
て表現型選択マーカー(代表的には、抗生物質に対する耐性)を与えることがで
きる特別の遺伝子配列を担持しているであろう。これら形質転換ベクターは、宿
主細胞の形質転換の後にこれら表現型マーカーによって選択することができる。
本発明において使用することができる宿主細胞には、大腸菌(E、 coll)
、S、 typhimuriumおよび5erratia marcescen
sなどの細菌宿主を含む原核生物が含まれる。また、酵母または糸状菌などの真
核性宿主を本発明において用いることができる。
クローニングベクターとこのベクターで形質転換された宿主細胞を本発明で用い
て、通常、ベクターのコピー数を増加させる。コピー数の増加により、硝酸レダ
クターゼの遺伝子配列を含むベクターを単離することができ、例えば、これを用
いてキメラ遺伝子配列を植物細胞中に導入することができる。このベクター中に
含まれる遺伝物質を、マイクロピペットの使用により植物細胞中に直接マイクロ
インジェクションして、組換えDNAを機械的に移すことができる。また、細胞
によって取込まれる遺伝物質との沈澱コンプレックスを形成するポリエチレング
リコールを用いて、遺伝物質を植物細胞中に移すこともできる[Paszkow
skiら、 EMBOJ、 3: 2717−22 (1984)コ。
本発明の別の態様では、硝酸レダクターゼの遺伝子配列を、電気穿孔法によって
植物細胞中に導入することができる[Frommら、「電気穿孔法により単子葉
植物および双子葉植物細胞に転移させた遺伝子配列の発現J、 Proc、Na
tl、Acad、Sci、 U、S、A、 82: 5824 (1985)]
。
この方法においては、硝酸レダクターゼの遺伝子構築物を含有するプラスミドの
存在下に植物のプロトプラストを電気穿孔する。強い場の電気的衝撃は生物膜を
可逆的に透過性にし、プラスミドの導入を可能にする。電気穿孔された植物のプ
ロトプラストは細胞壁を再生し、分裂し、そして植物カルスを形成する。発現さ
れた硝酸レダクターゼを伴う形質転換植物細胞の選択は、上記の表現型マーカー
を用いて行なうことができる。
硝酸レダクターゼの遺伝子配列を植物細胞に導入する別の方法は、硝酸レダクタ
ーゼの遺伝子配列で形質転換されたAgrobacterium tumefa
ciensで植物細胞を感染させることである。当分野で既知の適当な条件のも
とで、形質転換植物細胞を増殖させて新芽、根を形成させ、さらに植物まで成長
させる。硝酸レダクターゼの遺伝子配列を、例えばAgrobacterium
tumefaciensのTiプラスミドを用いて適当な植物細胞に導入する
ことができる。このTiプラスミドはAgrobacterium tumef
aciensによる感染によって植物細胞に伝達され、植物ゲノム中に安定に組
込まれる[Horschら、「植物における機能的な外来遺伝子の遺伝j、 5
cience 233: 496−498 (1984): Fraleyら、
汀oc、Nat1.^cad、Sci、U、S、A、80: 4803 (19
83)コ。
Tiプラスミドは形質転換細胞の生成に必須である2つの領域を含有している。
この1つはトランスファーDNA(T−DNA)と呼ばれ、腫瘍の生成を誘導す
る。他方はビルレント領域と呼ばれ、生成には必須であるが、腫瘍の維持には必
須ではない。植物ゲノムに転移するトランスファーDNA領域は、その転移能力
に影響を及ぼすことなく、酵素の遺伝子配列を挿入することによってその大きさ
を増加させることができる。腫瘍を引き起こす遺伝子配列を除去してその遺伝子
がもはや干渉しないようにすることにより、次にこの改良型のTiプラスミドを
、本発明の遺伝子配列構築物を適当な植物細胞に転移させるためのベクターとし
て用いることができる。
Agrobacteriumによって形質転換され、形質転換細胞がら全植物を
再生することができる全ての植物細胞を本発明に従って形質転換し、それによっ
て、転移した硝酸レダクターゼ遺伝子配列を含有する形質転換された全植物を得
ることができる。
現在、以下に示す2種類の異なる方法が、Agrobacteriumで植物細
胞を形質転換するために存在する:
(1)培養され単離されたプロトプラストとAgrobacteriumの同時
培養;または
(2)Agrobacteriumによる細胞または組織の形質転換。
方法(1)は、プロトプラストの培養および培養されたプロトプラストからの植
物の再生が可能な確立された培養系を必要とする。
方法(2)は、(a)植物細胞または組織がAgrobacteriumによっ
て形質転換されうろこと;および(b)形質転換された細胞または組織を誘導し
て全植物に再生しうること;を必要とする。バイナリ−系では、感染させるため
に2種類のプラスミド、即ちT−DNA含有プラスミドおよびvirプラスミド
を必要とする。
酵素が発現されるようにTiプラスミドで植物細胞または植物を形質転換した後
、これら植物細胞または植物を適当な表現型マーカーによって選択することがで
きる。これらの表現型マーカーには抗生物質耐性が含まれるが、これに限定はさ
れない。他の表現型マーカーが当分野で知られており、これを本発明において使
用することもできる。
プロトプラストを単離および培養して全再生植物を得ることができる全ての植物
を本発明によって形質転換することができ、転移した硝酸レダクターゼ遺伝子配
列を含有する全植物を回収することができる。いくつかの適当な植物を例示する
と、これにはFragaria。
LotusSMedicago、0nobrychis、 Trifolium
STrigonella、 VignalCitrusSLinum、 Ger
anium、 Manicot、 DaucusSArabidopsis、
Brassica、 Raphanus、 5inapis、 Atropa、
Capsicum、 Datura、 Hyoscyamus。
LycopersionSNicotiana、 Solanum、 Petu
niaSDigitalisSMajorana、 Cichorium、 H
e1ianthus、 LactucaSBromus、 Asparagus
SAntirrhinum、 Hemerocallis、 NemesiaS
PelargoniumSPanicum、 Pennisetum、 Ran
unculus、 5enecio、 Salpiglossis、 Cucu
misXBrowallia、 GlycineSLolium、 Zea、
TriticumSSorghumおよびDaturaなどの属の種が含まれる
。
実際的には全ての植物(全ての主要な穀物種、サトウキビ、テンサイ、綿、果樹
およびその他の樹木、マメ類ならびに野菜類を含むが、これらに限定はされない
)を培養された細胞または組織から再生しうるという証拠が増えつつある。Ag
robacteriumによってこれら植物の全てが形質転換されうるか否かに
ついては、現在その知識が限定されている。Agrobacteriumの天然
の植物宿主である種はインビトロで形質転換することができる。単子葉植物、特
に穀物類および草類はAgrobacteriumの天然の宿主ではない。Ag
robacteriumを用いてこれらを形質転換しようとする試みは最近まで
不成功であった[tlooykas−Van Slogterenら、 Nat
ure 311: 763−764 (1984)]。ある種の単子葉植物をA
grobacteriumによって形質転換しうることが現在では明らかになり
つつある。現在利用可能となった新規な実験方法を用いて、穀物および草類の種
を形質転換することができる。
Agrobacteriumによって形質転換しつる別の植物の属には、Ipo
m。
ea、 Pa5siflora、 Cyclamen、 Malus、 Pru
nusSRosaSRubus、 Populus、 Santalum、 A
Alllu、 LiliumSNarcissus、 Ananas、 Ara
chis、 PhaseolusおよびPisumが含まれる。
培養プロトプラストからの植物の再生は以下の文献に記載されてv York、
1983); M、R,Davey、 r植物プロトプラストノ培養オヨヒ再
gs、 pp、19−29 (Birkhauser、 Ba5el、 198
3); P、J、Dale、 r穀物および他の扱いにくい農作物のプロトプラ
スト培養および植物再生J、 Protoplasts、 1983− Lec
ture Proceedings、 pI)、 31−41 (Birkha
user。
Ba5el、 1983);およびH,Binding、 r植物の再生J、
Plant Protoplasts、 pp、21−37 (CRCPres
s、 Boca Raton、 1985)。
再生は植物の種類によって変わるが、通常は、複数コピーの硝酸レダクターゼ遺
伝子配列を含有する形質転換プロトプラストの懸濁液を最初に得る。次いで、こ
のプロトプラスト懸濁液から天然の胚として発達および発芽する段階まで、胚の
形成を誘導することができる。通常、培養培地は種々のアミノ酸およびホルモン
(オーキシンやサイトカイニンなど)を含有しているであろう。また、特にトウ
モロコシやアルファルファなどの種に対しては、培地にグルタミン酸やプロリン
を加えるのが好都合である。新芽と根が同時に現れるのが普通である。効率的な
再生は、培地、遺伝子型、および培養の経過に依存するであろう。これら3つの
変数を制御すると、再生は完全に再現可能かつ繰返し可能となる。
形質転換された植物細胞から成長させた成熟植物を自家授粉させて同系交配植物
を得る。この同系交配植物は硝酸レダクターゼの遺伝子配列を含有する種子を産
する。この種子を成長させて硝酸レダクターゼを有する植物を得ることができる
。
本発明の同系交配株を用いて昆虫耐性のハイブリッドを作成することができる。
この方法においては、昆虫耐性の同系交配系統を別の同系交配系統と交配させて
ハイブリッドを得る。
再生した植物から得た部分、例えば花、種子、葉、枝、果実なども、これらの部
分が昆虫耐性細胞を含有しているならば、本発明に包含される。また、再生した
植物の子孫、変異体および突然変異体も本発明の範囲内に含まれる。
二倍体植物においては、通常、一方の親を硝酸レダクターゼの遺伝子配列によっ
て形質転換し、他方の親は野生型である。これらの親を交配させた後には、第1
世代のハイブリッド(Fl)は、1/2の硝酸レダクターゼ/野生型:1/2の
硝酸レダクターゼ/野生型の分布を示すであろう。この第1世代のハイブリッド
(Fl)を自家授粉させて第2世代のハイブリッド(F2)を得る。このF2ハ
イブリッドの遺伝子分布は、1/4の硝酸レダクターゼ/硝酸レダクターゼ:1
/2の硝酸レダクターゼ/野生型=1/4の野生型/野生型である。この硝酸レ
ダクターゼ/硝酸レダクターゼの遺伝子構成を有するF2ハイブリッドを、除草
剤耐性の植物として選択する。
本明細書において用いる変異体とは、この変異体が昆虫耐性の植物をなお構成し
ているならば、安定かつ遺伝性の表現型の変化について言うものである(植物の
子孫に性的に伝達される遺伝性の変異を含む)。また、本明細書において用いる
突然変異体とは、放射などの環境的条件の結果としての変異、またはある特質が
十分に確立された遺伝法則に従って減数分裂により伝達される遺伝的変異の結果
としての変異を言うものである。しかし、この突然変異植物は本発明の昆虫耐性
をなお示すものでなければならない。
以上に本発明の詳細な説明したが、以下の具体的な実施例を参照することによっ
て本発明をさらに明確に理解することができる。これら実施例は例示のために挙
げたものであって、特に明記しない限り本発明を限定するものではない。
(以下、余白)
実施例1 トウモロコシ由来物質の調製トウモロコシ苗(Zea mays L
、、 Golden Jubilee)は水耕法で成育させた。種子(仁)を通
常の漂白剤から調製した1、5%容量/容量Na0C1中に15分間浸し、蒸留
水で洗浄し、暴気した蒸留水中、室温で発芽させた。24時間後、発芽した種子
を、暴気した0、 2mMのCa Cl 2溶液(5L)の表面から約1cm上
のステンレス・スチール・スクリーン上にまき、プラスチックの覆いをかぶせて
25℃の暗所に置いた。そのプラスチックの覆いを3日後に除去した。5日後に
、窒素を欠く空気を含ませた0、1〜強度のホーグランド(Hoagland)
溶液no、 1 [Boagland、 D、R,、and Arnon、 D
、1.、 Ca1. Agric。
Exp、 5tat、 C1rc、 No、 347 (1950)]に苗を移
し、制御された環境下の栽培室に置いた。栽培条件は60〜65%相対湿度、2
5℃、および連続光としてNRAレベルに及ぼす周期の影響を最小限にした。苗
天蓋の光子束密度は、Licor 190 Sセンサーを用0た400〜700
nmでの計測で400μモルm−2,s−1であり、白熱および自冷色の蛍光灯
により各々1:5の割合で供給した。光源は5ylvania Lightin
g System、 Danvers、 MAより入手した。連続光の下で2日
経過後、NRAを誘導するために24時間、1mMKNO3を含有する0、1強
度のホーグランド(Hoagland)溶液no、 lに移した。
ミクロソームの単離
9日経過のトウモロコシ苗がら得た根(25g)を種のすぐ下で摘出し、はさみ
で1cmの断片に切り、次いで冷却した乳鉢と乳棒中の冷却した粉砕緩衝液(6
0ml)中ですり砕いた。この粉砕緩衝液は、250mMスクロース、3mMエ
チレンジアミン四酢酸酢酸DTA)、50mM2−アミノ−2−(ヒドロキシメ
チル)−1,3−プロパンジオール(トリス−HCl)(pH8,0)、0 、
05 %(w/w根)ホ’) ヒニルポリピロリドン、1mMジチオトレイトー
ル(DTT)、3mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、1μ
M Na2MoO4(H2O)2、および5μMフラビンーアデニンジヌクレオ
チド(FAD)からなるものであった。PMSFはイソプロパツール90.1M
保存液として調製し、0.75ml PMS F + 25ml粉砕緩衝液の比
で加えた。DTTは脱イオン水中1.0M保存液として調製し、0.025a+
I DTT : 25ml粉砕緩衝液の比で加えた。粉砕緩衝液中に使用した全
ての化学品は、Sigma Chemical Co、、 St、 Louis
、 MO,USAから得た。ホモジネートを4層のチーズクロスで濾過し、12
゜000gで10分間遠心した。いくつかの実験において、12. O00g遠
心後の分画の一部を酵素分析のために蓄えた。上清を120゜000gで20分
間遠心した。得られたペレットはミクロソーム分画、すなわち粗膜分画を表した
。酵素分析のためのいくつかの実験において120.000g遠心後の分画を用
いた。
NRAを測定するために、ミクロソームのペレットを再懸濁緩衝液中に懸濁し、
20m1に希釈し、120.000gで20分間遠心した。再懸濁緩衝液は、2
1nMトリスーHCI(pH8,2)、1gMNa2Moo4(H2O)2.5
gM FAD、3mM PMSFおよび1mMDTTであった。工程をさらに3
回繰返し、最初のミクロソーム分画を含む各々の膜ペレットから得た試料をNR
A測定のために蓄えた。
原形質膜の単離
ミクロソームのペレットを250mMスクロース、5mMK−ホスフェート(p
H7,8)および1mMPMSFの溶液(2,2m1)中に再懸濁し、Lars
sonらにより詳述されている水性ポリマー2相系[原形質膜: Modern
Methods of Plant Analysis、 New 5eri
es、 Vol、 1゜Ce1l Components、 HF Links
ensら編、eds、、 Springer−Verlag、 Berlin、
pp、 85−104 (1985)コで分配した。この方法の全ての工程は
、4℃で行った。簡単に言えば、6.5%(W/W)デキストランT500(P
harmacia Fine Chemicals、 Piscataway、
NJ、 USA)、6.5%(W/W)ポリエチレングリコール335 Q
(Sigma Chemical Co、 、 St、 Louis。
MO,USA)、0.33Mスクロース、3mM KCIおよび5mMK−ホス
フェート(pH7,8)を含む2相系(8ml)に、再懸濁されたミクロソーム
分画(2ml)を加えた。試験管の内容物を40〜50回倒置することにより混
合し、スイング・パケット・ローター(swinging−bucket ro
tor)にて1.200gで5分間遠心した。上相を集めて、S7)]が記載し
ているようにして新鮮な下相の上に再分配した。残存しているミクロソームU2
および最初の下相(Ll)分画を集めて、各々を再懸濁緩衝液(20ml)で希
釈し、120.000gで20分間遠心した。U2ベレットを再懸濁緩衝液中に
懸濁し、20m1に希釈して再び120. OOOgで20分間遠心した。得ら
れたペレットを懸濁して、タンパク質濃度が120.000g遠心後の分画に等
しくなるまで再懸濁緩衝液で希釈し、酵素分析のために直接用いた。
塩の洗浄 2回遠心したU2分画を0 、5 mg、 ml−、タンパク質濃度
となるまで再懸濁緩衝液で希釈し、最終濃度がQ、5ml中O〜0.IMNaC
1となるようにした。全ての分画を30秒間激しく混合し、氷上に置いた。塩処
理した分画をアメリカン・ブランド(AmericanBrand)(Amer
ican 5cientific Product、 McGraw Park
、 IL、 USA)超音波処理装置中で氷上にて超音波処理した。20分後、
分画を再懸濁緩衝液(8ml)で希釈し、150,000gで15分間遠心した
。この再懸濁ペレットにおいて硝酸レダクターゼ活性を測定した。
2度ペレットにしたU2分画を再懸濁緩衝液でタンパク質が0.5mg」l−1
となるまで希釈し、全量0.5ml中0〜0.1%トリトンX−100(オクチ
ルフェノキシポリエトキシエタノール、 Sigma Chemical Co
、、 St、 Louis、 MO,USA)となるようにして、30秒間激し
く混合し、次いで氷上に置いた。15分後、分画を希釈せずに150、 OOO
gで15分間遠心した。再懸濁されたペレットおよび可溶性分画においてバナデ
ート(Vanadate)−感受性ATPアーゼ活性よびNRAを測定した。
実施例2 トウモロコシにおける膜−結合性のNR活活性トウモロコシ跡ら単離
した粗膜分画において硝酸レダクターゼ活性を検出した。潜在性の捕獲された可
溶性NRAを放出させるために、膜ペレットを低張性緩衝液中で4回洗浄した[
Pupillo、 P、。
and Del Grosso、 E、、 Planta 151:506−5
11 (1981)コ。最初の洗浄によりNRAの23%が可溶性分画に放出さ
れた。これはおそら(、膜小胞中にゆるく結合していたかまたは捕獲されていた
可溶性NRAを表すものであった。膜ペレットを引き続き洗浄することによりさ
らにわずかなNRAが放出された。これは、洗浄された膜ペレット中に検出され
たNRAが膜−結合性であることを示した。ゆるく結合している可溶性NRAを
除去するために、以降の全ての実験において膜分画は低張性緩衝液で少なくとも
2回洗浄した。
可溶性および膜結合性NR活性の両方に対するトリトンX−100の効果を表1
に示す。ミクロソームのNR活性はトリトンX−100により9倍まで刺激され
た一方で、可溶性NR活性にはほとんど影響はなかった。T:p比が約3 、5
mg、 mg−+である0、043%のトリトンX−100で最大活性に達し
た。ミクロソームのNR活性に対して、トリトンX−100のより高い濃度によ
るそれ以上の効果はほとんどなかった。洗浄剤による活性化は可溶性NR活性に
対するよりも膜−結合性NR活性に対するほうがはるかに大きいために、トリト
ンX−100による刺激はNR活性に対する一般的効果の結果ではなく、膜−結
合性酵素の特異的な活性化であるように思われる。同様に、粒状のセルラーゼは
トリトンX−100により刺激されるが、可溶性セルラーゼはほとんど影響を受
けない[Koehler、 D、E、ら、 Plant Physiol、58
:324−330 (1976)]。
表1のために、上述のようにしてトウモロコシ苗を栽培し、膜分画を単離した。
ミクロソーム分画をベレットにして低張性緩衝液中で3回再懸濁し、タンパク質
濃度が120.000g遠心後(可溶性)の分画(0、7mg、 mg”)と等
量になるまで希釈し、直接NR活性の測定に用いた。可溶性分画および最終ミク
ロソームペレット中でトリトンX−100の濃度を増加させながら硝酸レダクタ
ーゼ活性を測定した。実験は3回繰り返し、平均±SEを示す。
表1
トウモロコシ根由来の可溶性およびミクロソームのNR活性に対するトリトンX
−100の効果反応混合物中の Tap 硝酸レダクターゼ活性トリトンX−1
00(%) (mg、mg”) (nモルmg−1、h−1)可溶性 ミクロソ
ーム
0 0 181±13 13.7±4
0.013 1.0 188±15 28.4±30.017 1.4 212
±12 101 ±80.043 3.5 193±13 124 ±7.50
.086 6.9 212±16 133 ±90.129 10.4 205
±13 128 ±8シヨ糖勾配遠心分離法によるトウモロコシ根ミクロソーム
分画の予備的分析により、ミクロソーム−結合性NR活性はPM分画中にに富む
ことが示された。NR活性がPMに局在化していることを示すために、高度に精
製されたPM分画を単離することは重要である。
導入部で説明した様にNR活性が一般に細胞質ゾル中に局在化していると考えら
れているので、PM分画が細胞質性物質を含まないことは特に重要である。
水性2相分配を用いて、トウモロコシ根由来の非常に純度の高い5kensら編
、 Springer−Verlag、Berlin、 Heidelberg
、New York (1985); lodges、 T、に、、 and
Mills、 D、、 Academic Press 118:41−54
(1986)]。水水性2相配されたトウモロコシ−根ミクロソーム分画のマー
カー酵素による評価を表2に示す。U2分画においてPM H”−ATPアーゼ
活性が2.3倍豊富であることが検出された。トノプラスト、液胞、ゴルジ体、
小胞体、ブラスチドおよび細胞質に対するマーカーの評価により、これらの活性
の各々はU2において顕著に減少していることが示された。ミクロソームに比べ
て、U2分画においては、硝酸塩−感受性ATPアーゼ活性(トノプラスト)は
100%、NADHCyt cレダクターゼ活性(小胞体)は95%、潜在的な
UDPアーゼ活性(ゴルジ体)は96%、およびチトクロームCオキシダーゼ活
性(ミトコンドリア)は91%減少した。U2において検出可能なプラスチドお
よび細胞質ゾル性の[Anderson、 L、E。
ら、Plant Physiol、45+583−585 (1970); M
iflin、B、J、ら、 PlantPhysiol、嬰:870−74 (
1974)コトリオースリン酸イソメラーゼ活性および細胞質ゾル性の[Qua
il、 P、H,、Annu、 Rev、 Plant Physiol、 3
0+425−85 (1979)]アルコールデヒドロゲナーゼ活性のU2にお
ける欠如により、この分画に細胞質性の不純物の混入が全くなかったことが証明
されている。マーカー−酵素のデータにより、U2は主にPMからなることを示
している。
表2のために、上述のようにしてトウモロコシ根の分画を単離した。活性を保存
するために上記の分画の調製物を単離後直ちに用いた。また一度に全試験を行う
ために十分なPM分画の量を単離することができなかったので全試験を行うため
に数個の異なる調製物が必要であった。様々な分画を与える3つの異なる調製物
を用いて各々の試験を少な(とも3回繰り返した。平均±SEを示す。
表2
トウモロコシ根分画のマーカー酵素による評価感受性 3±0.4 44.7±
1.0 36.6±1.0 101±1,2ATPアーゼ”/PM
NO3−感受性
ATPアーゼ°10,7±0.05 0.06±0.01 0.23±0.02
0±0トノブラスト
潜在性UDPアーゼ“0.6±0.05 29.4±0.5 63.4±0.8
1.05±0.2/ゴルジ
NADHCyt c
レダクターゼ”/ 0.08±0.01 0.9±0.05 1±0.1 0.
05±0.005R
Cyt cオキシダ
ーゼ/ミドコン 0±00.3±0.05 0.5±0.050.03±0.0
05ドリア
TPIc/プラスチ)’ 5±0.5 5.5±0.6 9.1tO,50i0
/細胞質
ADH’ /細胞質 52±10±00±00±OaμモルPi、 mgタンパ
ク質、h刊りμモルCyt c、 mgタンパク質、h−1cμモルNADH,
mgタンパク質、h−1dnモルNAD、mgタンパク質、h−1膜結合性NR
活性がPM中に局在化しているかどうかを決定するために、可溶化および相−分
配された膜分画におけるNR活性の分布を測定した(表3)。金板NR活性の約
1.8〜19%(12,000g遠心後の上清のNR活性を基にして)が、トリ
トンX−100の非存在下および存在下の各々においてミクロソーム分画中に検
出された。U2(PM)分画において、ミクロソームの1.7〜2.6倍豊富な
NR活性が、トリトンX−100の非存在下および存在下の各々において検出さ
れた。これらを合わせて考えると、マーカー−酵素およびNR活性データは、膜
結合性NR活性がPMと関連を有することを示している。
NR活性がPMにイオン性の結合をしているかどうかを決定するために、PM小
胞を0〜1.0MNaC1を含む緩衝液に再懸濁し、30秒間勢い良(混合し、
20分間氷上で超音波処理して次いでベレット化した。対照(塩を含まない)の
分画は超音波処理しなかった。
PM結合性NR活性は、1Mまでの塩による洗浄の影響は受けなかった。これに
より、PMに対するNR活性の結合は単純なイオン性の結合以上のものであって
、NR活性は脂質二重層としっかりと結合していることを示した。
膜結合性NR活性のトリトンX−100による刺激(表1.3)は、NADHお
よび/またはNO3−がPMのNR活性のNADH酸化部位および/またはN
O3−還元部位に接近することができなかったことを示す。また、トウモロコシ
根PM分画と結合したNADH依存性フェリシアン化物レダクターゼ活性は0.
025%トリトンX−100により6倍刺激されたが、これによりBuekho
utおよびBrubec[Buckhout、 T、J、、 and Hrub
ec、 T、C,、Protoplasma 135:144−154 (19
86)]は、NAD(P)H酸化および/またはフェリシアン化物還元の主要部
位はPMの外側表面に露出していないことを示唆するに至った。Singer[
Singer、 S、J、、 Annu、 Rev、 Biochem、 43
:805−833 (1974)コは、洗浄剤による活性化は膜中に深く埋めら
れた酵素の特徴であることを提示した。
表3のために、上述のようにして分画を単離し、0.1%トリトンX−1,00
の存在下および非存在下でNR活性を測定した。T:p比は約7であった。実験
を5回繰り返した平均および±SEを示す。
表3
トウモロコシ根分画における硝酸レダクターゼ活性硝酸レダクターゼ活性
12に上清865±3 0.65±0.08 158±13 166±13可溶
性b57±4 0.65±0.1 179±24’ 218±10ミクロソーム
14±0.2 0.8±0.1 11±1126±4L+ 2.4±0.5
0.8±0.1 3.8±0.5 90±12U2 1.4±0.2 0.8±
0.05 19.3±0.5 323±8a 12. OO0g遠心後の上清
b 120.000g遠心後の上清
c 120,000g遠心から得たペレットL1 最初の下相
U2 第二の下相
トリトンX−100によるNR活性の刺激が、膜由来のNR活性を可溶化した結
果であるかどうかを決定するために、トリトンX−100の濃度を増加させてP
M小胞を処理し、次いで遠心した(表4)。NR活性の大部分は、ミクロソーム
分画におけるNR活性に対する最適のTap比よりわずかに少ない0.05%ト
リトンX−100(T:p=1.25)により可溶化された(表1)。これとは
対照的に、0.1%トリトンX−100(T:p=2.5)までを用いたPM小
胞の処理によりわずかなバナデートー感受性H”−、ATPアーゼは除去された
(表4)。PMのATPアーゼとは異なり、PM結合性NR活性の潜在性はNR
活性の膜からの可溶化と相関関係があると考えられた。
NR活性についての値は、結果が反応混合物のタンパク質濃度に基づくものであ
るから、表3よりも表4においてより高い。表3ではタンパク質の分析は膜を含
んでおり、一方、表4では膜は、トリトンX−100処理によりNR活性が可溶
化された後に遠心により調製物から分離される。上清の溶液におけるタンパク質
の濃度を次いで測定した。
表4のために2回ペレット化されて再懸濁されたPM分画をO〜0.1%トリト
ンX−100にて氷上で15分間処理し、次いで150、000gで15分間遠
心した。硝酸レダクターゼ(AおよびB)およびバナデート感受性ATPアーゼ
活性(Cおよび)を、可溶性分画(AおよびC)中および再懸濁ペレット(Bお
よびD)中で測定した。
実験は少な(とも3回繰り返した。平均値±SEを示す。
表4
トウモロコシ根由来のPMのNR活性およびH”−ATPアーゼのトリトンX−
100−可溶化トリトン T:pタンパク質 硝酸レダクターゼ活性0 0 0
0±0
0.005 0.125 0.084 128±15,20.05 1.25
0.16 545±390.1 2.5 0.2 46叶25
B、膜ペレット
0 0 0.76 02±5.9
0.005 0.125 0.49 164±9.80.05 1.25 0.
43 21±1.80.1 2.5 0.30 19±2.30、可溶性分画
0 0 0 0±0
0.005 0.125 0.005 0±00.05 1.25 0.12
14±150.1 2.5 0.136 25±2,2D、膜ペレット
0 0 0.27 23±2.1
0.005 0.125 0.20 34.4±3.10.05 1.25 0
.16 75±13.9実施例4 膜結合性トウモロコシNR活性の特徴NO3
−を厳格に含まないよう維持した植物の根から単離したPM分画中に存在する非
常に低い対照レベル以上である1mMNo”−により原形質膜NR活性を誘導し
た。この低量のNR活性は、本質的なものであるか、または系において検出する
ことができない低レベルのNO3−混入の結果であり得る。膜NR活性は不安定
であり;PM分画が0℃でプロテアーゼ阻害剤の存在下に維持されているときに
PMのNR活性における時間依存性の減少が生じた。トリトンX−100により
可溶化された原形質膜のNR活性およびトウモロコシ根由来の可溶性NR活性は
、オオムギの葉から精製されたNR活性に対して調製した抗血清により不活性化
した。抗−NR活性血清[Somers、D、A、ら、Plant Physi
ol、72:949−952 (1983)]は、Dr、R。
L、 Warner、 Washington 5tate Llnivers
ity、 Pullman、 WA、の好意により提供された。
要約すると、潜在性NR活性は、水性2相分配により単離されたトウモロコシ−
根のPM分画中で同定された。NR活性は、NaC1濃度をIMまで上昇させて
洗浄することによってはPM小胞から除去されなかったが、トリトンX−100
(0,05%)により可溶化された。この結果は、硝酸塩を還元し得る全膜タン
パク質がトウモロコシ根のPM中に存在することを示す。
実施例5 膜結合性オオムギNRの活性に対する抗−NRIgGの効果
クロレラNR抗血清から精製した抗−NRIgGフラグメントは、No3−の取
り込みを90%以上阻害したが、オオムギ苗によるN。
2−の取り込みには影響を与えなかった(表5)。[クロレラNRはオオムギN
Rよりも安定であり、純粋な調製物が得られたために抗原来の可溶性NRとの交
差反応を示し、これはNR活性の不活性化により証明された]。阻害効果は、部
分的にのみ可逆であり:新しい取り込み溶液中で3回洗浄し、10分間の平衡期
間の後に対照の50%まで取り込みが回復した。プレ免疫血清から単離したIg
Gフラグメントは、硝酸塩の取り込みを36%阻害したが効果は洗浄により完全
に可逆的であった。
無傷の抗−NR分子はNO3−の取り込みに影響を与えなかった(表5)が、そ
の理由はおそらく切断されたフラグメント(50kD)よりもそれらがはるかに
太きく(150kD)、根細胸壁を通じてNO3−輸送部位に結合するためにた
やすく動くことができないからであろう。酵母のPMPi結合タンパク質に対す
る無傷の抗体は、酵母細胞壁が除去されるかIgG分子がパパインで切断される
までインビボでPiの取り込みに影響しなかった。これにより、Jeanjea
nら[Jeanjean、 R,ら、 Arch、 Microbiol、 1
37:215−219 (1984)]は、無傷のIgG分子は大き過ぎて酵母
細胞壁に浸透してPi輸送体に結合することができなかったことを示唆している
。
抗−NRIgGフラグメントによるNo3−の取り込みの阻害により、NRもし
くはNo3−輸送に関与する抗原的に関連したタンパク質が、細胞質ゾルに対す
る主要なイオン(およびIgGフラグメント)の障壁であるPM中に存在するこ
とが示唆された。NRがPM中に存在するかどうかを決定するために、非常に豊
富なPM分画を単離することが重要である。植物膜分画の水性2相分配は高純度
のPM分画を単離するための便利な技術である[:Hodges、 T、に、ら
、 1leth、 Enzymol、 118:41−54 (1986);
Larsson C,、r原形質膜J、 Modern Methods of
Plant Analysis、 New 5eries、 Vol、 1.
r細胞構成成分」。
HF Linksensら編、 SpringerVerlag、Berlin
、 pp、85−104 (1985)コ。
表5のために、上述のようにしてNO3−で誘導されたもの(NO3−取り込み
実験)またはNO2−で誘導されたもの(NO2−取り込み実験)を用いて取り
込みの実験を行った。0.5時間の取り込み実験についての平均の割合+/−8
Eが報告されている。各々の実験を2回繰り返し、代表的なデータを示す。
表5
硝酸塩および硝酸塩取り込みに対するNR抗体の効果実験 NO3−取り込み率
NO2−取り込み率処理順序 μモル/gxh
1、最初の取り込み率 3.3士領1 3.6±0.42、プレ免疫IgGフラ
グメント2.1±0.1 3.2±0.53、洗浄後のプレ免疫IgG
フラグメント 3.0±0.09 3.1±0.44、無傷の抗−NR血清 3
.3±0.2 3.0土0.25、洗浄後の無傷の抗−
NR血清 3.69±0.1 3.3士146、抗−NRIgGフラグメント0
.25±領08 3.2士領97洗浄後の抗−NR
性
2相分配されたオオムギ根のミクロソーム分画のマーカー酵素による評価を表6
に示す。トリトンX−100の存在下および非存在下の各々においてミクロソー
ム分画よりも2.3〜2.8倍豊富なPM ATPアーゼ活性が上相中に検出さ
れた。相分配PM分画のATPアーゼのトリトンによる刺激については、良く確
認されている(表6)。Larsson C,[r原形質膜J、 Modern
Methods of Plant Analysis、 New 5eri
es、 Vol、 1. r細胞構成成分J、 HF Linksensら編、
Springer−Verlag、Berlin、 pp、85−104 (
1985); Sandstrom、R,P、ら。
Plant Physiol、 85:693−698 (1987)コによる
記載を参照。潜在性は、小胞がシールされていて表が外側になっていることを示
し、PMのATPアーゼの加水分解部位に対するATPの接近可能性の増加に寄
与している。最近、さらにトリトンX−1,00は、おそら<ATPアーゼ近く
の脂質環境を変化することによりまたは阻害的組成物を除去することによりPM
ATPアーゼを活性化することが提唱されて来た[Sandstrom、 R
,Pら、 Plant Physiol、 85+693−698 (1987
)]。トノプラスト、ゴルジ体、ミトコンドリア、ER,ブラスチドおよび細胞
質に対するマーカー評価により、これらの活性の各々は2相法により顕著に減少
することが示された。特に重要であるのは、NRは一般的に細胞質ゾルの酵素で
あると考えられているから、上相分画中に細胞質の混入がないことであった[0
aks、 A、 et al、、 Anにより、上相分画は主にPMからなるこ
とが示されている。
表6において、上述のように膜分画を単離して酵素を試験した。
0.0125%トリトンX−100(T: P=25)の存在下および非存在下
(±T)でのバナデート感受性ATPアーゼ、NO3−感受性ATPアーセおよ
び潜在性UDPアーゼ活性はμモルP i/mgタンパク質X時間(時)て表す
。NADHCyt cレダクターゼおよびCytcオキシダーゼ活性はμモル/
mgタンパク質X時間(分)で表す。TPIおよびADH活性はそれぞれ、タン
パク質1mg当たりのnモルNADH酸化物もしくはμモルNAD還元物X時間
(分)で表す。各実験は少な(とも3回繰返し、代表的なデータを示す。
表6
可溶性、ミクロソームおよび相分泥膜分画のマーカー酵素による評価
植物の分画可溶性ミクロソーム下相 上相感受性 PM 11,8 22.1
21.2 51.8ATPアーゼ(−丁)
パナデート
感受性 PM 14.3 30! 24.5 84.5ATPアーゼ(十T)
NO,−感受性 トップ
ATPアーゼ ラスト 0.70 0.31 0.95 0潜在性UDPアーゼ
ゴルジ 3.2 4 10.4ONADHCyt c
レダクターゼ ER6620319555,2Cyt cオキシダ ミドコン
TPI プラスチド
/細胞質 0.27 2.44 2 0ADH細胞質 50.1000
実施例7 オオムギ硝酸レダクターゼ活性の分布板可溶性および相分泥膜分画に
おけるNR活性の分布を表7に示す。NR活性のほとんどは可溶性であり、よ(
確証されているが[0aks、 A、ら、 Ann、 Rev、 PI Phy
siol、 36:345−365 (1985)] : トトリ2の存在下で
試験したときには全NRの約4%は膜分画と結合していた。トリトン存在下およ
び非存在下の各々において、上相(PM)分画中のNR活性はミクロソームの1
.8〜5.4倍豊富であることが検出された(表7)。繰返し行ったPM分画の
再懸濁および再ペレット化によりNR活性を減少させることはながった。これら
を合わせて考えると、マーカー酵素およびNR活性から得た結果により、オオム
ギ根のNRの重要な部分は非常に豊富なPM分画中に存在することが示された。
反応混合物ヘノ0.1%トリトンX−100(T:P=10)(7)添加は、膜
結合性のNR特異活性をミクロソーム分画において60倍、下相で16倍および
上相で20倍刺激したが、可溶性NR活性は係数1.7シか増加させなかった(
表7)。NRとは対照的に、上相PMのATPアーゼ活性はトリトンにより刺激
されたが、下相PMのATPアーゼ活性は影響を受けなかった(表6)。これら
の結果は、水性ポリマーの2相系の下相における裏返しのPM小胞部分の発見[
Larsson C,、r原形質膜j、 : Modern Methods
of Plant Analysis。
New 5eries、 Vol、l、「細胞構成成分J、 EIF Link
sensら編、 Springer−verlag、 Berlin、 pp、
85−104 (1985)コと一致するものである。
トリトンX−100は、酵素の加水分解部位が外側にあってATPに接近できな
いために下相小胞のPM ATPアーゼを刺激しない[Larsson C,、
r原形質膜j、: Modern Methods of Plant Ana
lysis、 New 5eries、 Vol、 1. r細胞構成成分J、
HF Linksensら、 eds、、 SpringerJerlag、
Berlin、pp、85−104 (1985); Sandstrom、
R,P、ら、ヒ方におけるトリトン非存在下での顕著なNR活性の欠如は、膜
結合性のNRNo3−還元部位および/またはNADH酸化部位が直接PMのど
ちらの側にも露出していないことを示した。PM結合性のNRの大部分は0.1
%トリトンX−100(T:P=2.5)により可溶化された(表8)。対照的
に、トリトンの同様の1度ではPMATPアーゼは可溶化されながった。これに
より、膜結合性のNRの潜在性は膜からのNRの可溶化の機構であったことが示
唆される。
表7のために、上述のようにして膜分画を単離した。0.1%トリトンX−10
0(T:P=10)の存在下および非存在下で硝酸レダクターゼを試験した。実
験は少なくとも4回繰返し、代表的な実験から得たデータを示す。
表8のために、上述のようにして上相(PM)分画を単離し、トリトンX−10
0で処理した。0.1%トリトンX−100の存在下で可溶性およびペレット分
画中のNRを試験した。実験は5回繰返し、代表的な実験から得られたデータを
示す。
表7
オオムギ根分画における硝酸レダクターゼ活性の分布硝酸レダクターゼ活性
12に
上清” 65 0.56 10,300 21.300 284 586可溶性
” 59 0.5 11,600 19.200 394 651ミクロソ
ーム 13 0.41 13.9 840 2.6 157下相I 2.2 0
,48 7.1 116 6.7110上相ri t、1 0.35 5.4
109 14 284a 12,000g遠心から得た
b 120,000g遠心から得た
c 120.000g遠心から得たペレット表8
処理 ペレット 可溶性
nモル/冨9タンパク質×h
−トリトンX−1002110
+トリトンX−10026301
実施例8 オオムギ硝酸レダクターゼと原形質膜の結合度NRとPMの結合度を
測定するために、PM小胞を500mMNac1および1mMEDTA中で勢い
良く渦撹拌し、15分間超音波処理し、次いで希釈後にペレット化した(表9)
。塩/キレート/超音波処理によりNRがPM分画から除去されなかったことに
より、結合は単にイオン性のものではなく、NRはPM脂質二重層としっかり結
合していることを示唆した。
PM結合性のNR活性をさらに特徴付けるために、PM小胞を単離し、トリトン
X−100(T : P=2.5)で処理してNRを膜ペレットから除き(表8
)、次いでプレ免疫もしくは抗−NR血清と共にインキュベートした(表10)
。PM結合性のNRは、NR抗血清により不活性化されたが、プレ免疫血清によ
る影響は受けなかった。
二次元電気泳動により分離されたトリトン可溶化PM分画のウェスタン・プロッ
ト上の単一のスポットは、NR抗血清調製物を用いて検出された。
NR抗血清によるPM結合性のNRの不活性化およびNO3−輸送阻害は、NO
3−輸送およびPM結合性NRが関係するかもしれないという可能性を提示する
。PM結合性のNRは、ButZおよびJacks。
n[Butz、 R,G、 et al、、 Phytochem、 16:4
09−417 (1977)コにより提示されたNO3−の輸送および還元の両
方を行う酵素複合体の一部であるかもしれない。これとは別に、NO3−輸送体
およびPM結合性のNRは完全に分離しているが抗原性が関係した系であるかも
しれない。Ruftyら[Rufty、T、lF、、Jr、et al、、 P
lant Physiol、82:675−680 (1986)]は最近、N
R誘導系のためのレセプターおよび機能的NRタンパク質の両方は根細胞のPM
と結合しているかもしれないことを提示している。
この結果により、抗−NRIgGフラグメントはNO3−の取り込みを特異的に
阻害することが示された。ここに示されたように、PMに局在化された膜結合性
NRは、NO3−の取り込みを阻害した同じ抗体がさらにPMのNRを不活性化
することを示す。これらの結果により、オオムギ根のPMにおけるNO3−輸送
とNO3−還元の関連の可能性が示唆される。
表9のために、上述のように原形質膜分画を単離し、500mMNaC1,1m
MEDTAを使用して、もしくは使用せずに洗浄し、超音波処理した。処理後、
再懸濁緩衝液でPM分画を希釈し、ペレット化した。トリトンX−100(T二
p=10)の存在下で、得られたペレットをNR活性について試験した。実験を
3回繰返し、代表的な実験から得たデータを示す。
表10のために、上述のように硝酸レダクターゼをPM分画から可溶化した。水
(100μm)(=抗血清)、プレ免疫血清、もしくは抗−NR抗血清をトリト
ン可溶化PM分画(200μm)に加えた。
分画を氷上に2時間維持し、次いでミクロ試験管(microfuge)中、1
2、OOORPMで5分間遠心した。上清の分画中の硝酸レダクターゼを試験し
た。各実験を少な(とも4回繰返し、代表的なデータを示す。
表9
オオムギPM分画の塩およびキレート洗浄+NaC1,EDTA 224
表10
トリトンX−100で可溶化したオオムギPMのNRの不活性化(nモル/mA
’Xh)
一抗血清 15.8
+ブレ免疫血清 16.0
十抗−NR血清 0.0
特定の具体例との関連において本発明を説明してきたが、これをさらに変更し得
ること、さらにいかなる変更、使用、もしくは以下に示す本発明の適用、すなわ
ち一般に、本発明の本質および本発明の開示から発展した本発明の属する分野で
既知のもしくは通例の実施範囲内にあるものおよび本明細書中これより前に示さ
れた本質的な特徴に適用され得るものおよび添付の請求の範囲内のものを本出願
が包含することを意図していることは理解されるであろう。
国際調査報告
lmw+tstmvl AM 1lsPC7/ [590(X、 397PCT
/US90104397
Claims (11)
- 1.実質的に天然不純物の混入がない原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性。
- 2.該活性がトウモロコシ由来である請求項1に記載の原形質膜結合性の硝酸レ ダクターゼ活性。
- 3.該活性がオオムギ由来である請求項1に記載の原形質膜結合性の硝酸レダク ターゼ活性。
- 4.原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性をコードし得る遺伝子配列を含む組 換え分子。
- 5.該原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性を発現する請求項4に記載の組換 え分子。
- 6.該分子が細菌細胞において該活性を発現し得る請求項5に記載の組換え分子 。
- 7.植物細胞において該分子が該活性を発現し得る請求項5に記載の組換え分子 。
- 8.請求項4に記載の組換え分子を含有する細胞。
- 9.該細胞が細菌細胞である請求項8に記載の細胞。
- 10.該細胞が植物細胞である請求項8に記載の細胞。
- 11.原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性をコードし得る遺伝子配列を含む 組換え分子を含有する植物。
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