JPH05500156A - 膜結合した硝酸レダクターゼ活性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：膜結合した硝酸レダクターゼ活性発明の分野 本発明は、植物、特にオオムギ苗の硝酸レダクターゼ活性に関する。さらに、本 発明は、この活性を発現する組換え分子、この活性を発現する形質転換植物、お よび農業においてこの活性を利用することに関する。

本発明は、その一部にはＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｅｒｏｎａｕｔｉｃｓ　ａｎｄ　 ５ｐａｃｅ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（Ｎ　Ａ　Ｓ　Ａ）の認可ＮＣＣ２ −９９の支援を得て為されたものである。政府は本発明に権利を有している。

発明の背景 硝酸塩（ＮＯ３つは高等植物の主な窒素供給源である。この硝酸塩がアミノ酸中 に導入されるためには、それが植物細胞中に輸送され、次いでアンモニアまで化 学的に還元されなければならない。

従って、根によるＮＯ３−の輸送が植物におけるＮＯ３−同化の過程の第１の１ 秋である。輸送はＮｏ３−によって誘導さｔｉＳＲＮＡとタンパク質合成の両方 を必要とする。これが、特異的なＮ０ｓ−＠送タンパク質が合成されるというＪ ａｃｋｓｏｎ、　ＩＦ、　Ａ、ら［Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５２＋１２ ０−１２７　（１９７３）］の提案を導いた。ＮＯ３−輸送物質の活性について 多くのことが知られているがＪＧｏｙａｌ、　Ｓ、　Ｓ、ら、　Ｐｌａｎｔ　Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、　８２：１０５１−１０５６　（１９８６））、Ｘ等Ｍ物！、： おいてＮｏ３−輸送タンハク質ハイまだ同定されていない。

硝酸塩が植物中に輸送されると、多酵素の過程でアンモニアに還元される。硝酸 塩の還元はかなりのエネルギーを必要とし、還元の最終産物であるアンモニアは 蓄積されると毒性であるので（従って、過剰に存在するときにはそれ自体が輸送 されなければならない）、この硝酸塩の還元は厳密に調節されている。

この硝酸塩還元経路の第１の酵素は、「硝酸レダクターゼ」（または、これと等 しく　ｒＮＲ活性」）と呼ばれている［Ｇｕｅｒｒｅｒｏ、　Ｍ、　Ｇ。

は、一般に細胞質に局在化されていると考えられている［Ｒｉｔｅｎｏｕｒ。

Ｇ、　Ｌ、ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、４２：　２３３−２３７　（１９ ６６）；　Ｄａｌｌｉｎｇ、Ｍ、Ｊ、ら、旦ｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ ｃｔａ　２８３：　５１３−５１９　（１９７２）；　５ｕｚｕｋｉ、Ｄ、Ａ、 ら、巴凹！！月５１：　４５７−４６１　（１９８１）；　０ａｋｓ、Ａ、ら、 Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、３６・　３４５−３６５　（１ ９８５）コ。

いくつかの報告により、全植物硝酸レダクターゼ活性の一部が細胞質ゾル性では ないことが示唆されている。例えば、Ｍｉｆｌｉｎ、　Ｂ、　Ｊ。

は初めて、全オオムギ根ＮＲ活性をミトコンドリアに富む分画中に少ない割合で 発見した［Ｍｉｆｌｉｎ、Ｂ、Ｊ、、　Ｎａｔｕｒｅ　２１４：　１１３３−１ １３４　（１９６７）〕。続いて、Ｍｉｆｌｉｎ、　Ｂ、　Ｊ、は、膜結合した ＮＲ活性がミトコンドリアとは別個の未同定の顆粒分画中に局在化されているこ とを報告した［Ｍｉｆｌｉｎ、Ｂ、Ｊ、、　Ｍａｎｔａ　９３：　１６０−１７ ０　（１９７０月。Ｂｌｅｖｉｎｓら［Ｐｌａｎｔ−Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５７： 　４５８−４５９　（１９７６）コは後に、オオムギの根から調製した顆粒分画 中に見い出されるＮＲ活性が、細菌汚染によることもありうることを示した（特 に、苗を低０２の下で成長させたとき）。Ｌｉｐｓ。

Ｓ、　Ｈ，は、ＮＲ活性がタバコの葉の細胞微小体の膜に局在化されていること 、および可溶性分画中に検出されるＮＲ活性が組織抽出中に膜から遊離したもの であることを示唆した［Ｌｉｐｓ、　Ｓ、　Ｈ，、Ｅｕｒ、　Ｊ、　ＢｉｏｃＮ Ｒ活性の存在を提示した。Ｌｏｐｅｚ−Ｒｕｉｚら［Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ ｌ、　７９：　１００６−１０１０　（１９８５）］は、緑藻類のＮＲ活性をピ レノイド中に位置決定した。

さらに、いくつかの観察によって、このような非−細胞質ゾル性ＮＲ活性が細胞 の原形質膜（ＰＭ）に存在していることもあることが示唆されている。例えば、 Ｒｕｆｔｙら［Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８２：　６７５−６８０　（１ ９８６）］は、機能的なＮＲ活活性タンパクセＮＲ活性誘導系の受容体の両方が 根細胞のＰＭに結合していることもある可能性を議論している。Ｂｕｔｚ、　Ｒ ，Ｇ、ら［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：　４０９−４１７　（１９７ ７）っけ、トランスメンブランＮＲ活性がＮＯ３−輸送の担体として機能するの であろうと提案した。硝酸レダクターゼ活性は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａ ｓｓａの細胞壁−ＰＭ領域中に、およびトノブラスト膜中に見い出されてぃる［ Ｒｏｌｄａｎ、　Ｊ、　Ｍ、ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、７０：　８７２ −８７４　（１９ｇ２）コ。しかし、硝酸レダクターゼ活性は高等植物の原形質 膜に存在していることは見い出されていない。

ＮＨ，とＮＯ３−輸送の両方は、ＮＯ３−によって同時に誘導され、タンパク質 およびＲＮＡ合成阻害物質によって阻害され、そして根にグルコースを与えるこ とによって活性が増加するので、Ｂｕｔｚ、　Ｒ，Ｇ。

らは、膜結合したＮＲ活性がＮＯ３−輸送の担体として機能することを提案した ［Ｂｕｔｚ、　Ｒ，Ｇ、ら、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ、１６：　４０９−４１７　 （１９７７）コ。

発明の要約 潜在的な硝酸レダクターゼ活性（ＮＲ活性）がトウモロコシ根ミクロソーム分画 に検出された［Ｚｅａ　ｗａｙｓ　Ｌ、、　Ｇｏｌｄｅｎ　Ｊｕｂｉｌｅｅ］。

ミクロソーム結合性のＮＲ活性はトリトンＸ−１００（オクチルフェノキシポリ エトキシエタノール）によって２０倍まで刺激されたが、可溶性のＮＲ活性は１ ．２倍まで増加したにすぎなかった。ミクロソーム結合性のＮＲ活性は、全種Ｎ Ｒ活性の１９％までを示した。

水性の２相分配によるミクロソーム分画の分析によって、膜−結合性のＮＲ活性 が第２の上相（Ｕ２）に存在していることがわかった。

マーカー酵素による分析によって、このＵ２分画が原形質膜（ＰＭ）であること が示された。このＰＭ結合性のＮＲ活性は１．０ＭまでのＮａＣ１で小胞を洗浄 することによっては除去されなかったが、０゜０５％トリトンＸ−１００により ＰＭから可溶化した。対照的に、バナデート感受性のＡＴＰアーゼ活性は０．１ ％トリトンＸ−１００による処理によってＰＭから可溶化されなかった。これら の結果は、硝酸塩を還元することができるタンパク質がトウモロコシ根のＰＭの 疎水性領域中に存在していることを示すものである。

膜結合性の硝酸レダクターゼ（ＮＲ）が、水性２相分配によってオオムギ（Ｈｏ ｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ、　ｖａｒ　ＣＭ　７２）の根から単離した原 形質膜（ＰＭ）分画中に検出された。このＰＭ結合性のＮＲは、５００ｍＭＮａ Ｃ１および１ｍＭＥＤＴＡを用いて小胞を洗浄することによっては除去されず、 全種のＮＲ活性の４％までを示した。ＰＭ結合性のＮＲはトリトンＸ−１００に よって２０倍まで刺激されたが、可溶性ＮＲは１．７倍増加したにすぎなかった 。その潜在性は、膜からのＮＲの可溶化の関数であった。トリトンＸ−１００に よってＰＭ分画から可溶化したＮＲは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ　５ｏｒｏｋｉｎｉ ａｎａ　ＮＲに対する抗血清によって不活性化された。抗−ＮＲ血清から精製さ れた抗−ＮＲ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）フラグメントはＮＯ３−の取込みを９ ０％以上阻害したが、ＮＯ２−の取込みには作用を有していなかった。

この阻害作用は部分的に可逆的であるにすぎなかった（根を徹底的にすすいだ後 に、対照の５０％まで取込みが回復した）。プレ免疫血清ＩｇＧフラグメントは ＮＯ３−の取込みを３６％阻害したが、この作用はすすぎによって完全に可逆的 であった。無傷のＮＲ抗血清はＮｏ３−の取込みに全（作用を有していなかった 。本発明は、オオムギ根のＰＭにおけるＮｏ３−の取込みとＮＯ３−の還元が関 連していることを示すものである。

本発明は、高等植物から得ることができる「非−細胞質ゾル性」の「膜結合性」 の硝酸レダクターゼ活性に関する。本発明はオオムギの非−細胞質ゾル性の膜結 合性の硝酸レダクターゼ活性を基に説明されているが、本発明が他の植物由来の 他の非−細胞質ゾル性かつ膜結合性の硝酸レダクターゼ活性の同定および単離を 可能にするものであり、また、このような活性およびそれらの使用が本発明の等 価の範囲内にあることは容易に理解されるであろう。

本明細書において用いる「硝酸レダクターゼ」またはｒＮＲＪなる用語は、硝酸 塩の還元を触媒することができる酵素を指すものとする。このような酵素は、そ の物理的性質、即ちアミノ酸配列、天然または変性後の分子量など、またはそれ と等しくその機能的性質、即ち速度定数（ｖ、、、、Ｋ、、ターンオーバー数な ど）、基質の選択性もしくは特異性、産生される産物、反応条件の選択性（即ち 、熱、ｐＨ１イオン性、補助因子、補酵素など）のいずれかによって言及するこ とができる。「活性」なる用語は、その機能的性質によって酵素を指し、言及す るものである。

酵素は、それが天然に産生される細胞の細胞質中に通常は存在しないか、または 実質的に存在しないときに、「非−細胞質ゾル性」である。即ち、非−細胞質ゾ ル性の酵素とは、それが通常かつ天然に産生される細胞の細胞質に存在するか、 または存在しうる酵素である。

酵素は、それが天然に産生される細胞の原形質膜に結合しているか、または天然 に結合することができるときに、「膜結合性」である。即ち、膜結合性の酵素と は、それが通常かつ天然に産生される細胞の原形質膜に結合した状態で存在する か、または存在しつる酵素である。

■、原形質膜分画の単離 原形質膜に非常に富む供給源は、種々の植物組織のいずれかから得ることができ る。原形質膜の好ましい供給源は、トウモロコシの根から単離した粗製の膜調製 物から得ることができる。水性の２相分配［Ｌａｒｓｓｏｎ、Ｃ，Ｈ，、Ｍｏｄ ｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｎ、Ｓ、シ リーズ、細胞成分、第１巻中、　８５−１０４頁、　Ｌｉｎ５ｋｅｎｓら編、　 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｅｌｅｉｄｅｌｂｅｒｇ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８５）：　Ｈｏｄｇｅｓ、Ｔ、に、おＰ、ら、　 Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５：　６９３−６９８　（１９８７）］を用 いて、高度に豊富化されたＰＭ分画を得た。膜結合性のＮＲ活性はこのＰＭ中に 存在で成長させるのが好ましい。種子口を、好ましくは通常の漂白剤から調製し た１、５％容量／容量のＮａ０Ｃ１で１５分間処理し、蒸留水ですすぎ、暴気し た蒸留水中、室温で発芽させる。約２４時間後に、この発芽させた種子を、暴気 した０、２ｍＭのＣａ　Ｃ１２溶液（５Ｌ）の表面から約１ｃｍ上のステンレス スチール・スクリーン上に広げる。

この種子をプラスチック包装で覆い、２５℃の暗所に置く。このプラスチック包 装を３日後に除去し、さらに２日後に、好ましくは苗を窒素を欠（暴気した０、 １強度のＨｏａｇｌａｎｄ溶液Ｎｏ、　１　［Ｈｏａｇｌａｎｄ、　Ｄ。

Ｒら、　Ｃａ１．Ａｇｒｉｃ、Ｅｘｐ、５ｔａｔ、Ｃ１ｒｃ、　Ｎｏ、３４７　 （１９５０）コに移し、制御された環境の生育室に置（。好ましくは、生育条件 を６０〜６５％の相対湿度、２５℃および連続光としてＮＲ活性のレベルに及ぼ す周期の影響を最小にする。苗天蓋の光子東密度は、Ｌｉｃｏｒ　１９０Ｓセン サーにより４００〜７００ｎｍで測定して約４００μモルｍ−２ｓ−’であり、 好ましくは白熱および自冷蛍光ランプによりそれぞれ１：５の比で供給する。好 ましくは、５ｙｌｖａｎｉａ　Ｌｉｇｈｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｄａｎｖｅ ｒｓ。

ＭＡ）からライトを入手する。連続光中で２日の後に、１ｍＭのＫＮＯ３を含有 する０、１強度のＨｏａｇｌａｎｄ溶液Ｎ００１に２４時間、苗を移してＮＲ活 性を誘導することができる。

９日経過のトウモロコシ苗から根（約２５ｇ）を切り取り（好ましくは、種子の すぐ下）、はさみで１ｃｍ片に切る。次いで、冷却した乳鉢と乳棒を用いて、ま たは他の適当な手段を用いて、適当な量の冷粉砕緩衝液（即ち、６０ｍ１）中で 苗をすり砕く。適当な粉砕緩衝液は、２５０ｍＭスクロース、３ｍＭエチレンジ アミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）、５０ｍＭ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）− １，３−プロパンジオール（トリス−ＨＣｌＸｐＨ８，０）、０．０５％（ｗ／ ｗ根）ポリビニル−ポリピロリドン、１ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、 ３ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｇＭ　Ｎａ２Ｍ。

Ｏａ　（Ｈ２０）　ｚ、および５μＭフラビンーアデニンジヌクレオチド（ＦＡ Ｄ）からなるのが好ましい。ＰＭＳＦは、好ましくはイソプロパツール中の０． １Ｍ保存液として調製し、０．７５ｍｌ　ＰＭＳ　Ｆ　：　２５ｍ１粉砕緩衝液 の比で加える。ＤＴＴは脱イオン水中の１．０Ｍ保存液として調製し、０．０２ ５ｍｌ　ＤＴＴ　：　２５ｍｌ粉砕緩衝液の比で加える。粉砕緩衝液中に使用し た全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｗｉｃａｌ　Ｃｏ、　（Ｓｔ、　Ｌｏ ｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）から入手することができる。ホモジネートを好ましく は４層のチーズクロスで濾過し、好ましくは１２、０００ｇで１０分間遠心する 。この１２．　ＯＯ０ｇ遠心後の分画を酵素分析用に蓄えておいてもよい。この 上清を好ましくは１２０゜０００ｇで２０分間遠心する。得られたペレットはミ クロソーム分画、即ち粗製の膜分画である。この１２０．　ＯＯ０ｇ遠心後の分 画を酵素分析用に用いることもできる。

ＮＲ活性を測定するために、上で得たミクロソームのペレットを好ましくは再懸 濁緩衝液中に懸濁し、２０ｍ１に希釈し、１２０，０００ｇで２０分間遠心する 。再懸濁緩衝液は、２ｍＭｌ−リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，２）、１μＭ　ＮａｚＭ ｏＯ４（Ｈ２Ｏ）ｚ、５ｇＭ　ＦＡＤ、３＋ａＭＰＭＳＦおよび１ｍＭＤＴＴを 含有しているのが好ましい。好ましくはこの工程を３回以上繰返し、最初のミク ロソーム分画を含む各々の膜ベレットから得た試料をＮＲ活性の測定のために蓄 えた。

これとは別に、ミクロソームのペレットを好ましくは２５’ＯｍＭスクロース、 ５ｍＭＫ−ホスフェ　ｈ（ｐＨ７，８）および１ｍＭＰＭＳＦの溶液（２，２ｍ １）中に再懸濁し、Ｌａｒｓｓｏｎらが詳述している水性ポリマー２相系［原形 質膜：　Ｍｏｄｅｒｎ　ｌ！ｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉ ｓ、　Ｎｅｗ　５ｅｒｉｅｓ、Ｖｏｌ、　１．　Ｃｅ１ｌ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓ、ＨＦ　Ｌｉｎｋｓｅｎｓら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒ ｌｉｎ、　ｐｐ、　８５−１０４　（１９８５）］で分配した。この方法の全て の工程を４℃で行なうのが好ましい。

好ましくは、適当な量の再懸濁されたミクロソーム分画（１〜５ｍ１）を、６． ５％（ｗ／ｗ）デキストランＴ　５００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ、　ＵＳＡ）、６．５％（ ｗ／ｗ）ポリエチレングリコール３３５０　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）、領３３Ｍスクロース、３ｍ ＭＫＣｌおよび５ｍＭＫ−ホスフェート（ｐＨ７゜８）を含む２相系（約８ｍ１ ）に加える。この試験管の内容物を４０〜５０回の反転によって混合し、スイン グ・パケット・ローター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ−ｂｕｃｋｅｔ　ｒｏｔｏｒ）にて １．２００ｇで５分間遠心する。

上側の相を集め、Ｓａｎｄｓｔｒｏｍら［Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５ ：　６９３−６９８　（１９８７）］が記載しているようにして新鮮な下側の相 の上に再分配した。

残存しているミクロソーム（Ｕ２）および最初の下側相（Ｌｌ）分画を集め、各 々を適当な量（例えば、２０ｍ１）の再懸濁緩衝液で希釈し、１２０、０００ｇ で２０分間遠心した。Ｕ２ペレットを再懸濁緩衝液に懸濁し、２０ｍ１に希釈し 、再び１２０，０００ｇで２０分間遠心した。

得られたペレットを懸濁し、タンパク質濃度が１２０，０００ｇ遠心後の分画に 等しくなるまで再懸濁緩衝液で希釈し、これを酵素分析に直接用いることができ る。

２回遠心したＵ２分画をＱ　、　５　ｍｇ、　ｍｌ−、タンパク質濃度となるま で再懸濁緩衝液で希釈し、最終濃度がＱ、５ｍｌ中Ｏ〜０．１ＭＮａＣ１となる ようにする。全ての分画を３０秒間激しく混合し、氷上に置（。塩処理した分画 を、例えばアメリカン・ブランド（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｒａｎｄ）ソニケータ ー（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔ、　ＭｃＧｒａ ｗ　Ｐａｒｋ、　ＩＬ、　ＵＳＡ）中、氷上にて超音波処理する。２０分後に、 分画を再懸濁緩衝液（８ｍｌ）で希釈し、１５０．　ＯＯＯｇで１５分間遠心す る。この再懸濁ペレットにおいて硝酸レダクターゼ活性を測定することができる 。

これとは別に、２度ペレット化したＵ２分画を再懸濁緩衝液で０５ｍｇ／ｍｌの タンパク質となるまで希釈し、全量３．５ｍｌ中でＯ〜０１％トリトンＸ−１０ ０（オクチルフェノキンポリエトキシエタノール：　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）となるようにする。

次いで、好ましくはこの材料を約３０秒間激しく混合し、氷上に置く。１５分後 に、分画を希釈せずに１５０．０００ｇで１５分間遠心する。これら再懸濁され たペレットおよび可溶性の分画において、バナデート（Ｖａｎａｄａｔｅ）感受 性のＡＴＰアーゼ活性およびＮＲ活性を測定する。

種々の酵素（その使用は本発明を容易にする）の活性は、次のようにして測定す ることができる。トリトンＸ−１００刺激されたヌクレオントシホスファターゼ （ＵＤＰアーゼ）活性は、Ｎａｇａｈａｓｈｉ、　Ｊ、ら［Ｐｒｏｔｏｐｌａｓ ｎ＋　１１２：　１６７−１７３　（１９８２）］に従って測定するのが好まし い。

トリオースリン酸イソメラーゼ活性は、Ｇｉｂｂｓ、　Ｍ、らの方法［解糖酵素 、　ＨＦ　Ｌｉｎｋｓｅｎｓ、　ＢＤ　Ｓａｎｗａｌ、　Ｍ　Ｔｒａｃｅｙ編、 　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｉａｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｖｏ ｌ、７．　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｂｅｒｌｉｎ、ｐ、５２０　（１ ９６４）コに従って測定するのが好ましい。チトクロムＣオキシダーゼ（ＥＣ１ ，９゜３、１．　）は、Ｈｏｄｇｅｓ、　Ｔ、　Ｋ、らの方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ 　Ｅｎｚｙｍｏｌ　３２：　３９２−４０６　（１９７４）］に従って測定する のが好ましい。アンチマイシンＡ非感受性ＮＡＤＨＣｙｔ　ｃレダクターゼ（Ｅ Ｃ１，６，９９，３）活性は、Ｌｏｒｄら［Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．５７：　６ ５９−６６７　（１９７３）］およびＨｏｄｇｅｓ、　Ｔ、　Ｋ、ら［Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ。

１３２：　３９２−４０６　（１９７４）］の記載のように測定するのが好まし い。バナデート感受性のＡＴＰアーゼ（ＥＣ３，６，１，３）活性は、トリトン Ｘ−のが好ましい。アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，１）は、Ｓ ｕｚｕｋｉ、　Ｙ、らの方法［Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　２７：　１２１ −１２５　（１９７２）］に従って測定するのが好ましい。硝酸レダクターゼ活 性（ＥＣ１，６，６，１）は、測定容量を５００μｍまで減少させることを除き 、種々の濃度のトリトンＸ−１００（既知のＴａｐ比）の存在下に、Ａｓｌａｍ らの方法［Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８３：　５７９−５８４　（１９８ ７）コに従って測定するのが好ましい。すべての酵素の比活性をｍｇ膜タンパク 質基づいて報告する。

タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法［Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、、 　Ａｎａｌ、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　７２：　２４８−２５４］の改良法を用いて測定するのが好ましい 。この方法では、０．２％のトリトンＸ−１００（６０μｍ）を各々の試験管に 入れて膜タンパク質を可溶化した。結晶性ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ９Ｍｏ、　ＵＳＡ）を標準として 用いた。

上記の方法を用いて、トウモロコン根から単離した粗製の膜分画において硝酸レ ダクターゼ活性を検出した。捕捉された可能性のある可溶性ＮＲ活性を遊離させ るために、膜ペレットを低張性緩衝液［Ｐｕｐｉｌｌｏ、　Ｐ、ら、　Ｐｌａｎ ｔａ　１５１：　５０６−５１１　（１９８１）コ中で好ましくは４回洗浄する 。最初の洗浄によりＮＲ活性の約２０〜２５％が可溶性分画に放出される。これ は、恐らく、膜小胞内にゆるく結合していたかまたは捕捉されていた可溶性ＮＲ 活性であろう。膜ベレットを引き続き洗浄すると、さらにわずかなＮＲ活性が放 出される。このことは、洗浄された膜ペレット中に検出されたＮＲ活性が膜結合 性であることを示すものである。通常、膜分画を低張性緩衝液で少なくとも２回 洗浄して、ゆるく結合している可溶性ＮＲ活性を除去するのが好ましい。

■、膜結合性の硝酸レダクターゼの遺伝子操作本発明は、さらに、膜結合性の硝 酸レダクターゼをコードしている遺伝子配列、この遺伝子配列を含有する発現媒 体、この媒体で形質転換された宿主、この形質転換された宿主の発現によって産 生された硝酸レダクターゼ、およびこの硝酸レダクターゼの使用を包含するもの である。

種々の方法のいずれかを用いて硝酸レダクターゼをコードしている遺伝子配列を クローニングすることができる。このような方法の１つは、ｃＤＮＡ挿入体のシ ャトルベクターライブラリー（硝酸レダクターゼを発現する細胞から導（）を、 硝酸レダクターゼの遺伝子配列を含有している挿入体の存在について分析するこ とを必要とする。この分析は、細胞をベクターでトランスフェクトし、次いでＮ Ｒの発現を調べることによって行なうことができる。硝酸レダクターゼの遺伝子 配列をクローニングするための方法の１つは、酵素分子のアミノ酸配列を決定す ることを必要とする。この課題を達成するためには、ＮＲ膜タンパク質精製しく 上記の試験を用いて）、分析して、タンパク質のアミノ酸配列を決定する。この ような配列を解明することができる任意の方法を用いることができるが、Ｅｄｍ ａｎ分解法が好ましい。自動配列決定機を用いることが特に好ましい。

酵素の全アミノ酸配列を決定することも可能であるが、分子のペプチドフラグメ ントの配列を決定し、この配列データを用いて全ＮＲ遺伝子配列を単離するのに 用いることができるオリゴヌクレオチドプローブを調製するのが好ましい。ＮＲ ペプチドフラグメントは、臭化シアンまたはプロテアーゼ類（パパイン、キモト リプシンまたはトリプシンなど）と共に無傷分子をインキュベートすることによ って得ることができる［０ｉｋｅ、　Ｙ、ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２ ５７：　９７５１−９７５８　（１このペプチドが１０アミノ酸より長いときに は、通常、この配列の情報は遺伝子配列（硝酸レダクターゼをコードしている配 列など）をクローニングすることを可能にするに十分である。

このアミノ酸配列の情報を用いて、それをコードしつるＤＮＡ配列を調べて硝酸 レダクターゼをコードしている遺伝子配列をクローニングする。遺伝暗号は縮重 しているので、特定のアミノ酸をコードするのに１以上のコドンを用いることが できる［Ｗａｔｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、、　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ 、第３版中、　３５６−３５７頁、Ｗ。

Ａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ、、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、ＣＡ　（１９７７） コ。

ときにはアミノ酸配列が唯一のオリゴヌクレオチドによってコードされているこ ともあるが、アミノ酸配列は１組の類似オリゴヌクレオチドのいずれかによって コードされていることが多い。重要なことは、この組の構成員のすべてがペプチ ドフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチドを含んでいるが、 即ちペプチドフラグメントをコードしている遺伝子配列と同一のオリゴヌクレオ チド配列を潜在的に含有しているが、この組の構成員の１つだけが遺伝子配列の ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含有していることである。この構 成員がこの粗生に存在し、この組の他の構成員の存在下であってもＤＮＡにハイ ブリダイズすることができるので、ペプチドをコードしている遺伝子配列をクロ ーニングするために単一のオリゴヌクレオチドを用いるのと同じ方法で、１組の 未分画のオリゴヌクレオチドを用いることができる。

遺伝暗号［Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ、第３版中、　Ｗ、Ａ、Ｂｅ ｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　ＣＡ　（１９７７）］を 用いて、１またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができる （そのそれぞれがＮＲペプチドをコードすることができる）。

特定のオリゴヌクレオチドが実際に現実の硝酸レダクターゼをコードしている配 列を構成する可能性は、真核細胞において特定のアミノ酸をコードするのに実際 に用いられる特定コドンの頻度および異常な塩基対合の関係を考慮することによ って評価することができる。

このような「コドン使用規則」は、Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，ら［Ｊ」ｏｌｅｃ、Ｂｉ ｏｌ、　１８３：　１−１２　（１９８５）］が開示している。Ｌａｔｈｅの「 コドン使用規則」を用いて、ＮＲペプチド配列をコードしうる理論的に「最も可 能性の高い」ヌクレオチド配列を含む１個のオリゴヌクレオチドまたは１組のオ リゴヌクレオチドを同定する。

この硝酸レダクターゼ遺伝子配列フラグメントをコードしうる理論的に「最も可 能性の高い」配列を含む１個のオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオ チドを用いて、「最も可能性の高い」１個の配列または１組の配列にハイブリダ イズしうる相補性の１個のオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオチド の配列を同定する。このような相補性の配列を含むオリゴヌクレオチドをプロー ブとして用いてＮＲ遺伝子配列を同定し、単離することができる［Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、　Ｔ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）］。

即ち、まとめると、ＮＲペプチド配列の実際の同定が、該ペプチドをコードしう る理論的に「最も可能性の高い」１個のＤＮＡ配列または１組のＤＮＡ配列の同 定を可能にする。この理論的な配列に相補性のオリゴヌクレオチドを作成するこ とによって（または、１組の「最も可能性の高い」オリゴヌクレオチドに相補性 の１組のオリゴヌクレオチドを作成することによって）、ＮＲ遺伝子配列を同定 および単離するためのプローブとして機能しうる１個のＤＮＡ分子（または、１ 組のＤＮＡ分子）を得る。

本発明に従って硝酸レダクターゼを遺伝子操作するための方法は、硝酸レダクタ ーゼをコードしうる遺伝子配列をクローニングすることによって、およびこの遺 伝子配列を発現させることによって促進される。本明細書で使用する「遺伝子配 列」なる用語は、核酸分子（好ましくは、ＤＮＡ）を指すものとする。硝酸レダ クターゼをコードしうる遺伝子配列は種々の供給源から得ることができる。これ ら供給源には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成りＮＡ、およびこれらの組合せが 含まれる。

ゲノムＤＮＡは天然のイントロンを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい 。さらに、このゲノムＤＮＡを、ＮＲ遺伝子配列の５゛プロモーター領域と結合 させて得ることもできる。宿主細胞がタンパク質の発現に関与する転写調節およ び翻訳開始シグナルを認識することができるなら、この５°領域を保持し、転写 および翻訳開始の調節に用いてよい。

ｃＤＮＡについては、このｃＤＮＡをクローニングし、得られたクローンを所望 の配列をコードしているｃＤＮＡ用の適当なプローブてスクリーニングしてよい 。所望のクローンが単離されたなら、このｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの場合と実質 的に同じ方法で操作することができる。しかし、ｃＤＮＡを用いるとイントロン または介在配列は全く存在しないであろう。このため、硝酸レダクターゼをコー ドしているｃＤＮＡ分子が本発明の好ましい遺伝子配列である。

ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡはいくつかの方法で得ることができる。ゲノムＤＮ Ａは、当分野で周知の手段によって適当な細胞から抽出し、精製することができ る。別法によれば、ｍＲＮＡを硝酸レダクターゼを産生ずる細胞から単離し、こ れを用いて当分野で周知の手段によりｃＤＮＡを調製することができる。このよ うな適当なＤＮＡ調製物を酵素によって切断するか、またはランダムに剪断し、 組換えベクターに連結して遺伝子配列ライブラリーを得る。次いで、これらベク ターを上記のオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングして、ＮＲをコード している配列を同定することができる。

上記の操作によって同定された適当な１個のオリゴヌクレオチドまたは１組のオ リゴヌクレオチド（ＮＲ遺伝子配列のフラグメントをコードすることができるか 、または１個のオリゴヌクレオチドまたは１組のオリゴヌクレオチドに相補性で ある）を合成し、ＮＲ遺伝子配列を発現しうる細胞から得たＤＮＡまたはさらに 好ましくはｃＤＮＡ調製物に対して、当分野で周知の手段によりハイブリダイズ させる。使用するＤＮＡまたはｃＤＮＡの供給源は、ＮＲ配列を豊富化したもの であるのが好ましい。このような豊富化は、高レベルのＮＲ遺伝子配列を生じる 細胞からＲＮＡを抽出することによって得たｃＤＮＡによって得るのが最も容易 である。核酸ハイブリダＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）］、およびＨａｙ ｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、ら［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄ８５）］が 開示している（これら文献は本明細書の一部を構成する）。

所望のＮＲをコードしている配列の検出を容易にするため、上記のＤＮＡプロー ブを検出可能なグループでラベルすることができる。

このような検出可能なグループは、検出可能な物理的または化学的性質を有する 任意の物質であってよい。このような物質は免疫検定の分野で多く開発されてお り、通常、この方法において有用な任意のラベルの大部分を本発明に適用するこ とができる。特に有用なラベルは、酵素的に活性なグループ、例えば酵素［Ｃ１ １ｎ、　Ｃｈｅｍ、η：１２４３　（１９７６）を参照］、酵素基質［英国特許 ５ｐｅｃ、　１，５４８，７４１を参照コ、補酵素［米国特許Ｎｏ、　４．２３ ０．７９７および４．２３８．５６５を参照］および酵素阻害物質［米国特許Ｎ ｏ、　４．１３４．７９２を参照コ；蛍光物質［Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２５： 　３５３　（１９７９）を参照］；発色物質：発光物質、例えば化学発光物質お よび生物発光物質［Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２５：　５１２　（１９７９）を参 照］：特異的に結合しうるリガンド：近接相互作用する対、ならびに放射性同位 体、例工１ｆ３Ｈ，”Ｓ、　”Ｐ、　”　Ｉ　オヨＵ１４（、ｃｔ）ル。コノヨ ウナラベルおよびラベル対を、それら自身の物理的性質（例えば、蛍光物質、発 色物質および放射性同位体）またはそれらの反応もしくは結合の性質（例えば、 酵素、基質、補酵素および阻害物質）に基づいて検出する。例えば、補助因子ラ ベルされたプローブは、酵素（そのラベルが補助因子である）とこの酵素の基質 を加えることによって検出することができる。例えば、基質に作用して測定可能 な物理的性質を有する産物を与える酵素を用いることができる。この例には、β −ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが含まれ るが、これらに限定はされない。

次いで、ハイブリダイズしうろことがわかった上記の遺伝子配列ライブラリーの 構成員を分析して、それらが含有しているＮＲコード化配列の長さと性質を調べ る。

ＮＲ遺伝子配列をクローニングする別の方法においては、ＮＲを発現することが できる細胞由来のＤＮＡまたはより好ましくはｃＤＮＡを発現ベクター中にクロ ーニングすることによって発現ベクターのライブラリーを調製する。次いで、こ のライブラリーをスクリーニングして、抗−ＮＲ抗体と結合するタンパク質を発 現することができ、かつ、ＮＲまたはＮＲのフラグメントと同一のアミノ酸配列 を有するポリペプチドをコードしうるヌクレオチド配列を有する構成員を選択す る。

上記の方法によって得たクローン化した硝酸レダクターゼコード化配列を発現ベ クターに機能的に結合させ、細菌または真核細胞に導入して、ＮＲまたはその機 能的誘導体を産生させる。このような操作のための方法はＭａｎｉａｔｉｓ、　 Ｔ、ら（上記）が開示しており、当分野では周知である。

このように、上記の方法は硝酸レダクターゼまたはそのフラグメントをコードし うる遺伝子配列を同定することができる。この遺伝子配列の特徴をさらに調べる ためには、この配列がコードしているＮＲを発現させ、それがＮＲの性質を保持 していることを確認するのが望ましい。このような性質には、抗−ＮＲ抗体と特 異的に結合する能力、ＮＲと結合しうる抗体の産生を誘導する能力、受容細胞に 硝酸レダクターゼ活性を与える能力などが含まれる。

上記の組換え法を用いる代わりに、合成法（例えば、有機合成法）を用いること により、ＮＲをコードしている遺伝子配列を調製することができる。

（以下、余白） ■、硝酸レダクターゼおよびその機能的誘導体の発現上記の方法によって得た硝 酸レダクターゼをコードしている配列を発現ベクターに機能的に連結し、原核ま たは真核細胞中に導入して、硝酸レダクターゼまたはその機能的誘導体を産生さ せることができる。本発明は、この無傷の硝酸レダクターゼおよびこの硝酸レダ クターゼの機能的誘導体の両方に関するものである。硝酸レダクターゼの「機能 的誘導体」とは、硝酸レダクターゼの生物学的活性に実質的に類似した生物学的 活性（機能的に、または構造的に）を保持する化合物である。この「機能的誘導 体」なる用語は、分子の「フラグメント」、「変異体」、「類似体」または「化 学的誘導体」を含むことを意図している。硝酸レダクターゼなどの分子の「フラ グメント」とは、該分子の任意のポリペプチド小集団を指すことを意味する。硝 酸レダクターゼなどの分子の「変異体」とは、完全分子またはそのフラグメント のいずれかに構造および機能が実質的に類似している分子を指すことを意味する 。２つの分子が実質的に類似した構造を有しているとき、または２つの分子が類 似した生物学的活性を保持しているときに、一方の分子は他方の分子に「実質的 に類似」していると言われる。即ち、２つの分子が類似の活性を保持しているな らば、一方の分子の構造が他方に見い出されないときであっても、あるいはアミ ノ酸残基配列が同一ではないときであっても、この用語を本明細書で用いるとき にはこれら２分子は変異体であるとみなされる。硝酸レダクターゼなどの分子の 「類似体」とは、完全分子またはそのフラグメントのいずれかに機能が実質的に 類似している分子を指すことを意味する。本明細書では、分子が通常はその分子 の一部ではない別の化学的部分を含有しているときに、ある分子は別の分子の「 化学的誘導体」であると言われる。このような部分は、分子の溶解性、吸収性、 生物学的半減期などを改善する。

このような作用を媒介することができる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐ ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８０）に開示されてい る。この部分を分子に結合させるための方法は当分野で周知である。

硝酸レダクターゼまたはその機能的誘導体をコードしているＤＮＡ配列を、常法 に従ってベクターＤＮＡと結合させることができる。

これには、連結のための平滑末端化または付着末端化、適当な末端を得るための 制限酵素消化、適切な付着末端の充填、所望ではない結合を避けるためのアルカ リホスファターゼ処理、および適当なりガーゼによる連結が含まれる。このよう な操作のための方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら（上記）が開示しており、 当分野では周知である。

ＤＮＡなどの核酸分子は、それが転写および翻訳調節の情報を含むヌクレオチド 配列を含有し、この配列がポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列に「 機能的に連結」しているときにポリペプチドを「発現することができる」と言わ れる。機能的な結合とは、調節ＤＮＡ配列および発現させようとするＤＮＡ配列 が、遺伝子配列を発現させるような仕方で結合している結合を指す。遺伝子配列 の発現に必要な調節領域の正確な性質は生物の種類によって変わるであろうが、 プロモーター領域を含んでいるのが普通であろう。原核生物では、このプロモー ター領域は、プロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指令する）ならびにＲＮＡに転 写されたときに硝酸レダクターゼ合成の開始を合図するであろうＤＮＡ配列の両 方を含んでいる。通常、このような領域は転写および翻訳の開始に関与している ５゛−非暗号配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列 などを含有しているであろう。

所望なら、硝酸レダクターゼをコードしている遺伝子配列の３゛側の非暗号領域 を、上記の方法によって得ることができる。この領域を、終止およびポリアデニ ル化などの転写終止調節配列用に保持させることもできる。即ち、硝酸レダクタ ーゼをコードしているＤＮＡ配列に天然に隣接している３゛−領域を保持させる ことによって、転写終止シグナルを付与することができる。この転写終止シグナ ルが発現宿主細胞において十分に機能しないときには、この宿主細胞において機 能する３′−領域を置換してもよい。

２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域の配列と硝酸レダクターゼをコー ドしている配列）の間の結合の性質が次のようであるときに、これら２つのＤＮ Ａ配列は機能的に結合していると言われる：（１）フレームシフト突然変異を導 入する結果にならない；（２）硝酸レダクターゼの遺伝子配列の転写を指令する プロモーター領域配列の能力に悪影響を及ぼさない；または（３）プロモーター 領域配列によって転写させようとする硝酸レダクターゼの遺伝子配列の能力に悪 影響を及ぼさない。即ち、プロモーターがＤＮＡ配列を転写させることができる なら、該プロモーター領域は該ＤＮＡ配列に機能的に結合している。

このように、硝酸レダクターゼを発現させるためには、適当な宿主によって認識 される転写および翻訳シグナルが必要である。

本発明は、原核または真核細胞のいずれかにおいて硝酸レダクターゼタンパク質 （または、その機能的誘導体）を発現させることを包含する。好ましい原核性宿 主には、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス属、シュードモナス属、サルモネ ラ属、セラッチア属などの細菌が含まれる。最も好ましい原核宿主は大腸菌であ る。特に重要な細菌宿主には、大腸菌に１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６） 、大腸菌Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ＼λ＼原 栄養性）　（ＡＴＣＣ２７３２５）、および他の腸内細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたは５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓな ど）、および種々のシュードモナス種が含まれる。

このような条件のもとでは、硝酸レダクターゼはグリコジル化されないであろう 。原核宿主は、発現プラスミド中のレプリコンおよびコントロール配列に適合す るものでなければならない。

原核細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属、ストレプトマイセス属 など）中で硝酸レダクターゼ（または、その機能的誘導体）を発現させるために は、硝酸レダクターゼをコードしている配列を機能的な原核性プロモーターに機 能的に結合させることが必要である。このようなプロモーターは構成性またはよ り好ましくは調節可能（即ち、誘導可能または抑制解除可能）のいずれであって もよい。構成性プロモーターの例には、バクテリオファージλのｉｎｔプロモー ター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、およ びｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列 のＣＡＴプロモーターなどが含まれる。誘導可能な原核性プロモーターの例には 、バクテリオファージλの主右側および左側プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、 大腸菌のｔｒｐ。

ｒｅｃＡ、　１ａｃＺ、　１ａｃＴおよびｇａｌプロモーター、枯草菌のα−ア ミラーゼプロモーター［Ｕｌｍａｎｅｎ、　１．ら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、１６２＋　１７６−１８２　（１９：　１１−２０　（１９８４）］、バシラ ス属のバクテリオファージのプロモーター　［Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、Ｊ、　、 　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌ ｉ中、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、　ＮＹ　（１９８２）］、 ならびにストレプトマイセス属のプロモーター［１ｆａｒｄ、　Ｊ、　Ｍ、ら、 　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２０３：　４６８−４７８　（１９８６）］ （１９８６）］およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ、Ｓ、　［Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅ ｔ、　１８：　４１５−４４２　（１９８４）］によって概説されている。

また、原核細胞における適切な発現には、遺伝子配列をコードしている配列の上 流にリポソーム結合部位の存在が必要である。この好ましい真核宿主には、酵母 、菌類、昆虫細胞、哺乳動物細胞（インビボまたは組織培養のいずれか）が含ま れる。宿主として有用な哺乳動物細胞には、線維芽細胞起源の細胞、例えばＶＥ ＲＯまたはＣＨＯ−Ｋｌ、またはリンパ様細胞起源の細胞、例えばバイブリド− ｖＳＰ２１０−ＡＧ１４またはミエローマＰ３Ｘ６３Ｓｇ８、およびこれらの誘 導体が含まれる。好ましい哺乳動物宿主細胞には、５Ｐ２１０およびＪ５５８Ｌ 、ならびに神経芽細胞腫セルライン、例えば１ＭＲ３３２（正しい翻訳後プロセ ッシングの比較的高い能力を付与する）が含まれる。

哺乳動物宿主のためには、いくつかの可能なベクター系を硝酸レダクターゼの発 現のために利用することができる。宿主の性質に依存して、多種多様の転写およ び翻訳調節配列を用いることができる。

この転写および翻訳調節配列は、ウィルス供給源から、例えばアデノウィルス、 ウシ乳頭腫ウシ、サルウィルスなどから得ることができ、ここで調節シグナルは 高レベルで発現する特定の遺伝子配列に結合している。別法では、アクチン、コ ラーゲン、ミオシンなどの哺乳動物遺伝子産物由来のプロモーターを用いること ができる。抑制または活性化を行なう転写開始調節シグナルを選択して、遺伝子 配列の発現を変調させることができる。温度感受性であって温度を変えることに より発現を抑制または開始させることができる調節シグナル、または化学物質（ 中間代謝物など）による調節を受ける調節シグナルが重要である。

酵母は、翻訳後のペプチド修飾をも行ないうるという重要な利点を与える。酵母 において所望のタンパク質を産生させるために利用することができる高コピー数 のプラスミドと強力なプロモーター配列を用いる多数の組換えＤＮＡ法が存在す る。酵母はクローン化した哺乳動物遺伝子配列生成物のリーダー配列を認識し、 リーダー配列を保持するペプチド（即ち、プレーペプチド）を分泌する。

酵母をグルコースに富む培地中で増殖させたときに大量に産生されるグルコース 分解酵素をコードしている活発に発現される遺伝子配列からのプロモーターおよ び終止要素を導入した一連の酵母遺伝子配列発現系のいずれかを利用することが できる。さらに、既知のグルコース分解の遺伝子配列は、極めて効率的な転写コ ントロールシグナルをも与えることができる。例えば、ホスホグリセレートキナ ーゼの遺伝子配列のプロモーターおよびターミネータ−シグナルを利用すること ができる。

別の好ましい宿主は昆虫細胞、例えばショウジヨウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ）幼虫である。宿主として昆虫細胞を用いると、ショウジヨウバエのアルコール デヒドロゲナーゼプロモーターを利用することができる［Ｒｕｂｉｎ、Ｇ、Ｍ、 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：　１４５３−１４５９　（１９８８）コ。別の方 法によれば、バキュロウィルスベクターを操作して、昆虫細胞において中、　Ｓ ｅｔｌｏｗ、Ｊ、にら編、　Ｐｌｅｎｕｍ、第８巻、　２７７−２９７頁（１９ ８６）］。

上記のように、真核宿主において硝酸レダクターゼを発現させるためには真核性 調節領域の使用を必要とする。通常、このような領域は、ＲＮＡの合成の開始を 指令するに十分なプロモーター領域を含んでいるであろう。好ましい真核性プロ モーターには、マウスメタ−［ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、　、　Ｃｅ１ｌ　３１ ：　３５５−３６５　（１９８２）］　；　Ｓ　Ｖ　４０の初期プロモーター［ Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，ら、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９０：　３０ ４−３１０　（１９８１）］；および酵母のｇａ１４遺伝子配列のプロモーター ［Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｓ、　Ａ、ら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７９：　６９７１ −６９７５　（１９８２）；　５ｉｌｖｅｒ、　Ｐ、　Ａ、轣B Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８１：　５９５ １−５９５５　（１９８４）コが含まれる。

広く知られているように、真核性ｍＲＮＡの翻訳は第１のメチオニンをコードし ているコドンから始まる。このため、硝酸レダクターゼ（または、その機能的誘 導体）をコードしているＤＮＡ配列と真核性プロモーターの間の結合がメチオニ ンをコードしうる介在コドン（即ち、ＡＵＧ）を全く含まないことを確実にする のが好ましい。

このようなコドンの存在は、融合タンパク質の生成（ＡＵＧコドンが、硝酸レダ クターゼをコードするＤＮＡ配列と同じリーディング・フレーム中にあるとき） 、またはフレームシフト突然変異（ＡＵＧコドンが、硝酸レダクターゼをコード する配列と同じリーディング・フレーム中にないとき）の結果を与える。

硝酸レダクターゼをコードしている配列および機能的に結合させたプロモーター を、直線分子またはより好ましくは共有結合によって閉環した分子のどちらであ ってもよい非複製ＤＮＡ（または、ＲＮＡ）分子として、受容原核細胞または真 核細胞のどちらかに導入することができる。このような分子は自律的に複製する ことができないので、硝酸レダクターゼの発現は導入した配列の一時的な発現に よって起こるであろう。別法によれば、導入された配列を宿主染色体中に組込む ことによって永久的な発現が起こる。

１つの態様では、所望の遺伝子配列を宿主細胞染色体中に組込むことができるベ クターを使用する。導入されたＤＮＡを染色体中に安定に組込んだ細胞は、発現 ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１またはそれ以上のマーカーを も導入することによって選択することができる。このマーカーは、栄養要求変異 種にプロトトロフィーを与えるであろう［例えば、抗生物質または重金属（銅な ど）などの生物致死剤耐性コ。選択マーカーの遺伝子配列を、発現させようとす るＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させるか、または同時トランスフェクションによ って同じ細胞に導入することができる。さらに、別の要素が１本鎖結合タンパク 質ｍＲＮＡの最も望ましい合成のために必要となるであろう。これらの要素には 、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサ−および終止シ グナルが含まれるであろう。このような要素を導入したｃＤＮＡ発現ベクターに は、Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，［Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７４：　２８ ０　（１９８３）］が開示したものが含まれる。

好ましい態様においては、導入した配列を、受容宿主における自律的な複製が可 能なプラスミドまたはウィルスベクターに導入する。

この目的に多種多様のベクターの任意のものを用いることができる。

特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択する際の重要な因子には次のも のが含まれる：即ち、ベクターを含んでいる受容細胞を、ベクターを含んでいな い受容細胞から認識および選択する際の容易さ；特定の宿主において望ましいベ クターのコピー数；ならびに、異なる種の宿主細胞の間でベクターを「往復」さ せうろことが所望であるか否かなどである。好ましい原核性ベクターには、大腸 菌中で複製することができるプラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏＩＥｌ、 ｐｓｃｌｏｌ、ｐＡｃＹｃ１８４、πｖＸなどが含まれる。

ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）］が開示している。バシラス 属プラスミドにはｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７などが含まれる。このよ う適当なストレプトマイセス属プラスミドには、ｐ　Ｉ　Ｊ　１０１　［Ｋｅｎ ｄａｌｌ、　Ｋ、　Ｊ、ら、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９：　４１７７ −４１８３　（１９８７）コ、およびφＣ３１などのストレプトマイセスバクテ リオファージ［Ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ、　Ｆ、ら。

５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ａｃｔ ｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ中。

Ａｋａｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ、　Ｂｕｄａｐｅｓｔ、　Ｈｕｎｇａｒｙ　（ １９８６）、　ｐｐ、４５−５４］が含まれ−７４２（１９７８）コが概説して いる。

好ましい真核性プラスミドにはＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０．２−ミクロンサ ークルなど、またはそれらの誘導体類が含まれる。

構築物（群）を含むＤＮＡ配列またはベクターが発現用に調製されたなら、この ＤＮＡ構築物（群）を種々の適当な手段、例えば形質転換、トランスフェクショ ン、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リン酸カルシウム沈 澱、直接的なマイクロインジェクションなどのいずれかによって適当な宿主細胞 中に導入してよい。

ベクターを導入した後に、ベクター含有の細胞の増殖を選択する選よって、硝酸 レダクターゼまたは硝酸レダクターゼのフラグメントが産生される結果になる。

これは、形質転換された細胞そのままで起こりうるし、また、この細胞を誘導し て分化させた後に起こりつる（例えば、神経芽細胞腫の細胞にブロモデオキシウ ラシルを与えることなどによって）。

発現されたタンパク質は、抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティーク ロマトグラフィー、電気泳動など、通常の条件に従って単離および精製してもよ い。

■、遺伝的に修飾された植物への硝酸レダクターゼの使用硝酸レダクターゼの遺 伝子配列を遺伝子操作法によって植物中に導入することができる。これは、植物 細胞中で産生されたときに、植物による窒素の固定化を容易にするための手段と して用いることができ、従って植物の還元窒素に対する要求を減少させるか、ま たは不要にすることができる。従って、肥料に対する依存性が比較的小さく、か つ劣悪な栽培条件のもとて比較的生存しつる植物を得ることが可能になる。即ち 、本発明の別の態様においては、ＮＲ遺伝子配列を植物の形質転換に用いて、こ の植物に硝酸レダクターゼ活性を付与するか、またはそれを高める。

本発明において使用してよいＮＲ遺伝子配列の暗号領域は、この遺伝子配列の完 全長または部分的な活性長のものである。しかし、この硝酸レダクターゼをコー ドしている遺伝子配列は、得られた植物細胞中で機能的な硝酸レダクターゼとし て発現され、産生されることが必要である。

硝酸レダクターゼの遺伝子配列をコードしているゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡな らびに合成りＮＡに由来するＤＮＡを本発明に用いることができる。また、硝酸 レダクターゼの遺伝子配列を、部分的にｃＤＮＡクローンから、部分的にゲノム クローンから、部分的に合成遺伝子から、ならびにこれらの種々の組合せから構 築してもよい。さらに、硝酸レダクターゼの遺伝子配列をコードしているＤＮＡ は、種々の種からの部分からなっていてもよい。

別の態様においては、本発明は、 （ａ）ある植物細胞において発現したときに硝酸レダクターゼに対して機能的で ある、硝酸レダクターゼをコードしている第１の遺伝子配列； （ｂ）この硝酸レダクターゼの暗号領域のどちらかの側に機能的に連結した１ま たはそれ以上の付加的な遺伝子配列；を含有するキメラの遺伝子配列を包含する 。これらの付加的な遺伝子配列は、プロモーター（群）またはターミネータ−（ 群）のための配列を含んでいる。植物の調節配列は宿主細胞に対して異種または 同種のどちらであってもよい。

好ましい態様においては、硝酸レダクターゼの遺伝子配列のプロモーターを用い てキメラ遺伝子配列を発現させる。この遺伝子配列に用いることができる他のプ ロモーターには、ｎｏｓ、　ｏｃｓおよびＣａＭＶプロモーターが含まれる。使 用することができる効率的な植物プロモーターは過産生植物プロモーターである 。硝酸レダクターゼの遺伝子配列と機能的に結合したこのプロモーターは、硝酸 レダクターゼの発現を促進することができるはずである。本発明に用いることが できる通産生植物プロモーターには、大豆由来のりブロース−１，５−ビホスフ ェートカルポキシラーゼの小サブユニット（ＳＳ）のプロモーター［Ｂｅｒｒｙ −Ｌｏｖｅら、　ＪｌＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐ、　Ｇｅｎ、、ｌ： ４８３−４９８　（１９８２）］およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプ ロモーターが含まれる。これら２つのプロモーターは、真核植物細胞中で光誘導 されることが知られている［例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ、　ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉ ｖｅ、　Ａ、　Ｃａｓｈｍｏｒｅ、　Ｐｌｅｎｕｍ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８３）、　ｐａｇｅｓ　２９−３８；　Ｃｏｒｒｕｚ ｉ、Ｇ、ら、Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５８：　１３９９　（ １９８３）：およびＤｕｎｓｍｕｉｒ、　Ｐ、ら、　Ｊ、　ｏｆ　Ｍｏ１．　ａ ｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、、　２：　２８５　（１９８３）を参照コ 。

さらに別の好ましい態様においては、硝酸レダクターゼの遺伝子配列を含有する キメラの遺伝子配列の発現を、植物プロモーターと、および遺伝子配列分泌シグ ナル配列と正しいリーディングフレーム中に機能的に結合させる。

植物プロモーターおよび好ましい態様では分泌シグナル配列に機能的に結合させ た硝酸レダクターゼ遺伝子配列を含有するキメラ遺伝子配列を、適当なりローニ ングベクターに連結することができる。

通常は、宿主細胞に適合する種から導いたレプリコンおよびコントロール配列を 含むプラスミドまたはウィルス（バクテリオファージ）ベクターを用いる。通常 、クローニングベクターは、複製起点、ならびに形質転換された宿主細胞におい て表現型選択マーカー（代表的には、抗生物質に対する耐性）を与えることがで きる特別の遺伝子配列を担持しているであろう。これら形質転換ベクターは、宿 主細胞の形質転換の後にこれら表現型マーカーによって選択することができる。

本発明において使用することができる宿主細胞には、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｌ） 、Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよび５ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎ ｓなどの細菌宿主を含む原核生物が含まれる。また、酵母または糸状菌などの真 核性宿主を本発明において用いることができる。

クローニングベクターとこのベクターで形質転換された宿主細胞を本発明で用い て、通常、ベクターのコピー数を増加させる。コピー数の増加により、硝酸レダ クターゼの遺伝子配列を含むベクターを単離することができ、例えば、これを用 いてキメラ遺伝子配列を植物細胞中に導入することができる。このベクター中に 含まれる遺伝物質を、マイクロピペットの使用により植物細胞中に直接マイクロ インジェクションして、組換えＤＮＡを機械的に移すことができる。また、細胞 によって取込まれる遺伝物質との沈澱コンプレックスを形成するポリエチレング リコールを用いて、遺伝物質を植物細胞中に移すこともできる［Ｐａｓｚｋｏｗ ｓｋｉら、　ＥＭＢＯＪ、　３：　２７１７−２２　（１９８４）コ。

本発明の別の態様では、硝酸レダクターゼの遺伝子配列を、電気穿孔法によって 植物細胞中に導入することができる［Ｆｒｏｍｍら、「電気穿孔法により単子葉 植物および双子葉植物細胞に転移させた遺伝子配列の発現Ｊ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：　５８２４　（１９８５）］ 。

この方法においては、硝酸レダクターゼの遺伝子構築物を含有するプラスミドの 存在下に植物のプロトプラストを電気穿孔する。強い場の電気的衝撃は生物膜を 可逆的に透過性にし、プラスミドの導入を可能にする。電気穿孔された植物のプ ロトプラストは細胞壁を再生し、分裂し、そして植物カルスを形成する。発現さ れた硝酸レダクターゼを伴う形質転換植物細胞の選択は、上記の表現型マーカー を用いて行なうことができる。

硝酸レダクターゼの遺伝子配列を植物細胞に導入する別の方法は、硝酸レダクタ ーゼの遺伝子配列で形質転換されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓで植物細胞を感染させることである。当分野で既知の適当な条件のも とで、形質転換植物細胞を増殖させて新芽、根を形成させ、さらに植物まで成長 させる。硝酸レダクターゼの遺伝子配列を、例えばＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドを用いて適当な植物細胞に導入する ことができる。このＴｉプラスミドはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓによる感染によって植物細胞に伝達され、植物ゲノム中に安定に組 込まれる［Ｈｏｒｓｃｈら、「植物における機能的な外来遺伝子の遺伝ｊ、　５ ｃｉｅｎｃｅ　２３３：　４９６−４９８　（１９８４）：　Ｆｒａｌｅｙら、 汀ｏｃ、Ｎａｔ１．＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８０：　４８０３　（１９ ８３）コ。

Ｔｉプラスミドは形質転換細胞の生成に必須である２つの領域を含有している。

この１つはトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と呼ばれ、腫瘍の生成を誘導す る。他方はビルレント領域と呼ばれ、生成には必須であるが、腫瘍の維持には必 須ではない。植物ゲノムに転移するトランスファーＤＮＡ領域は、その転移能力 に影響を及ぼすことなく、酵素の遺伝子配列を挿入することによってその大きさ を増加させることができる。腫瘍を引き起こす遺伝子配列を除去してその遺伝子 がもはや干渉しないようにすることにより、次にこの改良型のＴｉプラスミドを 、本発明の遺伝子配列構築物を適当な植物細胞に転移させるためのベクターとし て用いることができる。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換され、形質転換細胞がら全植物を 再生することができる全ての植物細胞を本発明に従って形質転換し、それによっ て、転移した硝酸レダクターゼ遺伝子配列を含有する形質転換された全植物を得 ることができる。

現在、以下に示す２種類の異なる方法が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍで植物細 胞を形質転換するために存在する： （１）培養され単離されたプロトプラストとＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの同時 培養；または （２）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる細胞または組織の形質転換。

方法（１）は、プロトプラストの培養および培養されたプロトプラストからの植 物の再生が可能な確立された培養系を必要とする。

方法（２）は、（ａ）植物細胞または組織がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによっ て形質転換されうろこと；および（ｂ）形質転換された細胞または組織を誘導し て全植物に再生しうること；を必要とする。バイナリ−系では、感染させるため に２種類のプラスミド、即ちＴ−ＤＮＡ含有プラスミドおよびｖｉｒプラスミド を必要とする。

酵素が発現されるようにＴｉプラスミドで植物細胞または植物を形質転換した後 、これら植物細胞または植物を適当な表現型マーカーによって選択することがで きる。これらの表現型マーカーには抗生物質耐性が含まれるが、これに限定はさ れない。他の表現型マーカーが当分野で知られており、これを本発明において使 用することもできる。

プロトプラストを単離および培養して全再生植物を得ることができる全ての植物 を本発明によって形質転換することができ、転移した硝酸レダクターゼ遺伝子配 列を含有する全植物を回収することができる。いくつかの適当な植物を例示する と、これにはＦｒａｇａｒｉａ。

ＬｏｔｕｓＳＭｅｄｉｃａｇｏ、０ｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、　Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ＳＴｒｉｇｏｎｅｌｌａ、　ＶｉｇｎａｌＣｉｔｒｕｓＳＬｉｎｕｍ、　Ｇｅｒ ａｎｉｕｍ、　Ｍａｎｉｃｏｔ、　ＤａｕｃｕｓＳＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、　 Ｂｒａｓｓｉｃａ、　Ｒａｐｈａｎｕｓ、　５ｉｎａｐｉｓ、　Ａｔｒｏｐａ、 　Ｃａｐｓｉｃｕｍ、　Ｄａｔｕｒａ、　Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ。

ＬｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎＳＮｉｃｏｔｉａｎａ、　Ｓｏｌａｎｕｍ、　Ｐｅｔｕ ｎｉａＳＤｉｇｉｔａｌｉｓＳＭａｊｏｒａｎａ、　Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、　Ｈ ｅ１ｉａｎｔｈｕｓ、　ＬａｃｔｕｃａＳＢｒｏｍｕｓ、　Ａｓｐａｒａｇｕｓ ＳＡｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、　Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ、　ＮｅｍｅｓｉａＳ ＰｅｌａｒｇｏｎｉｕｍＳＰａｎｉｃｕｍ、　Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、　Ｒａｎ ｕｎｃｕｌｕｓ、　５ｅｎｅｃｉｏ、　Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、　Ｃｕｃｕ ｍｉｓＸＢｒｏｗａｌｌｉａ、　ＧｌｙｃｉｎｅＳＬｏｌｉｕｍ、　Ｚｅａ、　 ＴｒｉｔｉｃｕｍＳＳｏｒｇｈｕｍおよびＤａｔｕｒａなどの属の種が含まれる 。

実際的には全ての植物（全ての主要な穀物種、サトウキビ、テンサイ、綿、果樹 およびその他の樹木、マメ類ならびに野菜類を含むが、これらに限定はされない ）を培養された細胞または組織から再生しうるという証拠が増えつつある。Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによってこれら植物の全てが形質転換されうるか否かに ついては、現在その知識が限定されている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然 の植物宿主である種はインビトロで形質転換することができる。単子葉植物、特 に穀物類および草類はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの天然の宿主ではない。Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用いてこれらを形質転換しようとする試みは最近まで 不成功であった［ｔｌｏｏｙｋａｓ−Ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら、　Ｎａｔ ｕｒｅ　３１１：　７６３−７６４　（１９８４）］。ある種の単子葉植物をＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換しうることが現在では明らかになり つつある。現在利用可能となった新規な実験方法を用いて、穀物および草類の種 を形質転換することができる。

Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって形質転換しつる別の植物の属には、Ｉｐｏ ｍ。

ｅａ、　Ｐａ５ｓｉｆｌｏｒａ、　Ｃｙｃｌａｍｅｎ、　Ｍａｌｕｓ、　Ｐｒｕ ｎｕｓＳＲｏｓａＳＲｕｂｕｓ、　Ｐｏｐｕｌｕｓ、　Ｓａｎｔａｌｕｍ、　Ａ Ａｌｌｌｕ、　ＬｉｌｉｕｍＳＮａｒｃｉｓｓｕｓ、　Ａｎａｎａｓ、　Ａｒａ ｃｈｉｓ、　ＰｈａｓｅｏｌｕｓおよびＰｉｓｕｍが含まれる。

培養プロトプラストからの植物の再生は以下の文献に記載されてｖ　Ｙｏｒｋ、 　１９８３）；　Ｍ、Ｒ，Ｄａｖｅｙ、　ｒ植物プロトプラストノ培養オヨヒ再 ｇｓ、　ｐｐ、１９−２９　（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ、　Ｂａ５ｅｌ、　１９８ ３）；　Ｐ、Ｊ、Ｄａｌｅ、　ｒ穀物および他の扱いにくい農作物のプロトプラ スト培養および植物再生Ｊ、　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、　１９８３−　Ｌｅｃ ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、　ｐＩ）、　３１−４１　（Ｂｉｒｋｈａ ｕｓｅｒ。

Ｂａ５ｅｌ、　１９８３）；およびＨ，Ｂｉｎｄｉｎｇ、　ｒ植物の再生Ｊ、　 Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、　ｐｐ、２１−３７　（ＣＲＣＰｒｅｓ ｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　１９８５）。

再生は植物の種類によって変わるが、通常は、複数コピーの硝酸レダクターゼ遺 伝子配列を含有する形質転換プロトプラストの懸濁液を最初に得る。次いで、こ のプロトプラスト懸濁液から天然の胚として発達および発芽する段階まで、胚の 形成を誘導することができる。通常、培養培地は種々のアミノ酸およびホルモン （オーキシンやサイトカイニンなど）を含有しているであろう。また、特にトウ モロコシやアルファルファなどの種に対しては、培地にグルタミン酸やプロリン を加えるのが好都合である。新芽と根が同時に現れるのが普通である。効率的な 再生は、培地、遺伝子型、および培養の経過に依存するであろう。これら３つの 変数を制御すると、再生は完全に再現可能かつ繰返し可能となる。

形質転換された植物細胞から成長させた成熟植物を自家授粉させて同系交配植物 を得る。この同系交配植物は硝酸レダクターゼの遺伝子配列を含有する種子を産 する。この種子を成長させて硝酸レダクターゼを有する植物を得ることができる 。

本発明の同系交配株を用いて昆虫耐性のハイブリッドを作成することができる。

この方法においては、昆虫耐性の同系交配系統を別の同系交配系統と交配させて ハイブリッドを得る。

再生した植物から得た部分、例えば花、種子、葉、枝、果実なども、これらの部 分が昆虫耐性細胞を含有しているならば、本発明に包含される。また、再生した 植物の子孫、変異体および突然変異体も本発明の範囲内に含まれる。

二倍体植物においては、通常、一方の親を硝酸レダクターゼの遺伝子配列によっ て形質転換し、他方の親は野生型である。これらの親を交配させた後には、第１ 世代のハイブリッド（Ｆｌ）は、１／２の硝酸レダクターゼ／野生型：１／２の 硝酸レダクターゼ／野生型の分布を示すであろう。この第１世代のハイブリッド （Ｆｌ）を自家授粉させて第２世代のハイブリッド（Ｆ２）を得る。このＦ２ハ イブリッドの遺伝子分布は、１／４の硝酸レダクターゼ／硝酸レダクターゼ：１ ／２の硝酸レダクターゼ／野生型＝１／４の野生型／野生型である。この硝酸レ ダクターゼ／硝酸レダクターゼの遺伝子構成を有するＦ２ハイブリッドを、除草 剤耐性の植物として選択する。

本明細書において用いる変異体とは、この変異体が昆虫耐性の植物をなお構成し ているならば、安定かつ遺伝性の表現型の変化について言うものである（植物の 子孫に性的に伝達される遺伝性の変異を含む）。また、本明細書において用いる 突然変異体とは、放射などの環境的条件の結果としての変異、またはある特質が 十分に確立された遺伝法則に従って減数分裂により伝達される遺伝的変異の結果 としての変異を言うものである。しかし、この突然変異植物は本発明の昆虫耐性 をなお示すものでなければならない。

以上に本発明の詳細な説明したが、以下の具体的な実施例を参照することによっ て本発明をさらに明確に理解することができる。これら実施例は例示のために挙 げたものであって、特に明記しない限り本発明を限定するものではない。

（以下、余白） 実施例１　トウモロコシ由来物質の調製トウモロコシ苗（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　Ｌ 、、　Ｇｏｌｄｅｎ　Ｊｕｂｉｌｅｅ）は水耕法で成育させた。種子（仁）を通 常の漂白剤から調製した１、５％容量／容量Ｎａ０Ｃ１中に１５分間浸し、蒸留 水で洗浄し、暴気した蒸留水中、室温で発芽させた。２４時間後、発芽した種子 を、暴気した０、　２ｍＭのＣａ　Ｃｌ　２溶液（５Ｌ）の表面から約１ｃｍ上 のステンレス・スチール・スクリーン上にまき、プラスチックの覆いをかぶせて ２５℃の暗所に置いた。そのプラスチックの覆いを３日後に除去した。５日後に 、窒素を欠く空気を含ませた０、１〜強度のホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ） 溶液ｎｏ、　１　［Ｂｏａｇｌａｎｄ、　Ｄ、Ｒ，、ａｎｄ　Ａｒｎｏｎ、　Ｄ 、１．、　Ｃａ１．　Ａｇｒｉｃ。

Ｅｘｐ、　５ｔａｔ、　Ｃ１ｒｃ、　Ｎｏ、　３４７　（１９５０）］に苗を移 し、制御された環境下の栽培室に置いた。栽培条件は６０〜６５％相対湿度、２ ５℃、および連続光としてＮＲＡレベルに及ぼす周期の影響を最小限にした。苗 天蓋の光子束密度は、Ｌｉｃｏｒ　１９０　Ｓセンサーを用０た４００〜７００ ｎｍでの計測で４００μモルｍ−２，ｓ−１であり、白熱および自冷色の蛍光灯 により各々１：５の割合で供給した。光源は５ｙｌｖａｎｉａ　Ｌｉｇｈｔｉｎ ｇ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡより入手した。連続光の下で２日 経過後、ＮＲＡを誘導するために２４時間、１ｍＭＫＮＯ３を含有する０、１強 度のホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ）溶液ｎｏ、　ｌに移した。

ミクロソームの単離 ９日経過のトウモロコシ苗がら得た根（２５ｇ）を種のすぐ下で摘出し、はさみ で１ｃｍの断片に切り、次いで冷却した乳鉢と乳棒中の冷却した粉砕緩衝液（６ ０ｍｌ）中ですり砕いた。この粉砕緩衝液は、２５０ｍＭスクロース、３ｍＭエ チレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ）、５０ｍＭ２−アミノ−２−（ヒドロキシメ チル）−１，３−プロパンジオール（トリス−ＨＣｌ）（ｐＨ８，０）、０　、 ０５　％（ｗ／ｗ根）ホ’）　ヒニルポリピロリドン、１ｍＭジチオトレイトー ル（ＤＴＴ）、３ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μ Ｍ　Ｎａ２ＭｏＯ４（Ｈ２Ｏ）２、および５μＭフラビンーアデニンジヌクレオ チド（ＦＡＤ）からなるものであった。ＰＭＳＦはイソプロパツール９０．１Ｍ 保存液として調製し、０．７５ｍｌ　ＰＭＳ　Ｆ　＋　２５ｍｌ粉砕緩衝液の比 で加えた。ＤＴＴは脱イオン水中１．０Ｍ保存液として調製し、０．０２５ａ＋ Ｉ　ＤＴＴ　：　２５ｍｌ粉砕緩衝液の比で加えた。粉砕緩衝液中に使用した全 ての化学品は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ 、　ＭＯ，ＵＳＡから得た。ホモジネートを４層のチーズクロスで濾過し、１２ ゜０００ｇで１０分間遠心した。いくつかの実験において、１２．　Ｏ００ｇ遠 心後の分画の一部を酵素分析のために蓄えた。上清を１２０゜０００ｇで２０分 間遠心した。得られたペレットはミクロソーム分画、すなわち粗膜分画を表した 。酵素分析のためのいくつかの実験において１２０．０００ｇ遠心後の分画を用 いた。

ＮＲＡを測定するために、ミクロソームのペレットを再懸濁緩衝液中に懸濁し、 ２０ｍ１に希釈し、１２０．０００ｇで２０分間遠心した。再懸濁緩衝液は、２ １ｎＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８，２）、１ｇＭＮａ２Ｍｏｏ４（Ｈ２Ｏ）２．５ ｇＭ　ＦＡＤ、３ｍＭ　ＰＭＳＦおよび１ｍＭＤＴＴであった。工程をさらに３ 回繰返し、最初のミクロソーム分画を含む各々の膜ペレットから得た試料をＮＲ Ａ測定のために蓄えた。

原形質膜の単離 ミクロソームのペレットを２５０ｍＭスクロース、５ｍＭＫ−ホスフェート（ｐ Ｈ７，８）および１ｍＭＰＭＳＦの溶液（２，２ｍ１）中に再懸濁し、Ｌａｒｓ ｓｏｎらにより詳述されている水性ポリマー２相系［原形質膜：　Ｍｏｄｅｒｎ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｎｅｗ　５ｅｒｉ ｅｓ、　Ｖｏｌ、　１゜Ｃｅ１ｌ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、　ＨＦ　Ｌｉｎｋｓ ｅｎｓら編、ｅｄｓ、、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、 　ｐｐ、　８５−１０４　（１９８５）コで分配した。この方法の全ての工程は 、４℃で行った。簡単に言えば、６．５％（Ｗ／Ｗ）デキストランＴ５００（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 　ＮＪ、　ＵＳＡ）、６．５％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール３３５　Ｑ　 （Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ，ＵＳＡ）、０．３３Ｍスクロース、３ｍＭ　ＫＣＩおよび５ｍＭＫ−ホス フェート（ｐＨ７，８）を含む２相系（８ｍｌ）に、再懸濁されたミクロソーム 分画（２ｍｌ）を加えた。試験管の内容物を４０〜５０回倒置することにより混 合し、スイング・パケット・ローター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ−ｂｕｃｋｅｔ　ｒｏ ｔｏｒ）にて１．２００ｇで５分間遠心した。上相を集めて、Ｓ７）］が記載し ているようにして新鮮な下相の上に再分配した。残存しているミクロソームＵ２ および最初の下相（Ｌｌ）分画を集めて、各々を再懸濁緩衝液（２０ｍｌ）で希 釈し、１２０．０００ｇで２０分間遠心した。Ｕ２ベレットを再懸濁緩衝液中に 懸濁し、２０ｍ１に希釈して再び１２０．　ＯＯＯｇで２０分間遠心した。得ら れたペレットを懸濁して、タンパク質濃度が１２０．０００ｇ遠心後の分画に等 しくなるまで再懸濁緩衝液で希釈し、酵素分析のために直接用いた。

塩の洗浄　２回遠心したＵ２分画を０　、５　ｍｇ、　ｍｌ−、タンパク質濃度 となるまで再懸濁緩衝液で希釈し、最終濃度がＱ、５ｍｌ中Ｏ〜０．ＩＭＮａＣ １となるようにした。全ての分画を３０秒間激しく混合し、氷上に置いた。塩処 理した分画をアメリカン・ブランド（ＡｍｅｒｉｃａｎＢｒａｎｄ）（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔ、　ＭｃＧｒａｗ　Ｐａｒｋ 、　ＩＬ、　ＵＳＡ）超音波処理装置中で氷上にて超音波処理した。２０分後、 分画を再懸濁緩衝液（８ｍｌ）で希釈し、１５０，０００ｇで１５分間遠心した 。この再懸濁ペレットにおいて硝酸レダクターゼ活性を測定した。

２度ペレットにしたＵ２分画を再懸濁緩衝液でタンパク質が０．５ｍｇ」ｌ−１ となるまで希釈し、全量０．５ｍｌ中０〜０．１％トリトンＸ−１００（オクチ ルフェノキシポリエトキシエタノール、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ＵＳＡ）となるようにして、３０秒間激し く混合し、次いで氷上に置いた。１５分後、分画を希釈せずに１５０、　ＯＯＯ ｇで１５分間遠心した。再懸濁されたペレットおよび可溶性分画においてバナデ ート（Ｖａｎａｄａｔｅ）−感受性ＡＴＰアーゼ活性よびＮＲＡを測定した。

実施例２　トウモロコシにおける膜−結合性のＮＲ活活性トウモロコシ跡ら単離 した粗膜分画において硝酸レダクターゼ活性を検出した。潜在性の捕獲された可 溶性ＮＲＡを放出させるために、膜ペレットを低張性緩衝液中で４回洗浄した［ Ｐｕｐｉｌｌｏ、　Ｐ、。

ａｎｄ　Ｄｅｌ　Ｇｒｏｓｓｏ、　Ｅ、、　Ｐｌａｎｔａ　１５１：５０６−５ １１　（１９８１）コ。最初の洗浄によりＮＲＡの２３％が可溶性分画に放出さ れた。これはおそら（、膜小胞中にゆるく結合していたかまたは捕獲されていた 可溶性ＮＲＡを表すものであった。膜ペレットを引き続き洗浄することによりさ らにわずかなＮＲＡが放出された。これは、洗浄された膜ペレット中に検出され たＮＲＡが膜−結合性であることを示した。ゆるく結合している可溶性ＮＲＡを 除去するために、以降の全ての実験において膜分画は低張性緩衝液で少なくとも ２回洗浄した。

可溶性および膜結合性ＮＲ活性の両方に対するトリトンＸ−１００の効果を表１ に示す。ミクロソームのＮＲ活性はトリトンＸ−１００により９倍まで刺激され た一方で、可溶性ＮＲ活性にはほとんど影響はなかった。Ｔ：ｐ比が約３　、５ 　ｍｇ、　ｍｇ−＋である０、０４３％のトリトンＸ−１００で最大活性に達し た。ミクロソームのＮＲ活性に対して、トリトンＸ−１００のより高い濃度によ るそれ以上の効果はほとんどなかった。洗浄剤による活性化は可溶性ＮＲ活性に 対するよりも膜−結合性ＮＲ活性に対するほうがはるかに大きいために、トリト ンＸ−１００による刺激はＮＲ活性に対する一般的効果の結果ではなく、膜−結 合性酵素の特異的な活性化であるように思われる。同様に、粒状のセルラーゼは トリトンＸ−１００により刺激されるが、可溶性セルラーゼはほとんど影響を受 けない［Ｋｏｅｈｌｅｒ、　Ｄ、Ｅ、ら、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、５８ ：３２４−３３０　（１９７６）］。

表１のために、上述のようにしてトウモロコシ苗を栽培し、膜分画を単離した。

ミクロソーム分画をベレットにして低張性緩衝液中で３回再懸濁し、タンパク質 濃度が１２０．０００ｇ遠心後（可溶性）の分画（０、７ｍｇ、　ｍｇ”）と等 量になるまで希釈し、直接ＮＲ活性の測定に用いた。可溶性分画および最終ミク ロソームペレット中でトリトンＸ−１００の濃度を増加させながら硝酸レダクタ ーゼ活性を測定した。実験は３回繰り返し、平均±ＳＥを示す。

表１ トウモロコシ根由来の可溶性およびミクロソームのＮＲ活性に対するトリトンＸ −１００の効果反応混合物中の　Ｔａｐ　硝酸レダクターゼ活性トリトンＸ−１ ００（％）　（ｍｇ、ｍｇ”）　（ｎモルｍｇ−１、ｈ−１）可溶性　ミクロソ ーム ０　０　１８１±１３　１３．７±４ ０．０１３　１．０　１８８±１５　２８．４±３０．０１７　１．４　２１２ ±１２　１０１　±８０．０４３　３．５　１９３±１３　１２４　±７．５０ ．０８６　６．９　２１２±１６　１３３　±９０．１２９　１０．４　２０５ ±１３　１２８　±８シヨ糖勾配遠心分離法によるトウモロコシ根ミクロソーム 分画の予備的分析により、ミクロソーム−結合性ＮＲ活性はＰＭ分画中にに富む ことが示された。ＮＲ活性がＰＭに局在化していることを示すために、高度に精 製されたＰＭ分画を単離することは重要である。

導入部で説明した様にＮＲ活性が一般に細胞質ゾル中に局在化していると考えら れているので、ＰＭ分画が細胞質性物質を含まないことは特に重要である。

水性２相分配を用いて、トウモロコシ根由来の非常に純度の高い５ｋｅｎｓら編 、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ 、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８５）；　ｌｏｄｇｅｓ、　Ｔ、に、、　ａｎｄ　 Ｍｉｌｌｓ、　Ｄ、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１１８：４１−５４　 （１９８６）］。水水性２相配されたトウモロコシ−根ミクロソーム分画のマー カー酵素による評価を表２に示す。Ｕ２分画においてＰＭ　Ｈ”−ＡＴＰアーゼ 活性が２．３倍豊富であることが検出された。トノプラスト、液胞、ゴルジ体、 小胞体、ブラスチドおよび細胞質に対するマーカーの評価により、これらの活性 の各々はＵ２において顕著に減少していることが示された。ミクロソームに比べ て、Ｕ２分画においては、硝酸塩−感受性ＡＴＰアーゼ活性（トノプラスト）は １００％、ＮＡＤＨＣｙｔ　ｃレダクターゼ活性（小胞体）は９５％、潜在的な ＵＤＰアーゼ活性（ゴルジ体）は９６％、およびチトクロームＣオキシダーゼ活 性（ミトコンドリア）は９１％減少した。Ｕ２において検出可能なプラスチドお よび細胞質ゾル性の［Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｌ、Ｅ。

ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、４５＋５８３−５８５　（１９７０）；　Ｍ ｉｆｌｉｎ、Ｂ、Ｊ、ら、　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、嬰：８７０−７４　（ １９７４）コトリオースリン酸イソメラーゼ活性および細胞質ゾル性の［Ｑｕａ ｉｌ、　Ｐ、Ｈ，、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　３ ０＋４２５−８５　（１９７９）］アルコールデヒドロゲナーゼ活性のＵ２にお ける欠如により、この分画に細胞質性の不純物の混入が全くなかったことが証明 されている。マーカー−酵素のデータにより、Ｕ２は主にＰＭからなることを示 している。

表２のために、上述のようにしてトウモロコシ根の分画を単離した。活性を保存 するために上記の分画の調製物を単離後直ちに用いた。また一度に全試験を行う ために十分なＰＭ分画の量を単離することができなかったので全試験を行うため に数個の異なる調製物が必要であった。様々な分画を与える３つの異なる調製物 を用いて各々の試験を少な（とも３回繰り返した。平均±ＳＥを示す。

表２ トウモロコシ根分画のマーカー酵素による評価感受性　３±０．４　４４．７± １．０　３６．６±１．０　１０１±１，２ＡＴＰアーゼ”／ＰＭ ＮＯ３−感受性 ＡＴＰアーゼ°１０，７±０．０５　０．０６±０．０１　０．２３±０．０２ 　０±０トノブラスト 潜在性ＵＤＰアーゼ“０．６±０．０５　２９．４±０．５　６３．４±０．８ 　１．０５±０．２／ゴルジ ＮＡＤＨＣｙｔ　ｃ レダクターゼ”／　０．０８±０．０１　０．９±０．０５　１±０．１　０． ０５±０．００５Ｒ Ｃｙｔ　ｃオキシダ ーゼ／ミドコン　０±００．３±０．０５　０．５±０．０５０．０３±０．０ ０５ドリア ＴＰＩｃ／プラスチ）’　５±０．５　５．５±０．６　９．１ｔＯ，５０ｉ０ ／細胞質 ＡＤＨ’　／細胞質　５２±１０±００±００±ＯａμモルＰｉ、　ｍｇタンパ ク質、ｈ刊りμモルＣｙｔ　ｃ、　ｍｇタンパク質、ｈ−１ｃμモルＮＡＤＨ， ｍｇタンパク質、ｈ−１ｄｎモルＮＡＤ、ｍｇタンパク質、ｈ−１膜結合性ＮＲ 活性がＰＭ中に局在化しているかどうかを決定するために、可溶化および相−分 配された膜分画におけるＮＲ活性の分布を測定した（表３）。金板ＮＲ活性の約 １．８〜１９％（１２，０００ｇ遠心後の上清のＮＲ活性を基にして）が、トリ トンＸ−１００の非存在下および存在下の各々においてミクロソーム分画中に検 出された。Ｕ２（ＰＭ）分画において、ミクロソームの１．７〜２．６倍豊富な ＮＲ活性が、トリトンＸ−１００の非存在下および存在下の各々において検出さ れた。これらを合わせて考えると、マーカー−酵素およびＮＲ活性データは、膜 結合性ＮＲ活性がＰＭと関連を有することを示している。

ＮＲ活性がＰＭにイオン性の結合をしているかどうかを決定するために、ＰＭ小 胞を０〜１．０ＭＮａＣ１を含む緩衝液に再懸濁し、３０秒間勢い良（混合し、 ２０分間氷上で超音波処理して次いでベレット化した。対照（塩を含まない）の 分画は超音波処理しなかった。

ＰＭ結合性ＮＲ活性は、１Ｍまでの塩による洗浄の影響は受けなかった。これに より、ＰＭに対するＮＲ活性の結合は単純なイオン性の結合以上のものであって 、ＮＲ活性は脂質二重層としっかりと結合していることを示した。

膜結合性ＮＲ活性のトリトンＸ−１００による刺激（表１．３）は、ＮＡＤＨお よび／またはＮＯ３−がＰＭのＮＲ活性のＮＡＤＨ酸化部位および／またはＮ　 Ｏ３−還元部位に接近することができなかったことを示す。また、トウモロコシ 根ＰＭ分画と結合したＮＡＤＨ依存性フェリシアン化物レダクターゼ活性は０． ０２５％トリトンＸ−１００により６倍刺激されたが、これによりＢｕｅｋｈｏ ｕｔおよびＢｒｕｂｅｃ［Ｂｕｃｋｈｏｕｔ、　Ｔ、Ｊ、、　ａｎｄ　Ｈｒｕｂ ｅｃ、　Ｔ、Ｃ，、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ　１３５：１４４−１５４　（１９ ８６）］は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化および／またはフェリシアン化物還元の主要部 位はＰＭの外側表面に露出していないことを示唆するに至った。Ｓｉｎｇｅｒ［ Ｓｉｎｇｅｒ、　Ｓ、Ｊ、、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４３ ：８０５−８３３　（１９７４）コは、洗浄剤による活性化は膜中に深く埋めら れた酵素の特徴であることを提示した。

表３のために、上述のようにして分画を単離し、０．１％トリトンＸ−１，００ の存在下および非存在下でＮＲ活性を測定した。Ｔ：ｐ比は約７であった。実験 を５回繰り返した平均および±ＳＥを示す。

表３ トウモロコシ根分画における硝酸レダクターゼ活性硝酸レダクターゼ活性 １２に上清８６５±３　０．６５±０．０８　１５８±１３　１６６±１３可溶 性ｂ５７±４　０．６５±０．１　１７９±２４’　２１８±１０ミクロソーム 　１４±０．２　０．８±０．１　１１±１１２６±４Ｌ＋　２．４±０．５　 ０．８±０．１　３．８±０．５　９０±１２Ｕ２　１．４±０．２　０．８± ０．０５　１９．３±０．５　３２３±８ａ　１２．　ＯＯ０ｇ遠心後の上清 ｂ　１２０．０００ｇ遠心後の上清 ｃ　１２０，０００ｇ遠心から得たペレットＬ１　最初の下相 Ｕ２　第二の下相 トリトンＸ−１００によるＮＲ活性の刺激が、膜由来のＮＲ活性を可溶化した結 果であるかどうかを決定するために、トリトンＸ−１００の濃度を増加させてＰ Ｍ小胞を処理し、次いで遠心した（表４）。ＮＲ活性の大部分は、ミクロソーム 分画におけるＮＲ活性に対する最適のＴａｐ比よりわずかに少ない０．０５％ト リトンＸ−１００（Ｔ：ｐ＝１．２５）により可溶化された（表１）。これとは 対照的に、０．１％トリトンＸ−１００（Ｔ：ｐ＝２．５）までを用いたＰＭ小 胞の処理によりわずかなバナデートー感受性Ｈ”−、ＡＴＰアーゼは除去された （表４）。ＰＭのＡＴＰアーゼとは異なり、ＰＭ結合性ＮＲ活性の潜在性はＮＲ 活性の膜からの可溶化と相関関係があると考えられた。

ＮＲ活性についての値は、結果が反応混合物のタンパク質濃度に基づくものであ るから、表３よりも表４においてより高い。表３ではタンパク質の分析は膜を含 んでおり、一方、表４では膜は、トリトンＸ−１００処理によりＮＲ活性が可溶 化された後に遠心により調製物から分離される。上清の溶液におけるタンパク質 の濃度を次いで測定した。

表４のために２回ペレット化されて再懸濁されたＰＭ分画をＯ〜０．１％トリト ンＸ−１００にて氷上で１５分間処理し、次いで１５０、０００ｇで１５分間遠 心した。硝酸レダクターゼ（ＡおよびＢ）およびバナデート感受性ＡＴＰアーゼ 活性（Ｃおよび）を、可溶性分画（ＡおよびＣ）中および再懸濁ペレット（Ｂお よびＤ）中で測定した。

実験は少な（とも３回繰り返した。平均値±ＳＥを示す。

表４ トウモロコシ根由来のＰＭのＮＲ活性およびＨ”−ＡＴＰアーゼのトリトンＸ− １００−可溶化トリトン　Ｔ：ｐタンパク質　硝酸レダクターゼ活性０　０　０ 　０±０ ０．００５　０．１２５　０．０８４　１２８±１５，２０．０５　１．２５　 ０．１６　５４５±３９０．１　２．５　０．２　４６叶２５ Ｂ、膜ペレット ０　０　０．７６　０２±５．９ ０．００５　０．１２５　０．４９　１６４±９．８０．０５　１．２５　０． ４３　２１±１．８０．１　２．５　０．３０　１９±２．３０、可溶性分画 ０　０　０　０±０ ０．００５　０．１２５　０．００５　０±００．０５　１．２５　０．１２　 １４±１５０．１　２．５　０．１３６　２５±２，２Ｄ、膜ペレット ０　０　０．２７　２３±２．１ ０．００５　０．１２５　０．２０　３４．４±３．１０．０５　１．２５　０ ．１６　７５±１３．９実施例４　膜結合性トウモロコシＮＲ活性の特徴ＮＯ３ −を厳格に含まないよう維持した植物の根から単離したＰＭ分画中に存在する非 常に低い対照レベル以上である１ｍＭＮｏ”−により原形質膜ＮＲ活性を誘導し た。この低量のＮＲ活性は、本質的なものであるか、または系において検出する ことができない低レベルのＮＯ３−混入の結果であり得る。膜ＮＲ活性は不安定 であり；ＰＭ分画が０℃でプロテアーゼ阻害剤の存在下に維持されているときに ＰＭのＮＲ活性における時間依存性の減少が生じた。トリトンＸ−１００により 可溶化された原形質膜のＮＲ活性およびトウモロコシ根由来の可溶性ＮＲ活性は 、オオムギの葉から精製されたＮＲ活性に対して調製した抗血清により不活性化 した。抗−ＮＲ活性血清［Ｓｏｍｅｒｓ、Ｄ、Ａ、ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ ｏｌ、７２：９４９−９５２　（１９８３）］は、Ｄｒ、Ｒ。

Ｌ、　Ｗａｒｎｅｒ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　５ｔａｔｅ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ、　Ｐｕｌｌｍａｎ、　ＷＡ、の好意により提供された。

要約すると、潜在性ＮＲ活性は、水性２相分配により単離されたトウモロコシ− 根のＰＭ分画中で同定された。ＮＲ活性は、ＮａＣ１濃度をＩＭまで上昇させて 洗浄することによってはＰＭ小胞から除去されなかったが、トリトンＸ−１００ （０，０５％）により可溶化された。この結果は、硝酸塩を還元し得る全膜タン パク質がトウモロコシ根のＰＭ中に存在することを示す。

実施例５　膜結合性オオムギＮＲの活性に対する抗−ＮＲＩｇＧの効果 クロレラＮＲ抗血清から精製した抗−ＮＲＩｇＧフラグメントは、Ｎｏ３−の取 り込みを９０％以上阻害したが、オオムギ苗によるＮ。

２−の取り込みには影響を与えなかった（表５）。［クロレラＮＲはオオムギＮ Ｒよりも安定であり、純粋な調製物が得られたために抗原来の可溶性ＮＲとの交 差反応を示し、これはＮＲ活性の不活性化により証明された］。阻害効果は、部 分的にのみ可逆であり：新しい取り込み溶液中で３回洗浄し、１０分間の平衡期 間の後に対照の５０％まで取り込みが回復した。プレ免疫血清から単離したＩｇ Ｇフラグメントは、硝酸塩の取り込みを３６％阻害したが効果は洗浄により完全 に可逆的であった。

無傷の抗−ＮＲ分子はＮＯ３−の取り込みに影響を与えなかった（表５）が、そ の理由はおそらく切断されたフラグメント（５０ｋＤ）よりもそれらがはるかに 太きく（１５０ｋＤ）、根細胸壁を通じてＮＯ３−輸送部位に結合するためにた やすく動くことができないからであろう。酵母のＰＭＰｉ結合タンパク質に対す る無傷の抗体は、酵母細胞壁が除去されるかＩｇＧ分子がパパインで切断される までインビボでＰｉの取り込みに影響しなかった。これにより、Ｊｅａｎｊｅａ ｎら［Ｊｅａｎｊｅａｎ、　Ｒ，ら、　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１ ３７：２１５−２１９　（１９８４）］は、無傷のＩｇＧ分子は大き過ぎて酵母 細胞壁に浸透してＰｉ輸送体に結合することができなかったことを示唆している 。

抗−ＮＲＩｇＧフラグメントによるＮｏ３−の取り込みの阻害により、ＮＲもし くはＮｏ３−輸送に関与する抗原的に関連したタンパク質が、細胞質ゾルに対す る主要なイオン（およびＩｇＧフラグメント）の障壁であるＰＭ中に存在するこ とが示唆された。ＮＲがＰＭ中に存在するかどうかを決定するために、非常に豊 富なＰＭ分画を単離することが重要である。植物膜分画の水性２相分配は高純度 のＰＭ分画を単離するための便利な技術である［：Ｈｏｄｇｅｓ、　Ｔ、に、ら 、　１ｌｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１１８：４１−５４　（１９８６）；　 Ｌａｒｓｓｏｎ　Ｃ，、ｒ原形質膜Ｊ、　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ 　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｎｅｗ　５ｅｒｉｅｓ、　Ｖｏｌ、　１． 　ｒ細胞構成成分」。

ＨＦ　Ｌｉｎｋｓｅｎｓら編、　ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ 、　ｐｐ、８５−１０４　（１９８５）コ。

表５のために、上述のようにしてＮＯ３−で誘導されたもの（ＮＯ３−取り込み 実験）またはＮＯ２−で誘導されたもの（ＮＯ２−取り込み実験）を用いて取り 込みの実験を行った。０．５時間の取り込み実験についての平均の割合＋／−８ Ｅが報告されている。各々の実験を２回繰り返し、代表的なデータを示す。

表５ 硝酸塩および硝酸塩取り込みに対するＮＲ抗体の効果実験　ＮＯ３−取り込み率 　ＮＯ２−取り込み率処理順序　μモル／ｇｘｈ １、最初の取り込み率　３．３士領１　３．６±０．４２、プレ免疫ＩｇＧフラ グメント２．１±０．１　３．２±０．５３、洗浄後のプレ免疫ＩｇＧ フラグメント　３．０±０．０９　３．１±０．４４、無傷の抗−ＮＲ血清　３ ．３±０．２　３．０土０．２５、洗浄後の無傷の抗− ＮＲ血清　３．６９±０．１　３．３士１４６、抗−ＮＲＩｇＧフラグメント０ ．２５±領０８　３．２士領９７洗浄後の抗−ＮＲ 性 ２相分配されたオオムギ根のミクロソーム分画のマーカー酵素による評価を表６ に示す。トリトンＸ−１００の存在下および非存在下の各々においてミクロソー ム分画よりも２．３〜２．８倍豊富なＰＭ　ＡＴＰアーゼ活性が上相中に検出さ れた。相分配ＰＭ分画のＡＴＰアーゼのトリトンによる刺激については、良く確 認されている（表６）。Ｌａｒｓｓｏｎ　Ｃ，［ｒ原形質膜Ｊ、　Ｍｏｄｅｒｎ 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　Ｎｅｗ　５ｅｒｉ ｅｓ、　Ｖｏｌ、　１．　ｒ細胞構成成分Ｊ、　ＨＦ　Ｌｉｎｋｓｅｎｓら編、 　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、　ｐｐ、８５−１０４　（ １９８５）；　Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ、Ｒ，Ｐ、ら。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５：６９３−６９８　（１９８７）コによる 記載を参照。潜在性は、小胞がシールされていて表が外側になっていることを示 し、ＰＭのＡＴＰアーゼの加水分解部位に対するＡＴＰの接近可能性の増加に寄 与している。最近、さらにトリトンＸ−１，００は、おそら＜ＡＴＰアーゼ近く の脂質環境を変化することによりまたは阻害的組成物を除去することによりＰＭ 　ＡＴＰアーゼを活性化することが提唱されて来た［Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ、　Ｒ ，Ｐら、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５＋６９３−６９８　（１９８７ ）］。トノプラスト、ゴルジ体、ミトコンドリア、ＥＲ，ブラスチドおよび細胞 質に対するマーカー評価により、これらの活性の各々は２相法により顕著に減少 することが示された。特に重要であるのは、ＮＲは一般的に細胞質ゾルの酵素で あると考えられているから、上相分画中に細胞質の混入がないことであった［０ ａｋｓ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎにより、上相分画は主にＰＭからなるこ とが示されている。

表６において、上述のように膜分画を単離して酵素を試験した。

０．０１２５％トリトンＸ−１００（Ｔ：　Ｐ＝２５）の存在下および非存在下 （±Ｔ）でのバナデート感受性ＡＴＰアーゼ、ＮＯ３−感受性ＡＴＰアーセおよ び潜在性ＵＤＰアーゼ活性はμモルＰ　ｉ／ｍｇタンパク質Ｘ時間（時）て表す 。ＮＡＤＨＣｙｔ　ｃレダクターゼおよびＣｙｔｃオキシダーゼ活性はμモル／ ｍｇタンパク質Ｘ時間（分）で表す。ＴＰＩおよびＡＤＨ活性はそれぞれ、タン パク質１ｍｇ当たりのｎモルＮＡＤＨ酸化物もしくはμモルＮＡＤ還元物Ｘ時間 （分）で表す。各実験は少な（とも３回繰返し、代表的なデータを示す。

表６ 可溶性、ミクロソームおよび相分泥膜分画のマーカー酵素による評価 植物の分画可溶性ミクロソーム下相　上相感受性　ＰＭ　１１，８　２２．１　 ２１．２　５１．８ＡＴＰアーゼ（−丁） パナデート 感受性　ＰＭ　１４．３　３０！　２４．５　８４．５ＡＴＰアーゼ（十Ｔ） ＮＯ，−感受性　トップ ＡＴＰアーゼ　ラスト　０．７０　０．３１　０．９５　０潜在性ＵＤＰアーゼ ゴルジ　３．２　４　１０．４ＯＮＡＤＨＣｙｔ　ｃ レダクターゼ　ＥＲ６６２０３１９５５５，２Ｃｙｔ　ｃオキシダ　ミドコン ＴＰＩ　プラスチド ／細胞質　０．２７　２．４４　２　０ＡＤＨ細胞質　５０．１０００ 実施例７　オオムギ硝酸レダクターゼ活性の分布板可溶性および相分泥膜分画に おけるＮＲ活性の分布を表７に示す。ＮＲ活性のほとんどは可溶性であり、よ（ 確証されているが［０ａｋｓ、　Ａ、ら、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ＰＩ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、　３６：３４５−３６５　（１９８５）］　：　トトリ２の存在下で 試験したときには全ＮＲの約４％は膜分画と結合していた。トリトン存在下およ び非存在下の各々において、上相（ＰＭ）分画中のＮＲ活性はミクロソームの１ ．８〜５．４倍豊富であることが検出された（表７）。繰返し行ったＰＭ分画の 再懸濁および再ペレット化によりＮＲ活性を減少させることはながった。これら を合わせて考えると、マーカー酵素およびＮＲ活性から得た結果により、オオム ギ根のＮＲの重要な部分は非常に豊富なＰＭ分画中に存在することが示された。

反応混合物ヘノ０．１％トリトンＸ−１００（Ｔ：Ｐ＝１０）（７）添加は、膜 結合性のＮＲ特異活性をミクロソーム分画において６０倍、下相で１６倍および 上相で２０倍刺激したが、可溶性ＮＲ活性は係数１．７シか増加させなかった（ 表７）。ＮＲとは対照的に、上相ＰＭのＡＴＰアーゼ活性はトリトンにより刺激 されたが、下相ＰＭのＡＴＰアーゼ活性は影響を受けなかった（表６）。これら の結果は、水性ポリマーの２相系の下相における裏返しのＰＭ小胞部分の発見［ Ｌａｒｓｓｏｎ　Ｃ，、ｒ原形質膜ｊ、　：　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ。

Ｎｅｗ　５ｅｒｉｅｓ、　Ｖｏｌ、ｌ、「細胞構成成分Ｊ、　ＥＩＦ　Ｌｉｎｋ ｓｅｎｓら編、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　ｐｐ、 　８５−１０４　（１９８５）コと一致するものである。

トリトンＸ−１００は、酵素の加水分解部位が外側にあってＡＴＰに接近できな いために下相小胞のＰＭ　ＡＴＰアーゼを刺激しない［Ｌａｒｓｓｏｎ　Ｃ，、 ｒ原形質膜ｊ、：　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａ ｌｙｓｉｓ、　Ｎｅｗ　５ｅｒｉｅｓ、　Ｖｏｌ、　１．　ｒ細胞構成成分Ｊ、 　ＨＦ　Ｌｉｎｋｓｅｎｓら、　ｅｄｓ、、　ＳｐｒｉｎｇｅｒＪｅｒｌａｇ、 　Ｂｅｒｌｉｎ、ｐｐ、８５−１０４　（１９８５）；　Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ、 　Ｒ，Ｐ、ら、ヒ方におけるトリトン非存在下での顕著なＮＲ活性の欠如は、膜 結合性のＮＲＮｏ３−還元部位および／またはＮＡＤＨ酸化部位が直接ＰＭのど ちらの側にも露出していないことを示した。ＰＭ結合性のＮＲの大部分は０．１ ％トリトンＸ−１００（Ｔ：Ｐ＝２．５）により可溶化された（表８）。対照的 に、トリトンの同様の１度ではＰＭＡＴＰアーゼは可溶化されながった。これに より、膜結合性のＮＲの潜在性は膜からのＮＲの可溶化の機構であったことが示 唆される。

表７のために、上述のようにして膜分画を単離した。０．１％トリトンＸ−１０ ０（Ｔ：Ｐ＝１０）の存在下および非存在下で硝酸レダクターゼを試験した。実 験は少なくとも４回繰返し、代表的な実験から得たデータを示す。

表８のために、上述のようにして上相（ＰＭ）分画を単離し、トリトンＸ−１０ ０で処理した。０．１％トリトンＸ−１００の存在下で可溶性およびペレット分 画中のＮＲを試験した。実験は５回繰返し、代表的な実験から得られたデータを 示す。

表７ オオムギ根分画における硝酸レダクターゼ活性の分布硝酸レダクターゼ活性 １２に 上清”　６５　０．５６　１０，３００　２１．３００　２８４　５８６可溶性 ”　５９　０．５　１１，６００　１９．２００　３９４　６５１ミクロソ ーム　１３　０．４１　１３．９　８４０　２．６　１５７下相Ｉ　２．２　０ ，４８　７．１　１１６　６．７１１０上相ｒｉ　ｔ、１　０．３５　５．４　 １０９　１４　２８４ａ　１２，０００ｇ遠心から得た ｂ　１２０，０００ｇ遠心から得た ｃ　１２０．０００ｇ遠心から得たペレット表８ 処理　ペレット　可溶性 ｎモル／冨９タンパク質×ｈ −トリトンＸ−１００２１１０ ＋トリトンＸ−１００２６３０１ 実施例８　オオムギ硝酸レダクターゼと原形質膜の結合度ＮＲとＰＭの結合度を 測定するために、ＰＭ小胞を５００ｍＭＮａｃ１および１ｍＭＥＤＴＡ中で勢い 良く渦撹拌し、１５分間超音波処理し、次いで希釈後にペレット化した（表９） 。塩／キレート／超音波処理によりＮＲがＰＭ分画から除去されなかったことに より、結合は単にイオン性のものではなく、ＮＲはＰＭ脂質二重層としっかり結 合していることを示唆した。

ＰＭ結合性のＮＲ活性をさらに特徴付けるために、ＰＭ小胞を単離し、トリトン Ｘ−１００（Ｔ　：　Ｐ＝２．５）で処理してＮＲを膜ペレットから除き（表８ ）、次いでプレ免疫もしくは抗−ＮＲ血清と共にインキュベートした（表１０） 。ＰＭ結合性のＮＲは、ＮＲ抗血清により不活性化されたが、プレ免疫血清によ る影響は受けなかった。

二次元電気泳動により分離されたトリトン可溶化ＰＭ分画のウェスタン・プロッ ト上の単一のスポットは、ＮＲ抗血清調製物を用いて検出された。

ＮＲ抗血清によるＰＭ結合性のＮＲの不活性化およびＮＯ３−輸送阻害は、ＮＯ ３−輸送およびＰＭ結合性ＮＲが関係するかもしれないという可能性を提示する 。ＰＭ結合性のＮＲは、ＢｕｔＺおよびＪａｃｋｓ。

ｎ［Ｂｕｔｚ、　Ｒ，Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ、　１６：４ ０９−４１７　（１９７７）コにより提示されたＮＯ３−の輸送および還元の両 方を行う酵素複合体の一部であるかもしれない。これとは別に、ＮＯ３−輸送体 およびＰＭ結合性のＮＲは完全に分離しているが抗原性が関係した系であるかも しれない。Ｒｕｆｔｙら［Ｒｕｆｔｙ、Ｔ、ｌＦ、、Ｊｒ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、８２：６７５−６８０　（１９８６）］は最近、Ｎ Ｒ誘導系のためのレセプターおよび機能的ＮＲタンパク質の両方は根細胞のＰＭ と結合しているかもしれないことを提示している。

この結果により、抗−ＮＲＩｇＧフラグメントはＮＯ３−の取り込みを特異的に 阻害することが示された。ここに示されたように、ＰＭに局在化された膜結合性 ＮＲは、ＮＯ３−の取り込みを阻害した同じ抗体がさらにＰＭのＮＲを不活性化 することを示す。これらの結果により、オオムギ根のＰＭにおけるＮＯ３−輸送 とＮＯ３−還元の関連の可能性が示唆される。

表９のために、上述のように原形質膜分画を単離し、５００ｍＭＮａＣ１，１ｍ ＭＥＤＴＡを使用して、もしくは使用せずに洗浄し、超音波処理した。処理後、 再懸濁緩衝液でＰＭ分画を希釈し、ペレット化した。トリトンＸ−１００（Ｔ二 ｐ＝１０）の存在下で、得られたペレットをＮＲ活性について試験した。実験を ３回繰返し、代表的な実験から得たデータを示す。

表１０のために、上述のように硝酸レダクターゼをＰＭ分画から可溶化した。水 （１００μｍ）（＝抗血清）、プレ免疫血清、もしくは抗−ＮＲ抗血清をトリト ン可溶化ＰＭ分画（２００μｍ）に加えた。

分画を氷上に２時間維持し、次いでミクロ試験管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中、１ ２、ＯＯＯＲＰＭで５分間遠心した。上清の分画中の硝酸レダクターゼを試験し た。各実験を少な（とも４回繰返し、代表的なデータを示す。

表９ オオムギＰＭ分画の塩およびキレート洗浄＋ＮａＣ１，ＥＤＴＡ　２２４ 表１０ トリトンＸ−１００で可溶化したオオムギＰＭのＮＲの不活性化（ｎモル／ｍＡ ’Ｘｈ） 一抗血清　１５．８ ＋ブレ免疫血清　１６．０ 十抗−ＮＲ血清　０．０ 特定の具体例との関連において本発明を説明してきたが、これをさらに変更し得 ること、さらにいかなる変更、使用、もしくは以下に示す本発明の適用、すなわ ち一般に、本発明の本質および本発明の開示から発展した本発明の属する分野で 既知のもしくは通例の実施範囲内にあるものおよび本明細書中これより前に示さ れた本質的な特徴に適用され得るものおよび添付の請求の範囲内のものを本出願 が包含することを意図していることは理解されるであろう。

国際調査報告 ｌｍｗ＋ｔｓｔｍｖｌ　ＡＭ　１ｌｓＰＣ７／　［５９０（Ｘ、　３９７ＰＣＴ ／ＵＳ９０１０４３９７

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に天然不純物の混入がない原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性。
2. ２．該活性がトウモロコシ由来である請求項１に記載の原形質膜結合性の硝酸レ ダクターゼ活性。
3. ３．該活性がオオムギ由来である請求項１に記載の原形質膜結合性の硝酸レダク ターゼ活性。
4. ４．原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性をコードし得る遺伝子配列を含む組 換え分子。
5. ５．該原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性を発現する請求項４に記載の組換 え分子。
6. ６．該分子が細菌細胞において該活性を発現し得る請求項５に記載の組換え分子 。
7. ７．植物細胞において該分子が該活性を発現し得る請求項５に記載の組換え分子 。
8. ８．請求項４に記載の組換え分子を含有する細胞。
9. ９．該細胞が細菌細胞である請求項８に記載の細胞。
10. １０．該細胞が植物細胞である請求項８に記載の細胞。
11. １１．原形質膜結合性の硝酸レダクターゼ活性をコードし得る遺伝子配列を含む 組換え分子を含有する植物。