KR100217517B1 - 살충성 단백질-인코우딩 유전자, 이 유전자로 형질전환된 벼과 식물 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
유전자는 벼과 식물의 유전자의 코돈 이용과 정합되게 코돈 이용을 하도록 변이된 SEQ ID NO : 1 로 표시되는 염기 서열을 가진 살충성 단백질을 인코우딩하는 합성 유전자, 상기 구조 유전자를 함유하는 발현벡터, 벼과 유래의 원형질체를 벡터로 형질 전환시켜 벼의 배양 세포 존재하에 액체 배지중에서 원형질체를 배양하여 군락을 형성하고 이 군락으로 부터 벼과 식물을 재생하는 단계로 되어 있는 재조합 벼과 식물 제조 방법 및 해충에 대하여 내성을 가진 재조합 벼과 식물을 제공한다.
Description
제1도는 PCR (폴리머라아제 연쇄 반응) 에 의한 2 중 스트랜드 DNA 합성의 개략도.
제2도는 올리고뉴클레오티드로 부터의 PCR 에 의한 2 중 스트랜드 DNA 합성의 개략도.
제3도는 올리고뉴클레오티드로 부터 PCR 에 의한 2 중 스트랜드 DNA 합성의 개략도.
제4도는 PCR 에 사용된 프라이머 (세그먼트 1) 의 염기서열.
제5도는 PCR 에 사용된 프라이머 (세그먼트 5) 의 염기서열.
제6도는 PCR 에 사용된 프라이머 (세그먼트 4) 의 염기서열.
제7도는 PCR 에 사용된 프라이머 (세그먼트 2) 의 염기서열.
제8도는 PCR 에 사용된 프라이머 (세그먼트 6) 의 염기서열.
제9도는 PCR 에 사용된 프라이머 (세그먼트 3) 의 염기서열.
제10도는 플라스미드 pMCSC8, pMCSA8 및 pMCSK8 의 구성시 치환을 위해 사용된 클로닝 부위.
제11도는 플라스미드 pBT1291 구성의 개략도.
제12도는 형질전환체를 스크리이닝하기 위하여 PCR 생성물을 전기 영동처리하여 얻은 이동패턴.
제13도는 형질전환에 사용된 유전자를 서어던 잡종 번식법으로 검출하여 얻은 이동 패턴.
제14도는 형질전환에 사용된 유전자의 mRNA 를 노오던 잡종 번식법으로 검출하여 얻는 이동 패턴.
제15도는 점돌연변이성 벼 잎에서 발현된 B.t. 독소 단백질을 웨스턴 블로팅법으로 검출하여 얻은 이동 패턴.
제16도는 벼 (Oriza) 에서 분리된 유전자의 코돈 이용.
제17도는 벼잎에서 고도로 발현된 것으로 보이는 유전자의 코돈이용.
제18도는 서열번호 1 (SEQ ID NO : 1) 의 염기서열을 가진 합성 유전자의 코돈 이용.
제19도는 2 세대 형질전환체의 PCR 생성물을 전기 영동하여 얻은 이동 패턴.
제20도는 2 세대 (R1) 잎에서 발현된 B.t. 독소 단백질을 웨스턴 블로팅법으로 검출하여 얻은 이동 패턴.
제21도는 벼 (Oriza) 유전자, 벼잎에서 고도로 발현된 것으로 보이는 유전자, 서열번호 1 의 염기서열을 가진 합성 유전자 및 B.t. 독소에 각의 아미노산을 인코우딩하는 천연 유전자에서 관찰된 각각의 아미노산에 대한 코돈 이용의 선열.
제22도는 벼 (Oriza) 유전자, 벼잎에서 고도로 발현된 것으로 보이는 유전자, 서열번호 1 의 염기 서열을 가진 합성 유전자 및 B.t. 독소에 각각의 아미노산 (단 메티오닌과 트립토판은 제외) 을 인코우딩하는 천연 유전자에서 관찰된 각각의 아미노산에 대한 코돈 XXC/G 이용의 선열.
본 발명은 살충성 단백질을 인코우딩 (encoding) 하는 합성 유전자, 이 유전자로 형질전환된 재조합 벼과 (科) 식물 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 본 발명은 살충성 박테리아로 알려진 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠루스타키 HD-1 (Bacillus thuringiensis var. kurustaki HD-1) 유래의 결정성 단백질 (δ-엔도톡신) 유사체를 인코우딩하는 합성 유전자 및 이 합성 유전자로 식물을 형질전환시켜 적당한 배지중에서 생장시키는 곤충 및/ 또는 해충에 내성을 가진 벼과 식물 제조 방법에 관한 것이다.
근래에는 많은 수의 연구자들이 활성 성분으로서 살충성 박테리아 또는 박테리아 생성물을 이용한 박테리아성 살충제에 대하여 많은 연구를 하고 있다.
예를 들자면 바실루스 투린지엔시스 (이하 간단히 " B.t. " 라 한다) 는 α- , β-및 γ-엑소톡신과 δ-엔도톡신 등의 각종 독소를 생성하는 것으로 알려진 그람 양성균인데 여러가지 해충에 대하여 독성이 극히 강하다 (Angus, T.A., Nature 174 : 545, 1954). 이들 박테리아 독소중에서 포자 형성기 도중 B.t. 에 의해 생긴 δ-엔도톡신이 결정성 단백질 개재물로서 관심의 촛점이 되고 있는데, 현재 실용화되어 있다.
여러가지 B.t. 균주가 좁은 범위의 숙주 스펙트럼에 대해서도 선택성을 크게 하고 인간을 비롯한 동물에게 무해하며 환경적으로도 허용되는 살충제의 활성 성분으로 적합한 특성을 가진 결정성 단백질을 생성하는 것으로 알려져 있다. B.t. 독소의 숙주 스펙트럼에 포함되는 것으로는 레피돕테라 (Lepidoptera), 딥테라 (Diptera) 및 콜레옵테라 (Coleoptera) 에 속하는 여러가지 수많은 곤충들이 있다. B.t. 균주의 박테리아를 이들이 생성하는 결정성 단백질의 숙주 스펙트럼에 따라 다섯가지로 분류하고 있다.
이러한 결정성 단백질의 유전 공학에 관한 여러가지 연구 결과 독성 단백질을 인코우딩하는 유전자에 의하여 형질전환된 곤충에 내성 (耐性) 인 식물 제조가 가능하게 되었다.
예를 들자면 Vaeck 등 (Nature 328 : 33-37, 1987) (Plant Genetic Systems Inc., Belgium) 은 B.t 유래의 살충성 단백질을 인코우딩하는 유전자를 담배 (煙草) 게놈 (genome) 에 통합함으로써 곤충에 내성이 있는 담배 (Nicotiana) 를 제조하는데 성공하였다.
보고서에 의하면 이 유전자의 약 5'- 절반을 사용하여 얻은 발현은 유전자 전체를 사용하여 얻은 것보다 훨씬 효율적이었다.
Fischhoff 등 (Bio/Technology 5 : 807813 , 1987 , Monsanto Inc.) 은 B.t. 의 살충성 단백질을 인코우딩하는 유전자에 의하여 형질전환된 재조합 토마토 (Lycopersicon) 의 제조에 성공하였다.
그러나 이들 두가지 보고서는 형질전환된 유전자의 발현 생성물을 웨스턴 블로팅법 (Western blotting) 으로 검출하는데 실패하였는데, 이로 부터 천연산 유전자로서는 충분한 발현을 얻기가 거의 불가능하다는 것을 시사하는 것이다.
유전자 번역에 관하여 흥미로운 것은 주어진 아미노산의 번역활성은 조직사이마다 달라진다는 점이다. 따라서 글루타민, 류우신 및 알라닌 등이 풍부한 저장 단백질인 제인 (zein) 을 활발하게 합성하는 옥수수 (Trysacum) 의 배유 (胚乳 : albumen) 중의 tRNA 는 옥수수 씨눈 중의 tRNA 에 비하여 이들 아미노산을 인코우딩하는 유전자의 번역에 보다 많이 참여할 수 있다. 즉 이것은 이 조직중에서 고도로 발현되어야만 하는 제인등과 같은 소요의 단백질을 인코우딩하는 유전자의 적정한 번역을 촉진하는 방식으로 특정한 조직중의 tRNA 가 구성된다는 것을 의미한다.
Wilbur 등 (Plantphysiol, 92 : 111 , 1990) 은 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물등의 고급 식물과 박테리아 사이에 코돈 이용의 차이가 있다고 지적하고 있다.
따라서 XCG 및 XUA 등의 코돈에 대한 코돈 이용은 쌍떡잎 식물에서는 각각 1.8및 3.2이고 외떡잎 식물에서는 각각 6.3및 1.4이다. XXC 및 XXG 등의 코돈에 대한 종합적인 코돈 이용 (이하 " 코돈 XXC/G 이용 " 이라한다. 여기서 두개의 X 중 각각은 A,G,C 및 T 로 된 그룹으로 부터 독립적으로 선택되는 것이다) 은 쌍떡잎 식물에서는 45이고 외떡잎 식물에서는 73.5이다. 여기서 잘 정립된 것은 번역 가능한 유전자중의 GC 함량은 벼과 식물 (예 : 벼) 같은 외떡잎 식물이 쌍떡잎 식물의 경우보다 많다는 점이다.
박테리아에 있어서 코돈 이용은 균주에 따라 달라진다. 예를 들자면 코돈 XGG, XUA 및 XXC/G 등에 대한 코돈 이용은 B.t. 변종 쿠루스타키 HD-1 [ cry IA(b) ] 에 의해 생긴 B.t. 독소의 하나인 δ-엔도톡신을 인코우딩하는 유전자에 있어서 각각 10.4, 3.3및 24.4이다.
이들 사실로부터 시사하는 점은 식물 조직중의 tRNA 는 세균성 유전자의 충분한 번역을 할 수 없다는 것이다.
근래에 와서 Prederick (Bio/Technology 8 : 930-942, 1990 ) (Monsanto Inc.) 은 3'-절반이 결실(deletion) 되어 코돈이 변화된 개량 유전자에 의해 형질 전환된 무명 (Gossypium) 에 있어서 B.t. 독소를 고도로 발현시킬 수 있다는 것을 맨 먼저 보고하였다. 즉 B.t. 유래의 δ-엔도톡신을 인코우딩하는 유전자를 화학적으로 합성하여 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모우터 (Promoter) (이 프로모우터에는 35S 프로모우터의 인핸서 (enhancer) 영역을 함유함) 의 하류쪽에다 결찰 (ligation)하고, 수득한 유전자를 사용하여 아그로박테리움(Agrobacterium) 에 의해 형질전환시켰다. 합성 유전자는 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠루스타키 HD-1 [cry IA(b)] 와 HD-73 [cry IA(c)] 의 유전자로 부터 제조하였다. 합성 유전자에 의하여 B.t. 독소를 고도로 발현시켰는데 (잎중의 가용성 단백질의 약 0.050.1), 이것은 천연 B.t. 독소를 인코우딩하는 유전자를 사용하여 얻은 것보다 약 50100 배 정도되는 발현율이다. 코튼 보울 워엄 (cotton-ball worm) 을 사용하여 생물 검정법으로 살충 활성을 측정한 결과 약 70100의 방어활성이 관찰되었다.
Frederick 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 3324-3328, 1991 ) 은 코돈을 바꾸어 변이시켜 식물 유전자의 발현에 효과가 있는 세균성 유전자에 대하여 영역별로 검토를 시도하였다.
이들은 변이될 영역을 9 개소를 선택하여 이들 개소중 일부 또는 전부를 변이시키고 아그로박테리움을 사용하여 각각을 담배와 토마토 식물로 형질전환시켜 여러가지 유전자를 만들었다.
9 개소의 변이된 영역을 가지는 유전자로 부터 나타나는 발현효율을 100라 하면 5'-말단으로 부터 700 bp 이내에서 4 개의 변이영역을 가진 유전자는 약 80의 효율을 나타내었다.
한편 3'-절반 영역이 변이되는 유전자에 의하여 형질전환된 식물에서는 B.t. 독소가 전혀 검출되지 않았다.
5'-말단으로 부터 246283 bp 사이의 영역(들)에서 변이를 가진 유전자의 경우에서는 발현효율이 최고이었는데, 이것은 9 개의 변이된 영역을 가진 유전자에서 나타나는 경우의 5380이었다.
본 발명에 앞서 위에 나온 바와 같이 Monsanto 사는 무명, 담배, 토마토 등의 식물에서 세균성 단백질 (B.t. 단백질) 의 고발현율은 코돈 이용의 변이를 통해 달성할 수 있다는 것을 보여주었다.
Lubrizol Genetics 사에서는 살충성 결정질 단백질을 인코우딩하는 합성유전자(일본국 특허 공개 공보 제186989/1990호) 를 개시 (開示) 하였는데, 이 공보에는 코돈이용에 관하여 언급되어 있다. 그러나 예시된 식물은 단지 담배뿐이다.
위에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 앞서 식물에서의 세균성 독소 발현에 대하여는 쌍떡잎 식물에서만 보고되어 있고 살충성 결정질 단백질의 검출 가능한 양이 외떡잎 식물에서 발현되었다는 보고는 아직까지 없었다.
이들 사실로 부터 식물에서 B.t. 독소 인코우딩 유전자의 발현을 위해서는 3'-절반을 결실시켜 식물유전자와 정합 (整合) 되게 코돈 이용을 함으로써 세균성 유전자를 변이시켜야 하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있다.
이러한 사정하에서 본 발명자들은 철저히 연구한 결과 벼과 식물에서 고도로 발현시킬 수 있는 B.t. 독소의 유사체를 인코우딩하는 합성 유전자 제조에 최초로 성공하였다.
즉, 본 발명은 벼과 식물의 유전자에 정합(整合) 하는 코돈 이용을 하도록 변이된 염기서열을 가지며 세균성-살충성 단백질을 인코우딩하는 합성 유전자와 이 유전자를 가진 발현 벡터와, 이 벡터로 형질전환된 벼과 식물 및 그 제조 방법을 제공한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 형질전환되는 식물의 유전자와 합성 유전자 사이에서의 코돈 이용의 정합성은 상이한 코돈 이용의 비율 () 로 나타내어진다.
본 발명은 오리자 (Oriza), 트리티컴 (Triticum), 호르데움 (Hordeum), 세칼루 (Secalu) 및 에쉬노클로아 (Eschinochloa) 등의 그라미네에 (Gramineae) 에 속하는 식물, 바람직하게는 오리자 (벼과 식물) 에서의 합성 유전자의 발현에 관한 것이다.
본 발명의 합성 유전자는 B.t. 로 간단히 표현되는 바실루스 투린지엔시스 변종 쿠루스타키 HD-1 유래의 δ-엔도톡신 인코우딩 유전자로 부터 제조하였다.
" 재조합 식물 " 또는 " 형질전환된 식물 " 이란 용어는 형질전환 결과 해충에 대하여 저항을 가질 수 있는 본 발명의 합성 유전자를 가진 식물을 뜻한다.
" B.t. 독소 " 란 용어는 B.t. 유래의 독성 단백질을 뜻하는데 본 명세서에서 B.t. 독소는 B.t. 에 의해 생성된 천연산 독성 단백질뿐만 아니라 본 발명의 합성 유전자에 의해 인코우딩된 단백질까지 포함하여 일컫는 것인데, 이들에 의해 식물로 형질전환되어 발현되었을 경우 식물 해충 내성을 발휘한다.
" 천연 B.t. 유전자 " 란 B.t. 독소를 인코우딩하는 천연산 유전자를 뜻한다.
본 발명의 유전자는 천연 B.t. 독소와 기능적으로 균등한 단백질을 인코우딩하는 방식으로 화학적 및 효소적 방법을 이용하여 제조하였다. 이 유전자에는 약 200400 bp 마다 6 bp 제한부위를 삽입하여 변이를 더욱 용이하게 하도록 한 것이다. 이들 부위로 인하여 숙주 특이성등의 원인이 되는 영역을 기타 영역으로 교체하기가 용이해진다. 본 발명의 유전자의 합성은 코우딩된 아미노산에는 아무런 영향을 주는 일이 없이 각 코돈의 염기 성분을 식물에 적합한 염기서열로 변화시켜 줌으로써 달성할 수 있다. 변이는 천연 B.t. 유전자의 코돈 이용을 벼과 식물의 유전자의 코돈 이용에 적합하도록 하기 위해 실시한다. 적당한 코돈 이용은 다음과 같은 코돈 이용을 고려하여 결정해야 한다.
(가) 세가지 정지 코돈 (TAA, TAG 및 TGA) 을 제외한 모두 64 가지의 코돈중에서 61 가지 코돈에 대한 코돈 이용.
(나) 단지 코돈 하나에 의해서만 인코우딩되는 메티오닌과 트립토판을 제외한 모두 20 가지의 아미노산중에서 18 가지 아미노산 각각에 대한 코돈 이용.
(다) 이들 18 가지 아미노산에 대한 코돈 XXC/G 이용.
이 경우에 있어서 외떡잎 식물과 쌍떡잎 식물의 코돈 XXC/G 이용시의 차이를 고려해야 한다.
본 발명의 합성 유전자를 잎과 같은 특정 식물 조직에서 고도로 발현시키고자 할 경우에는 조직마다 적정 코돈 이용이 각기 달라지기 때문에 잎에서 고도로 발현되는 유전자의 코돈 이용과 합성 유전자의 코돈 이용을 정합시키는 것이 중요하다. 이렇게 하자면 잎에서 고도로 발현되는 유전자의 코돈 이용 (가), (나) 및 (다) 에 입각하여 합성 유전자의 염기서열을 디자인 함으로써 성취할 수 있다.
또한 바람직한 것은 각 아미노산을 인코우딩하는 코돈을 합성 유전자 전체에 걸쳐 균일하게 분포시켜야 하는 점이다.
합성 유전자에 결합되는 제한부위는 DNA 세그먼트 (segment) 의 결합부위로 작용하는데, 이것은 B.t. 변종 쿠루스타키 HD-1 [cry IA(b)] 의 천연 단백질의 아미노산 서열로 부터 예측되는 염기 서열중에서 발견되는 것들 중에서 선택한다. (J. Bac. 166 : 801811 , 1986). 형질 전환시킬 목적식물이 벼 (Oriza) 이면 아래와 같이 결정방법에 따라 각종 벼 조직에 있는 공지의 유전자의 코돈 이용을 고려하여 염기 서열을 변경시킨다.
1) 아래의 (라), (마) 및 (바)에 따라 얻는 벼의 각종 조직의 유전자에 있어서 코돈 이용의 평균값을 결정한다.
(라) 세가지 정지코돈을 제외한 모두 64 가지 코돈중에서 61 가지 코돈에 대한 코돈 이용 (제16도).
(마) 한가지 코돈에 의하여 인코우딩되는 메티오닌과 트립토판을 제외한 모두 20 가지 아미노산중에서 18 가지 아미노산 각각에 대한 코돈 이용 (제21도, 벼)
(바) 이들 18 가지 아미노산에 대한 코돈 XXC/G 이용 (제22도, 벼)
2) 벼 잎에서 고도로 발현되는 것으로 생각되는 유전자의 코돈이용을 아래와 같이 결정한다.
(사) 세가지 정지 코돈을 제외한 모두 64 가지 코돈중에서 61 가지 코돈의 코돈 이용 (제17도).
(아) 한가지 코돈에 의하여 인코우딩되는 메티오닌과 트립토판을 제외한 모두 20 가지 아미노산중에서 18 가지 아미노산 각각에 대한 코돈 이용 (제21도, 벼잎).
(자) 위의 18 가지 아미노산에 대한 코돈 XXC/G 이용 (제22도, 벼잎).
코돈 결정을 위해서 추천할 수 있는 것은 다음 사항을 고려하는 것이다. 즉 B.t. δ-엔도톡신을 인코우딩하는 유전자의 염기 서열을 변경시켜 각 아미노산에 대한 코돈이용을 위의 (라) 에서 얻는 벼 유전자 (제16도) 의 경우에 대하여, 약 ±4의 비율로 하여 바람직하게는 위의 (마) 에서 얻는 것 (제21도, 벼) 에 대하여 40의 비율로 적용하도록 한다. 더욱 바람직한 것은 cry IA(b) 의 경우에 있어서 아르기닌, 류우신, 세린, 글리신, 트레오닌, 발린, 이소류우신, 아스파라긴, 글루탐산 및 페닐알라닌을 비롯한 10 가지 아미노산 등의 B.t. 독소 우성인 아미노산에 대한 코돈 이용을 ±25의 비율로 위의 (바) 에서 얻는 코돈이용 (제22도, 벼) 에 적용한다.
" B.t. 독소 우성 아미노산 " 이란 B.t. 독소중의 함량에 대하여 아미노산이 상위 위치에 랭크 (rank) 되는 것을 뜻한다. 본 발명의 목적상 가장 바람직한 것은 코돈을 선택함에 있어서 코돈 이용을 (사) (제17도), (아) (제21도, 벼잎) 및 (자) (제22도, 벼잎) 에서 얻는 것들에 될 수 있는 한 근접하도록 하는 것이다.
각각의 아미노산을 인코우딩하는 코돈을 앞서 나온 합성 유전자 전체에 대하여 균일하게 분포하도록 하는 것이 좋다.
이렇게 디자인한 합성 유전자의 예가 서열번호 1 (SEQ ID NO : 1) 에 나와 있다. 제18도는 64 가지 코돈 (정지 코돈은 제외) 중에서 61 가지 코돈에 대한 코돈 이용을 나타낸 것이고, 제21도 (BTHsyn) 는 18 가지 아미노산 (메티오닌과 트립토판은 제외) 각각에 대한 코돈 이용을 나타낸 것이며, 제22도 (BTHsyn) 는 SEQ ID NO : 1 의 합성 유전자의 18 가지 아미노산 각각에 대한 코돈 XXC/G 이용을 나타낸 것이다.
합성 유전자와 벼의 천연 유전자 사이에 있어서 정지 코돈을 제외한 61 가지 코돈에 대한 코돈 이용을 비교해 본 결과 알 수 있는 것은 아르기닌을 인코우딩하는 AAC (3.51) 를 제외한 모든 코돈에 대하여 그 차이는 약 2정도라는 점이다. 코돈 이용은 벼잎에서 고도로 발현되는 유전자와 합성 유전자 사이에 비교를 했을때 훨씬 일치하고 있었다.
즉, 이 차이는 아스파라긴을 인코우딩하는 AAC 에 대해서는 최고 (3.33) 이었고 기타는 극히 양호하게 일치하였는데, 이로 부터 알 수 있는 것은 합성 유전자의 코돈 이용은 벼잎에 함유된 유전자의 코돈 이용에 보다 근접되게 부합되고 있다는 점이다.
메티오닌과 트립토판을 제외한 모두 20 가지 아미노산중에서 18 가지 아미노산 각각에 대한 코돈 이용에 대하여 비교를 해본 결과 거의 모든 코돈 이용이 프롤린을 인코우딩하는 CCG (36.9) 를 제외하고는 그 차이가 약 20로서 극히 양호하게 일치하였다. 벼잎에서 고도로 발현되는 유전자에 대하여 비교했을 경우의 코돈 이용은 훨씬 일치하게 되었다. 즉, 그 차이는 리신을 인코우딩하는 AAG 에 대해서는 최고 (37) 이었고 기타는 양호하게 일치하였는데, 이로 부터 알 수 있는 것은 합성 유전자의 코돈 이용은 벼잎에 함유된 유전자의 코돈이용에 보다 근접되게 부합되고 있다는 점이다.
아르기닌, 류우신, 세린, 글리신, 트레오닌, 발린, 이소류우신, 아스파라긴, 글루탐산 및 페닐알라닌을 비롯한 B.t. 독소 우성인 10 가지 아미노산 각각을 인코우딩하는 코돈에 대하여 코돈 이용을 비교해 보기도 하였다. 한가지 아미노산을 제외하고는 (세린의 경우 24.2) 그 차이가 약 15로서 모든 아미노산에 있어서 극히 양호하게 일치함을 관찰할 수 있었다. 합성 유전자의 이들 아미노산에 대한 코돈 XXC/G 이용과 벼잎에서 고도로 발현되는 유전자의 경우를 비교해본 결과, 합성 유전자의 경우가 한가지만을 제외하고는 (세린의 경우 13.2) 벼잎에서 발현되는 유전자의 경우에 대해 근접함을 알 수 있었다.
이 기술분야의 당업자라면 쉽사리 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 살충성 단백질을 인코우딩하는 DNA 는 뉴클레오티드 첨가, 결실 또는 치환등의 종래 방법으로 쉽사리 변이시킬 수 있으므로, 결국 동일 내지 향상된 활성을 가진 살충성 단백질을 인코우딩하는 DNA 유도체를 얻게 된다. 따라서 본 발명에서는 종래 방법으로 얻은 변이 유전자 (modified gene) 를 제공한다.
위에 나온 바와 같이 디자인된 유전자는 종래 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들자면 아래에 나온 방법과 제1도 내지 제3도에 있는 바와 같이 약 20100 bp 되는 단일 스트랜드의 올리고뉴클레오티드를 합성하고 PCR(polymerase chain reaction : 폴리머라아제 연쇄반응) 에 의해 각 세그먼트를 결합시켜 2 중 스트랜드 DNA 를 얻는다 (Am. J. Hum. Genet. 37 : 172, 1989).
방법 A : 이 방법은 제1도에 개략적으로 나와 있는 바와 같이 기본적인 방법이다. 이 방법에 의하면 각 쌍이 3'-말단에 약 10 bp 의 상보서열 (complementarg sequence) 을 가진 한쌍의 70 nt 올리고뉴클레오티드를 합성하여 표준 PCR 용 반응 혼합물중에서 반응시켜 필요로 하는 2 중 스트랜드 DNA 를 제조할 수 있다.
방법 B : 이 방법은 제2도에 개략적으로 나와 있는 바와 같이 기본 방법 A 의 응용이다. 방법 B 에 의하면 370 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 다음과 같이 제조할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 3 및 4 를 위의 방법 A 와 마찬가지로 처리하여 130 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 제조한다. 수득한 DNA 를 PCR 에 의하여 올리고뉴클레오티드 2 및 5 와 반응시키고, 수득한 DNA 와 올리고뉴클레오티드 1 및 6 을 PCR 로 처리하여 필요로 하는 2 중 스트랜드 DNA 를 얻는다. 이 방법은 제한부위가 멀리 떨어져 있는 길이가 긴 2중 스트랜드 DNA 를 쉽사리 얻을 수 있다는데 그 장점이 있다.
방법 C : 이 방법은 제3도에 개략적으로 나와 있는 바와 같이 기본 방법 A 의 또 다른 응용이다. 방법 C 에 의하면, 제3도에 있는 것과 같이 제한부위를 가지는 260 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 다음과 같이 제조할 수 있다.
즉, 올리고뉴클레오티드 쌍 1 및 2 와, 3 및 4 을 방법 A 와 마찬가지 방법으로 처리하여 130 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 제조한다. 수득한 DNA 를 각 단편들이 접하고 있는 제한부위에 상응한 제한 효소로 처리한 다음 리가아제로 결찰시킨다. 생성물의 일부와 올리고뉴클레오티드 1 및 4 를 다시 PCR 처리하여 필요로 하는 2 중 스트랜드 DNA 를 얻는다.
이 방법은 개개의 짧은 세그먼트를 클로닝할 필요가 없고 효소적으로 결찰시킨 DNA 의 증폭을 신속히 진행시킬 수 있기 때문에 필요로 하는 DNA 의 클로닝을 용이하게 할 수 있다는 장점을 가지고 있다.
이들 방법은 소요의 DNA 제조에 적합하겠으나 이들 방법에 한정되는 것은 아니고 방법 B 와 방법 C 를 병용한 방법도 이용할 수 있다.
방법 B 및/또는 C 에 따라 제조한 2 중 스트랜드 DNA 세그먼트 각각을 복수개의 클로닝 부위를 가진 적당한 클로닝 벡터에다 클로닝한다. 적당한 벡터의 예로서는 기존의 벡터의 클로닝 부위를 변경시켜 얻는 ColE1 플라스미드 및 그 유사체로 부터 유래되는 에쉐리히아 콜리 (Escherichia coli) 유래의 벡터, 예컨대 pUC18, 19 (Gene 33 : 103, 1985 ), pHSG298, 299, 399 (Gene 61 : 63, 1987), pBSIISK +/-, pBSIISK +/- (Stratagene Inc.)] 등이 있다.
클로닝된 세그먼트의 서열은 Sanger 등의 디데옥시법 (dideoxy method) (Proc. Natl. Acad. Sci. 74 : 5463-5467, 1977) 으로 확인할 수 있다. 양말단에 제한부위를 가진 각각의 DNA 세그먼트를 상응한 제한효소로 처리하여 T4 DNA 리가아제 존재하에 결찰시켜 B.t. 독소를 인코우딩하는 완전한 길이의 구조 유전자를 얻는다. B.t. 독소 발현을 위하여 벼과 식물의 구조 유전자 발현에 적합한 프로모우터와 터미네이터 (terminator), 필요한 경우 인트론 (intron) 을 가진 플라스미드 벡터에다 삽입한다. 프로모우터는 식물에서 기능을 발휘하는 것으로 알려진 것들 중에서 선택하는데, 이러한 프로모우터의 예로서는 꽃양배추 모자이크 바이러스로 부터 유래되는 프로모우터, 즉 CaMV35S (pB1221 : EMBO. J. 6 : 39013907, 1987), rbcS (ribulose 1.5-bisphosphate carboxylase), Cab (클로로필 a/b 결합 단백질) (Science 244 : 174, 1989) 등이 있다.
터미네이터의 예로서는 꽃 양배추 모자이크 바이러스, NOS (nopaline synthetase) 등에서 유래되는 것들이 있다. 구조 유전자와 프로모우터 사이에서 인트론 (들) 을 함유하는 벡터 역시 고발현 벡터로 사용할 수 있다. 인트론의 예로서는 옥수수 Adh1 의 제1차 인트론 (알코올 수소 이탈 효소 유전자 : Genes & Development 1 : 1183 - 1200, 1987), 아주까리 기름식물 Cat 의 제1차 인트론 (카탈라아제 유전자 : Tanaka, et al. Nucleic Acids Research 18 : 6767 - 6770, 1990) 등이 있다.
본 발명의 목적상 발현 벡터에는 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자, 네오마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라아제 유전자, β-글루쿠로니다아제 유전자등으로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 두가지 이상의 외래 유전자를 함유하는 것이 바람직한데, 이들 외래 유전자 중의 하나는 필요로 하는 군락 (colony) 선택의 기준이 되는 선택 마아커 (selective marker) 로 작용한다. 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자가 바람직한 선택 마아커 유전자이다.
선택 마아커 및 기타를 인코우딩하는 외래 유전자는 형질전환시에 동시에 사용되는 별도의 벡터 또는 동일한 발현 벡터중에 함유되어도 좋다.
본 발명의 벡터를 사용하여 벼과 식물을 형질전환시킨다. 형질전환은 일반적으로 다음 단계로 되어 있다.
주어진 벼과 식물로 부터 원형질체 (Protoplast) 를 얻어 액상 매체중에 현탁시킨다. 발현 벡터의 원형질체로의 형질전환은 종래 방법, 예컨대 전기 펄스 처리법으로 실시할 수 있다. 수득한 원형질체를 배양된 벼과 세포를 함유하는 배지중에서 배양하여 군락을 얻는다. 필요로 하는 군락을 선택하여 생장시켜 재조합 생성물로서의 식물을 재생시킨다. (Shimamoto et al , Nature 337 : 274276, 1989). 이 방법을 이하 구체적으로 설명한다.
원형질체는 기존의 벼 품종, 즉 닙퐁바레 (NIPPONBARE), 코시히카리 (KOSHIHIKARI), 사사니시키 (SARANISHIKI) 등 중에서 한가지를 사용하여 제조할 수 있다. 성숙된 종자 또는 미숙 종자, 잎집 (leaf sheath) 및 /또는 뿌리 등의 식물 조직으로 부터 제조한 세포 현탁액 또는 유합조직 (callus) 을 액상 배지 중에서 배양시켜 셀룰라아제 등과 같은 세포벽을 분해할 수 있는 효소를 함유한 용액중에서 050 spm, 2530℃ 의 조건하에 약 316 시간 처리한다. 효소 처리를 한 후 배양액을 여과하여 소화되지 아니한 물질을 분리한다. 여액에 25 배 체적의 KMC 용액 (0.1187M 염화 칼륨, 0.0817M 염화 마그네슘, 0.085M 염화 칼슘, pH 6.0) (Theor. Appl. Genet. 53 : 5763, 1978) 을 가하고 원심분리하여 정제된 원형질체를 얻는다.
형질 전환은 예컨대 위에 나온 바와 같이 하여 제조한 구조 유전자를 함유하는 발현 벡터 1100 ㎍/㎖ 와 식물로 부터 제조한 원형질체 (210) × 106/㎖ 를 액상매체, 즉, 30200 mM 염화 칼슘, 050 mM 염화 마그네슘 및 0.20.6 M 만니톨을 함유한 완충액 중에 현탁시키고 여기에 전기 펄스를 가하여 실시할 수 있다.
바람직하게는 전기 펄스 처리법은 일본국 특허 공개 공보 제181791/1989호에 기재되어 있는 1001000 μF 콘덴서를 이용한 직류 펄스 (초기 전압 : 2001000 V/㎝, 펄스폭 : 약 150 msec) 에 의하여 실시한다. 펄스 처리된 원형질체를 R2 배지 (Plant. Cell. Puysiol. 14 : 1113, 1973) 의 무기성분들의 혼합물과 MS 배지 (Murashige and Skoog, 15 : 473 - 497, 1962) 의 비타민 혼합액을 함유하는 액체 배지 (R2/MS) 또는 MS 배지에 현탁시키는데, 이 배지에는 질소원으로서 질산 칼륨 0.20.5를 함유하는 것이 바람직하다. 이 현탁액을 약 1.03.0의 아가로오스를 함유하는 MS 배지 또는 R2/MS 배지 등과 동일량 혼합하여 페트리 접시에 신속하게 얇게 확산시켜 응고시킨다. 고체 배지중의 원형질체의 최종 농도는 약 (550) × 105/㎖ 인 것이 바람직하다.
고화된 아가로오스를 약 520 ㎜ 크기의 세그먼트로 절단하여 어두운 곳에서 2327℃ 의 액상 배지중에서 완만하게 진탕 (2050 rpm) 하면서 배양한다.
원형질체가 벼과 식물에서 유래한 것일때는 배지중에 배양된 벼 세포 약 100300 ㎎ PW/dish 를 함유하는 것이 바람직하다. 또 다른 방법으로서는 바닥이 멤브레인 필터로 형성되었거나 부착되어 있는 용기를 사용하여 동시 배양할 수도 있다. 즉, 원형질체를 함유한 액상 배지를 용기에 넣고, 페트리 접시속에 있는 배양된 세포를 함유한 액상 배지중에 위의 용기를 침지한다.
배양된 세포는 왕성한 세포 분열조건하에서 미세한 세포 덩어리 형태의 것이 바람직하다.
이 배양된 세포를 씨, 줄기, 뿌리 또는 꽃밥 등의 벼의 조직으로 부터 제조한 유합 조직을 액상 배지에서 반복하여 준배양 (subculturing) 하면서 신속히 분열할 수 있는 세포를 선별함으로써 쉽사리 얻을 수 있다. 34 주 배양 후에는 0.51 ㎜ 군락이 나타난다. 벡터중에 하이드로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자 (hph) 등과 같이 선택 마아커 유전자로 작용하기도 하는 외래 유전자가 함유되면 배양 개시후 720 일 되는 날 배지에 하이그로마이신 10100 ㎍/㎖ 을 가하고 계속해서 배양함 으로써 필요로 하는 형질 전환체의 선별을 용이하게 할 수 있다. 선별된 군락을 증식 배지에 옮기고 2327 ℃ 에서 24 주간 조명 (10004000 룩스) 하에 배양하여 약 36 ㎜Ø 되는 유합 조직을 얻는다.
증식 배지는 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D) 등의 식물 호르몬 2 ㎍/㎖ 와 아가로오스가 0.11.0보충된 R2 배지 같은 한천 배지이어도 좋다. 형질 전환에 사용된 벡터중에 외래 유전자의 하나로서 hph 유전자를 함유하고 있으면 분리된 유합조직을 하이그로마이신 2.050 ㎍/㎖ 가 보충된 동일 배지에서 증식시켜 하이그로마이신 내성의 발현을 확인한다.
0.51.5아가로오스를 함유하고 포르말린이 함유되지 않거나 사이토키닌 110 ㎖/ℓ 이 보충된 R2/MS 배지중에서 2327℃ 에서 조명 (20004000 룩스) 하면서 210 주간 유합조직을 생장시켜 막눈 (adventitious bud) 또는 곁배 (adventive embryo) 를 형성시킨 다음 이것을 호르몬이 함유되지 아니한 R2/MS 배지중에서 23 주간 배양하여 이식할 수 있는 어린 식물을 얻는다.
어린 식물을 질석 (vermiculite) 같은 적당한 배지중에서 생장시켜 소요의 형질전환된 식물, 즉 재조합 벼의 식물체를 얻는다.
형질전환된 세포 또는 식물에 있어서 본 발명의 합성 유전자의 존재는 공지의 방법, 예컨대 Mol. Gen. Genet. 211 : 172, 1988 에 기재된 방법에 따라 DNA 를 분리하여 PCR 처리 (Am. J. Hum. Genet. 37 : 172, 1985) 또는 서어던 잡종 번식법 (Sourthen hybridization) (J. Mol. biol. 98 : 505 , 1980) 으로 처리함으로써 확인 할 수 있다.
형질 전환된 세포가 식물 게놈 (plant genome) 중에 결합된 유전자를 발현하면 형질 전환된 유전자를 프로우브 (probe) 로 사용하는 노오던 잡종번식법 (Northern hybridization) (Thomas. P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 77 : 5201, 1980) 또는 형질전환된 유전자의 발현 생성물에 대해 성장시킨 항혈청을 사용하는 웨스턴 블포팅법 (Western blotting) (Towbin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 : 4350, 1979) 으로 확인할 수 있다.
본 발명을 실시예에 따라 구체적으로 설명한다.
[실시예 1]
[B.t. 독소를 인코우딩하는 구조 유전자의 화학적 및 효소적 합성과 발현 벡터의 구축]
[(1) 올리고데옥시뉴클레오티드 제조]
서열번호 1 (SEQ ID NO : 1) 에 나와 있는 염기 서열을 가진 B.t. 독소 인코우딩 구조 유전자 구축을 위한 16 개의 세그먼트 각각에 대한 올리고뉴클레오티드는 공지의 방법 (Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185 - 3192, 1981; Beaucaqe et al. Tetrahedron Lett. 22 : 1859 - 1862, 1981) 에 따라 합성할 수 있다.
모든 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성장치 (Applied Biosystems 391 DNA Synthesizer) 를 사용하여 고체상 포스포르아미다이트-트리에스테르 커플링법으로 제조하였다. 올리고머로 부터 보호기를 제거하고 28암모니아수를 사용하는 종래의 방법에 따라 고체 담체로 부터 분리하였다. 조(粗) 올리고뉴클레오티드 혼합물을 올리고뉴클레오티드 정제 카아트리지 (OPC 칼럼, Applied Biosystems) 를 사용하여 Mcbridge 등의 방법 (Biotechniques 6 : 362 - 367, 1988) 방법에 따라 정제하였다.
[(2) PCR 에 의한 2 중 스트랜드 DNA 제조]
각 세그먼트 제조에 사용된 올리고뉴클레오티드의 길이와 서열은 제4도 내지 제9도에 나와 있고 각 세그먼트의 제한부위는 제11도에 나와 있다. 각 세그먼트는 아래에 나온 바와 같이 방법 B 또는 방법 C 를 이용하여 제조하였다.
[(가) 세그먼트 1 제조]
세그먼트 1 은 양말단에 Sal I 및 Spe I 부위를 가진 190 bp 단편이다 (제4도). 이 세그먼트는 4 가지 올리고뉴클레오티드 프라이머 (primer) 를 사용하여 방법 B 에 따라 제조하였다. 센스프라이머 (senseprimer) 1-3 과 안티센스프라이머 1-4 를 PCR 에 의하여 반응시킨다 (Am. J. Hum. Genet. 37 : 172, 1985). PCR 은 프라이머농도 각각, 10 ㎛, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.005Tween 20, 0.005NO-40, 0.001젤라틴, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 200 ㎛ 및 REPLITHERM Thermostable DNA Polymerase (EPISENTRE 사제) 5 단위를 함유하는 100 ㎕ 의 반응 혼합물중에서 DNA Thermal Cycler PJ1000 (PERKIN-ELMERCETUS 사제) 를 사용하여 실시하였다.
94℃ 1 분, 5055℃ 2 분 및 72℃ 3 분으로 된 반응 사이클을 30 회 반복하여 반응시켰다. 방법 B 에서 2 중 스트랜드 DNA 제조를 위한 PCR 은 프라이머와 DNA 를 바꾸는 것이외에는 동일한 조건하에서 실시하는 것이 일반적이다. 또 다른 방법으로서는 102 bp DNA 함유의 수득한 PCR 혼합물 5 ㎕, 센스프라이머 1 - 2 및 안티센스프라이머 1-4 를 사용하여 동일한 조건하에서 PCR 을 실시하여 163 bp DNA 를 얻었다. 또한 센스프라이머 1-1, 안티센스프라이머 1-4 및 반응 혼합물 5 ㎕ 을 사용하여 또 다른 PCR 을 실시함으로써 필요로 하는 196 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 얻었다.
[(나) 세그먼트 5 제조]
세그먼트 5 는 양말단에 Eco RI 및 Xba I 부위를 가진 405 bp 단편이다(제5도). 이 세그먼트는 위에 나온 (가) 와 마찬가지 방법으로 6 가지 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 방법 B 에 따라 제조하였다. 센스 프라이머 5-3 과 안티센스프라이머 5-4 를 마찬가지 조건하에서 PCR 로 반응시켜 145 bp DNA 를 얻는다. PCR 은 sid 145 bp DNA 함유의, DNA 용액 ㎕, 센스프라이머 5-2 및 안티센스 프라이머 5-5 를 사용하여 실시함으로써 287 bp DNA 를 얻었다. 287 bp DNA 함유 용액 5 ㎕, 센스프라이머 5-1 과 안티센스프라이머 5-6 을 사용하여 PCR 을 실시함으로써 필요로 하는 411 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 얻었다.
[(다) 세그먼트 4 제조]
세그먼트 4 는 양말단에 EcoT141 과 ScaI부위를 가지며 하나의 내부 Bgl II 부위를 가진 277 bp 단편이다 (제6도). 이 세그먼트는 5 가지 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 방법 B 와 방법 C (제2도 및 제3도) 에 따라 제조하였다. 센스프라이머 4-1 과 안티센스프라이머 4-2 를 PCR 로 반응시켜 EcoT141 말단과 BglII 말단을 가진 142 bp DNA 를 얻는다. 센스 프라이머 4-4 와 안티센스프라이머 4-5 를 PCR 로 반응시켜 91 bp DNA 를 얻는 다음, 91 bp DNA 함유용액 5 ㎕, 센스프라이머 4-3 및 안티센스프라이머 4-5 를 사용하여 또 다른 PCR 처리하여 BglII 말단 및 ScaI 말단을 가진 151 bp DNA 를 얻는다. 142 bp DNA 와 151 bp DNA 각각을 다음과 같이 반응시켰다.
DNA 를 함유하는 전체 반응 용액을 페놀/클로로포름 (1 : 1) 용액 100 ㎕ 와 반응시켜 종래와 같이 탈단백질 처리하고 수성층을 3 M NaOAc (pH 5.2) 10㎕ 및 EtOH 250 ㎕ 와 혼합하여 DNA 를 침전시켰다.
회수한 DNA 를 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨 및 100 mM NaCl 을 함유하는 용액 100 ㎕ 중에서 제한효소 Bgl II 10 단위로 처리하였다. 반응 혼합물을 Ix TBE 완충액중에서 1Seakem GTG Agarose (FMC 사제) 로 전기 영동시키고, DNA 함유 밴드를 회수한 다음 DNA 를 SUPREC-D1 (Takara 사제) 로 겔로 부터 정제하였다. 정제된 DNA 각각으로 부터 약 1/10 을 취하여 이것을 사용해서 키트 (kit) 에 첨부된 설명서에 따라 DNA 결찰 키트 (Takara 사제) 를 사용하여 T4 DNA 리가아제 존재하에 50 ㎕ 의 반응계중에서 결찰시켰다. 결찰 혼합물 (5 ㎕) 과 센스프라이머 4-1 및 안티센스프라이머 4-5 를 PCR 처리하여 필요로 하는 283 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 얻었다.
[(라) 세그먼트 2 제조]
세그먼트 2 는 양말단에 ScaI 부위와 SacI 부위를 가지며 하나의 내부 StuI 부위를 가진 414 bp 단편이다 (제7도). 이 세그먼트는 7 가지 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 위에 나온 방법 B 와 방법 C 에 따라 제조하였다.
센스프라이머 2-2 와 안티센스프라이머 2-3 를 PCR 로 반응시켜 117 bp DNA 를 얻은 다음, 이것을 PCR 에 의하여 센스프라이머 2-1 및 안티센스프라이머 2-3 과 반응시켜 ScaI 말단과 StuI 말단을 가진 179 bp DNA 를 제조한다. 센스프라이머 2-5 와 안티센스프라이머 2-6 를 PCR 로 반응시켜 129 bp DNA 를 얻은 다음, 이것을 센스프라이머 2-4 및 안티센스프라이머 2-7 과 PCR 에 의하여 반응시켜 StuI 말단과 SacI 말단을 가진 254 bp DNA 를 제조하였다. 179 및 254 bp DNA 들을 각각 위의 (다)에 나온 바와 마찬가지 방법으로 침전시켜 회수한다. 회수한 DNA 들을 10 mM Tris- HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨 및 50 mM NaCl 을 함유하는 용액 100 ㎕ 중에서 제한 효소 StuI 로 처리하고, 위의 (다) 에 나온 바와 마찬가지 방법으로 정제하여 결찰시켰다. 결찰 혼합물 (5 ㎕) 와 센스프라이머 2-1 및 안티센스프라이머 2-7 을 사용하여 PCR 처리함으로써 필요로 하는 420 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 제조하였다.
[(마) 세그먼트 6 제조]
세그먼트 6 은 양말단에 SacI 부위와 HindIII 부위를 가진 352 bp 단편이다 (제8도). 이 세그먼트는 5 가지 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 위의 (가) 와 동일한 방식으로 방법 B (제2도) 에 따라 제조하였다. 센스프라이머 6-3 및 안티센스프라이머 6-4 를 마찬가지 조건하에 PCR 에 의하여 반응시켜 146 pb DNA 를 제조하였다. 146 bp DNA, 를 함유하는 DNA 용액 5 ㎕ 센스프라이머 6-2 및 안티센스프라이머 6-5 를 사용하여 PCR 처리해서 284 bp DNA 를 제조하였다. 284 bp DNA 함유 용액 5 ㎕, 센스프라이머 6-1 과 안티센스프라이머 6-5 를 사용하여 PCR 처리하여 필요로 하는 354 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 얻었다.
[(바) 세그먼트 3 제조]
세그먼트 3 은 양말단에 HindIII 부위와 BclI 부위를 가지며 하나의 내부 PvuI 부위를 가진 249 bp 단편이다 (제9도). 이 세그먼트는 5 가지 합성 올리 고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 위의 (다) 에서 나온 바와 같이 방법 B 및 방법 C (제2도 및 제3도) 에 따라 제조하였다. 센스프라이머 3-1 과 안티센스 프라이머 3-2 를 PCR 에 의하여 반응시켜 HindIII 말단과 PvuI 말단을 가진 117 bp DNA 를 제조한다.
센스프라이머 3-4 와 안티센스프라이머 3-5 를 PCR 에 의하여 반응시켜 88 bp DNA 를 얻고, 이것을 센스프라이머 3-3 및 안티센스프라이머 3-5 와 PCR 에 의해 반응시켜 PvuI 말단과 BclI 말단을 가진 150 bp DNA 를 제조한다.
179 bp DNA 와 254 bp DNA 를 위의 (다) 에 나온 바와 마찬가지로 하여 침전시켰다. 회수한 DNA 를 20 mM Tris-Hcl (pH 8.5), 10 mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨 및 100 mM KCl을 함유하는 용액 100 ㎕ 중에서 제한 효소 PvuI 로 처리하고 위의 (다) 에 나온 바와 마찬가지로 하여 정제하여 결찰시켰다.
결찰 혼합물 (5 ㎕) 과 센스프라이머 3-1 및 안티센스프라이머 3-5 를 사용하여 PCR 처리함으로써 필요로 하는 255 bp 2 중 스트랜드 DNA 를 제조하였다.
[(3) B.t. 독소를 인코우딩하는 완전한 길이의 구조 유전자 구축 및 이를 함유하는 발현 벡터]
(2) 의 (다) 에 기재된 바와 마찬가지로 (2) 에서 얻은 6 가지 세그먼트 각각을 회수하고 양말단의 제한 부위에 대하여 특이성을 가진 제한 효소로 처리하여 분획한후 정제하였다.
이렇게 하여 얻은 단편을 DNA 결찰 키트 (Takara 사제) 를 사용하여 다음에 나오는 클로닝 벡터에 클로닝한 다음 형질전환시켜 E. coli DH5α를 얻었다.
세그먼트 1 : pBSIIKS + (Stratagene 사제)
세그먼트 2 : EcoRI 클로닝 부위 및 HindIII 클로닝 부위에서 플라스미드 pHSG398 을 소화시켜 제10도에 있는 바와 같이 이들을 바람직한 클로닝 부위로 치환함으로써 pHSG398 로 부터 얻은 pMCSC8(Gene 61 : 63, 1987)
세그먼트 3 : EcoRI 부위 및 HindIII 부위에서 플라스미드 pUC18 을 소화시켜 제10도에 있는 바와 같이 이들을 바람직한 클로닝부위로 치환함으로써 pUC18 로 부터 얻은 pMCSA8.
세그먼트 4 : EcoRI 클로닝 부위 및 HindIII 클로닝 부위에서 플라스미드 pHSG298 을 소화시켜 제10도에 있는 바와 같이 이들을 바람직한 클로닝부위로 치환함으로써 pHSG298 로 부터 얻은 pMCSK8 (Gene 61 : 63, 1987).
세그먼트 5 : pUC18 (Gene 33 : 103, 1985) 세그먼트 6 : pHSG399 (Gene 61 : 63, 1987) 삽입된 DNA 의 염기 서열을 결정함으로써 세그먼트 16 이 각각 클로닝된 플라스미드 pBTH 1-6 을 얻었다 (제11도).
염기 서열은 플라스미드 DNA 를 분리하여 Sanger 등의 디데옥시뉴클레오티드 서열 측정 방법 (Proc. Natl. Acac. Sci. 74 : 5463 - 5467, 1977) 에 따라 처리함으로써 결정하였다.
플라스미드는 제11도에 있는 바와 같이 하여 구축하였다. 약 1000 bp sphI - SalI 영역내의 아주까리 기름 식물 유래의 카탈라아제 유전자의 인트론과 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 35 S 프로모우터를 함유하는 고발현 벡터 pIG221 (1 ㎍, Tanaka et al., Nucleic Acids Research 18 : 6767 - 6770, 1990) 을 상응한 제한 효소 각각 10 단위로 처리하여 소화시켜 1000 bp SphI - SalI 단편을 분리한 다음 이것을 플라스미드 pHG398 에다 서브클로닝하여 pBTO1 을 얻었다.
세그먼트 1 을 함유하는 플라스미드 pBTHI1 을 제한 효소 XbaI 로 처리하고 DNA 블런팅 키트 (Blunting Kit) (Takara 사제) 를 사용하여 키트에 부착된 설명서에 따라 T4 DNA 폴리머라아제를 함유한 반응계 총 20 ㎕ 중에서 블런트 엔트 (bland-end) 처리한 다음 SpeI 로 소화처리하여 벡터 DNA 를 얻었다. 천연 B.t. 유전자의 일부를 플라스미드 pBTO2 로 부터 분리하였는데, 이것은 천연 B.t. 유전자 (pSY177 로부터 유래한 것, J. Bacteriol. 166 : 801 - 811, 1986) 의 일부 (SpeI - EcoRI 단편 97bp 를 제한 효소 SpeI 와 Eco RV 로 소화시켜 얻은 것이다.
이들 DNA 단편, 즉 위와 같이 하여 제조한 천연 B.t 유전자의 일부와 벡터 DNA 를 DNA 결찰키트 (Takara 사제) 를 사용하여 결찰시켜 플라스미드 pBTH101 을 얻었다. 플라스미드 pBTH101 을 제한 효소 SalI 및 EcoRI 으로 소화시켜 281 bp DNA 를 얻은 다음 이것을 SalI 부위와 EcoRI 부위의 플라스미드 pBTOH 에다 결찰시켜 플라스미드 pBTH111 을 얻었다.
이와 병행하여 실시한 실험에서 플라스미드 pBTH112 를 다음과 같이 구축하였다.
플라스미드 pBTH5 를 제한 효소 EcoRI 및 XbaI 로 소화시켜 411 bp 단편을 얻어, 이것을 플라스미드 pBTH4 의 제한부위 EcoRI 및 EcoT141 (XbaI 의 경우와 동일한 점착 말단을 가짐) 에다 위에서와 동일한 방법으로 결찰시켜 플라스미드 pBTH102 를 얻었다. 플라스미드 pBTH2 를 제한 효소 ScaI 및 SacI 로 소화시켜 414 bp DNA 단편을 얻어 이것을 위에서와 동일한 방법으로 제한부위 ScaI 및 SacI 의 플라스미드 pBTH102 에다 결찰시켜 플라스미드 pBTH112 를 얻었다.
또 다른 병행 시험에서는 천연 B.t 유전자의 일부 (pSY177, J, Bacteriol. 166 : 801811, 1986) 를 가진 238 BP BclI-KpnI 단편과 노팔린 신타아제 (nopaline synthase) 의 약 300 bp 의 폴리 (A) 추가 신호 서열 사이에서 XbaI 부위와 SpeI 부위를 가지는 복수 정지 링커가 있는 약 550 bp 단편을 위에 나온 바와 마찬가지 방법으로 pMCSC8 의 BclI 부위와 KpnI 부위에다 클로닝하여 플라스미드 pBTO3 을 얻었다. 플라스미드 pBTH3 을 제한효소 Hind III 및 BclI 로 소화시켜 256 bp DNA 단편을 얻고, 이것을 위에 나온 바와 마찬가지 방법으로 HindIII 부위와 BclI 부위의 pBTO3 에다 결찰시켜 플라스미드 pBTH103 을 얻었다.
플라스미드 pBTH6 을 제한효소 SacI 및 HindIII 으로 소화시켜 352 bp DNA 를 얻어 이것을 위에 나온 바와 마찬가지로 SacI 부위와 HindIII 부위의 pBTH103 에다 결찰시켜 pBTH113 을 얻었다.
마지막으로 pBTH111 의 약 1300 bp SphI-EcoRI 단편, pBTH112 의 약 1100 bp EcoRI-SacI 단편 및 pBTH113 을 제한부위 SphI 및 SacI 에 결찰시켜 필요로 하는 완전 길이의 합성 B.t. 유전자와 이 합성 유전자를 고도로 발현할 수 있는 발현 벡터 pBTH1291 (제11도) 를 얻었다.
[실시예 2]
[식물에서의 B.t. 독소 인코우딩 합성 유전자의 발현]
[(1) 벼 원형질체의 형질 전환]
발현 벡터 pBT1291 을 사용하여 벼과 식물을 형질 전환시킨다.
일반적으로 형질전환을 벼과 식물에서 얻는 원형질체를 액상 매체중에 현탁시키고, 합성 유전자를 가진 발현 벡터로 원형질체를 전기 펄스 처리하여 형질 전환시키며, 형질전환된 원형질체를 배양된 벼 세포를 함유하는 적당한 배지중에서 배양하여 군락 (colony) 을 얻고, 이 군락으로 부터 공지 방법 (Shimamoto et al. Nature 337 : 274-276, 1989) 으로 재조합 식물을 재생시킴으로써 실시 할 수 있다.
원형질체를 다음과 같이 제조하였다. 즉 벼품종 (NIPPONBARE) 의 성숙한 씨눈 유합 조직으로 부터 세포 현탁액을 제조하여 35 일 동안 생장시키고, 4셀룰라아제 (yakult 사제), 1마세로자임 R-10 (Yakult 사제) 및 0.4만니톨을 함유하는 효소 용액 (pH 5.6) 중에서 30℃에서 34 시간 처리하였다. 효소 처리가 끝나면 배양액을 여과하여 소화되지 아니한 물질을 분리하고 여액을 4 배 체적의 KMC 용액 (0.118M 염화 칼륨, 0.0817M 염화 마그네슘, 0.085 M 염화 칼슘, pH 6.0, 위에 나온 문헌 참조) 과 혼합하여 원심분리함으로써 원형질체를 펠릿 (pellet) 으로 얻은 다음 이 펠릿을 KMC 용액으로 2 회 세척하였다.
수득한 원형질체를 70 mM 염화 칼륨, 5 mM 염화 마그네슘, 0.4 M 만니톨 및 0.1MES 를 함유한 완충액 (pH 5.8) 중에 8 × 106/㎖ 의 밀도로 현탁시켰다.
이 현탁액에 합성 구조 유전자를 함유한 플라스미드 벡터 60 ㎍/㎖ 와 프로모우터로서 CaMV 35S 와 외래 유전자로서 하이그로마이신 포스포트란스퍼라아제 유전자와 NOS (노팔린 신타아제) 또는 CaMV 유래의 터미네이터를 함유하는 pGL2(Nature 338 : 274 - 276, 1989) 등의 플라스미드 60 ㎍/㎖ 을 가하고 5 ℃ 에서 5 분간 냉각시켰다.
이 혼합물을 멸균된 플라스틱 셀에 옮겨 넣고 병열 전극을 사용하여 직류 펄스를 인가하였다 (콘덴서 : 1000 μF ; 초기전압 : 500 V/㎝ ; 펄스폭 : 약 30 msec). 이어서 이 현탁액을 4℃ 에서 10 분간 냉각하고 등량의 R2/MS 원형질체 아가로오스 배지 (Mol. Gen. Genet. 206 : 408, 1987) 와 혼합한 후 약 0.7 ㎜ 두께로 고화시켜 고체 아가로오스 (세포밀도, 약 4 × 106/㎖) 를 얻었다.
전기 펄스 처리된 원형질체를 함유한 고체 아가로오스를 약 10 ㎜ 크기의 세그먼트 절단하여 R2/MS 원형질 배지 5 ㎖ 가 들어 있는 6 ㎝ 페트리 접시에 넣었다.
이 접시에다 배양된 벼 세포 약 100 ㎎(FW) 을 영양 세포로 하여 가하고 어두운 곳에서 약 29℃ 에서 약 10 일간 완만히 진탕 (50 rpm) 하면서 원형질체를 배양하였다.
배양세포를 다음과 같이 제조하였다. 즉 벼씨를 발육시킨 벼의 뿌리로 부터 유합조직을 얻어 이것을 액상 배지중에서 매주 준배양하여 배양세포의 현탁액을 얻고 분열이 왕성한 미세한 세포 (1㎜Ø) 를 현탁액으로 부터 선별하였다.
10 일간 배양한 후 영양세포를 KMC 용액으로 제거하고 2-4 일간 배양한 다음 하이그로마이신 B 20 ㎍/㎖ 를 가하고 다시 2-3 주간 배양하였다.
아가로오스 조각을 2 ㎎/ℓ 의 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 6수크로오스 및 0.25아가로오스를 함유하는 R2 연질 한천 배지로 옮겨 이 혼합물을 2-4 주간 배양하여 군락을 생장시켰다. 확대된 군락을 분리하여 R2 연질 한천 배지에다 옮겼다.
수득한 유합조직을 R2/MS 재생배지 (3소르비톨, 2수크로오스. 1아가로오스, pH 5.8) 에 옮겨 넣고 조명 (20004000 룩스) 하에 25℃ 에서 310 주간 배양한 후 새가지와 뿌리의 재생을 관찰하였다.
새싹이 약 2 ㎝ 정도 자랐을때 R2/MS 재생배지를 가진 플라스틱 상자에 옮겨 넣고 어린 식물이 되도록 생장시켰다. 다시 질석 포트에서 생장시켜 성숙한 재조합 벼를 얻었다.
[(2) PCR 에 의한 형질 전환체의 스크리이닝]
하이그로마이신 내성 군락을 스크리이닝하여 형질 전환된 합성 유전자의 존재 유무를 아래와 같이 확인하였다.
하이그로마이신 내성 군락의 일부로 부터 DNA 를 추출하였다 (Mol. Gen. Genet. 211 : 27, 1988). 1.5 ㎖ 마이크로 원심분리관중에 재현탁 완충액 (20 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA) 250 ㎕ 을 가하고 이 완충액 중에서 두가지 유합조직을 균질화한 다음, 여기에다 20SDS 20 ㎕ 을 가하고 68에서 15 분간 배양하였다. 7.5 M 암모늄 아세테이트 150 ㎕ 을 가한 다음 이 혼합물을 얼음위에 가하여 30 분 방치하고 나서 15000 rpm 에서 4 ℃ 에서 15 분간 원심분리하였다. 상청액에다 EtOH 1㎖ 을 가하고 동일한 조건하에서 원심분리하여 DNA 를 침전시켰다.
이 DNA 를 70EtOH 로 세척하고 건조한 다음 TB 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) 30 ㎕ 중에 용해시켰다.
이렇게 하여 수득한 DNA 를 PCR 처리하여 형질전환된 유전자를 제12도에 있는 프라이머를 사용하여 스크리이닝하였다. PCR 은 위에서 얻은 DNA 5 ㎕, 각 프라이머 1 ㎛ 씩, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.005Tween 20, 0.005NP-40, 0.001젤라틴, dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 200 ㎛, REPLITHERM Thermostable DNA 폴리머라아제 (EPISENTRE 사제) 5 단위를 함유하는 반응 혼합물 총 50 ㎕ 중에서 실시하였다.
94℃ 1 분, 50℃ 2 분 및 72℃ 3 분으로 된 반응 사이클을 DNA Thermal Cycler PJ1000 (PERKIN-ELMER CETUS 사제) 에서 3035 회 반복하여 PCR 을 실시하고, 생성물을 종래 방식으로 전기 영동법에 의하여 분석하였다.
제12도에서 알 수 있는 바와 같이 증폭된 DNA 의 1.0 kb 밴드가 플라스미드 pBT1291 에 의해 형질전환된 유합 조직에서 관찰되었다. 마찬가지 방법으로 수많은 하이그로마이신 내성 군락을 스크리이닝하여 이들중 47가 합성 유전자 (플라스미드 pBT1291) 를 함유하고 있음을 확인하였다.
[(3) 완전한 길이의 형질전환된 유전자의 검출]
위의 (2) 및 스크리이닝에 의하여 얻는 형질전환된 유합조직으로 부터 DNA 를 추출하여 20 단위의 제한효소 XBaI 로 소화시킨 다음 서어던 잡종번식법 (Southern hybridization) (J. Mol. Biol. 98 : 505, 1980) 으로 분석하였다. pBT1291 의 XbaI 단편을 멀티프라임 DNA 라벨링 시스템 (Multi-prime DNA Labelling System) (Amersham 사제, Feinbeng et al. Analytical Biochem. 137 : 266 - 267, 1987) 과 α-32P-dCTP (Amersham 사제, 370MBq/㎖, 110 TBq/m㏖) 을 사용하여 라벨링하여 프로우브 (probe) 로 사용하였다. 그 결과는 제13도에 나와 있는데, 이로 부터 알 수 있는 것은 B.t. 합성 유전자와 인트론의 합친 길이에 상응한 예측된 2.5 kb DNA 밴드가 형질 전환된 모든 대상물에서 검출되었다는 점이다.
[(4) 형질전환된 유전자 전사로서의 mRNA 의 검출]
형질전환된 유합조직으로 부터 총 RNA 를 분리하여 서어던 잡종 번식법 (Analytical Biochem. 162 : 156-159, 1987) 으로 완전한 길이의 유전자를 함유하고 있음을 확인하였다. 각 RNA (20 ㎍) 를 노오던 잡종 번식법 (Northern hybridization : Thomas, P, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 77 : 5201, 1980) 으로 위에 나온 바와 같은 마찬가지 방법으로 제조한 프로우브를 사용하여 분석 하였다.
그 결과는 제14도에 나와 있다. 제14도로 부터 알 수 있는 것은 형질전환된 유전자의 예측된 전사에 상응한 mRNA 의 3.02.4 kb 밴드가 모든 대상물에서 검출되었다는 점이다.
[(5) 형질전환된 유전자의 번역 생성물로서의 B.t. 독소의 검출]
재생된 벼의 잎으로 부터 SDS 가용성 단백질을 추출하여 웨스턴 블로팅법 (Western blotting : Towbin et al. Proc. Hatl. Acad. Sci. 76 : 4350, 1979) 으로 B.t. 독소 검출에 사용하였다. 재조합 벼의 잎 조각 (약 2 × 0.5 ㎝) 을 액체 질소로 동결 건조하고 모르타르에서 분쇄하여 분말로 한 다음 즉시 시료 완충액 (25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4SDS, 8mM DTT, 20글리세롤, 0.004BPB, 200 ㎛ 류우펩신) 100 ㎕ 로 추출하였다. 추출물을 비등욕중에서 5 분간 가열하고 4℃ 에서 15 분간 12000 rpm 으로 원심분리하여 상청액을 시료용액으로 분리하였다. 이 시료용액을 SDS-PAGE 전기 영동법으로 처리하고 블로팅 완충액 (25 mM Tris, 192 mM 글리신, 20MeOH) 중에서 임모빌론 멤브레인 (Immobilon Membrane : MILLIPORE 사제) 에다 200 ㎃, 35V 에서 옮겼다.
B.t. 독소 검출시에 면역된 토끼체내에서 생성시킨 안티 B.t. 독소 항혈청으로 부터 정제한 면역 글로불린 G(IgG) 을 1 차 항체로서 사용하였고 알칼리성 포스파타아제 결합 염소 항 토끼 IgG (JACKSON 사제) 을 2 차 항체로 사용하였다.
그 결과는 제15도에 나와 있는데, 이로 부터 B.t. 독소에 대하여 생성된 항혈청으로 부터 정제한 면역 글로불린 G(IgG) 와 반응 할 수 있는 약 72 kD 정도 되는 분자량을 가진 단백질을 검출하였음을 알 수 있다. 이 단백질의 발현은 SDS 가용성 단백질의 경우의 약 0.05 0.1로 추정된다.
[(6) 차세대 R1에 대한 합성 유전자의 유전 및 그 발현]
B.t. 독소를 고도로 발현하는 벼로 부터 씨를 수거하여 파종한 다음 생장시켜 차세대 (R1) 에 대한 합성 유전자의 유전 및 분리비를 파악하였다. 위의 (2) 에서 나온 바와 마찬가지 방식으로 파종 한지 14 일후 벼잎 (약 5 × 2㎜) 에서 DNA 를 추출하여 PCR 처리 하였다. 그 결과는 표 1 에 나와 있는데, 이 표로 부터 알 수 있는 것은 유전자는 세가지 독립계통에서 유전되었고 분리비는 약 3 : 1 이라는 점이다. C7-4 계통의 벼에서 추출한 DNA 를 전기 영동법으로 분석하였다 (제19도).
F2-11 계통의 약 3 개월된 벼를 사용하여 위의 (5) 에 나온 바와 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅법을 실시한 결과, R세대의 벼 역시 모세대 벼와 거의 동일한 정도로 B.t. 독소를 발현함을 알 수 있다 (제20도).
[(7) 재조합 벼의 곤충 내성 시험]
벼의 전형적인 해충인 레피돕테라 (Lepidoptera) 에 속하는 크나팔로크로시스 메디날리스 (Cnaphalocrocis medinalis) 에 대한 재조합 벼의 내성을 다음과 같이 조사하였다.
시험에 있어서 벼에 접종된 해충의 생존율 (또는 치사율) 은 완전한 길이의 합성 유전자 [(B.t.-유전자(+)] (예 : B2-9 계통 : 시험군) 를 유전하는 것으로 판명된 계통의 14 일된 모 (seedling) 를 사용하여 조사하였다.
B2-9 계통의 14 일된 모의 뿌리를 철저히 씻은 후 물을 적신 탈지면으로 싸고, 다시 파라필름 (parafilm) 으로 싸서 물이 증발하지 않도록 하여 벼를 생존상태로 유지하였다.
벼 하나를 높이 약 20 ㎝ 되는 반투명 플라스틱 튜우브 속에 넣고 2 일 되는 C. 메디날리스 (2-3 ㎜) 를 접종하였다. 주야 12 시간 간격으로 25℃ 에서 7 일간 시험을 하였다.
동일한 시험에서 처리하지 아니한 벼 (천연 벼, NIPPONBARE) 와 본 발명의 발현 벡터로 처리한 것으로서 잡종 분리의 결과 B.t. 유전자를 상실한 유전자 [B.t. -유전자(-)] 를 가진 벼를 대조군으로 사용하였다. 그 결과는 표 2 와 표 3 에 나와 있다. 시험군 [B.t. 유전자(+)] 에 있어서 해충의 생존율 (또는 치사율) 은 대조군 [NIPPONBARE 및 B.t. 유전자 (-)] 의 경우와는 극히 판이하였다. 즉 시험군에서의 치사율은 대조군에서 관찰된 것 보다 높았다. 또한 분명한 것은 생존한 해충의 생장율은 대조군에 비하여 시험군에서 훨씬 낮았다.
위에서 분명히 알 수 있는 것은 형질전환된 B.t. 독소 인코우딩 유전자를 고도로 발현하는 벼는 레피돕테라에 속하는 해충에 대하여 효과적인 내성을 가지고 있다는 점이다.
결론적으로 본 발명의 합성 유전자는 B.t. 독소를 인코우드하고 벼과 식물에 적합한 염기 서열을 가지고 있기 때문에 벼과 식물에서 고도로 발현될 수 있고 해충에 대한 저항성이 있다. 수득한 본 발명의 재조합 벼는 농업적으로 유용한 것으로 기대된다.
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