ES2389767T3

ES2389767T3 - Plantas de trigo que tienen mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona

Info

Publication number: ES2389767T3
Application number: ES04732967T
Authority: ES
Inventors: Calvin Konzak; Iwona Birk; Bijay Singh
Original assignee: BASF SE; Northwest Plant Breeding Co
Current assignee: BASF SE; Northwest Plant Breeding Co
Priority date: 2003-05-28
Filing date: 2004-05-14
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2024-05-14
Also published as: ATE556139T1; UA92716C2; US20160376605A1; US10570411B2; RU2005140937A; AU2004243416A8; EP1633875B1; US20070033670A1; AU2004243416A1; EP1633875A2; AU2004243416B2; CL2012003254A1; PL1633875T3; EP2508609A1; US9382526B2; CA2527115A1; CL2004001294A1; CA2527115C; MA27919A1; CL2012003255A1

Abstract

Una planta de trigo o de triticale que contiene al menos un ácido nucleico IMI seleccionado de entre el grupo que consiste de: (a) ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23; y (b) polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que comprende una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24; en donde el ácido nucleico IMI le confiere además a la planta mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta.

Description

Plantas de trigo que tienen mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona en general con plantas que tienen una mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona. Más específicamente, la presente invención se refiere a plantas de trigo obtenidas por mutagénesis y cruzamiento y transformación, que tienen una mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona.

Antecedentes de la invención

La acetohidroxiácido sintasa (AHAS, EC 4.1.3.18, acetolactato sintasa (ALS)), codificada por el ácido nucleico Als, es la primera enzima que cataliza la síntesis bioquímica de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh B. K., 1999, Biosíntesis de valina, leucina e isoleucina en: Singh B. K. (Ed.) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. Nueva York, Nueva York. Páginas 227 - 247). AHAS es el sitio de acción de cuatro familias de herbicidas estructuralmente diferentes, incluyendo las sulfonilureas (LaRossa R. A. y Falco S. C., 1984, Trends Biotechnol 2: 158 - 161), las imidazolinonas (Shaner et al., 1984, Plant Physiol 76: 545 -546), las triazolopirimidinas (Subramanian y Gerwick, 1989, Inhibición de la acetolactato sintasa por triazolopirimidinas en (ed) Whitaker J. R., Sonet PE Biocatalysis in agrucultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society. Washington, DC, Páginas 277 - 288), y los pirimidiloxibenzoatos (Subramanian et al., 1990, Plant Physiol 94: 239 244). Los herbicidas de imidazolinona y sulfonilurea son ampliamente utilizados en la agricultura moderna debido a su efectividad con tasas de aplicación muy bajas y relativamente sin toxicidad para los animales. Por actividad de inhibición AHAS, estas familias de herbicidas previenen el crecimiento y desarrollo adicional de las plantas sensibles, incluidas muchas especies de malas hierbas. Varios ejemplos de herbicidas de imidazolinona que se encuentran comercialmente disponibles son PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquin), y ARSENAL® (imazapir). Ejemplos de herbicidas de sulfonilureas son clorsulfurón, metil metsulfurona, metil sulfometurona, etil clorimurón, metil tifensulfurona, metil tribenurona, metil bensulfurona, nicosulfurona, metil etametsulfurona, rimsulfurona, metil-triflusulfurona, triasulfurona, metil primisulfurona, cinosulfurona, amidosulfurona, fluzasulfurona, imazosulfurona, etil pirazosulfurona, y halosulfurona.

Debido a su alta eficacia y baja toxicidad, los herbicidas de imidazolinona son los favoritos para su aplicación por atomización sobre la parte superior de una amplia zona de vegetación. La capacidad para rociar un herbicida sobre la parte superior de una amplia extensión de vegetación disminuye los costos asociados con el establecimiento y mantenimiento de plantaciones, y disminuye la necesidad de la preparación del sitio antes del uso de tales productos químicos. El esparcimiento sobre la parte superior de una especie tolerante deseada también resulta en la capacidad para alcanzar el potencial máximo de rendimiento de la especie deseada debido a la ausencia de especies competitivas. Sin embargo, la capacidad de utilizar tales técnicas de esparcimiento sobre la superficie depende de la presencia de especies tolerantes a la imidazolinona de la vegetación deseada en la zona sobre la cual se hace el rocío.

Entre los principales cultivos agrícolas, algunas especies de leguminosas tales como la soja son naturalmente tolerantes a los herbicidas de imidazolinona debido a su capacidad de metabolizar rápidamente los compuestos herbicidas (Shaner y Robson, 1985, Weed Sci. 33: 469 - 471). Otros cultivos como el maíz (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol 100: 882 - 886) y el arroz (Barrett et al., 1989, Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, Nueva York, páginas 195 - 220) son susceptibles a los herbicidas de imidazolinona. La sensibilidad diferencial a los herbicidas de imidazolinona depende de la naturaleza química del herbicida en particular y del metabolismo diferencial del compuesto de una forma tóxica a una forma no tóxica en cada planta (Shaner et al., 1984, Plant Physiol. 76: 545 - 546; Brown et al., 1987, Pestic. Biochm. Physiol. 27: 24 - 29). Otras diferencias fisiológicas de la planta tales como la absorción y la translocación también juegan un papel importante en la sensibilidad (Shaner y Robson, 1985, Weed Sci. 33: 469 - 471).

Se han producido exitosamente variedades de cultivos tolerantes a las imidazolinonas, sulfonilureas, y triazolopirimidinas utilizando mutagénesis de las semillas, las microsporas, el polen, y el callo en Zea mays, Brassica napus, Glycine max, y Nicotiana tabacum (Sebastian et al., 1989, Crop Sci. 29: 1403 - 1408, Swanson et al., 1989, Theor. Appl. Genet. 78: 525 - 530; Newhouse et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 83: 65 - 70; Sathasivan et al., 1991, Plant Physiol. 97: 1044 - 1050; Mourand et al., 1993, J. Heredity 84: 91 - 96). En todos los casos, un solo gen nuclear parcialmente dominante confirió tolerancia. Cuatro plantas de trigo tolerantes a la imidazolinona también fueron previamente aisladas después de mutagénesis de la semilla de Triticum aestivum L. cv Fidel (Newhouse et al., 1992, Plant Physio. 100: 882 - 886). Los estudios de herencia confirmaron que un solo gen parcialmente dominante confirió tolerancia. Con base en estudios alélicos, los autores concluyeron que las mutaciones en las cuatro líneas identificadas se encontraban localizadas en el mismo locus. Uno de los genes de tolerancia de la variedad de cultivo Fidel fue denominada FS-4 (Newhouse et al., 1992, Plant Physiol. 100: 882 - 886).

El modelamiento por ordenador de la conformación tridimensional del complejo AHAS-inhibidor predice diferentes aminoácidos en el bolsillo propuesto de enlazamiento del inhibidor como sitios en donde las mutaciones inducidas probablemente conferirían tolerancia selectiva a las imidazolinonas (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 359 - 368). Las de plantas de tabaco producidas con algunas de estas mutaciones racionalmente diseñadas en los sitios propuestos de enlazamiento de la enzima AHAS de hecho exhibieron tolerancia específica a una sola clase de herbicidas (Ott et al., 1996, J. Mol. Biol. 263: 359 - 368).

La tolerancia de una planta a los herbicidas de imidazolinona también ha sido reportada en una cantidad de patentes. Las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.761.373, 5.331.107, 5.304.732, 6.211.438, 6.211.439, y

6.222.100 describen en general el uso de un ácido nucleico alterado Als para obtener tolerancia al herbicida en las plantas, y revelar específicamente ciertas líneas de maíz tolerantes a imidazolinona.

La Patente de los Estados Unidos No. 5.013.659 divulga plantas que presentan tolerancia a los herbicidas que posee mutaciones en al menos un aminoácido en una o más regiones conservadas. Las mutaciones descritas allí codifican ya sea tolerancia cruzada para imidazolinonas y sulfonilureas o tolerancia específica a la sulfonilurea, pero no se describe tolerancia específica a la imidazolinona. Además, la patente de los Estados Unidos No. 5.731.180 y la patente de los Estados Unidos No. 5.767.361 discuten un gen aislado que tiene una única sustitución de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de AHAS de plantas monocotiledóneas de tipo silvestre que da como resultado una tolerancia específica a la imidazolinona.

WO 03/014357 describe ácidos nucleicos de Triticum aestivum L. cv CDC Teal que confieren mayor tolerancia a la imidazolinona. Se han identificado 3 loci independientes de resistencia, cada uno con un alelo que confiere resistencia al imazamox. Se amplificaron genes parciales Als1 y Imi1 a partir de ADN genómico, y se encontró que dos de las líneas resistentes al imazamox, a saber TeallMI 15A y TeallMI 11A, tienen una sustitución de serina por asparagina en el dominio IPSGG (dominio E).

WO 03/014356 describe ácidos nucleicos del hábito de primavera de Triticum monococcum que confieren mayor tolerancia a la imidazolinona. WO 03/013225 describe ácidos nucleicos del trigo de primavera rojo duro de la variedad Gunner y del trigo blanco de invierno de la variedad Madsen de Triticum aestivum que confieren mayor tolerancia a la imidazolinona. En ambos casos, se encontró que las líneas resistentes a la imidazolinona tienen también una sustitución de serina por asparagina en el dominio IPSGG (dominio E).

Hasta la fecha, el estado de la técnica no ha descrito plantas de trigo Triticum turgidum tolerantes a la imidazolinona

o plantas de triticale tolerantes a la imidazolinona. El estado de la técnica tampoco ha descrito plantas tolerantes a la imidazolinona que contengan al menos un ácido nucleico alterado Als de Triticum turgidum. El estado de la técnica tampoco ha descrito plantas de trigo tolerantes a la imidazolinona que contengan mutaciones en genomas diferentes al genoma a partir del cual se deriva el gen FS-4. Por lo tanto, lo que se necesita en el estado de la técnica es la identificación de genes de tolerancia a la imidazolinona de genomas y especies adicionales. Lo que también se necesita en la técnica son plantas de trigo y plantas de triticale que tengan una mayor tolerancia a herbicidas tales como la imidazolinona y que contengan al menos un ácido nucleico alterado Als. También se necesitan métodos para controlar el crecimiento de malezas en la cercanía de tales plantas de trigo o plantas de triticale. Estas composiciones y métodos permitirían el uso de técnicas de aspersión por encima a la hora de aplicar herbicidas en las zonas que contienen las plantas de trigo o las plantas de triticale.

Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con plantas de trigo o de triticale que contienen al menos un ácido nucleico IMI seleccionado del grupo que consiste de:

(a): ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23; y

(b): polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que comprende una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24;

en donde el ácido nucleico IMI le confiere además a la planta mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta.

De acuerdo con una realización particular, dichas plantas incluyen adicionalmente al menos un ácido nucleico adicional IMI seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(i): ácidos nucleicos Imi2 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en la SEQ ID NO: 1;

(ii): ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en SEQ ID NO: 3; y

(iii) polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que incluya una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

La presente invención también se relaciona con partes de plantas, células de plantas, y semillas producidas por las plantas de la invención, en donde las partes de la planta, las células de la planta y la semilla incluyen al menos un ácido nucleico IMI como el definido aquí.

La presente invención se relaciona además con ácidos nucleicos aislados IMI, en donde los ácidos nucleicos incluyen un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(a): ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23;

(b): polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que comprenden una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24; y

(c): polinucleótidos que son el complemento de cualquiera entre (a) y (b) anteriores.

La presente invención se relaciona también con métodos para producir una planta transgénica que tenga mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona que comprenden:

(a): la transformación de una célula de una planta con uno o más vectores de expresión que contienen al menos un ácido nucleico IMI de Triticum turgidum; y

(b): la generación a partir de la célula de la planta de una planta transgénica con una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta;

en donde el ácido nucleico IMI de Triticum turgidum se selecciona de entre el grupo que consiste de:

(i): ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23; y

(ii): polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que comprenden una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24.

Las plantas transgénicas o las semillas de las mismas producidas por medio del método anterior son también abarcadas por la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención proporciona plantas de trigo que contienen ácidos nucleicos IMI, en donde la planta de trigo tiene una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta. Las plantas de trigo pueden contener uno, dos, tres, o más alelos de IMI. En una realización, la planta de trigo contiene al menos un ácido nucleico IMI. En otra realización, al menos un ácido nucleico IMI se selecciona de entre el grupo que consiste de un ácido nucleico Imi 1, un ácido nucleico Imi 2, y un ácido nucleico Imi

3. En otra realización, al menos un ácido nucleico IMI comprende un ácido nucleico IMI de Triticum turgidum. En otra realización, al menos un ácido nucleico IMI comprende un ácido nucleico IMI de la subespecie Durum. En aún otra realización, la planta de trigo comprende múltiples ácidos nucleicos IMI localizados sobre diferentes genomas. En otra realización, los múltiples ácidos nucleicos IMI incluyen un ácido nucleico Imi 2 de Triticum turgidum y un ácido nucleico Imi 3 de Triticum turgidum. En otra realización, los múltiples ácidos nucleicos IMI incluyen un ácido nucleico Imi 2 de la subespecie Durum y un ácido nucleico Imi 3 de la subespecie Durum. Preferiblemente, los ácidos nucleicos IMI codifican proteínas que contienen una mutación en una secuencia conservada de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de un Dominio A, un Dominio B, un Dominio C, un Dominio D, y un Dominio E. Más preferiblemente, la mutación está en un Dominio E conservado. También se suministran partes de plantas y semillas de plantas derivadas de las plantas de trigo descritas aquí.

La presente invención también proporciona plantas de triticale que contienen ácidos nucleicos IMI, en donde la planta de triticale tiene una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comprada con una variedad de tipo silvestre de la planta de triticale. En una realización, la planta de triticale contiene al menos un ácido nucleico IMI. En otra realización, al menos un ácido nucleico IMI se selecciona de entre el grupo que consiste de un ácido nucleico Imi 1, un ácido nucleico Imi 2, y un ácido nucleico Imi 3. En otra realización, al menos un ácido nucleico IMI incluye un ácido nucleico IMI de Triticum turgidum. En otra realización, al menos un ácido nucleico IMI incluye un ácido nucleico IMI de la subespecie Durum. En aún otra realización, la planta de trigo incluye múltiples ácidos IMI localizados sobre genomas diferentes. En otra realización, los múltiples ácidos nucleicos IMI incluyen un ácido nucleico Imi2 de Triticum turgidum y un ácido nucleico Imi3 de Triticum turgidum. En otra realización, los múltiples ácidos nucleicos IMI incluyen un ácido nucleico Imi 2 de la subespecie Durum y un ácido nucleico Imi 3 de la subespecie Durum. En aún otra realización, el ácido nucleico IMI codifica proteínas que contienen una mutación en una secuencia conservada de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste de un Dominio A, un Dominio B, un Dominio C, un Dominio D, y un Dominio E. Más preferiblemente, la mutación está en un Dominio E conservado. También se proporcionan partes de plantas y semillas de plantas derivadas de las plantas de triticale descritas aquí.

Los ácidos nucleicos IMI de la presente invención pueden incluir una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre el grupo que consiste de un polinucleótido de la SEQ ID NO: 5, o de la SEQ ID NO: 23; un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 6, y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos anteriormente mencionados.

Las plantas de la presente invención pueden ser transgénicas o no transgénicas. Los ejemplos de plantas de trigo no transgénicas que tienen mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona incluyen una planta de trigo que tiene un Número de Designación de Depósito de la Patente ATCC PTA-4919, PTA-4922; o un derivado mutante, recombinante, o modificado por medio de ingeniería genética de la planta con Número de Designación de Depósito de la Patente ATCC PTA-4919, o PTA-4922 ; o de cualquier progenie de la planta con el Número de Designación de Depósito de la Patente ATCC PTA-4919, o PTA-4922; o una planta que sea una progenie de cualquiera de estas plantas.

Además de las composiciones de la presente invención, se proporcionan diferentes métodos. Se describen aquí métodos para modificar la tolerancia de una planta a un herbicida de imidazolinona que comprende la modificación de la expresión de un ácido nucleico IMI en la planta. También se describen métodos para producir una planta transgénica que tiene mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona que comprenden, la transformación de una célula de una planta con un vector de expresión que contiene uno o más ácidos nucleicos IMI y la generación de la planta a partir de una célula de la planta. También se describe un método para controlar malas hierbas en la vecindad de una planta, que comprende la aplicación de un herbicida de imidazolinona a las malas hierbas y a la planta, en donde la planta tiene mayor tolerancia al herbicida de imidazolinona comparado con un variedad de tipo silvestre de la planta, y en donde la planta contiene uno o más ácidos nucleicos IMI. En algunas realizaciones preferidas de estos métodos, las plantas incluyen múltiples ácidos nucleicos IMI que están localizados sobre diferentes genomas de trigo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una alineación de secuencias de ADN del gen Als 2 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Ciccio de trigo Durum (SEQ ID NO: 11), el gen Als 2 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Colosseo de trigo Durum ( SEQ ID NO: 14), el gen Als 2 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Utopia de trigo Durum (SEQ ID NO: 16), y una secuencia de consenso del gen Als 2 de trigo Durum (SEQ ID NO: 19). No hay polimorfismos entre las variedades.

La Figura 2 muestra una alineación de una secuencias de ADN del gen Als 3 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Ciccio de trigo Durum (SEQ ID NO: 13), el gen Als 3 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Colosseo de trigo Durum ( SEQ ID NO: 15), el gen Als 3 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Utopia de trigo Durum (SEQ ID NO: 17), y una secuencia de consenso del gen Als 3 de trigo Durum (SEQ ID NO: 21). No hay polimorfismos entre las variedades.

La Figura 3 muestra una alineación de secuencia de ADN del gen Als 2 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Ciccio (SEQ ID NO: 11), el gen Als 2 amplificado a partir del ADN genómico de la línea Cl19 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 1), el gen Als 2 amplificado a partir del ADN genómico de la línea UT15 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 7), el gen Als 2 amplificado a partir del ADN genómico de la línea UT19 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 9) y una secuencia de consenso del gen Als 2 del trigo Durum (SEQ ID NO: 19). El polimorfismo del nucleótido que confiere la tolerancia a la imidazolinona a la línea Cl19 se indica en negrita.

La Figura 4 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Als 2 de la variedad Ciccio (SEQ ID NO: 12), la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Als 2 de la línea Cl19 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 2), la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Als 2 de la línea UT15 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 8), la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Als 2 de la línea UT19 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 10), y una secuencia de consenso Als 2 de trigo Durum (SEQ ID NO: 20). El polimorfismo que le confiere tolerancia a la imidazolinona a la línea Cl19 se indica en negrita.

La Figura 5 muestra una alineación de secuencia de ADN del gen Als 3 amplificado a partir del ADN genómico de la variedad Utopia (SEQ ID NO: 17), la secuencia parcial del polinucleótido Als 3 a partir del ADN genómico de la línea UT12 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO : 3), el gen Als 3 amplificado a partir del ADN genómico de la línea UT15 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 5), el gen Als 3 amplificado a partir del ADN genómico de la línea UT19 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 23), y una secuencia de consenso del gen Als 3 de trigo Durum (SEQ ID NO: 21). Los polimorfismos del nucleótido que confieren tolerancia a la imidazolinona a las líneas se indican en negrita.

La Figura 6 muestra una alineación de secuencia de aminoácidos de la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Als 3 de la variedad Utopia (SEQ ID NO: 18), la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia parcial del polinucleótido Als 3 de la línea UT12 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 4), la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Als 3 de la línea UT15 tolerante a la imidazolinona (SEQ ID NO: 6), la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Als 3 de la línea UT19 tolerante a la imidazolinonas (SEQ ID NO: 24), y una secuencia de consenso Als 3 de trigo Durum (SEQ ID NO: 22). El polimorfismo del nucleótido que confiere la tolerancia a la imidazolinona a la línea UT12 se indica en negrita.

La Figura 7 es una representación esquemática de las secuencias conservadas de aminoácidos en los genes AHAS implicados en la tolerancia a diferentes inhibidores de AHAS. El sitio específico del aminoácido para la tolerancia es indicado por medio de un subrayado. (Modificado a partir de Devine, M. D. y Eberlein, C.V., 1997, Physiological, biochemical and molecular aspects of herbicide tolerance based on altered target sites in Herbicide Activity: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press Amersterdam, páginas 159 - 185).

Descripción detallada

La presente invención está dirigida a plantas de trigo, partes de plantas de trigo, y células de plantas de trigo que tienen una mayor tolerancia a los herbicidas de imidazolinona. La presente invención también incluye semillas producidas por las plantas de trigo que se describen en este documento y métodos para controlar malas hierbas en la cercanía de las plantas de trigo que se describen en este documento. Debe entenderse que tal como se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones, "un" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se utiliza. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que al menos una célula puede ser utilizada.

Tal como se usa aquí, el término "planta de trigo" se refiere a una planta que es miembro del género Triticum. Las plantas de trigo de la presente invención pueden ser miembros de un género Triticum que incluye, pero no se limita a, T. aestivum, T. turgidum, T. timopheevii, T. monococcum, T. zhukovskyi, y T. uraftu, y sus híbridos. Los ejemplos de las subespecies T. aestivum incluidas en la presente invención son aestivum (trigo común), compactum (trigo club), Macha (trigo macha), vavilovi (trigo vavilovi), spelta, y sphaecrococcum (trigo shot). Los ejemplos de subespecies de T. turgidum incluidas dentro de la presente invención son turgidum, carthlicum, dicoccom, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicum y dicoccoides. Los ejemplos de las subespecies de T. monococcum incluidas en la presente invención son monococcum (einkorn) y aegilopoides. En una realización de la presente invención, la planta de trigo es un miembro de la especie Triticum turgidum; y, en particular, un miembro de la subespecie Durum, por ejemplo, una variedad de cultivo Ciccio, Colosseo, o Utopia.

El término "planta de trigo" pretende abarcar plantas de trigo en cualquier etapa de maduración o de desarrollo, así como cualquier tejido u órgano (partes de la planta) tomadas o derivadas de cualquiera de tales plantas a menos que se indique claramente lo contrario en el contexto. Las partes de las plantas incluyen, pero no se limitan a, tallos, raíces, flores, óvulos, estambres, hojas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, cultivos de anteras, gametófitos, esporofitos, polen, microsporas, protoplastos, y similares. La presente invención también incluye semillas producidas por las plantas de trigo de la presente invención. En una realización, las semillas son líneas genéticamente puras para una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la semilla de la planta de trigo.

La presente invención también abarca plantas de triticale, partes de las plantas de triticale y células de la planta de triticale que tienen una mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona. Como se utiliza aquí, una "planta de triticale" se refiere a una planta que es creada mediante el cruce de una planta de centeno (Secale cereale) ya sea con una planta de trigo tetraploide (por ejemplo Triticum turgidum) o una planta de trigo hexaploide (por ejemplo, Triticum aestivum). La presente invención también incluye semillas producida por las plantas de triticale descritas aquí y los métodos para controlar las malas hierbas en las proximidades de las plantas triticale descritas aquí.

La presente invención describe una planta de trigo que contiene al menos un ácido nucleico IMI, en donde la planta de trigo tiene mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Es posible para las plantas de trigo de la presente invención tener múltiples ácidos nucleicos IMI de diferentes genomas ya que estas plantas pueden contener más de un genoma. Por ejemplo, una planta de trigo Triticum turgidum contiene dos genomas, normalmente denominados como los genomas A y B. Debido a que se requiere una enzima metabólica AHAS, se asume que cada genoma tiene al menos un gen que codifica para la enzima AHAS (es decir, al menos un gen Als), comúnmente observado con otras enzimas metabólicas en trigo tetraploide que ha sido mapeado. Tal como se usa aquí, el término " locus del gen Als" se refiere a la posición de un gen Als sobre un genoma, y los términos "gen all" y "ácido nucleico Als" se refieren a un ácido nucleico que codifica a la enzima AHAS. El ácido nucleico Als sobre cada genoma se diferencia en su secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico Als sobre otro genoma. Alguien capacitado en el arte puede determinar el genoma de origen de cada ácido nucleico Als a través de cruce genético y / o ya sea métodos de secuenciación o métodos de digestión con exonucleasa conocidos por aquellos capacitados en el arte. Tal como se utiliza aquí, los términos "ácido nucleico Als 1", "ácido nucleico Als 2", y "ácido nucleico Als 3" se refieren a ácidos nucleicos Als situados sobre tres genomas diferentes. Para los propósitos de esta invención, el locus del gen Als 3 se localiza en el genoma A, y el locus del gen Als 2 se encuentra en el genoma B. También para los propósitos de esta invención, ácidos nucleicos IMI derivado a partir de los genomas A o B se distinguen y denominan como ácidos nucleicos Imi 3 o Imi 2, respectivamente.

Tal como se utiliza aquí, el término "ácido nucleico IMI" se refiere a un ácido nucleico Als que tiene una secuencia que está mutada a partir de un ácido nucleico Als de tipo silvestre y que confiere mayor tolerancia a imidazolinona a una planta en la cual se expresa. Tal como se utilizan aquí, los términos "ácido nucleico Imi 1", " ácido nucleico Imi 2", y "ácido nucleico Imi 3" son ácidos nucleicos IMI que se refieren a los alelos de tolerancia a la imidazolinona de los genes Als 1, Als 2, y Als 3 , respectivamente. Debido a que las plantas de trigo tiene dos copias de cada genoma, una planta de trigo contiene dos copias de cada ácido nucleico particular Als. Por ejemplo, una planta de trigo Triticum turgidum contiene dos copias de los genomas A y B, y por lo tanto dos copias de cada uno de los genes Als 2 y Als 3. Tal como se utiliza aquí, el término "alelo IMI" se refiere a una sola copia de un ácido nucleico particular IMI. En consecuencia, para los propósitos de la presente invención, una planta de trigo puede tener dos alelos Imi 2, uno en cada una de las dos copias del genoma B.

En otra modalidad, la planta de trigo contiene múltiples ácidos nucleicos IMI. Como se utiliza aquí, al describir una planta que contiene "múltiples ácidos nucleicos IMI", la frase "múltiples ácidos nucleicos IMI" se refiere a la presencia de diferentes ácidos nucleicos IMI en la planta y no a si la planta es homocigota o heterocigota en un locus Als particular. Por ejemplo, una planta que contiene múltiples ácidos nucleicos IMI puede incluir un ácido nucleico Imi 2 y un ácido nucleico Imi 3, en lugar de tener dos copias de un ácido nucleico Imi 2.

La clase Imi 2 de ácidos nucleicos incluye al ácido nucleico Imi 2 de las líneas Cl19, UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17 y UT20 descritas más adelante. La clase Imi 3 de ácidos nucleicos incluye al ácido nucleico Imi 3 de las líneas UT12, UT15 y UT19 descritas más adelante. Cada clase Imi puede incluir miembros de diferentes especies de trigo. Por lo tanto, cada clase Imi incluye ácidos nucleicos IMI que difieren en su secuencia de nucleótidos, pero que sin embargo se denominan como procedentes de, o están localizadas sobre, el mismo genoma de trigo utilizando estudios de herencia como es conocido por aquellos capacitados en el arte.

En consecuencia, la presente invención incluye una planta de trigo que contiene al menos un ácido nucleico IMI, en donde la planta de trigo tiene mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta y en donde al menos un ácido IMI se selecciona de entre un grupo que consiste de un ácido nucleico Imi 1, un ácido nucleico Imi 2, y un ácido nucleico Imi 3. En una realización, la planta comprende tanto un ácido nucleico Imi 2 como un ácido nucleico Imi 3. En una realización preferida, el ácido nucleico Imi 2 contiene la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, el ácido nucleico Imi 3 contiene la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 23.

La presente invención abarca también una planta de triticale tolerante a la imidazolinona. Como se usa aquí, una "planta triticale" se refiere a una planta que se crea mediante el cruce de una planta de centeno (Secale cereales), ya sea con una planta de trigo tetraploide (por ejemplo, Triticum turgidum) o una planta de trigo hexaploide (por ejemplo, Triticum aestivum). Para los fines de la presente invención, una planta de triticale tolerante a la imidazolinona contiene al menos un ácido nucleico IMI, en donde la planta triticale tiene una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta y en donde al menos un ácido nucleico IMI se selecciona de un grupo que consiste en un ácido nucleico Imi 1, un ácido nucleico Imi 2, y un ácido nucleico Imi 3. En una realización, la planta contiene tanto un ácido nucleico Imi 2 como un ácido nucleico Imi

3. En una realización preferida, el ácido nucleico Imi 2 comprende la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO:

1. En otra realización preferida, el ácido nucleico Imi 3 comprende la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 23.

Como se usa aquí con respecto a los ácidos nucleicos, el término "de" se refiere a un ácido nucleico "localizado en"

o "derivado de" un genoma particular. El término "localizado en" se refiere a un ácido nucleico contenido dentro de ese genoma particular. Como también se usa aquí con respecto a un genoma, el término "derivado de" se refiere a un ácido nucleico que ha sido removido o aislado de ese genoma. El término "aislado" se define con más detalle más adelante.

La presente invención incluye las plantas de trigo que contienen uno, dos, tres o más alelos IMI, en donde la planta de trigo tiene mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Los alelos IMI pueden incluir una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de un polinucleótido como el definido en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23; un polinucleótido que codifica un polipéptido tal como el definido en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, o la SEQ ID NO: 24; un polinucleótido que contiene al menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos antes mencionados; y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos antes mencionados. La presente invención también incluye plantas de triticale que contienen uno, dos, tres, o más alelos IMI, en donde la planta de triticale tiene mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Los alelos IMI pueden incluir una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de un polinucleótido como se define en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23; un polinucleótido que codifica un polipéptido como se define en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6, o la SEQ ID NO: 24; un polinucleótido que contiene al menos 60 nucleótidos consecutivos de cualquiera de los polinucleótidos antes mencionados; y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos antes mencionados.

En una realización, la planta de trigo o la planta de triticale constan de dos diferentes ácidos nucleicos IMI, donde los ácidos nucleicos se derivan de o se localizan en diferentes genomas del trigo. Preferiblemente, los dos ácidos nucleicos son un ácido nucleico Imi 2 y un ácido nucleico Imi 3. Más preferiblemente, el ácido nucleico Imi 2 contiene la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y el ácido nucleico Imi 3 contiene la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23. En otra realización, la planta de trigo o la planta de triticale contienen un ácido nucleico IMI, en donde el ácido nucleico incluye la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23. En aún otra realización, la planta de trigo contiene más de dos ácidos nucleicos IMI en donde cada ácido nucleico IMI es de un genoma diferente. Preferiblemente, al menos uno de los ácidos nucleicos IMI contiene una secuencia de polinucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23.

En una realización preferida de la presente invención, el aislado de ácido nucleico IMI aislado codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una mutación en un dominio que se conserva entre diferentes proteínas AHAS. Estos dominios conservados se denominan aquí como Dominio A, Dominio B, Dominio C, Dominio D, y Dominio E. La Figura 7 muestra la ubicación general de cada dominio en una proteína AHAS. El Dominio A contiene la secuencia de aminoácidos AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO: 25). El Dominio B contiene la secuencia de aminoácidos QWED (SEQ ID NO: 26). El Dominio C contiene la secuencia de aminoácidos VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO: 27). El Dominio D contiene la secuencia de aminoácidos AFQETP (SEQ ID NO: 28). El Dominio E contiene la secuencia de aminoácidos IPSGG (SEQ ID NO: 29). La presente invención también contempla que pueden existir ligeras variaciones en los dominios conservados, por ejemplo, en plantas cockleber, el residuo de serina en el Dominio E se sustituye por un residuo de alanina.

En consecuencia, la presente invención incluye una planta de trigo que contiene un ácido nucleico IMI que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación en un dominio conservado seleccionado del grupo que consiste de un Dominio A, un Dominio B, un Dominio C, un Dominio D, y un Dominio E. En una realización, la planta de trigo contiene un ácido nucleico IMI que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene una mutación en un Dominio E. En otras realizaciones preferidas, las mutaciones en los dominios conservados se producen en los lugares indicados por el subrayado siguiente: AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO: 25); QWED (SEQ ID NO: 26); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO: 27); AFQETP (SEQ ID NO: 28), e IPSGG (SEQ ID NO: 29). Una sustitución preferida es asparagina por serina en el Dominio E.

El herbicida de imidazolinona puede seleccionarse de, pero no se limita a, PURSUIT® (imazetapir), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox), SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazetabenz), ARSENAL® (imazapir), un derivado de cualquiera de los herbicidas anteriormente mencionados, o una mezcla de dos o más de los herbicidas antes mencionados, por ejemplo, imazapir / imazamox (ODYSSEY®). Más específicamente, el herbicida de imidazolinona puede seleccionarse de, pero no se limita a, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin-2-il)nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-3-quinolincarboxílico, ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metilnicotínico, y una mezcla de metil 6-(4-isopropil4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-m-toluato, y metil 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-p-toluato. Se prefiere el uso del ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico y del ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico. Se prefiere particularmente el uso del ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico.

Las plantas de trigo que se describen en este documento pueden ser ya sea plantas de trigo transgénicas o plantas de trigo no transgénicas. De manera similar, las plantas de triticale aquí pueden ser ya sea plantas transgénicas de triticale o plantas no transgénicas de triticale. Tal como se usa aquí, el término "transgénico" se refiere a cualquier planta, célula de la planta, callo, tejido de la planta, o parte de la planta, que contiene la totalidad o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante está integrado en forma estable en un cromosoma o elemento extra-cromosómico estable, de modo que es pasado a las generaciones sucesivas. Para los propósitos de la invención, el término "polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que ha sido alterado, reordenado, o modificado por medio de ingeniería genética. Los ejemplos incluyen cualquier polinucleótido o polinucleótidos clonados, que estén enlazados o unidos a secuencias heterólogas. El término "recombinante" no se refiere a alteraciones de polinucleótidos que se derivan de los eventos que ocurren naturalmente, tales como mutaciones espontáneas, o de mutagénesis no espontánea seguida por fitomejoramiento. Las plantas que contienen mutaciones que surgen debido a mutagénesis no espontánea y fitomejoramiento selectivo se denominan aquí como plantas no transgénicas y se incluyen en la presente invención. En realizaciones en las que la planta de trigo es transgénica y contiene múltiples ácidos nucleicos IMI, los ácidos nucleicos se pueden derivar de diferentes genomas o del mismo genoma. Alternativamente, en realizaciones en donde la planta de trigo es no transgénica y contiene múltiples ácidos nucleicos IMI, los ácidos nucleicos se encuentran en diferentes genomas o en el mismo genoma.

Un ejemplo de una línea de una planta de trigo no transgénica que contiene un ácido nucleico IMI es la línea de planta depositada con el ATCC bajo el Número de Designación del Depósito de la Patente PTA-4919 y denominada aquí como la línea de trigo UT15. La línea de trigo UT15 contiene un ácido nucleico Imi 3. La secuencia de nucleótidos correspondiente al locus del gen Als 3 en la línea UT15 es mostrada en la SEQ ID NO: 5. Otro ejemplo de una línea de una planta de trigo no transgénica que contiene un ácido nucleico IMI es la línea de la planta depositada con el ATCC bajo el Número de Designación de Depósito de la Patente PTA-4922. La secuencia de nucleótidos correspondiente el locus del gen Als 3 en la línea UT19 es idéntica a una secuencia de polinucleótidos como la definida en la SEQ ID NO: 23.

Se hicieron depósitos separados de aproximadamente 2500 semillas cada una de las líneas de trigo tolerantes a la imidazolinona con la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia el 7 de enero de 2003 y el 28 de enero de 2003. Estos depósitos fueron hechos de acuerdo con los términos y provisiones del Tratado de Budapest con relación al depósito de microorganismos. Los depósitos fueron hechos durante un término de al menos treinta años y al menos cinco años después de recibir la solicitud más reciente para el suministro de una muestra del depósito por parte de la ATCC. A las semillas depositadas se les otorgaron los Números de Designación de Depósito de la Patente PTA-4919, y PTA-4922.

La presente invención incluye a la planta de trigo que tiene un Número de Designación de Depósito de la Patente, PTA-4919, o PTA-4922 ; un derivado mutante, recombinante, o modificado por medio de ingeniería genética de la planta con el Número de Designación de Depósito de la Patente PTA-4919, o PTA-4922; cualquier progenie de la planta con el Número de Designación de Depósito de la Patente PTA-4919, o PTA-4922; y una planta que es la progenie de cualquiera de estas plantas. En una realización preferida, la planta de trigo de la presente invención tiene adicionalmente las características de tolerancia al herbicida de la planta con el Número de Designación de Depósito de la Patente PTA-4919, PTA-4922.

También se incluyen en la presente invención híbridos de las plantas de trigo descritas aquí y otra planta de trigo. La otra planta de trigo incluye, pero no se limita a, T. aestivum L. cv Fidel y cualquier planta de trigo que albergue un gen mutante FS-1, FS-2, FS-3 o FS-4. (Véase la patente de los Estados Unidos No. 6.339.184 y la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 08/474.832). Los híbridos preferidos contienen una combinación de los ácidos nucleicos Imi 1, Imi 2, y/o Imi 3.

Los términos "variedad cultivada" y "variedad" se refieren a un grupo de plantas dentro de una especie definidas por el intercambio de un conjunto común de características o rasgos aceptados por aquellos capacitados en la técnica como suficientes para distinguir una variedad cultivada o variedad de otra variedad cultivada o variedad. No hay ninguna implicación en cualquiera de los términos de que todas las plantas de cualquier variedad cultivada o variedad dada serán genéticamente idénticas, ya sea a nivel molecular o del gen completo, o que cualquier planta dada será homocigota en todos los loci. Una variedad cultivada o variedad se considera "una línea genéticamente pura" para un rasgo en particular si, cuando la variedad cultivada o la variedad de la línea genéticamente pura es autógama, y todos los descendientes contienen el rasgo. Los términos "línea de reproducción" o "línea" se refieren a un grupo de plantas dentro de una variedad cultivada definidas por el intercambio de un conjunto común de características o rasgos aceptados por los expertos en la técnica como suficientes para distinguir una línea de reproducción o línea de otra línea de reproducción o línea. No existe ninguna implicación en cualquiera de los términos de que todas las plantas de cualquier línea de reproducción dada o línea será genéticamente idéntica, ya sea a nivel del gen completo o a nivel molecular, o de que cualquier planta dada será homocigota en todos los loci. Una línea de reproducción o línea se considera una "línea genéticamente pura" para un rasgo en particular si, cuando la línea genéticamente pura o la línea de reproducción es autógama, todos los descendientes contienen el rasgo. En la presente invención, el rasgo surge de una mutación en un gen Als de la planta de trigo o de triticale o la semilla.

Se debe entender que la planta de trigo o de triticale de la presente invención puede contener un ácido nucleico Als de tipo silvestre, además de un ácido nucleico IMI. Se contempla que las líneas tolerantes a la imidazolinona pueden contener una mutación en sólo una de las múltiples isoenzimas AHAS. Por lo tanto, la presente invención incluye una planta de trigo o de triticale que contiene uno o más ácidos nucleicos IMI además de uno o más ácidos nucleicos Als de tipo silvestre.

Además de plantas de trigo y de triticale, la presente invención abarca proteínas y ácidos nucleicos aislados IMI. Los ácidos nucleicos comprenden un polinucleótido seleccionado del grupo que consta de un polinucleótido de la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23; un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 6, o la SEQ ID NO: 24; y un polinucleótido complementario a cualquiera de los polinucleótidos antes mencionados. En una realización preferida, el ácido nucleico IMI comprende una secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

El término "proteína AHAS" o "polipéptido AHAS" se refiere a una proteína acetohidroxiácido sintasa de tipo silvestre, y el término "proteína IMI" se refiere a cualquier proteína AHAS que es mutada a partir de una proteína AHAS de tipo silvestre y que confiere una mayor tolerancia a la imidazolinona a una planta, célula de la planta, parte de la planta, semilla de la planta, o tejido de la planta cuando se expresa en la misma. En una realización preferida, la proteína IMI comprende un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23. Como también se usa aquí, los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se refieren al ARN o ADN que es lineal o ramificado, monocatenario o bicatenario, o un híbrido de los mismos. El término también abarca híbridos de ADN / ARN. Estos términos incluyen también la secuencia no traducida localizada en ambos extremos 3' y 5' de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de la secuencia, secuencia arriba desde el extremo 5' de la región codificante y por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos de secuencia, secuencia abajo desde el extremo 3' de la región codificante del gen. Bases menos comunes, tales como inosina, 5-metilcitosina, 6-metiladenina, hipoxantina, y otras también pueden utilizarse para ARNbi (ARN bicatenario), y apareamiento del ribozima. Por ejemplo, los polinucleótidos que contienen análogos de propino C-5 de uridina y citidina han demostrado que se unen al ARN con una alta afinidad y que son inhibidores potentes antisentido de la expresión génica. Otras modificaciones, tales como la modificación con la columna vertebral fosfodiéster, o la 2'-hidroxi en el grupo del azúcar ribosa del ARN, también se pueden hacer. Los polinucleótidos antisentido y los ribozimas pueden consistir enteramente en ribonucleótidos, o pueden contener ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos mezclados. Los polinucleótidos de la invención pueden ser producidos por cualquier medio, incluyendo preparaciones genómicas, preparaciones de ADNc, síntesis in vitro, RT-PCR, y transcripción in vitro o in vivo.

Una molécula "aislada" de ácido nucleico es una que está sustancialmente separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico (es decir, secuencias que codifican otros polipéptidos). Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" es libre de algunas de las secuencias que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, las secuencias localizadas en los extremos 3' y 5' del ácido nucleico) en su replicón de origen natural. Por ejemplo, un ácido nucleico clonado se considera aislado. En diversas realizaciones, la molécula aislada de ácido nucleico IMI puede contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico (por ejemplo, una célula de Triticum turgidum). Un ácido nucleico aislado también se considera aislado si ha sido alterado por la intervención humana, o colocado en un locus o ubicación que no es su sitio natural, o si se introduce en una célula por medio de agroinfección, biolística, o cualquier otro método de transformación de plantas . Además, una molécula "aislada" de ácido nucleico, tal como una molécula de ADNc, puede estar libre de una parte del otro material celular con el que está asociado de forma natural, o medio de cultivo cuando es producido por medio de técnicas recombinantes, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando es sintetizado químicamente.

Específicamente excluidos de la definición de "ácidos nucleicos aislados" están: cromosomas de origen natural (tales como dispersiones cromosómicas), bibliotecas de cromosomas artificiales, bibliotecas genómicas y bibliotecas de ADNc que existen ya sea como una preparación in vitro de ácido nucleico o como una preparación de células huésped transfectadas / transformadas, en el que las células huésped son o bien una preparación heterogénea in vitro o sembrada en placa como una población heterogénea de colonias individuales. También se excluyen específicamente las bibliotecas anteriores en donde un ácido nucleico especificado representa menos del 5% del número de inserciones de ácido nucleico en las moléculas vector. Más específicamente excluidos están las preparaciones de ARN de células enteras o el ADN genómico de células enteras (incluidas las preparaciones de células enteras que están cortadas mecánicamente o digeridas enzimáticamente). Aún más específicamente excluidas está las preparaciones de células enteras que se encuentran ya sea como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis en donde el ácido nucleico de la invención no ha sido separado adicionalmente de los ácidos nucleicos heterólogos en el medio de electroforesis (por ejemplo, separación adicional por medio de escisión de una sola banda a partir de una población de bandas heterogéneas en un gel de agarosa o transferencia a una membrana de nylon).

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contenga una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23, o una porción de las mismas, se puede aislar utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de la secuencia suministrada en este documento. Por ejemplo, se puede aislar ADNc IMI de T. turgidum de una biblioteca de T. turgidum utilizando la totalidad o una porción de la secuencia de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 23. Además, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que comprende todo o una porción de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 23 por medio de la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleótidos diseñados con base en esta secuencia. Por ejemplo, se puede aislar el ARNm a partir de las células de las plantas (por ejemplo, por medio del procedimiento de extracción de guanidinio - tiocianato de Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294 - 5299), y se puede preparar ADNc utilizando transcriptasa inversa (por ejemplo, transcriptasa inversa MLV de Moloney, disponible con Gib-Gibco / BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa AMV, disponible con Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Se pueden diseñar iniciadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación por medio de la reacción en cadena de la polimerasa con base en la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede ser amplificada utilizando ADNc o, alternativamente ADN genómico, como molde e iniciadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por medio de la PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada puede ser clonada en un vector apropiado y caracterizado por medio de análisis de secuencia del ADN. Además, se pueden preparar los oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos IMI por medio de técnicas estándar de síntesis, por ejemplo, utilizando un sintetizador automático de ADN.

Los ácidos nucleicos IMI de la presente invención puede incluir secuencias que codifican una proteína IMI (es decir, "regiones de codificación"), así como secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden incluir sólo las regiones de codificación de un gen IMI, o pueden contener fragmentos genómicos completos aislados a partir de ADN genómico. Una región de codificación de estas secuencias se indica como una "posición ORF". Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir una porción de una región de codificación de un gen IMI, por ejemplo, un fragmento que puede ser utilizado como una sonda o iniciador. Las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación de los genes IMI de T. turgidum permiten la generación de sondas e iniciadores diseñados para su uso en la identificación y / o clonación de homólogos de IMI en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de IMI de otras plantas de trigo y especies relacionadas. La porción de la región de codificación también puede codificar un fragmento biológicamente activo de una proteína IMI.

Tal como se usa aquí, el término "porción biológicamente activa de" una proteína IMI pretende incluir una porción, por ejemplo, un dominio / motivo, de una proteína IMI que, cuando se produce en una planta incrementa la tolerancia de la planta a un herbicida de imidazolinona en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta. Los métodos para la cuantificación de una mayor tolerancia a los herbicidas de imidazolinona se suministran en los Ejemplos más adelante. Las porciones biológicamente activas de una proteína IMI incluyen péptidos derivados de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24 que incluyen menos aminoácidos que una proteína IMI de longitud completa e imparten una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona después de la expresión en una planta. Típicamente, las porciones biológicamente activas (por ejemplo, los péptidos que tienen, por ejemplo, 5,10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50,100, o más aminoácidos de longitud) incluyen un dominio o motivo con al menos una actividad de una proteína IMI. Además, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas en las que otras regiones del polipéptido están suprimidas, por medio de técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades descritas en este documento. Preferiblemente, las porciones biológicamente activas de una proteína IMI incluyen uno o más dominios conservados seleccionados del grupo que consiste de un Dominio A, un Dominio B, un Dominio C, un Dominio D, y un Dominio E, en el que el dominio conservado contiene una mutación.

La invención también proporciona polipéptidos quiméricos o de fusión IMI. Como se usa aquí, un "polipéptido quimérico" o un "polipéptido de fusión" IMI incluyen un polipéptido IMI operativamente enlazado a un polipéptido no IMI. Un "polipéptido no IMI" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que no es sustancialmente idéntica a la de un polipéptido IMI, por ejemplo, un polipéptido que no es una isoenzima IMI, en donde el péptido realiza una función diferente a la de un polipéptido IMI. Tal como se usa aquí con respecto al polipéptido de fusión, el término "operativamente enlazado" pretende indicar que el polipéptido IMI y el polipéptido no IMI se fusionan entre sí de tal manera que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido no IMI se puede fusionar al terminal N o al terminal C del polipéptido IMI. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión es un polipéptido de fusión GST-IMI en el cual se fusiona la secuencia de IMI con el terminal C de la secuencia de GST. Tales polipéptidos de fusión puede facilitar la purificación de polipéptidos recombinantes IMI. En otra realización, el polipéptido de fusión es un polipéptido IMI que contiene una secuencia señal heteróloga en su terminal N. En ciertas células huésped (por ejemplo, las células huésped de mamífero), la expresión y / o secreción de un polipéptido IMI se puede aumentar mediante el uso de una secuencia señal heteróloga.

Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido IMI que tiene una identidad de secuencia con un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos de la SEQID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23, pueden ser creada mediante la introducción de una o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23 de tal manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en el polipéptido codificado. Se pueden introducir modificaciones en una secuencia de la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23 mediante técnicas estándar, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, se realizan sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la cual el residuo aminoácido se remplaza con un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina , tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina), y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo , tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, un residuo aminoácido no esencial predicho en un polipéptido IMI es preferiblemente remplazado con otro residuo aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra realización, se pueden introducir mutaciones en forma aleatoria a lo largo de toda o parte de una secuencia de codificación IMI, tal como por medio de mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden ser seleccionados por una actividad IMI descrita aquí para identificar mutantes que retienen actividad IMI. Después de la mutagénesis de la secuencia de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23, el polipéptido codificado puede ser expresado en forma recombinante y la actividad del polipéptido se puede determinar analizando la tolerancia a la imidazolinona de una planta que expresa al polipéptido como se describe en los Ejemplos que se presentan más adelante.

Para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, se alinean las secuencias con el propósito de una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en la secuencia de un polipéptido para una alineación óptima con el otro polipéptido). Se comparan luego los residuos aminoácidos en las correspondientes posiciones de los aminoácidos. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo aminoácido en la correspondiente posición en la otra secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Se puede hacer el mismo tipo de comparación entre dos secuencias de ácido nucleico. El porcentaje de identidad de secuencia entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el porcentaje de identidad de secuencia = número de posiciones idénticas / número total de posiciones x 100). Para los propósitos de la invención, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos o de polipéptidos se determina utilizando el paquete de software Vector NTI

6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Una penalización por abertura de un hueco de 15 años y una penalización por extensión del hueco de 6,66 se utilizan para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos. Una penalización por abertura de un hueco de 10 y una penalización por extensión del hueco de 0,1 se utilizan para determinar el porcentaje de identidad de dos polipéptidos. Todos los demás parámetros se establecen en las configuraciones predeterminadas.

Debe entenderse que para los propósitos de determinar la identidad de secuencia, cuando se compara una secuencia de ADN con una secuencia de ARN, un nucleótido de timidina es equivalente a un nucleótido de uracilo. Preferiblemente, los polipéptidos IMI aislados incluidos en la presente invención son aproximadamente al menos 50 60%, preferiblemente aproximadamente al menos 60 - 70%, y más preferiblemente aproximadamente al menos 70 75%, 75 - 80%, 80 - 85 %, 85 - 90%, o 90 - 95%, y lo más preferible aproximadamente al menos 96, 97%, 98%, 99%, o más idénticos a una secuencia entera de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 24. En otra realización, los polipéptidos IMI aislados incluidos en la presente invención son aproximadamente al menos 50 - 60%, preferiblemente aproximadamente al menos 60 - 70%, y más preferiblemente aproximadamente al menos 70 - 75%, 75 -80%, 80 - 85 %, 85 - 90%, o 90 -95%, y lo más preferible aproximadamente al menos 96%, 97%, 98%, 99%, o más idénticos a una secuencia entera de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 24. Adicionalmente, se pueden crear ácidos nucleicos IMI optimizados. Preferiblemente, un ácido nucleico IMI optimizado codifica un polipéptido IMI que modula la tolerancia de una planta a herbicidas de imidazolinona, y más preferiblemente aumenta la tolerancia de una planta a un herbicida de imidazolinona por su sobreexpresión en la planta. Como se utiliza aquí, "optimizado" se refiere a un ácido nucleico que está modificado por ingeniería genética para incrementar su expresión en una planta

o animal dado. Para proporcionar ácidos nucleicos IMI optimizados de una planta, se puede modificar la secuencia de ADN del gen para que 1) incluya los codones preferidos por medio de genes de la planta altamente expresados; 2) incluya un contenido de A + T en la composición base de nucleótidos con aquella sustancialmente encontrada en las plantas; 3) forme una secuencia de iniciación de la planta, 4) elimine secuencias que provoquen desestabilización, poliadenilación inadecuada, degradación y terminación del ARN, o forme horquillas de estructura secundaria o de los sitios de empalme del ARN. Se puede lograr una mayor expresión de ácidos nucleicos IMI en plantas por medio de la utilización de la frecuencia de distribución del uso del codón en plantas en general o en una planta en particular. Los métodos para optimización de la expresión del ácido nucleico en las plantas se pueden encontrar en los documentos EPA 0359472; EPA 0385962; la solicitud PCT número WO 91/16432; la patente de los Estados Unidos No. 5.380.831; la patente de los Estados Unidos No. 5.436.391; Perlack et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 88: 3324 - 3328; y Murray et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477 - 498.

Como se utiliza aquí, "frecuencia de uso del codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Para determinar la frecuencia de uso de un codón particular en un gen, el número de ocurrencias de ese codón en el gen se dividen por el número total de ocurrencias de todos los codones que especifican el mismo aminoácido en el gen. De manera similar, la frecuencia de uso del codón preferido exhibida por una célula huésped puede ser calculada por medio de una frecuencia promedio del uso del codón preferido en una gran cantidad de genes expresados por la célula huésped. Es preferible que este análisis se limite a genes que sean altamente expresados por la célula huésped. El porcentaje de desviación de la frecuencia de uso del codón preferido para un gen sintético a partir de aquel empleado por una célula huésped se calcula primero mediante la determinación del porcentaje de desviación de la frecuencia de uso de un solo codón de aquel de la célula huésped seguido por la obtención de la desviación promedio sobre todos los codones. Tal como se define en este documento, este cálculo incluye los codones únicos (es decir, ATG y TGG). En términos generales, la desviación promedio total del uso del codón de un gen optimizado a partir de aquella de una célula huésped se calcula utilizando la ecuación 1A = n = 1 Z Xn-Yn Xn veces 100 Z donde Xn = frecuencia de uso para el codón n en la célula huésped; Yn = frecuencia de uso del codón n en el gen sintético; n representa un codón individual que especifica un aminoácido; y el número total de codones es Z. La desviación total de la frecuencia de uso del codón, A, para todos los aminoácidos debe ser preferiblemente aproximadamente menor al 25%, y más preferiblemente aproximadamente menor al 10%.

Por lo tanto, un ácido nucleico IMI puede ser optimizado de tal manera que su frecuencia de distribución de uso del codón se desvía, preferiblemente, no más del 25% de aquella de los genes de la planta altamente expresados y, más preferiblemente aproximadamente no mas del 10%. Además, se tiene en cuenta el contenido de G + C en porcentaje de la tercera base degenerada (las monocotiledóneas parecen favorecer G + C en esta posición, mientras que las dicotiledóneas no lo hacen). También es reconoce que el nucleótido XCG (donde X es A, T, C o G) es el codón menos preferido en dicotiledóneas mientras que el codón XTA es evitado tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Los ácidos nucleicos IMI optimizados de esta invención tienen preferiblemente índices de evitación del doblete CG y TA muy cercanos a aquellos de la planta huésped escogida (es decir, Triticum turgidum). Más preferiblemente, estos índices se desvían de aquel del huésped aproximadamente no mas del 10 al 15%.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican a los polipéptidos IMI descritos anteriormente, otro aspecto de la invención se relaciona con moléculas aisladas de ácido nucleico que son antisentido a las mismas. Se cree que los polinucleótidos antisentido inhiben la expresión del gen de un polinucleótido objetivo enlazando específicamente al polinucleótido objetivo e interfiriendo con la transcripción, el empalme, el transporte, la traducción y / o la estabilidad del polinucleótido objetivo. Se describen métodos en el estado del arte para dirigir al polinucleótido antisentido al ADN cromosómico, a un transcrito de ARN primario o a un ARNm procesado. Preferiblemente, las regiones objetivo incluyen sitios de empalme, codones de iniciación de la traducción, codones de terminación de la traducción, y otras secuencias dentro del marco de lectura abierto.

El término "antisentido", para los propósitos de la invención, se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que es suficientemente complementario con todo o con una porción de un gen, transcrito primaria, o ARNm procesado, para interferir con la expresión del gen endógeno. Polinucleótidos "complementarios" son aquellos que son capaces de apareamiento de bases de acuerdo con las reglas estándar de complementariedad de Watson-Crick. Específicamente, las purinas se aparearán con las pirimidinas para formar una combinación de guanina apareada con citosina (G:C) y adenina apareada ya sea con timina (A:T) en el caso del ADN, o adenina apareado con uracilo (A:U) en el caso del ARN. Se entiende que dos polinucleótidos pueden hibridar entre sí, incluso si no son completamente complementarios entre sí, ya que cada una tiene al menos una región que es sustancialmente complementaria con la otra. El término "ácido nucleico antisentido" incluye casetes de expresión de ARN monocatenario, así como de ADN bicatenario que pueden ser transcritos para producir un ARN antisentido.Ácidos nucleicos antisentido "activos" son moléculas de ARN antisentido que son capaces de hibridar selectivamente con un transcrito primario o un ARNm que codifica un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia del polipéptido de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 24.

Además de los ácidos nucleicos IMI y de los polipéptidos descritos anteriormente, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y los polipéptidos unidos a una fracción. Estas fracciones incluyen, pero no se limitan a, fracciones de detección, fracciones de hibridación, fracciones de purificación, fracciones de suministro, fracciones de reacción, fracciones de enlazamiento, y similares. Un grupo típico de ácidos nucleicos que tiene fracciones unidas son las sondas y los iniciadores. Las sondas y los iniciadores comprenden típicamente un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido típicamente comprende una región de secuencia de nucleótidos que hibrida bajo condiciones rigurosas con aproximadamente al menos 12, preferiblemente aproximadamente 25, más preferiblemente aproximadamente 40, 50, o 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 23, una secuencia antisentido de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 , o SEQ ID NO: 23, o mutantes de origen natural de los mismos. Los iniciadores con base en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, o SEQ ID NO: 23 pueden ser utilizados en reacciones PCR para clonar homólogos de IMI. Las sondas con base en las secuencias de nucleótidos IMI pueden ser utilizadas para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican los mismos polipéptidos o polipéptidos homólogos. En realizaciones preferidas, la sonda incluye además un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de una enzima. Tales sondas pueden ser utilizadas como parte de un kit de análisis de un marcador genómico para identificar células que expresan un polipéptido IMI, por ejemplo mediante la medición del nivel de un ácido nucleico que codifica IMI, en una muestra de células, por ejemplo, detectando los niveles de ARNm para IMI o determinando si un gen IMI genómico ha sido mutado o suprimido.

La invención proporciona además un vector de expresión recombinante aislado que contiene un ácido nucleico IMI como se describió anteriormente, en donde la expresión del vector en una célula huésped da como resultado una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona, en comparación con una variedad de tipo silvestre de la célula huésped. Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular dentro del cual se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ADN dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped dentro de la cual son introducidos (por ejemplo, los vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) están integrados dentro del genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y por lo tanto son replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes con los cuales están operativamente enlazados. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido " y "vector" pueden ser utilizados indistintamente, ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, y virus adeno-asociados), que sirven funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante de la invención incluyen un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas con base en las células huésped que son utilizadas para expresión, que está operativamente enlazadas a la secuencia de ácido nucleico que es expresada. Con respecto a un vector de expresión recombinante, "operativamente enlazado" pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés está enlazada a la(s) secuencia(s) reguladora(s) en una forma que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción / traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce dentro de la célula huésped). El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, reforzadores, y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) y Gruber y Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick y Thompson, capítulo 7, 89 - 108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluidas las referencias citadas allí. Las secuencias reguladoras incluyen a aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped y a aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células huésped o bajo ciertas condiciones. Se apreciará por parte de aquellos capacitados en el arte que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a ser transformada, del nivel de expresión de polipéptido deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden ser introducidos en células huésped para producir con ello polipéptidos o péptidos, incluyendo polipéptidos o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe aquí (por ejemplo, polipéptidos IMI, polipéptidos de fusión, etc.).

En una realización preferida de la presente invención, los polipéptidos IMI se expresan en plantas y en células de plantas, tales como células de plantas unicelulares (tales como algas) (ver Falciatore et al., 1999, Marine Biotechnology 1 (3): 239 - 251 y las referencias citadas allí) y células de plantas de plantas superiores (por ejemplo, las espermatofitas, tales como plantas de cultivo). Un polinucleótido IMI puede ser "introducido" en una célula de una planta por cualquier medio, incluyendo transfección, transformación o transducción, electroporación, bombardeo de partículas, agroinfección, biolística, y similares.

Los métodos adecuados para transformación o transfección de células huésped incluidas células de las plantas pueden ser encontrados en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Ya que una mayor tolerancia a herbicidas de imidazolinona es un rasgo general que se desea que sea heredado en una amplia variedad de plantas como el maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, cacahuate, algodón, colza y canola, yuca, pimienta, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especies Vicia, guisantes, alfalfa, plantas de arbusto (café, cacao, te), especies Salix, árboles (palma aceitera, coco), pastos perennes, y cultivos forrajeros, estas plantas de cultivo son también plantas objetivo preferidas para una modificación por ingeniería genética como una realización adicional de la presente invención. En una realización preferida, la planta es una planta de trigo. Los cultivos forrajeros incluyen, pero no se limitan a, hierba de trigo, alpiste, bromo, ballico, hierba verdiazul forrajera, dáctilo aglomerado, alfalfa, Salfoin, lotera, trébol híbrido, trébol rojo, y trébol de olor.

En una realización de la presente invención, la transfección de un polinucleótido IMI en una planta se logra por medio de transferencia de genes mediada por Agrobacterium. Un método de transformación conocido por aquellos capacitados en el arte es la inmersión de una planta de floración en una solución de Agrobacterias, en donde las Agrobacterias contienen el ácido nucleico IMI, seguido por fitomejoramiento de los gametos transformados. La transformación de una planta mediada por Agrobacterium puede ser llevada a cabo utilizando por ejemplo la cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90) (Koncz and Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383 - 396) o LBA4404 (Clontech). La transfomración se puede realizar por medio de técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere et al., 1994, Nucl. Acids. Res. 13: 4777 -4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. - Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995. - en Sect., Ringbuc Zentrale Signatur BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. y Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede ser transformada a través de la transformación del cotiledón o del hipocotiledón (Moloney et al., 1989, Plant Cell Report 8: 238 - 242; De Block et al., 1989, Plant Physiol. 91: 694 - 701). El uso de antibióticos para selección de la planta y de Agrobacterium depende del vector binario y de la cepa de Agrobacterium utilizada para la transformación. La selección de la colza se lleva a cabo normalmente utilizando kanamicina como marcador seleccionable para la planta. La transferencia de genes mediada por Agrobacterium al lino puede ser realizada utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994, Plant Cell Report 13: 282 - 285. Adicionalmente, la transformación de la soja se puede llevar a cabo utilizando por ejemplo una técnica descrita en la patente europea No. 0424 047, en la patente de los Estado Unidos No. 5.322.783, en la patente europea No. 0397 687, en la patente de los Estados Unidos No. 5.376.543, o en la patente de los Estados Unidos No. 5.169.770. La transformación del maíz se puede lograr por medio del bombardeo de partículas, incorporación de ADN mediada por polietilén glicol, o a través de la técnica de fibra de carburo de silicio. (Ver, por ejemplo, Freeling and Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la patente de los Estados Unidos No. 5.990.387, y un ejemplo específico de transformación del trigo se puede encontrar en la solicitud PCT No. WO 93/07256.

De acuerdo con la presente invención, el polinucleótido IMI introducido puede ser mantenido en la célula de la planta en forma estable si se lo incorpora en un replicón autónomo no cromosómico o si se lo integra en los cromosomas de la planta. Alternativamente, el polinucleótido IMI introducido puede estar presente sobre un vector no replicante extra cromosómico y ser expresado en forma transitoria o activo en forma transitoria. En una realización se puede crear un microorganismo recombinante homólogo en donde el polinucleótido IMI se integra en un cromosoma, se prepara un vector que contiene al menos una porción de un gen AHAS dentro del cual se ha introducido una supresión, adición, o sustitución para alterar así, por ejemplo, romper en forma funcional, al gen AHAS endógeno y para crear un gen IMI. Para crear una mutación puntual a través de recombinación homóloga, se pueden utilizar híbridos de ADN-ARN en una técnica conocida como quimeroplastia (Cole-Strauss et al., 1999, Nucleic Acids Research 27(5): 1323 - 1330 y Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3): 240 - 247). Otros procedimientos de recombinación homóloga en especies de Triticum son también bien conocidos en el arte y son contemplados para ser utilizados aquí.

En el vector de recombinación homóloga, el gen IMI puede estar flanqueado en sus extremos 5’ y 3’ por una molécula adicional de ácido nucleico del gen AHAS para permitir que ocurra la recombinación homóloga entre el gen IMI exógeno transportado por el vector y un gen AHAS endógeno, en un microorganismo o planta. La molécula adicional de ácido nucleico AHAS que flanquea es de longitud suficiente para recombinación homóloga exitosa con el gen endógeno. En forma típica, varios cientos de pares de bases hasta kilobases de ADN de flanqueo (tanto en los extremos 5’ como 3’) están incluidos en el vector (véase por ejemplo, Thomas, K. R., y Capecchi, M. R., 1987, Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homóloga o Strepp et al., 1998, PNAS, 95(8): 4368 4373 para recombinación con base en ADNc en Physcomitrella patens). Sin embargo, ya que el gen IMI normalmente se diferencia del gen AHAS en muy pocos aminoácidos, no siempre es necesaria una secuencia de flanqueo. El vector de recombinación homóloga se introduce en un microorganismo o célula de una planta (por ejemplo, a través de ADN mediado por polietilén glicol), y las células en las cuales el gen IMI introducido se han recombinado en forma homóloga con el gen AHAS endógeno se seleccionan utilizando técnicas conocidas en el arte.

En otra realización, se pueden producir microorganismos recombinantes que contienen sistemas seleccionados que permiten la expresión regulada del gen introducido. Por ejemplo, la inclusión de un gen IMI en un vector colocándolo bajo el control de un operón lac permite la expresión del gen IMI únicamente en presencia de IPTG. Tales sistemas reguladores son bien conocidos en el arte.

Ya sea que este presente en un vector no replicante extra cromosómico o un vector que se integra en un cromosoma, el polinucleótido IMI reside preferiblemente en un casete de expresión de la planta. Un casete de expresión de una planta contiene preferiblemente secuencias reguladoras capaces de dirigir la expresión génica en las células de la planta que están operativamente enlazadas de tal manera que cada secuencia pueda cumplir su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por medio de señales de poliadenilación. Las señales de poliadenilación preferidas son aquellas que se originan a partir del ADN-t de Agrobacterium tumefaciens tal como el gen 3 conocido como octopina sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales del mismo, pero también son adecuados todos los otros terminadores funcionalmente activos en las plantas. Como la expresión génica de la planta muy a menudo no está limitada a niveles transcripcionales, un casete de expresión de la planta contiene preferiblemente otras secuencias operativamente enlazadas como reforzadores de la traducción tal como la secuencia multiplicadora que contiene la secuencia líder no traducida 5’ del virus el mosaico del tabaco que mejora la relación del polipéptido por ARN (Gallie et al., 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693 - 8711). Los ejemplos de vectores de expresión de la planta incluyen aquellos detallados en: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195 1197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711 - 8721; and Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38.

La expresión génica de la planta debe estar operativamente enlazada a un promotor apropiado que confiere expresión génica en una forma oportuna preferida por el tipo de célula o preferida por el tejido. Los promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen cualquier promotor que sea capaz de iniciar la transcripción en una célula de la planta. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a, aquellos que pueden ser obtenidos a partir de plantas, virus de plantas, y bacterias que contienen genes que se expresan en plantas, tales como Agrobacterium y Rhizobium.

El promotor puede ser constitutivo, inducible, preferido de una etapa de desarrollo, preferido por el tipo de célula, preferido del tejido, o preferido del órgano. Los promotores constitutivos son activos bajo la mayoría de las condiciones. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen a los promotores 19S y 35S del CaMV (Odell et al., 1985, Nature 313: 810 - 812), al promotor 35S del CaMV sX (Kay et al., 1987, Science 236: 1299 - 1302), al promotor Sep1, al promotor de la actina del arroz (McElroy et al., 1990, Plant Cell 2: 163 - 171), al promotor de actina de Arabidopsis, al promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Molec Biol. 18: 675 - 689); pEmu (Last et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581 - 588), al promotor 35S del virus del mosaico de escrofularia, al promotor Smas (Velten et al., 1984, EMBO J. 3: 2723 - 2730), al promotor GRP1-8, al promotor de cinamilo alcohol deshidrogenasa (patente de los Estados Unidos No. 5.683.439), promotores del ADN-T de Agrobacterium, tales como manopina sintasa, nopalina sintasa, y octopina sintasa, la pequeña subunidad del promotor de ribulosa bifosfato carboxilasa (ssu-RUBISCO), y similares.

Los promotores inducibles son activos bajo ciertas condiciones ambientales, tales como la presencia o la ausencia de un nutriente o metabolito, calor o frío, luz, ataque por un patógeno, condiciones anaeróbicas, y similares. Por ejemplo, el promotor hsp80 de Brassica es inducido por choque térmico; el promotor PPDK es inducido por luz; el promotor PR-1 de tabaco, Arabidopsis, y maíz es inducible por infección con un patógeno; y el promotor Adh1 es inducido por hipoxia y estrés por frío. La expresión génica de la planta gene también puede ser facilitada a través de un promotor inducible (para revisión, véase Gatz, 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89 - 108). Los promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se desea una expresión génica específica en el tiempo. Los ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al., 1992, Plant J. 2: 397 - 404), y un promotor inducible por etanol (solicitud PCT No. WO 93/21334).

Los promotores preferidos de la etapa de desarrollo son preferencialmente expresados en ciertas etapas del desarrollo. Los promotores preferidos de órganos y tejidos incluyen a aquellos que son preferencialmente expresados en ciertos tejidos u órganos, tales como hojas, raíces, semillas, o xilema. Los ejemplos de promotores preferidos de tejidos y preferidos de órganos incluyen, pero no se limitan a promotores preferidos del fruto, preferidos del óvulo, preferidos del tejido macho, preferidos de la semilla, preferidos del integumento, preferidos del tubérculo, preferidos del tallo, preferidos del pericarpio, y preferidos de la hoja, preferidos del estigma, preferidos del polen, preferidos de la antera, preferidos del pétalo, preferidos del sépalo, preferidos del pedicelo, preferidos de la silicua, preferidos del tronco, preferidos de la raíz, y similares. Los promotores preferidos de la semilla son preferencialmente expresados durante el desarrollo y/o germinación de la semilla. Por ejemplo, los promotores preferidos de la semilla pueden ser preferidos del embrión, preferidos del endospermo, y preferidos del recubrimiento de la semilla. Véase, Thompson et al., 1989, BioEs-says 10:108. Los ejemplos de promotores preferidos de la semilla incluyen, pero no se limitan a celulosa sintasa (celA), Cim1, gamma-zeina, globulina-1, zeina de 19 kD del maíz (cZ19B1), y similares.

Otros promotores adecuados preferidos de tejidos o preferidos de órganos incluyen al promotor del gen de napina de colza (patente de los Estados Unidos No. 5.608.152), al promotor de USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991, Mol Gen Genet. 225(3): 459 - 67), al promotor de oleosina de Arabidopsis (solicitud PCT No. WO 98/45461), al promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (patente de los Estados Unidos No. 5.504.200), al promotor de Bce4 de Brassica (solicitud PCT No. WO 91/13980), o al promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2(2): 233 - 9), Así como promotores que confieren expresión específica de semilla en plantas monocotiledóneas como maíz, centeno, trigo, centeno, arroz, etc. Los promotores adecuados para resaltar son el promotor del gen lpt2 o lpt1 de cebada (solicitud PCT No. WO 95/15389 y solicitud PCT No. WO 95/23230) o aquellos descritos en la solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen de la hordeína de cebada, del gen de la glutelina del arroz, del gen de la orizina del arroz, el gen de la prolamina del arroz, el gen de la gliadina del trigo, el gel de la glutelina del trigo, el gen de la glutelina de la avena, el gen de la kasirina del sorgo, y el gen de la secalina del centeno).

Otros promotores útiles en los casetes de expresión de la invención incluyen, pero no se limitan a, el promotor principal de la proteína de enlazamiento de clorofila a/b, promotores de histona, al promotor Ap3, al promotor conglicina, al promotor de napina, al promotor de lectina de la soja, al promotor de zeina de 15 kD del maíz, al promotor de zeina de 22 kD, al promotor de zeina de 27 kD, al promotor de g-zeina, los promotores shrunken 1, shrunken 2, y bronce de cera, al promotor Zm13 (patente de los Estados Unidos No. 5.086.169), los promotores de poligalacturonasa de maíz (PG) (patente de los Estados Unidos Nos. 5.412.085 y 5.545.546), y al promotor SGB6 (patente de los Estados Unidos No. 5.470.359), así como promotores sintéticos u otros promotores naturales.

Se puede obtener flexibilidad adicional en el control de la expresión de un gen heterólogo en plantas por medio del uso de dominios de enlazamiento de ADN y elementos de respuesta de fuentes heterólogas (es decir, dominios de enlazamiento de ADN de fuentes no vegetales). Un ejemplo de tal dominio de enlazamiento de ADN heterólogo es el dominio de enlazamiento de ADN LexA (Brent y Ptashne, 1985, Cell 43: 729 - 736).

Otro aspecto de la invención se relaciona con células huésped dentro de las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" son usados indistintamente aquí. Se entiende que tales términos se refieren no solamente a la célula objetivo particular sino que también pueden aplicarse a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a que pueden presentarse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido ya sea a una mutación o a influencias medioambientales, tal progenie puede en realidad no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún se encuentran incluidas dentro del alcance del término tal como se lo utiliza aquí. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polinucleótido IMI puede ser expresado en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células de hongos, o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células vegetales, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Aquellos capcitado en el arte conocen otras células huésped adecuadas.

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, puede ser utilizada para producir (es decir, expresar) un polinucleótido IMI. Por lo tanto, la invención provee además métodos para producir polipéptidos IMI utilizando las células huésped de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (dentro de la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido IMI, o dentro de cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica un polipéptido IMI o de tipo silvestre) en un medio adecuado hasta que se produce el polipéptido IMI. En otra realización, el método comprende además el aislamiento de los polipéptidos IMI del medio o de la célula huésped. Otro aspecto de la invención se relaciona con polipéptidos IMI aislados, y con porciones biológicamente activas de los mismos. Un polipéptido “aislado” o “purificado” o una porción biológicamente activa del mismo está libre de algo del material celular cuando se lo produce por medio de técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se lo sintetiza químicamente. La expresión “sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de polipéptido IMI en las cuales se separa el polipéptido de algo de los componentes

celulares de las células en las cuales es producido en forma natural o recombinante. En una realización, la expresión

“sustancialmente libre de material celular” incluye preparaciones de un polipéptido IMI que tiene aproximadamente menos de 30% (en peso seco) de material no IMI (también denominado aquí como “polipéptido contaminante”), más

preferiblemente aproximadamente menos del 20% de material no IMI, aún más preferiblemente aproximadamente menos del 10% de material no IMI, y lo más preferible aproximadamente menos del 5% de material no IMI.

Cuando el polipéptido IMI, o una porción biológicamente activa del mismo, es producido en forma recombinante, está sustancialmente también preferiblemente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa aproximadamente menos del 20%, más preferiblemente aproximadamente menos del 10%, y lo más preferible

aproximadamente menos del 5% del volumen de la preparación del polipéptido. La expresión “sustancialmente libre de precursores químicos o de otras sustancias químicas” incluye preparaciones del polipéptido IMI en las cuales se separa al polipéptido IMI de precursores químicos o de otras sustancias químicas que están involucradas en la

síntesis del polipéptido. En una realización, la expresión “sustancialmente libre de precursores químicos o de otras sustancias químicas” incluye preparaciones de un polipéptido IMI que tienen aproximadamente menos de 30% (en peso seco) de precursores químicos o de sustancias químicas que no son IMI, más preferiblemente aproximadamente menos del 20% de precursores químicos o de sustancias químicas que no son IMI, aún más preferiblemente menos del 10% de precursores químicos o de sustancias químicas que no son IMI, y lo más preferible aproximadamente meno del 5% e precursores químicos o de sustancias químicas que no son IMI. En realizaciones preferidas, polipéptidos aislados, o porciones biológicamente activas de los mismos, la carencia de polipéptidos contaminantes del mismo organismo a partir de los cuales se deriva el polipéptido IMI. Típicamente, tales polipéptidos son producidos por medio de expresión recombinante, por ejemplo, de un polipéptido IMI de Triticum turgidum en plantas diferentes a Triticum turgidum, o en microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas, u hongos.

Las secuencias del polinucleótido y del polipéptido IMI de la invención tienen una variedad de usos. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la presente invención pueden ser utilizadas para transformar plantas, modulando por lo tanto la tolerancia de una planta a los herbicidas de imidazolinona. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir una planta transgénica que tiene mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona que comprende, (a) la transformación de la célula de una planta con uno o más vectores de expresión que contiene uno o más ácidos nucleicos IMI, y (b) la generación a partir de la célula de la planta de una planta transgénica con una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta. En un realización, los múltiples ácidos nucleicos IMI se derivan de diferentes genomas. También se incluyen en la presente invención métodos para producir una planta transgénica que tiene mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona que comprenden, (a) la transformación de una célula de una planta con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico IMI, en donde el ácido nucleico es un ácido nucleico no Imi 1 y (b) la generación a partir de la célula de la planta de una planta transgénica con una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta.

La presente invención incluye métodos para modificar la tolerancia de una planta a un herbicida de imidazolinona que comprenden la modificación de la expresión de uno o más ácidos nucleicos IMI. Preferiblemente, los ácidos nucleicos están localizados sobre, o se derivan de genomas diferentes. La tolerancia de la planta al herbicida de imidazolinona se puede aumentar o disminuir como se logra por medio del aumento o la disminución de la expresión de un polinucleótido IMI, respectivamente. Preferiblemente, la tolerancia de la planta al herbicida de imidazolinona se incrementa aumentando la expresión de un polinucleótido IMI. La expresión de un polinucleótido IMI puede ser modificada por medio de cualquier método conocido por aquellos capacitados en el arte. Los métodos para incrementar la expresión de los polinucleótidos IMI pueden ser utilizados en donde la planta sea o bien una planta transgénica o una no transgénica. En los casos en donde la planta es transgénica, la planta pude ser transformada con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican IMI descritos anteriormente, o la planta puede ser transformada con un promotor que dirija la expresión de polinucleótidos endógenos IMI en la planta, por ejemplo. La invención establece que tal promotor puede ser específico del tejido o regulado de acuerdo a la etapa de desarrollo. Alternativamente, las plantas no transgénicas pueden tener una expresión del polinucleótido endógeno IMI modificada por la inducción de un promotor nativo. La expresión de polinucleótidos que contienen una secuencia de polinucleótidos como se define en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 5, o la SEQ ID NO: 23 en plantas objetivo se puede lograr por medio de, pero sin limitarse a, uno de los siguientes ejemplos: (a) un promotor constitutivo, (b) un promotor inducido químicamente, y (c) la sobreexpresión de un promotor modificado genéticamente por ejemplo con factores de transcripción derivados de un dedo de zinc (Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657).̘

En una realización preferida, la transcripción del polinucleótido IMI se modula utilizando factores de transcripción derivados de un dedo de zinc (los ZFP) como se describe en Greisman y Pabo, 1997, Science 275: 657 y fabricado por Sangamo Biosciences, Inc. Estos ZFP contienen tanto un dominio de reconocimiento de ADN como un dominio funcional que provoca la activación o la represión de un ácido nucleico objetivo tal como un ácido nucleico IMI. Por lo tanto, se pueden crear ZFP de activación y represión que reconocen específicamente a los promotores del polinucleótido IMI descritos anteriormente y utilizarlos para incrementar o disminuir la expresión del polinucleótido IMI en una planta, modulando así la tolerancia de la planta al herbicida.

Como se describió detalladamente más arriba, las plantas producidas por medio de los métodos de la presente invención pueden ser plantas monocotiledóneos o dicotiledóneas. Las plantas se pueden seleccionar de maíz, trigo, centeno, avena, triticale, arroz, cebada, soja, cacahuate, algodón, colza y canola, yuca, pimienta, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especies Vicia, guisantes, alfalfa, café, cacao, te, especies Salix, palma aceitera, coco, pastos perennes, y cultivos forrajeros, por ejemplo. Los cultivos forrajeros incluyen, pero no se limitan a, hierba de trigo, alpiste, bromo, ballico, hierba verdiazul forrajera, dáctilo aglomerado, alfalfa, salfoin, lotera, trébol híbrido, trébol rojo, y trébol de olor. En una realización preferida, la planta es una planta de trigo. En cada uno de los métodos descritos anteriormente, la célula de la planta incluye, pero no se limita a, un protoplasto, una célula que produce gametos, y una célula que se regenera en una planta completa. Como se utiliza

aquí, el término “transgénico” se refiere a cualquier planta, célula de una planta, callo, tejido de una planta, o parte

de una planta, que contiene todo o parte de al menos un polinucleótido recombinante. En muchos casos, todo o parte del polinucleótido recombinante está integrado en forma estable dentro de un cromosoma o elemento extra cromosómico estable, para que sea pasado a generaciones sucesivas.

Como se describió anteriormente, la presente invención enseña composiciones y métodos para incrementar la tolerancia a la imidazolinona de una planta de trigo o semilla comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta o la semilla. En una realización preferida, la tolerancia a la imidazolinona de una planta de trigo o semilla se incrementa para que la planta o la semilla puedan resistir la aplicación del herbicida de imidazolinona aproximadamente preferiblemente de 10 - 400 g ai ha-1, más preferiblemente 20 - 60 g ai ha-1, y lo más preferible 40

-: 80 g ai ha-1. Como se utiliza aquí, por “resistencia” a la aplicación de un herbicida de imidazolinona se entiende que no se mata a la planta o no se la lastima por medio de tal aplicación.

Adicionalmente se describe aquí un método para controlar malas hierbas en las cercanías de una planta de trigo o de triticale, que comprende la aplicación de un herbicida de imidazolinona a las malas hierbas y a la planta de trigo o de triticale, en donde la planta de trigo o de triticale tienen mayor tolerancia al herbicida de imidazolinona comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta de trigo o de triticale, y en donde la planta de trigo o de triticale contienen uno o más ácidos nucleicos IMI. En una realización, la planta de trigo o de triticale contienen múltiples ácidos nucleicos IMI localizados sobre o derivados a partir de diferentes genomas, en donde los ácidos nucleicos IMI se seleccionan de entre el grupo que consiste de un ácido nucleico Imi 1, un ácido nucleico Imi 2, y un ácido nucleico Imi 3. En otra realización, la planta contiene un ácido nucleico Imi 2 y un ácido nucleico Imi 3. Para lograr que las plantas de trigo y de triticale tengan una mayor tolerancia a la imidazolinona, se pueden emplear una gran variedad de formulaciones para proteger a las plantas de trigo y de triticale de las malas hierbas, para mejorar el crecimiento de la planta y reducir la competencia por los nutrientes. Un herbicida de imidazolinona puede ser utilizado por si mismo para evitar la aparición, después de la aparición, antes de la plantación, y durante la plantación para el control de las malas hierbas en las áreas que rodean a las plantas de trigo descritas aquí, o se puede utilizar una formulación de un herbicida de imidazolinona que contenga otros aditivos. El herbicida de imidazolinona también puede ser utilizado como tratamiento para la semilla. Los aditivos encontrados en una formulación del herbicida de imidazolinona incluyen otros herbicidas, detergentes, adyuvantes, agentes de aspersión, agentes de adhesión, agentes estabilizantes, o similares. La formulación del herbicida de imidazolinona puede ser una preparación húmeda o seca y puede incluir, pero no se limita a, polvos que pueden fluir, concentrados emulsionables, y concentrados líquidos. El herbicida de imidazolinona y las formulaciones de herbicida se pueden aplicar de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, por medio de aspersión, irrigación, espolvoreados, o similares.

Debe entenderse también que lo anterior se relaciona con realizaciones preferidas de la presente invención y que pueden hacerse numerosos cambios en ellas sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones. La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que no pretenden constituirse de ninguna manera como limitaciones impositivas para el alcance de la misma. Por el contrario, se entiende claramente que puede recurrirse a otras diferentes realizaciones, modificaciones y equivalentes de las mismas, que, después de leer la presente descripción, pueden sugerirse por si mismas a aquellos capacitados en el arte sin apartarse del alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Mutagénesis y selección de líneas de trigo Durum tolerantes

Las líneas de trigo tolerantes a la imidazolinona se derivaron a través de técnicas de mutación y posterior selección convencional. La mutagénesis inicial de la semilla se hizo por medio de tratamiento de la semilla de la variedad de trigo Durum y sea con 3 o con 3,5 ml de EMS (etilmetano sulfonato) por litro durante 2 horas, después de un tratamiento de humectación previa con agua corriente durante 5,5 horas, luego enjuagando con agua destilada. Durante el tratamiento con EMS, se agitaron las semillas cada 10 - 15 minutos. Después de dos horas de tratamiento con EMS, se retiró ese mutágeno, y remplazo con amortiguador de fosfato (0,001 M, pH 3,5). Las semillas fueron luego tratadas con azida de sodio (2 ml/litro de una solución patrón 1 M), durante el cual las semillas fueron agitadas en forma intermitente durante 1 hora. Se decantó el líquido, y se enjuagaron las semillas 2 veces con agua destilada, se drenaron, y se dejaron sobre bandejas en un invernadero durante 24 - 36 horas hasta sequedad, antes de plantarlas en el campo en suelo húmedo.

Las plantas de la generación M1 que surgieron de las semillas tratadas fueron cosechadas a granel, y las semillas resultantes M2 fueron plantadas. Las plantas M2 fueron tratadas con 10 oz/ac del herbicida Raptor (88,6 g de imazamox/ha) en la etapa tres de hojas verdaderas. Las plantas que sobrevivieron a la aplicación del herbicida fueron trasplantadas a un invernadero para la producción de semilla M3.

Se seleccionaron las líneas M2:3 en un invernadero utilizando ya sea 10 oz/acre (88,6 g de imazamox/ha) o 12 oz/acre (106,3 g imazamox/ha) del herbicida Raptor®. Se aplicó el herbicida en la etapa 3 de hojas verdaderas. Se produjo semilla M3:4 a partir de las plantas M3 más tolerantes.

EJEMPLO 2

Tolerancia de las líneas de trigo Durum a herbicidas de imidazolinona

Pruebas de campo (1):

Se evaluaron nueve líneas M4:6 derivadas de cuatro plantas M2 (CI19, CI32, CI37, CO12) en un ensayo replicado en un sitio en un área de crecimiento de Durum en Italia. Se aplicaron 75 g/ha de imazamox a 21 - 25 plantas en etapa de crecimiento BBCH. Una tasa de 35 g/ha típicamente daría como resultado virtualmente en una mortalidad del 100% del trigo susceptible. El porcentaje de respuesta del cultivo (daño total) varió desde 0 hasta 13% 21 días después del tratamiento (DAT), y de 0 a 17% 43 DAT. El rendimiento como porcentaje de la misma línea no tratada varió desde 85% hasta 102%.

Pruebas de campo (2):

Se seleccionaron ciento diez líneas M3:4 derivadas de 16 plantas M2 a razón de 71 g/ha y 160 g/ha de imazamox. El número de líneas M4 por planta M2 varió desde uno hasta veinte. La tolerancia de las líneas M3:4 se comparó con parcelas no tratadas de la misma línea así como con parcelas tratadas de una variedad de cultivo de tipo silvestre a partir de la cual se derivaron algunas de ellas. La Tabla 1 resume los resultados.

Todas las líneas analizadas sobrevivieron a ambas tasas de tratamiento con herbicida, mientras que todas las plantas de tipo silvestre murieron con ambas tasas. Con base en la comparación con la línea de tipo silvestre, todas las líneas analizadas expresaron una tolerancia considerable a las tasas aplicadas, particularmente cuando se observa una reducción de la altura con relación a las parcelas no tratadas. Una tasa de 35 g/ha de imazamox es adecuada para matar trigo Durum susceptible. Por lo tanto, las líneas evaluadas fueron tolerantes a una tasa de casi 3 veces y hasta por encima de 4 veces esa tasa.

Tabla 1

Tabla 1. Puntajes de tolerancia de líneas M3:4 derivadas de 14 plantas M2 diferentes tratadas con dos diferentes tasas de imazamox

% de Clorosis: % de reducción de la altura

14 DAT1: 30 DAT 14 DAT 30 DAT

Designación de M2: 0 712 1603 0 71 160 0 71 160 0 71 160

Tipo silvestre: 0 90 90 0 100 100 0 100 100 0 100 100

UT01: 0 0-10 1-10 0 0 0-5 0 0 0 0 0-10 0-20

UT03: 0 0 5 0 5 5 0 10 10 0 5 5

UT05: 0 5-10 5-15 0 5-10 5-20 0 5-10 10-30 0 5-10 5-20

UT07: 0 0-5 5-10 0 0-10 5-15 0 0-10 0-10 0 0-5 0-10

UT08: 0 0-10 0-10 0 0-10 0-15 0 0-10 0-10 0 0-10 5-20

UT10: 0 5-10 10 0 5 5 0 0-10 0-20 0 0-5 0-10

UT12: 0 0-10 10-15 0 0-5 5-10 0 0-10 10-20 0 0-10 5-10

UT13: 0 5 5 0 5 5-10 0 0-10 0-10 0 5 5

UT14: 0 5-10 10 0 0 0 0 0 0-10 0 0-10 0-10

UT15: 0 30-70 30-70 0-5 0-10 0-15 0 0-10 0-10 0 5-20 5-30

UT16: 0 5-10 10-20 0 0 0-5 0 0 0-10 0 0-10 0-10

UT17: 0 5-20 5-30 0 0 0-5 0 0-20 0-30 0 5-20 5-30

UT19: 0 30-40 40 0 0 0-5 0 0-10 0-10 0 5-20 10-20

UT20: 0 0-5 5-10 0 0 0 0 0 0-20 0 5-10 10-15

1DAT se refiere a los días después del tratamiento con una tasa aplicable de herbicida después de que se hizo la clasificación 2,3 Los números son tasas de aplicación de herbicida en g/ha̘ Los números dentro de la tabla representan el rango de reacción a través de las líneas M3:4 derivadas de cada planta M2 enlistada.

Prueba de invernadero:

Quince líneas Durum, cada una derivada de una planta M2 diferente, y dos líneas Durum de tipo silvestre fueron evaluadas por la tolerancia al herbicida de imidazolinona imazamox con tasas de 100 y 160 g/ha en una prueba de invernadero. Las evaluaciones de tolerancia se hicieron el día 14 y 21 después del tratamiento. Se dio puntaje al daño sobre una escala de 0 - 9, con 0 representando ningún daño y 9 muerte de la planta. La Tabla 2 resume los

10 resultados.

Las líneas exhibieron mayor tolerancia que las líneas de tipo silvestre ya que todas las plantas de tipo silvestre murieron a los 21 días después del tratamiento, un tiempo en el cual incluso las líneas con lesiones significativas a los 14 días habían empezado a recuperarse. Una tasa de 35 g/ha de imazamox es adecuada para matar trigo

15 Durum susceptible. Por lo tanto, todas las quince líneas derivadas de mutagénesis exhibieron excelente tolerancia al imazamox.

Tabla 2. Calificación promedio de lesión de una planta de la progenie derivada de quince plantas Durum M2 y una línea Durum de tipo silvestre tratadas con dos diferentes tasas de imazamox

14 DAT1: 21 DAT

Línea: 100 g/ha 160 g/ha 100 g/ha 160 g/ha

UT01: 4,0 4,1 1,4 2,6

UT03: 4,8 5,2 2,2 2,8

UT05: 3,0 3,3 1,3 1,8

UT07: 3,7 4,4 1,9 2,5

UT08: 4,5 5,5 1,9 3,0

UT10: 5,8 6,5 4,3 5,1

UT12: 4,8 5,7 2,1 2,8

UT13: 4,7 5,8 2,3 3,4

UT14: 3,1 4,8 1,7 3,5

UT15: 4,3 4,6 2,7 3,0

UT16: 5,4 4,9 2,0 2,8

UT17: 4,1 4,7 2,5 3,1

UT19: 3,3 3,6 1,1 1,7

UT20: 5,0 5,3 2,1 2,5

CI19: 4,8 4,9 1,0 1,4

Línea de tipo silvestre

UT: 8,9 9,0 9,0 9,0

1DAT se refiere a los días después del tratamiento con una tasa aplicable de herbicida después de que se hizo la clasificación Los números dentro de la tabla representan el promedio de 24 plantas por tratamiento. Se dio puntaje a las plantas con base en una escala de 0 - 9, con 0 = sin daño, y 9 = muerte de la planta.

EJEMPLO 3

5 Base bioquímica de la tolerancia

La enzima blanco del herbicida imidazolinona es la acetohidroxiácido sintasa (AHAS), la primera enzima catalítica en la síntesis bioquímica de los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina, e isoleucina. Se cree que el herbicida se une a los sitios dentro de un bolsillo en la enzima, pero no se enlaza con el sitio activo.

10 La actividad in vitro de la enzima AHAS extraída de la planta puede ser medida bioquímicamente. El efecto sobre la actividad por la adición de diferentes concentraciones de un herbicida de imidazolinona tal como imazamox con la proteína AHAS extraída de las plantas de trigo Durum de tipo silvestre (Línea UT) puede ser observado en la Tabla

3. Incluso con concentraciones relativamente bajas, la actividad de AHAS cae rápidamente.

La Tabla 3 también contiene los datos de actividad de AHAS para diferentes líneas tolerantes al herbicida de

15 imidazolinona derivadas de M2. La inhibición de la actividad es marcadamente menor a menores concentraciones de imazamox, e incluso a las concentraciones más altas, la actividad es generalmente de un tercio hasta la mitad que la de control. Estos datos combinados con los datos de tolerancia de invernadero y de campo parecen soportar un cambio derivado de mutagénesis en al menos un gen AHAS en el genoma de Durum que resulta en una proteína AHAS que es producida con menor inhibición por imazamox.

Tabla 3. Actividad in vitro de AHAS, expresada como porcentaje de control, de trece líneas Durum y un control de tipo silvestre (UT), en presencia de diferentes concentraciones de imazamox

uM de Imazamox

Línea: 0 13 25 50 100

CI19: 100,0 54,0 56,3 55,3 41,9

UT01: 100,0 61,6 58,5 54,1 49,6

UT03: 100,0 73,7 63,5 60,3 52,2

UT05: 100,0 54,1 59,5 56,9 45,4

UT07: 100,0 64,3 61,3 46,9 50,6

UT08: 100,0 60,3 55,3 49,6 41,2

UT10: 100,0 68,4 59,7 54,9 46,6

UT12: 100,0 58,3 55,6 52,7 44,9

UT13: 100,0 73,2 60,4 51,8 46,5

UT14: 100,0 62,4 53,5 56,8 55,6

UT16: 100,0 51,9 46,7 45,5 41,7

UT17: 100,0 59,3 48,0 48,0 36,5

UT20: 100,0 63,4 61,8 50,3 40,3

UT: 100,0 15,9 11,1 10,2 5,4

5 EJEMPLO 4

Base molecular de la tolerancia

La caracterización molecular de las líneas tolerantes a la imidazolinona confirmo la presencia de mutaciones 10 específicas en los genes que codifican a la enzima AHAS (Als 2 y Als 3). La línea Cl19 tolerante a la imidazolinona contenía una sustitución de un par de bases, guanina por adenina en el gen Als 2 que resultó en una sustitución de serina por asparagina en el Dominio E de la enzima AHAS. La línea Cl19 no contenía ninguna mutación en el gen Als 3. En forma similar, las líneas tolerantes a la imidazolinona UT01, UT03, UT05, UT07, UT08, UT10, UT13, UT14, UT16, UT17, UT20, todas contenían un gen Als 3 con una secuencia de tipo silvestre y la sustitución del par de 15 bases, guanina por adenina en el gen Als 2.

La línea UT12 tolerante a la imidazolinona contenía una sustitución de un par de bases, guanina por adenina en el gen Als 3 que resultó en una sustitución de serina por asparagina en el Dominio E de la enzima AHAS. La línea UT12 no contenía ninguna mutación en el gen Als 2.

20 Las líneas Utopia UT15 y UT19 tolerantes a la imidazolinona contenían una nueva mutación en el gen Als 3, una sustitución del par de bases guanina por adenina que resultó en una sustitución del aminoácido alanina por treonina en la porción terminal amino de la enzima AHAS. La línea UT15 Utopia tolerante a la imidazolinona también contenía una sustitución del par de bases timina por citosina en el gen Als 2que no resultó en una sustitución de aminoácidos.

EJEMPLO 5

25 Plantas de trigo tolerantes a la imidazolinona genéticamente modificadas

Las plantas de trigo tolerantes a la imidazolinona se producen por medio de un método como el descrito por Ishida et al. (1996, Nature Biotech. 14: 745 - 750). Se aíslan embriones inmaduros con un tamaño de 1 - 2 mm 10 - 15 días después de la polinización y se esterilizan con etanol y una solución de Clorox al 30%. Los embriones inmaduros se

infectan con células de Agrobacterium que albergan al constructo de interés en un vector de Tabaco Japonés sobre

medio de infección LS y luego se cultivan conjuntamente sobre medio de co-cultivo LS durante 3 a 7 días (todo el

medio se deriva de Tabaco Japonés de acuerdo con Ishida et al. (1996, Nature Biotech. 14: 745 - 750)). Se

5 transfieren luego los explantes a medio LS que contiene PURSUIT® 0,05 a 0,1 M y se cultivan con poca luz

durante 1 a 2 semanas. Los callos que crecieron activamente se transfieren para una segunda y tercera selección

sobre medio LS suplementado con imazapir 0,5 a 1,0 M (PURSUIT®) y se cultivan durante 2 a 3 semanas.

Después de la tercera selección, se transfieren los callos a medio de regeneración suplementado con imazetapir

0,25 a 0,75 M (PURSUIT®) durante tres semanas. Se transfieren luego los brotes a ½ LS de enraizamiento y se 10 cultivan durante tres semanas antes de trasplantarlos al suelo y que crezcan en el invernadero. Las plantas

transgénicas putativas se rocían con 25 a 50 g/ha de imazamox (RAPTOR®) para eliminar las fugas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una planta de trigo o de triticale que contiene al menos un ácido nucleico IMI seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(a)

ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23; y

(b)

polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que comprende una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24;

en donde el ácido nucleico IMI le confiere además a la planta mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparado con una variedad de tipo silvestre de la planta.
2. La planta de la reivindicación 1, que comprende además al menos un ácido nucleico IMI adicional seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(i)

ácidos nucleicos Imi2 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en la SEQ ID NO: 1;

(ii)

ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en SEQ ID NO: 3; y

(iii) polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que incluya una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.
3.

La planta de la reivindicación 2, en donde la planta incluye un primer ácido nucleico IMI y un segundo ácido nucleico IMI, el primer ácido nucleico IMI incluye una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína IMI como la definida en la SEQ ID NO:2 y el segundo ácido nucleico IMI incluye una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína IMI como la definida en cualquiera de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24.
4.

La planta de la reivindicación 1 o 2, que comprende dos ácidos nucleicos IMI.
5.

La planta de la reivindicación 2, que comprende un ácido nucleico Imi2 y un ácido nucleico Imi3.
6.

La planta de la reivindicación 1, en donde la planta es transgénica.
7.

La planta de la reivindicación 1, en donde la planta es no transgénica.
8.

La planta de la reivindicación 7, en donde la planta de trigo es una planta de trigo Triticum turgidum.
9.

La planta de trigo o de triticale de la reivindicación 1, en donde la planta de trigo o la planta de triticale es una progenie criada a partir de una planta de trigo de cualquiera de las líneas UT15 y UT19, habiendo sido una muestra representativa de la semilla de cada línea respectivamente depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) bajo el Número de Designación de Depósito de la Patente PTA-4919 o PTA-4922.
10.

Una parte de la planta de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la parte la planta contiene al menos un ácido nucleico IMI como se define en la reivindicación 1.
11.

Una célula vegetal de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la célula vegetal contiene al menos un ácido nucleico IMI como el definido en la reivindicación 1.
12.

Una semilla producida por la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la semilla contiene al menos un ácido nucleico IMI como el definido en la reivindicación 1.
13.

La semilla de la reivindicación 12, en donde la semilla es una línea genéticamente pura para una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparado con una variedad de tipo silvestre de la semilla de la planta de trigo.
14.

Un ácido nucleico IMI aislado, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que consiste de:

(a)

ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23;

(b)

polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que comprende una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24; y

(c)

polinucleótidos que son el complemento de cualquiera de (a) hasta (b) anteriores.
15.

El ácido nucleico IMI aislado de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido como el definido en la SEQ ID NO: 5.
16.

El ácido nucleico IMI aislado de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido como el definido en la SEQ ID NO: 23.
17.

El ácido nucleico IMI aislado de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 6.
18.

El ácido nucleico IMI aislado de la reivindicación 14, en donde el ácido nucleico comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido como el definido en la SEQ ID NO: 24.
19.

Un método para producir una planta transgénica que tenga mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona que comprende:

(a)

la transformación de una célula de una planta con uno o más vectores de expresión que contienen al menos un ácido nucleico IMI de Triticum turgidum; y

(b)

la generación a partir de la célula de la planta de una planta transgénica con una mayor tolerancia a un herbicida de imidazolinona comparada con una variedad de tipo silvestre de la planta;

en donde el ácido nucleico IMI de Triticum turgidum se selecciona de entre el grupo que consiste de:

(i)

ácidos nucleicos Imi3 que comprenden una secuencia de polinucleótidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 23; y

(ii)

polinucleótidos que codifican cualquier proteína IMI que comprenden una secuencia de aminoácidos como la definida en cualquiera de las SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 24.
20. Una planta transgénica o semillas de las mismas producidas por medio del método de la reivindicación 19.