JP5535438B2 - イミダゾリノン除草剤に対する耐性の増加に関与する、植物内での新規変異誘発 - Google Patents

Description

本発明は、一般的に、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加した植物に関する。さらに特に、本発明は、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加した、変異誘発、交差交配、および形質転換によって得た植物に関する。

Ａｌｓ核酸によってコードされたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ；ＥＣ４．１．３．１８；アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ））は、分岐鎖アミノ酸バリン、ロイシンおよびイソロイシンの生化学的合成を触媒する第一の酵素である（Ｓｉｎｇｈ Ｂ．Ｋ．，１９９９，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｖａｌｉｎ，ｌｅｕｃｉｎｅ ａｎｄ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ ｉｎ：Ｓｉｎｇｈ Ｂ．Ｋ．（Ｅｄ）Ｐｌａｎｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｐｇ２２７−２４７）。ＡＨＡＳは、スルホニル尿素（ＬａＲｏｓｓａ ＲＡ ａｎｄ Ｆａｌｃｏ ＳＣ，１９８４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１５８−１６１）、イミダゾリノン類（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６）、チアゾロピリミジン類（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ ａｎｄ Ｇｅｒｗｉｃｋ，１９８９，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｂｙ ｔｒｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ ｉｎ（ｅｄ）Ｗｈｉｔａｋｅｒ ＪＲ，Ｓｏｎｎｅｔ ＰＥ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｐｇ２７７−２８８）、およびピリミジルオキシ安息香酸（Ｓｕｂｒａｍａｎｉｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９４：２３９−２４４）を含む、４つの構造的に異なる除草剤ファミリーの活性部位である。イミダゾリノンおよびスルホニル尿素除草剤は、非常に低い適用率でのこれらの効果、および動物における相対的に非毒性であることによって、現在農業において広く使用されている。ＡＨＡＳ活性を阻害することによって、これらのファミリーの除草剤は、多くの雑草種を含む影響を受けやすい植物のさらなる増殖および発育を妨げる。市販されているイミダゾリノン除草剤の種々の例には、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼサピル）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザクイン）およびＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）があげられる。スルホニル尿素除草剤の例には、クロルスルフロン、メタスルフロンメチル、スルホメトウロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベンウロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタンメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチルおよびハロスルフロンがあげられる。

それらの高効果および低毒性のために、イミダゾリノン除草剤は、広範囲の植生の上に噴霧することによってよく適用される。除草剤を広範囲の植生の上に噴霧する能力は、プランテーション設立および維持に関連したコストを減少させ、そのような化学物質の利用の前に、敷地造成の必要性を減少させる。所望の耐性種の上に噴霧することによってまた、競合種が存在しないために、所望の種の最大の収率ポテンシャルを達成可能となる。しかしながら、そのような噴霧技術を利用する能力は、噴霧領域における所望の植生のイミダゾリノン耐性種の存在に依存している。

主要な農作物のなかで、大豆のようないくつかのマメ科種は、除草剤化合物を迅速に代謝するそれらの能力のおかげで、天然に、イミダゾリノン除草剤に対して耐性である（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｓｏｎ，１９８５，Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ，３３：４６９−４７１）。トウモロコシ（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）および米（Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｒｏｐ Ｓａｆｅｎｅｒｓ ｆｏｒ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１９５−２２０）はイミダゾリノン除草剤に感受性である。イミダゾリノン除草剤に対する異なる感受性は、特定の除草剤の化学的特性、および毒性から非毒性形態への、各植物内での化合物の差次的な代謝に依存している（Ｓｈａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６：５４５−５４６；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：２４−２９）。吸収および転流のような他の植物の生理学的差違がまた、感受性において重要な役割を果たしている（Ｓｈａｎｅｒ ａｎｄ Ｒｏｂｓｏｎ，１９８５，Ｗｅｅｄ Ｓｃｉ．３３：４６９−４７１）。

イミダゾリノン類、スルホニル尿素類およびトリアゾロピリミジン類に対して耐性である農作物栽培品種が、Ｚｅａ ｍａｙｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍにおける種子、小胞子、花粉およびカルス変異誘発を用いて首尾よく産出されてきた（Ｓｅｂａｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２９：１４０３−１４０８、Ｓｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７８：５２５−５３０、Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８３：６５−７０；Ｓａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１０４４−１０５０；Ｍｏｕｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８４：９１−９６）。すべての場合で、単一の、部分的にドミナントな核遺伝子が耐性を与えた。４つのイミダゾリノン耐性コムギ植物がまた、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．ｃｖ Ｆｉｄｅｌの種子変異誘発にしたがってすでに単離された（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）。遺伝子形質研究によって、単一の、部分的にドミナントな遺伝子が耐性を与えることが確認された。対立遺伝子研究に基づいて、本発明者らは、４つの同定された系における変異が、同一の座に局在していたと結論づけた。１つのＦｉｄｅｌ栽培品種耐性遺伝子が、ＦＳ−４と命名された（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）。

ＡＨＡＳ阻害剤複合体の三次元配座のコンピュータに基づくモデリングによって、誘導された変異がイミダゾリノン類に対する選択的な耐性を与える可能性が高い部位として、提案された阻害剤結合ポケット中の種々のアミノ酸が予測される（Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８）。提案されたＡＨＡＳ酵素の結合部位中のこれらの合理的に設計された変異にて産出されたたばこ植物は実際に、単一のクラスの除草剤に対する特異的な耐性を示している（Ｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：３５９−３６８）。

イミダゾリノン除草剤に対して耐性な植物がまた、多数の特許にて報告されてきている。米国特許第４，７６１，３７３号、第５，３３１，１０７号、第５，３０４，７３２号、第６，２１１，４３８号、第６，２１１，４３９号および第６，２２２，１００号は一般的に、植物内での除草剤耐性を引き出すための、改変Ａｌｓ核酸の利用を記述しており、特に特定のイミダゾリノン耐性モロコシ株を開示している。米国特許第５，０１３，６５９号は、１つ以上の保存領域中、少なくとも１つのアミノ酸において変異を有する、除草剤耐性を示している植物を開示している。ここで記述された変異は、イミダゾリノン類およびスルホニル尿素類に対する交差耐性、またはスルホニル尿素類特異的耐性いずれかをコードしているが、イミダゾリノン特異的耐性は記述されていない。さらに、米国特許第５，７３１，１８０号および米国特許第５，７６７，３６１号は、結果としてイミダゾリノン特異的耐性となる、野生型単子葉植物ＡＨＡＳアミノ酸配列中で単一のアミノ酸置換を有する、単離遺伝子を議論している。

今日まで、先行技術では、ＦＳ−４イミダゾリノン耐性株中の変異以外の、イミダゾリノン除草剤に対する耐性の増加を与えるＡｌｓ１遺伝子における変異は記述されてこなかった。先行技術では、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｓｈｉｌｏｈ栽培品種からの、少なくとも１つの改変Ａｌｓ核酸を含むイミダゾリノン耐性コムギまたはライコムギ植物は記述されなかった。したがって、当分野で必要なことは、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を与えるさらなる変異の同定である。当分野でまた必要なものは、イミダゾリノンのような除草剤に対する耐性が増加しており、少なくとも１つの改変Ａｌｓ核酸を含む、コムギ植物およびライコムギ植物である。また、そのようなコムギ植物およびライコムギ植物の周辺での雑草の増殖を制御するための方法も必要である。これらの組成物および方法によって、コムギ植物およびライコムギ植物を含む領域に除草剤を適用する時に、噴霧技術が利用可能である。

［発明の開示］
本発明は、Ｉｍｉ核酸を含むコムギ植物を提供し、ここで前記コムギ植物は、野生型植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している。コムギ植物は、１つ、２つ、３つ以上のＩＭＩ対立遺伝子を含む。即ち、（ａ）野生型ＡＨＡＳタンパク質と比較して、結果としてＩＭＩタンパク質中のアラニンがスレオニンに置換される、ドメインＣ中の変異を含み、前記アラニンからスレオニンへの置換が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置である、ＩＭＩタンパク質をコードしている、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸、（ｂ）配列番号１にて列挙されたポリヌクレオチド配列を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、および（ｃ）配列番号２にて列挙されたアミノ酸配列を含むＩＭＩタンパク質をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、からなる群より選択される少なくとも１つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含む。好ましくは、Ｓｈｉｌｏｈ栽培品種Ｉｍｉ１核酸は、Ｄｏｍａｉｎ Ａ、Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、Ｄｏｍａｉｎ Ｃ、Ｄｏｍａｉｎ ＤおよびＤｏｍａｉｎ Ｅからなる群より選択される保存アミノ酸配列中に変異を含むタンパク質をコードする。さらに好ましくは、変異は保存Ｄｏｍａｉｎ Ｃ中である。また、本明細書で記述されたコムギ植物から由来した植物部分および植物種子も提供される。

本発明はまた、Ｉｍｉ核酸を含むライコムギ植物も提供し、前記ライコムギ植物は、野生型ライコムギ植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している。１つの実施形態において、ライコムギ植物は、少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含む。即ち、（ａ）野生型ＡＨＡＳタンパク質と比較して、結果としてＩＭＩタンパク質中のアラニンがスレオニンに置換されるドメインＣ中の変異を含み、前記アラニンからスレオニンへの置換が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置である、ＩＭＩタンパク質をコードしている、Ｓｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸、（ｂ）配列番号１にて列挙されたポリヌクレオチド配列を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、および（ｃ）配列番号２にて列挙されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、からなる群より選択される少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含む。Ｉｍｉ核酸は、Ｄｏｍａｉｎ Ａ、Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、Ｄｏｍａｉｎ Ｃ、Ｄｏｍａｉｎ ＤおよびＤｏｍａｉｎ Ｅからなる群より選択される保存アミノ酸配列中に変異を含むタンパク質をコードする。さらに好ましくは、変異は保存Ｄｏｍａｉｎ Ｃ中である。さらに好ましくは、変異は、ＡＬＳポリペプチドの９６位（配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置に相当する）でのアラニンからスレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする。また、本明細書で記述されたライコムギ植物から由来した植物部分および植物種子も提供される。

本発明のＩｍｉ核酸は、配列番号１にて定義したようなＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド、配列番号２にて定義したようなポリペプチドをコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含むＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含むＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み得る。

本発明の植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであり得る。イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加した非トランスジェニックコムギ植物の例は、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５（Ｓｈｉｌｏｈ−８）を有するコムギ植物、またはＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５（Ｓｈｉｌｏｈ−８）の植物の変異体、組換え体または遺伝子工学的に改変した誘導体、またはＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５（Ｓｈｉｌｏｈ−８）の植物の任意の子孫、または任意のこれらの植物の子孫である植物、である。

本発明の組成物に加えて、種々の方法が提供される。植物中のＩｍｉ核酸の発現を改変することを含む、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を改変する方法が本明細書で記述されている。また、植物細胞を、１つ以上のＩｍｉ核酸を含む発現ベクターで形質転換すること、およびその植物細胞から植物を産出することを含む、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加したトランスジェニック植物を産出する方法も記述される。本発明はさらに、イミダゾリノン除草剤を雑草、およびコムギまたはライコムギに適用することを含む、コムギまたはライコムギ植物周辺内の雑草を制御するための方法を含み、ここでコムギまたはライコムギ植物は、野生型コムギまたはライコムギ植物と比べてイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加しており、前記植物は１つ以上のＩＭＩ核酸を含む。これらの方法のいくつかの好ましい実施形態において、植物は、異なるコムギゲノム上に局在する多数のＩｍｉ核酸を含む。

本発明の１つ以上のＩｍｉ核酸を含む、発現カセット、形質転換ベクター、形質転換された非ヒト宿主細胞、および形質転換植物、植物細胞、植物部分および種子も提供される。

本発明は、植物中で発現した場合に、イミダゾリノン除草剤に対する耐性の増加を与えるポリペプチドをコードしている単離核酸を指向している。本発明はまた、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加した、コムギまたはライコムギ植物、コムギまたはライコムギ植物部分、およびコムギまたはライコムギ植物細胞も指向している。本発明にはまた、本明細書で記述されたコムギまたはライコムギ植物によって産出される種子、および本明細書で記述されたコムギまたはライコムギ植物の周辺の雑草を制御するための方法が含まれる。

本明細書において、語句「コムギ植物（ｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔ）」は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属のメンバーである植物を意味する。本発明のコムギ植物は、限定はしないが、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｚｈｕｋｏｖｓｋｙｉおよびＴ．ｕｒａｒｔｕを含むＴｒｉｔｉｃｕｍ属のメンバーおよびそれらのハイブリッドであり得る。本発明の範囲内に含まれるＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ亜種の例には、ａｅｓｔｉｖｕｍ（一般コムギ）、ｃｏｍｐａｃｔｕｍ（クラブコムギ）、ｍａｃｈａ（マッチャコムギ）、ｖａｖｉｌｏｖｉ（バビロビコムギ）、ｓｐｅｌｔａ ａｎｄ ｓｐｈａｅｃｒｏｃｏｃｃｕｍ（ショットコムギ）があげられる。本発明の範囲内に含まれるＴ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ亜種には、ｔｕｒｇｉｄｕｍ、ｃａｒｔｈｌｉｃｕｍ、ｄｉｃｏｃｃｏｍ、ｄｕｒｕｍ、ｐａｌｅｏｃｏｌｃｈｉｃｕｍ、ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ、ｔｕｒａｎｉｃｕｍおよびｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓがあげられる。本発明の範囲内に含まれるＴ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ亜種には、ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（ヒトツブコムギ）およびａｅｇｉｌｏｐｏｉｄｅｓがあげられる。本発明の１つの実施形態において、コムギ植物は、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．種のメンバーであり、特にＳｈｉｌｏｈ栽培品種である。

語句「コムギ植物（ｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔ）」は、任意の成熟度または発育の段階でのコムギ植物、ならびに文脈によって明らかに示唆されないかぎり、そのような任意の植物からとられた、または由来した任意の組織または器官（植物部分）を意味する意図がある。植物部分には、限定はしないが、茎、根、花、胚珠、おしべ、葉、胚、分裂領域、カルス組織、葯培養、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、プロトプラストなどが含まれる。本発明はまた、本発明のコムギ植物によって産出される種子を含む。１つの実施形態において、種子は、野生型コムギ植物種子と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加するように、正しく交配されている。

本発明はまた、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している、ライコムギ植物、ライコムギ植物部分、およびライコムギ植物細胞も企図する。本明細書において語句「ライコムギ植物（ｔｒｉｔｉｃａｌｅ ｐｌａｎｔ）」は、四倍体コムギ植物（たとえばＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）または五倍体コムギ植物（たとえばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）いずれかと、ライムギ植物（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）を交配することによって作製される植物を意味する。本発明はまた、本明細書で記述したライコムギ植物によって産出される種子、および本明細書で記述したライコムギの周辺の雑草を制御するための方法も含む。

本発明は、少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含むコムギ植物を記述しており、そこでコムギ植物は、野生型植物と比較してイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している。これらの植物が１つ以上のゲノムを含むことが可能であるので、本発明のコムギ植物が、異なるゲノムからの多数のＩＭＩ核酸を含むことが可能である。たとえば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍコムギ植物は、Ａ、ＢおよびＤゲノムと呼ばれる３つのゲノムを含む。ＡＨＡＳが必要な代謝酵素であるので、各ゲノムが、マップ化された五倍体コムギでの他の代謝酵素にて一般的にみられる、ＡＨＡＳ酵素をコードしている少なくとも１つの遺伝子（すなわち少なくとも１つのＡｌｓ遺伝子）を有することが予想される。本明細書において、語句「Ａｌｓ遺伝子座（Ａｌｓ ｇｅｎｅ ｌｏｃｕｓ）」は、ゲノム上のＡｌｓ遺伝子の位置を意味し、語句「Ａｌｓ遺伝子（Ａｌｓ ｇｅｎｅ）」および「Ａｌｓ核酸（Ａｌｓ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、ＡＨＡＳ酵素をコードしている核酸を意味する。各ゲノム上のＡｌｓ核酸は、そのヌクレオチド配列において、他のゲノム上のＡｌｓ核酸とは異なる。当業者が、各Ａｌｓ核酸の起源のゲノムを、遺伝的交配および／または当業者に公知であるシークエンシング法またはエキソヌクレアーゼ消化法いずれかを介して決定可能である。本明細書において、語句「Ａｌｓ１核酸（Ａｌｓ１ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」「Ａｌｓ２核酸（Ａｌｓ２ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」および「Ａｌｓ３核酸（Ａｌｓ３ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、３つの異なるゲノム上に局在するＡｌｓ核酸を意味する。本発明の目的のために、Ａｌｓ３遺伝子座はＡゲノム上に局在し、Ａｌｓ２遺伝子座はＢゲノム上に局在し、Ａｌｓ１遺伝子座はＤゲノム上に局在する。本発明の目的のために、Ａ、ＢまたはＤゲノムから由来したＩｍｉ核酸は、それぞれＩｍｉ３、Ｉｍｉ２またはＩｍｉ１核酸として区別され、指定される。

本明細書において、語句「Ｉｍｉ核酸（Ｉｍｉ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、野生型Ａｌｓ核酸から変異された配列を有し、発現している植物に対してイミダゾリノン耐性の増加を与える、Ａｌｓ核酸を意味する。本明細書において語句「Ｉｍｉ１核酸（Ｉｍｉ１ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、「Ｉｍｉ２核酸（Ｉｍｉ２ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」、「Ｉｍｉ３核酸（Ｉｍｉ３ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、それぞれＡｌｓ１、Ａｌｓ２、およびＡｌｓ３遺伝子のイミダゾリノン耐性対立遺伝子を意味するＩＭＩ核酸である。コムギ植物は、それぞれのゲノムの２つのコピーを含み、コムギ植物は、それぞれ特定のＡｌｓ核酸の２つのコピーを含む。たとえば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍコムギ植物は、それぞれＡ、ＢおよびＤゲノムの２つのコピー、したがって、Ａｌｓ３、Ａｌｓ２およびＡｌｓ１遺伝子のそれぞれの２つのコピーを含む。本明細書において語句「ＩＭＩ対立遺伝子（ＩＭＩ ａｌｌｅｌｅ）」は、特定のＩｍｉ核酸の単一コピーを意味する。したがって、本発明の目的のために、コムギ植物は２つのＩｍｉ１対立遺伝子を、１つがＤゲノムの２つのコピーのそれぞれ上で有し得る。

他の実施形態において、コムギ植物は、多重Ｉｍｉ核酸を含む。本明細書において、「多重Ｉｍｉ核酸」を含む植物を記述する場合、語句「多重Ｉｍｉ核酸（ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｍｉ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）」は、植物内の異なるＩｍｉ核酸の存在を意味し、植物が特定のＡｌｓ座にて、ホモ接合体であるか、ヘテロ接合体であるかを意味しない。たとえば、多重Ｉｍｉ核酸を含む植物は、Ｉｍｉ１核酸の２つのコピーを有するのとは対照的に、Ｉｍｉ１およびＩｍｉ２核酸を含み得る。

核酸のＩｍｉ１クラスには、Ｎｅｗｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００：８８２−８８６）によって記述されたようなＦＳ−４、および以下でより詳細に記述しているＳｈｉｌｏｈ−８遺伝子が含まれる。各Ｉｍｉクラスは、異なるコムギ種からのメンバーが含まれ得る。したがって、各Ｉｍｉクラスは、それらのヌクレオチド配列が異なるが、それにもかかわらず、当業者が公知であるような遺伝試験を用いて同一のコムギゲノムを起源とする、または局在していると設計される、Ｉｍｉ核酸を含む。

したがって、本発明は、少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含むコムギ植物を含み、そこでコムギ植物は、野生型植物と比較してイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加しており、少なくとも１つのＩｍｉ核酸が、Ｉｍｉ１核酸である。好ましい実施形態において、Ｉｍｉ１核酸は、配列番号１にて示したポリヌクレオチド配列を含む。他の好ましい実施形態において、コムギ植物は、多重Ｉｍｉ核酸を含む。

本発明はまた、イミダゾリノン耐性ライコムギ植物を包含する。本明細書において「ライコムギ植物（ｔｒｉｔｉｃａｌｅ ｐｌａｎｔ）」は、四倍体コムギ植物（たとえばＴｒｉｔｉｃｕｍ ｔｕｒｇｉｄｕｍ）または六倍体コムギ植物（たとえばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）いずれかを、ライ植物（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）と交配させることによって作製される植物を意味する。本発明の目的のために、イミダゾリノン耐性ライコムギ植物は、少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含み、ここで前記ライコムギ植物は、野生型植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加しており、少なくとも１つのＩｍｉ核酸がＩｍｉ１核酸である。好ましい実施形態において、Ｉｍｉ１核酸は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。他の好ましい実施形態において、ライコムギ植物は、多重のＩｍｉ核酸を含む。

核酸に関して本明細書において、語句「から（ｆｒｏｍ）」は、特定のゲノム「上に局在する（ｌｏｃａｔｅｄ ｏｎ）」または「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」核酸を意味する。語句「上に局在する（ｌｏｃａｔｅｄ ｏｎ）」は、特定のゲノム内に含まれる核酸を意味する。ゲノムに関して本明細書において、語句「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」は、ゲノムから取り除いた、または単離した核酸を意味する。語句「単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、以下でより詳細に定義される。

本発明は、１つ、２つ、３つ以上のＩＭＩ対立遺伝子を含むコムギ植物を含み、そこで前記コムギ植物は、野生型植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している。ＩＭＩ対立遺伝子には、配列番号１にて定義されたようなポリヌクレオチド、配列番号２にて定義されたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、任意の上記ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および任意の上記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、からなる群より選択されたヌクレオチド配列が含まれ得る。

本発明はまた、１つ、２つ、３つ以上のＩＭＩ対立遺伝子を含むライコムギ植物を含み、そこで前記ライコムギ植物は、野生型植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している。ＩＭＩ対立遺伝子には、配列番号１にて定義されたようなポリヌクレオチド、配列番号２にて定義されたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、任意の上記ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および任意の上記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、からなる群より選択されたヌクレオチド配列が含まれ得る。

１つの実施形態において、コムギ植物またはライコムギ植物は、２つの異なるＩｍｉ核酸を含む。好ましくは、２つの核酸の少なくとも１つが、Ｉｍｉ１核酸である。より好ましくは、２つのＩｍｉ核酸の少なくとも１つが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、コムギ植物またはライコムギ植物は、１つのＩｍｉ核酸を含み、前記核酸は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。また他の実施形態において、コムギ植物は、２つ以上のＩｍｉ核酸を含み、各Ｉｍｉ核酸は異なるゲノムからである。好ましくは、少なくとも１つのＩｍｉ核酸が、配列番号２のポリペプチド配列をコードしているポリヌクレオチド配列、または配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。

本発明の好ましい実施形態において、単離Ｉｍｉ核酸は、種々のＡＨＡＳタンパク質間で保存されるドメイン中に変異を含むアミノ酸配列をコードしている。これらの保存ドメインは、本明細書で、Ｄｏｍａｉｎ Ａ、Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、Ｄｏｍａｉｎ Ｃ、Ｄｏｍａｉｎ Ｄ、およびＤｏｍａｉｎ Ｅとして呼ぶ。図３は、ＡＨＡＳタンパク質中の各ドメインの一般的位置を示している。Ｄｏｍａｉｎ Ａは、アミノ酸配列ＡＩＴＧＱＶＰＲＲＭＩＧＴ（配列番号７）を含む。Ｄｏｍａｉｎ Ｂは、アミノ酸配列ＱＷＥＤ（配列番号８）を含む。Ｄｏｍａｉｎ Ｃは、アミノ酸配列ＶＦＡＹＰＧＧＡＳＭＥＩＨＱＡＬＴＲＳ（配列番号９）を含む。Ｄａｍａｉｎ Ｄは、アミノ酸配列ＡＦＱＥＴＰ（配列番号１０）を含む。Ｄｏｍａｉｎ Ｅは、アミノ酸配列ＩＰＳＧＧ（配列番号１１）を含む。本発明はまた、たとえばコックレーバー植物中の保存ドメイン内でわずかに変化が存在すること、Ｄｏｍａｉｎ Ｅ中のセリン残基がアラニン残基によって置換されることも企図している。

したがって、本発明は、Ｄｏｍａｉｎ Ａ、Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、Ｄｏｍａｉｎ Ｃ、Ｄｏｍａｉｎ ＤおよびＤｏｍａｉｎ Ｅからなる群より選択される保存ドメイン中に変異をもつアミノ酸配列をコードしているＩｍｉ核酸を含む、コムギ植物またはライコムギ植物を含む。１つの実施形態において、コムギ植物またはライコムギ植物は、Ｄｏｍａｉｎ Ｅ中に変異を有するアミノ酸配列をコードしているＩｍｉ核酸を含む。さらに好ましい実施形態において、保存ドメイン中の変異は、以下の下線によって示される部分にておこる。ＡＩＴＧＱＶＰＲＲＭＩＧＴ（配列番号７）、ＱＷＥＤ（配列番号８）、ＶＦＡＹＰＧＧＡＳＭＥＩＨＱＡＬＴＲＳ（配列番号９）、ＡＦＱＥＴＰ（配列番号１０）、ＩＰＳＧＧ（配列番号１１）。１つの好ましい置換は、Ｄｏｍａｉｎ Ｃ内のアラニンからスレオニンへの置換である。さらに好ましくは、置換は、ＡＬＳポリペプチドの９６位（配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置に相当する）でのアラニンからスレオニンへの置換である。

本発明は、ＡＨＡＳ酵素の活性を干渉する、少なくとも１つの除草剤に対する、植物、植物組織、植物細胞、または他の宿主細胞の耐性または抵抗性を増強するための方法を提供する。本発明はさらに、少なくとも１つの除草剤、特にＡＨＡＳ阻害除草剤に対する耐性を有する、植物、植物細胞、植物部分、植物器官、植物組織、種子および宿主細胞を提供する。好ましくは、そのようなＡＨＡＳ阻害除草剤は、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素阻害剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシ安息香酸除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤、またはこれらの混合物である。より好ましくは、そのような除草剤は、イミダゾリノン除草剤、または２つ以上のイミダゾリノン除草剤の混合物である。本発明のために、イミダゾリノン除草剤には、限定はしないが、ＰＵＲＳＵＩＴ（登録商標）（イマゼサピル）、ＣＡＤＲＥ（登録商標）（イマザピック）、ＲＡＰＴＯＲ（登録商標）（イミアザモックス）、ＳＣＥＰＴＥＲ（登録商標）（イマザクイン）、ＡＳＳＥＲＴ（登録商標）（イマゼサビンズ）、ＡＲＳＥＮＡＬ（登録商標）（イマザピル）、任意の上記除草剤の誘導体、および２つ以上の上記除草剤の混合物、たとえばイマザピル／イマザモックス（ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標））が含まれる。より特に、イミダゾリノン除草剤には、限定はしないが、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミジアゾリン−２−イル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル）−４−］［メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−３−キノリンカルボン］酸、［５−エチル−２−（４−イソプロピル−）４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル］−５−メチルニコチン酸、およびメチル［６−（４−イソプロピル−４−）メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ｍ−トルエンとメチル［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−）オキソ−２−イミダゾリン−２−イル］−ｐ−トルエンの混合物、から選択され得る。５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、および［２−（４−イソプロピル−４）メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−］イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸の利用が好ましい。［２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸の利用が特に好ましい。

本発明のために、スルホニル尿素除草剤には、限定はしないが、クロロスルフロン、メタスルフロンメチル、スルホメトウロンメチル、クロリムロンエチル、チフェンスルフロンメチル、トリベンウロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタンメトスルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、ピリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロン、ピラゾスルフロンエチル、ハロスルフロン、アジムスルフロン、シクロスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、ホルアムスルフロン、ヨードスルフロン、オキサスルフロン、メソスルフロン、プロスルフロン、スルホスルフロン、トリフロキシスルフロン、トリトスルフロン、任意の上記除草剤の誘導体、および１つ以上の上記除草剤の混合物が含まれる。本発明のトリアゾロピリミジン除草剤には限定はしないが、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメトスラム、メトスラムおよびペノキシスラムが含まれる。本発明のピリミジニルオキシ安息香酸除草剤には限定はしないが、ビスピリバック、ピリチオバック、ピリミノバック、ピリベンゾキシムおよびピリフタリドが含まれる。スルホニルアミノ−カルボニルトリアゾリノン除草剤には、限定はしないが、フルカルバゾンおよびプロポキシカルバゾンが含まれる。

ピリミジニルオキシ安息香酸除草剤は、ピリミジニルチオ安息香酸除草剤に非常に関連しており、Ｗｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａによって後者の名前を与えるように一般化された。したがって、本発明の除草剤にはさらに、限定はしないが、上記のピリミジニルオキシ安息香酸除草剤を含む、ピリミジニルチオ安息香酸除草剤が含まれる。

本明細書で記述したコムギ植物は、トランスジェニックコムギ植物または非トランスジェニックコムギ植物のいずれかであり得る。同様に、本明細書で記述したライコムギ植物は、トランスジェニックライコムギ植物または非トランスジェニックライコムギ植物のいずれかであり得る。本明細書において語句「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は、少なくとも１つの組換え体ポリヌクレオチドのすべてまたは部分を含む、任意の植物、植物細胞、カルス、植物組織または植物部分を意味する。多くの場合で、組換え体ポリヌクレオチドのすべてまたは部分が、クロモソームまたは安定クロモソーム外要素に安定して統合されており、連続世代にわたる。本発明の目的のために、語句「組換え体ポリヌクレオチド（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、遺伝子工学的に変更、再アレンジまたは改変したポリヌクレオチドを意味する。例には、異種配列に連結したか結合した、任意のクローン化ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチド類が含まれる。語句「組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は、自然突然変異のような天然に存在する事象、または選択的交配に続く非自然突然変異の結果であるポリヌクレオチドの変更を意味する。非自然突然変異および選択的交配によって発生する変異を含む植物が、本明細書で非トランスジェニック植物として呼ばれており、本発明に含まれる。コムギ植物またはライコムギ植物がトランスジェニックであり、多重Ｉｍｉ核酸を含む実施例において、核酸は、異なるゲノムから、または同一のゲノムから由来され得る。あるいは、コムギ植物またはライコムギ植物が非トランスジェニック植物であり、多重のＩｍｉ核酸を含む実施例において、核酸は、異なるゲノムまたは同一のゲノム上に局在する。

１つのＩｍｉ核酸を含む非トランスジェニックコムギ植物栽培品種の例は、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５下、ＡＴＣＣで寄託され、Ｓｈｉｌｏｈ−８株として本明細書で指定された、植物栽培品種である。Ｓｈｉｌｏｈ−８株はＩｍｉ１核酸を含む。Ｓｈｉｌｏｈ−８遺伝子に相当する部分長ヌクレオチド配列を、配列番号１に示している。

（ｉ４４１７−８として指定した）Ｓｈｉｌｏｈ−８株の２５００種子の寄託は、２００３年１０月３０日に、アメリカ培養細胞系統保存機関、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａにて実施された。これらの寄託は、微生物の寄託に関するブタベスト条約の条項および条件にしたがって実施された。寄託は、少なくとも３０年間の期間実施され、ＡＴＣＣが受けた寄託の試料の供給に対する最近の要求後少なくとも５年間実施される。寄託された種子は、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５を与えられた。

本発明は、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５を有するコムギ植物、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５の植物の変異体、組換え体、または遺伝子工学的に改変した誘導体、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５の植物の任意の子孫、および任意のこれらの植物の子孫である植物を含む。好ましい実施形態において、本発明のコムギ植物はさらに、Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５での植物の除草剤耐性特性を有する。

本明細書にて記述されたＳｈｉｌｏｈ−８コムギ植物のハイブリッド、およびＳｈｉｌｏｈ−８と他のコムギ植物のハイブリッドがまた本発明に含まれる。他のコムギ植物には、限定はしないが、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．ｃｖ Ｆｉｄｅｌ、および変異遺伝子ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３またはＦＳ−４を有する任意のコムギ植物が含まれる（米国特許第６，３３９，１８４号および米国特許出願第０８／４７４，８３２号を参照のこと）。

語句「栽培品種（ｃｌｕｔｉｖａｒ）」および「品種（ｖａｒｉｅｔｙ）」は、１つの栽培品種または品種を、他の栽培品種または品種と区別するのに十分なように、当業者によって受け入れられる特徴または形質の共通の組の共有化によって定義される、種内の植物の一群を意味する。任意の所与の栽培品種または品種が、全遺伝子または分子レベルいずれかで遺伝的に同一であり得ること、または任意の所与の植物がすべての座で同種であり得ること、いずれの意味も語句に含まない。栽培品種または品種は、正確な品種改良栽培品種または品種が自己受粉する時に、すべての子孫が形質を含む場合に、特定の形質に関して、「正確な品種改良（ｔｒｕｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）」と考えられる。語句「品種改良株（ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｌｉｎｅ）」または「株（ｌｉｎｅ）」は、１つの品種改良株または株を、他の品種改良株または株と区別するのに十分なように、当業者によって受け入れられる特徴の共通の特性または形質の組の共有化によって定義される、栽培品種内の植物の一群を意味する。任意の所与の品種改良株または株が、全遺伝子または分子レベルいずれかで遺伝的に同一であり得ること、または任意の所与の植物がすべての座で同種であり得ること、いずれの意味も語句に含まない。品種改良株または株は、正確な品種改良栽培品種または種類が自己受粉する時に、すべての子孫が形質を含む場合に、特定の形質に関して、「正確な品種改良（ｔｒｕｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ）」と考えられる。本発明において、形質は、コムギまたはライコムギ植物または種子のＡｌｓ遺伝子中の変異より発生する。

さらに、本明細書での語句「栽培品種」および「品種」の使用は、本発明の植物を、１つ以上の植物品種に制限する意図はない。本発明は植物品種を包含するが、本発明の植物には、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ５６２５の植物の除草剤耐性特性、および／または１つ以上の本発明のＩｍｉ核酸を含む任意の植物が含まれる。

本発明のコムギまたはライコムギ植物が、Ｉｍｉ核酸に加えて、野生型Ａｌｓ核酸を含むことが可能であると理解されるべきである。実施例１にて記述したように、Ｓｈｉｌｏｈ−８株は、多重ＡＨＡＳイソ酵素のただ一つの中に変異を含む。したがって、本発明は、１つ以上の野生型Ａｌｓ核酸に加えて、少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含む、コムギ植物またはライコムギ植物を含む。

コムギおよびライコムギ植物に加えて、本発明は、単離ＩＭＩタンパク質および核酸を包含する。核酸は、配列番号１にて定義したようなポリヌクレオチド、配列番号２にて定義したようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、任意の上記ポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、および任意の上記ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、Ｉｍｉ核酸は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む。

語句「ＡＨＡＳタンパク質（ＡＨＡＳ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ＡＨＡＳポリペプチド（ＡＨＡＳ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、「ＡＬＳタンパク質（ＡＬＳ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、および「ＡＬＳポリペプチド（ＡＬＳ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、アセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質を意味し、語句「ＩＭＩタンパク質（ＩＭＩ ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ＩＭＩポリペプチド（ＩＭＩ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、野生型ＡＨＡＳタンパク質から変異された、そしてそこで発現した場合に、植物、植物細胞、植物部分、植物種子または植物組織に対して、イミダゾリノン耐性の増加を与える、任意のＡＨＡＳタンパク質を意味する。好ましい実施形態において、ＩＭＩタンパク質は、配列番号１を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含む。そのようなＩＭＩタンパク質は、除草剤耐性ＡＨＡＳ活性、特にイミダゾリノン耐性ＡＨＡＳ活性を有する。そのような除草剤耐性ＡＨＡＳ活性は、ＡＨＡＳ活性アッセイによって評価可能である。たとえば、参照によって本明細書で組み込まれている、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７１：１７３−１７９を参照のこと。

他の好ましい実施形態において、ＩＭＩタンパク質は、配列番号２を含むポリペプチドを含む。また本明細書において、語句「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」および「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、直鎖または分岐鎖、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡ、またはそれらのハイブリッドを意味する。本語句はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを含む。これらの語句はまた、遺伝子のコード領域の３’および５’末端両方に局在する非翻訳配列、遺伝子のコード配列の５’末端からの配列上流の少なくとも約１０００ヌクレオチド、および３’末端からの配列下流の少なくとも約２００ヌクレオチドを含む。イノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチンおよび他のもののようなあまり一般的でない塩基を、アンチセンス、ｄｓＲＮＡ、およびリボザイムのために使用可能でもある。たとえば、ウリジンおよびシチジンのＣ−５プロピン類似体を含むポリヌクレオチドが、高い親和性でＲＮＡに結合すること、および遺伝子発現の強力なアンチセンス阻害剤であることが示されてきた。リン酸ジエステルバックボーンに対する改変、ＲＮＡのリボース糖基中の２’−ヒドロキシのような他の改変もまた実施可能である。アンチセンスポリヌクレオチドおよびリボザイムは、リボヌクレオチドの全体からなってよく、または混合リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含んでよい。本発明のポリヌクレオチドは、ゲノム調製、ｃＤＮＡ調製、インビトロ合成、ＲＴ−ＰＣＲ、およびインビトロまたはインビボ転写を含む、任意の方法によって産出し得る。

「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸分子は、核酸の天然の供給源（すなわち他のポリペプチドをコードしている配列）中に存在する、他の核酸分子から実質的に分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その天然に存在するレプリコン中の核酸（すなわち核酸の５’および３’末端に局在する配列）に天然に隣接する配列から自由である。たとえば、クローン化された核酸は単離されたと考えられる。種々の実施形態において、単離Ｉｍｉ核酸分子が、核酸が由来する細胞（たとえばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ細胞）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子と天然に隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ以下のヌクレオチド配列を含み得る。核酸はまた、ヒト介入によって変更された場合、またはその天然の部位ではない座または局所に配置された場合、またはアグロ感染、バイオリスティック、または植物形質転換の任意の他の方法によって細胞内に導入した場合に、単離されたと考えられる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、天然に関連している他の細胞物質、または組換え体技術によって産出した場合に培養培地、または化学的に合成した場合、化学的前駆体または他の化学物質から自由であり得る。

「単離核酸」の定義から特に除外されるものは、（クロモソームスプレッドのような）天然に存在するクロモソーム、人工クロモソームライブラリー、ゲノムライブラリーおよびインビトロ核酸調製物として、またはトランスフェクト／形質転換宿主細胞調製としてのいずれかで存在するｃＤＮＡライブラリーであり、そこで宿主細胞は、インビトロ異種調製物であるか、または単一コロニーの異種集団としてプレートされる。また、特定の核酸が、５％以下のベクター分子中の核酸挿入物のメンバーを構成する、上記ライブラリーも特に除外される。さらに、（機械的に剪断したか、または酵素的に消化した全細胞調製物を含む）全細胞ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ調製物が特に除外される。さらに、本発明の核酸が、電気泳動培地中で異種核酸からさらに分離されない、電気泳動によって分離された（たとえばアガロースゲルまたはナイロンブロットにて、異種バンド集団から単独バンドを除外することによって分離すること）、インビトロ調製物または異種混合物として発見される全細胞調製物が特に除外される。

本発明の核酸分子、たとえば、配列番号１のヌクレオチド配列またはその一部分を含む核酸分子は、標準の分子生物学技術および本明細書で提供される配列情報を用いて単離可能である。たとえば、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ ＩＭＩ ｃＤＮＡを、配列番号１のすべてまたは一部を用いて、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍライブラリーから単離可能である。さらに、配列番号１のすべてまたは一部を含む核酸分子を、本配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によって単離可能である。たとえば、ｍＲＮＡを、（たとえば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：５２９４−５２９９のグアニジニウム−チオシアネート抽出手順によって）植物細胞から単離可能であり、ｃＤＮＡを、逆転写酵素（たとえばＭｏｌｏｎｅｙ ＭＬＶ逆転写酵素、ギブコ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能、またはＡＭＶ逆転写酵素、生化学アメリカ社（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．）Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬから入手可能）を用いて調製可能である。ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１にて示したヌクレオチド配列に基づいて設計可能である。本発明の核酸分子を、標準のＰＣＲ増幅技術にしたがって、適切なオリゴヌクレオチドプライマーと、鋳型としてｃＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡを用いて、増幅可能である。そのようにして増幅された核酸を分子を、適切なベクター内にクローン化し、ＤＮＡ配列解析によって特性化可能である。さらに、ＩＭＩヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドを、たとえば自動化ＤＮＡシンセサイザーを用いて、標準の合成技術によって調製可能である。

本発明のＩｍｉ核酸は、ＩＭＩタンパク質をコードしている配列（すなわち「コード領域（ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）」、ならびに５’非翻訳配列および３’非翻訳配列を含み得る。あるいは、本発明の核酸分子は、ＩＭＩ遺伝子のコード領域のみを含み得、またはゲノムＤＮＡから単離した全ゲノム断片を含み得る。これらの配列のコード領域は、「ＯＲＦ位置（ＯＲＦ ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」として示される。さらに、本発明の核酸分子は、ＩＭＩ遺伝子のコード領域の一部、たとえば、プローブまたはプライマーとして使用可能である断片を含み得る。Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍからのＩＭＩ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列によって、他の細胞型または有機物内で、ＩＭＩ相同体、ならびに他のコムギ植物および関連種からのＩＭＩ相同体を同定すること、および／またはクローニングすることにおける使用のために設計されるプローブおよびプライマーの生成が可能になる。コード領域の部分はまた、ＩＭＩタンパク質の生物学的に活性な断片もコード可能である。

本明細書において語句ＩＭＩタンパク質の「生物学的に活性な部分（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｉｏｎ ｏｆ）」は、植物中に産出された時に、野生型植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する植物の耐性を増加させる、ＩＭＩタンパク質の一部分、たとえばドメイン／モチーフを含むことを意図する。増加したイミダゾリノン除草剤に対する耐性を定量するための方法を、以下の実施例にて提供している。ＩＭＩタンパク質の生物学的に活性な部分には、全長ＩＭＩタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、植物中での発現に際して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性の増加を与える、配列番号２に由来するペプチドが含まれる。典型的には、生物学的に活性な部分（たとえば長さにして、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００以上のアミノ酸であるペプチド）は、少なくとも１つのＩＭＩタンパク質の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。さらに、ポリペプチドの他の領域が欠落した他の生物学的に活性な他の部分を、組換え体技術によって調製し、１つ以上の本明細書で記述した活性に関して評価可能である。好ましくは、ＩＭＩタンパク質の生物学的に活性な部分は、Ｄｏｍａｉｎ Ａ、Ｄｏｍａｉｎ Ｂ、Ｄｏｍａｉｎ Ｃ、Ｄｏｍａｉｎ ＤおよびＤｏｍａｉｎ Ｅからなる群より選択される１つ以上の保存ドメインを含み、前記保存ドメインが変異を含む。

本発明はまた、ＩＭＩキメラまたは融合ポリペプチドも提供する。本明細書において、ＩＭＩ「キメラポリペプチド（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」または「融合ポリペプチド（ｆｕｓｉｏｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、非ＩＭＩポリペプチドに動作可能に連結したＩＭＩポリペプチドを含む。「非ＩＭＩポリペプチド（ｎｏｎ−ＩＭＩ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ペプチドがＩＭＩポリペプチドとは異なる機能を発揮する、実質的にＩＭＩポリペプチドと同一ではないアミノ酸配列を有するポリペプチド、たとえばＩＭＩイソ酵素ではないポリペプチドを意味する。融合ポリペプチドに関して本明細書において語句「動作可能に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、ＩＭＩポリペプチドと非ＩＭＩポリペプチドが互いに融合し、両方の配列が、使用する配列に寄与する提案された機能を満たすことを示唆する意図がある。非ＩＭＩポリペプチドは、ＩＭＩポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合可能である。たとえば、１つの実施形態において、融合ポリペプチドは、ＩＭＩ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合する、ＧＳＴ−ＩＭＩ融合ポリペプチドである。そのような融合ポリペプチドは、組換え体ＩＭＩポリペプチドの精製を促進可能である。他の実施形態において、融合ポリペプチドは、そのＮ末端にて、異種シグナル配列を含むＩＭＩポリペプチドである。特定の宿主細胞（たとえばほ乳動物宿主細胞）内で、ＩＭＩポリペプチドの発現および／または分泌が、異種シグナル配列の使用を介して増加可能である。

配列番号２のポリペプチドに対して特定の割合の配列同一性を有するＩＭＩポリペプチドをコードしている単離核酸分子を、配列番号１のヌクレオチド配列内に、１つ以上のヌクレオチド置換、添加または欠損を導入し、１つ以上のアミノ酸置換、添加または欠損が、コードされたポリペプチドに導入されることによって作製可能である。変異を、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介変異誘発のような、標準の技術によって、配列番号１の配列内に導入可能である。好ましくは、保守的アミノ酸置換を、１つ以上の予想される非必須アミノ酸残基で実施する。

「保守的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されてきた。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖を有するアミノ酸（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、ＩＭＩポリペプチド内の予想される非必須アミノ酸残基が好ましくは、同一の側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基によって置換される。あるいは、他の実施形態において、変異を、飽和変異誘発によってのような、ＩＭＩコード配列のすべてまたは一部にそって無作為に導入可能であり、ＩＭＩ活性を残す変異体を同定するために、本明細書で記述したＩＭＩ活性に関して、得られた変異体を選択可能である。配列番号１の配列の変異誘発に続いて、コードされたポリペプチドを、組換え体的に発現させることができ、ポリペプチドの活性を、以下の実施例にて記述したように、ポリペプチドを発現している植物のイミダゾリノン耐性を解析することによって決定可能である。

２つのアミノ酸配列のパーセント配列同一性を決定するために、配列を最適な比較目的のために並べる（たとえば他のポリペプチドとの最適アライメントのために、１つのポリペプチドの配列中にギャップを導入可能である）。次いで、相当するアミノ酸位置でのアミノ酸残基を比較する。１つの配列中の位置を、他の配列中の相当する位置での同一のアミノ酸によって占拠された場合に、分子がその位置で同一である。同一の型の比較を２つの核酸配列間で実施可能である。２つの配列間のパーセント配列同一性は、配列によって共有された同一の位置の数の関数である（すなわち、パーセント配列同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。本発明の目的のために、２つの核酸またはポリペプチド配列間のパーセント配列同一性を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ６．０（ＰＣ）ソフトウェアパッケージ（インフォマックス（ＩｎｆｏｒＭａｘ）、７６００ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｖｅ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ２０８１４）を用いて決定する。１５のギャップ解放ペナルティーおよび６．６６のギャップ伸張ペナルティーを、２つの核酸のパーセント同一性を決定するために使用する。１０のギャップ解放ペナルティーおよび０．１のギャップ伸張ペナルティーを、２つのポリペプチドのパーセント同一性を決定するために使用する。すべての他のパラメータは、初期設定に設定する。

配列同一性を決定する目的のために、ＤＮＡ配列をＲＮＡ配列と比較する時に、チミジンヌクレオチドがウラシルヌクレオチドに対する等価物であることが理解されるべきである。好ましくは、本発明の単離Ｉｍｉ核酸は、少なくとも約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜または９０％、９０〜９５％、最も好ましくは９６％、９７％、９８％、９９％以上、配列番号１にて示した全ポリヌクレオチド配列に対して同一である。他の実施形態において、本発明に含まれる単離Ｉｍｉ核酸は、少なくとも約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜または９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上、配列番号１にて示す全ポリヌクレオチド配列と同一である。

好ましくは、本発明の単離ＩＭＩポリペプチドは、少なくとも約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜または９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上、配列番号２にて示した全アミノ酸配列に対して同一である。他の実施形態において、本発明に含まれる単離ＩＭＩポリペプチドは、少なくとも約５０〜６０％、好ましくは少なくとも約６０〜７０％、より好ましくは少なくとも約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜または９０％、または９０〜９５％、最も好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％以上、配列番号２にて示す全アミノ酸配列と同一である。

さらに、最適化Ｉｍｉ核酸を作製可能である。好ましくは、最適化Ｉｍｉ核酸は、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を調節する、より好ましくは、植物中のその過剰発現に際して、イミダゾリノン除草剤に対する植物の耐性を増加させる、ＩＭＩポリペプチドをコードしている。本明細書において「最適化（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」は、所与の植物または動物におけるその発現を増加させるように遺伝子工学的に改変される核酸を意味する。植物最適化Ｉｍｉ核酸を提供するために、遺伝子のＤＮＡ配列は、１）高く発現した植物遺伝子によって好ましいコドンを含む、２）植物中で実質的に見られるヌクレオチド塩基組成でのＡ＋Ｔ含量を含む、３）植物開始配列を形成する、４）ＲＮＡの不安定化、不適切なポリアデニル化、分解および終結を引き起こす、または二次構造ヘアピンまたはＲＮＡスプライス部位を形成する、配列を除去する、ように改変可能である。植物中のＩｍｉ核酸の発現の増加を、一般的、または特定の植物にて、植物中でのコドン利用の分布頻度を用いることによって達成可能である。植物中の核酸発現を最適化するための方法は、欧州特許第０３５９４７２号、欧州特許第０３８５９６２号、ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９１／１６４３２号、米国特許第５，３８０，８３１号、米国特許第５，４３６，３９１号、Ｐｅｒｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３３２４−３３２８、およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８にてみることができる。

本明細書において「好ましいコドン利用の頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）」は、所与のアミノ酸を特定化するために、ヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される優先度を意味する。遺伝子内の特定のコドンの利用の頻度を決定するために、遺伝子内のそのコドンの発生の数を、遺伝子内の同一のアミノ酸を特定化する、すべてのコドンの発生の総数で割る。同様に、宿主細胞によって示される好ましいコドン利用の頻度は、宿主細胞によって高く発現された多数の遺伝子中での好ましいコドン利用の頻度を平均化することによって計算可能である。本解析は、宿主細胞によって高く発現している遺伝子に限定することが好ましい。宿主細胞によって利用されるものからの、合成遺伝子に関する好ましいコドン利用の頻度のパーセント偏差は、宿主細胞のものからの、単一のコドンの利用の頻度のパーセント偏差を決定し、続いてすべてのコドンにわたる平均偏差を得ることによってまず計算される。本明細書で定義されるように、本計算には、固有のコドン（すなわちＡＴＧおよびＴＧＧ）が含まれる。一般的語句において、宿主細胞のものからの、最適化遺伝子のコドン利用の総平均偏差を、等式１Ａ＝ｎ＝１ＺＸ_n−Ｙ_nＸ_n×１００Ｚ、式中Ｘ_n＝宿主細胞内のコドンｎに対する利用頻度、Ｙ_n＝合成遺伝子中のコドンｎに対する利用頻度であり、ｎはアミノ酸を特定する個々のコドンを表し、コドンの総数はＺであることを使用して計算する。すべてのアミノ酸に対するコドン利用の頻度の総偏差Ａは、好ましくは約２５％より少なく、より好ましくは約１０％より少ないはずである。

したがって、Ｉｍｉ核酸は、そのコドン利用の分布頻度が、好ましくは、非常に発現している植物遺伝子のものから２５％より少なく、より好ましくは、約１０％より少なく逸脱する。さらに、変性第三塩基のパーセンテージＧ＋Ｃ含量が考慮される（双子葉植物がそうでないのに対して、単子葉植物がこの位置でＧ＋Ｃを好むことが明らかである）。また、ＸＣＧ（式中ＸはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）が双子葉植物中の最小の好ましいコドンであり、一方でＸＴＡコドンが、単子葉植物および双子葉植物両方で避けられることも認識される。本発明の最適化Ｉｍｉ核酸はまた好ましくは、選択された宿主植物（すなわちＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）のものと非常に近い、ＣＧおよびＴＡダブレット回避インデックスを有する。さらに好ましくは、これらのインデックスは、約１０〜１５％より少ないところまで、宿主のものから逸脱する。

上述のＩＭＩポリペプチドをコードしている核酸分子に加えて、本発明の他の態様は、それに対するアンチセンスである単離核酸分子に関連する。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、標的ポリヌクレオチドの転写、スプライシング、輸送、翻訳および／または安定性を干渉することによって、標的ポリヌクレオチドの遺伝子発現を阻害すると考えられる。方法は、アンチセンスポリヌクレオチドを、クロモソームＤＮＡ、初期ＲＮＡ転写物または処理ｍＲＮＡに対して標的化するために、先行技術にて記述されている。好ましくは、標的領域には、スプライス部位、翻訳開始コドン、翻訳終結コドン、およびオープンリーディングフレーム内の他の配列が含まれる。

本発明の目的のための語句「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）」は、遺伝子、第一転写物または処理ｍＲＮＡのすべてまたは一部分に十分に相補的であるポリヌクレオチドを含む核酸で、内在性遺伝子の発現を干渉するものを意味する。「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」ポリヌクレオチドは、標準のワトソン−クリック相補ルールに従って、塩基対を可能にするものである。特に、プリンが、ＤＮＡの場合にシトシンと対になるグアニン（Ｇ：Ｃ）、チミンと対になるアデニン（Ａ：Ｔ）、またはＲＮＡの場合ウラシルと対になるアデニン（Ａ：Ｕ）の組合せを形成するための、ピリミジンとの塩基対である。２つのポリヌクレオチドが、互いに完全に相補的でなくても、それぞれが実質的に他と相補的である少なくとも１つの領域を有するという条件で、互いにハイブリッド形成しうることが理解され得る。語句「アンチセンス核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」には、一本鎖ＲＮＡならびにアンチセンスＲＮＡを産出するために転写可能である二本鎖ＤＮＡ発現カセットが含まれる。「活性（ａｃｔｉｖｅ）」アンチセンス核酸は、初期転写物、または配列番号２のポリペプチド配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしているｍＲＮＡと選択的にハイブリッド形成可能である、アンチセンスＲＮＡ分子である。

上述のＩｍｉ核酸およびポリペプチドに加えて、本発明は、部分に接着したこれらの核酸およびポリペプチドを含む。これらの部分には、限定はしないが、検出部分、ハイブリッド形成部分、精製部分、伝達部分、反応部分、結合部分などが含まれる。接着した部分を有する核酸の典型的な群は、プローブおよびプライマーである。プローブおよびプライマーには典型的に、実質的に単離されたオリゴヌクレオチドが含まれる。オリゴヌクレオチドは典型的には、少なくとも約１２、好ましくは約２５、より好ましくは約４０、５０または７５の、配列番号１に列挙した配列のセンス鎖の連続ヌクレオチド、配列番号１に列挙した配列のアンチセンス配列、またはその天然に存在する変異体に、ストリンジェント条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列の領域を含む。配列番号１のヌクレオチド配列に基づくプライマーを、ＩＭＩ相同体をクローン化するために、ＰＣＲ反応中で使用することができる。ＩＭＩヌクレオチド配列に基づくプローブを、同一または相同ポリペプチドをコードしている転写物またはゲノム配列を検出するために使用可能である。好ましい実施形態において、プローブはさらに、それに接着した標識群を含み、たとえば標識群は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であり得る。そのようなプローブは、たとえば、ＩＭＩ ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノムＩＭＩ遺伝子が変異されているか、または欠損しているかどうかを決定すること、のような、細胞の試料中、ＩＭＩ−コード核酸のレベルを測定することによってのような、ＩＭＩポリペプチドを発現している細胞を同定するためのゲノムマーカー試験の一部として使用することができる。

本発明はさらに、上述のようなＩｍｉ核酸を含む単離組換え体発現ベクターを提供し、そこで、宿主細胞内のベクターの発現は結果として、野生型宿主細胞と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性の増加となる。本明細書において語句「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、連結する他の核酸を輸送可能である核酸分子を意味する。ベクターの１つの型は「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡ区画を連結可能である環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。他のベクターの型はウイルスベクターであり、そこでさらなるＤＮＡ区画が、ウイルスゲノム内に連結可能である。特定のベクターが導入された宿主細胞内で自動複製可能である（たとえば細菌の複製起源を有するバクテリアベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内への導入に際して、宿主細胞のゲノム内に統合され、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターが、動作可能に連結した遺伝子の発現を指向可能である。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター（ｅｘｐｒｆｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）」と呼ばれる。一般的に、組換え体ＤＮＡ技術で利用される発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も使用されるベクターの形態であるので、同義語的に使用されている。しかしながら、本発明は、等価の機能を発揮するウイルスベクター（たとえば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ−関連ウイルス）のような他の形態の発現ベクターを含む意図がある。

本発明の組換え体発現ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現に適切な形態で、本発明の核酸を含み、これは、組換え体発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞の基礎に基づいて選択した、発現されるべき核酸配列に動作可能に連結している、１つ以上の調節配列を含むことを意味している。組換え体発現ベクターに関して、「動作可能に連結する（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式（たとえばインビトロ転写／翻訳システム内、またはベクターが宿主細胞内に導入される時に宿主細胞内）で、調節配列（類）に連結していることを意味する意図がある。語句「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（たとえばポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、たとえばそこに組み込まれた参考文献を含む、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）およびＧｒｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃｒｏｓｂｙ，ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃｈａｐｅｒ ７，８９−１０８，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａにて記述されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指向するもの、および特定の宿主細胞中のみ、または特定の条件下でヌクレオチド配列の発現を指向するもの、が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現のレベルなどのような因子に依存し得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入し、これによって、本明細書で記述されているような核酸によってコードされる融合ポリペプチドまたはペプチドを含むポリペプチドまたはペプチド（たとえばＩＭＩポリペプチド、融合ポリペプチドなど）を産出可能である。

本発明の好ましい実施形態において、ＩＭＩポリペプチドが、（藻類のような）単細胞植物細胞のような植物および植物細胞（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １（３）：２３９−２５１とそこに組み込まれた参考文献を参照のこと）、およびより高度な植物（たとえば農作物植物のような種子植物）からの植物細胞中で発現する。ＩＭＩポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換および形質導入、エレクトロポレーション、粒子衝撃、アグロ感染、微粒子銃などを含む任意の方法によって、植物細胞内に「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」し得る。

植物細胞を含む宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするために適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｖｏｌ．４４，「アグロバクテリウムプロトコル（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、ｅｄ．：Ｇａｒｔｌａｎｄ ａｎｄ Ｄａｖｅｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙのような他の実験室マニュアルにて見ることができる。イミダゾリノン除草剤に対する耐性の増加が、トウモロコシ、コムギ、ライ、オートムギ、ライコムギ、米、オオムギ、大豆、ピーナッツ、コットン、菜種およびアブラナ、マニホット、コショウ、ひまわりおよびマンジュギク、ジャガイモのようなナス科植物、タバコ、ナスおよびトマト、ビシア種、エンドウマメ、ムラサキウマゴヤシ、ブッシュ植物（コーヒー、カカオ、茶）、サリックス種、木（油やし、ココナッツ）、多年生牧草、飼料作物のような多数の植物内に遺伝されることが望まれる一般的な形質であり、これらの植物はまた、本発明のさらなる実施形態として、遺伝子工学的な好ましい標的植物である。好ましい実施形態において、植物は、コムギ植物である。飼料作物には、限定はしないが、ウィートグラス、カナリーグラス、ブロムグラス、ウィルドリグラス、ブルーグラス、オーチャードグラス、ムラサキウマゴヤシ、サルホイン、バーズフット、トレホイル、アルサイククローバー、レッドクローバーおよびスイートクローバーが含まれる。

本発明の１つの実施形態において、ＩＭＩポリヌクレオチドの植物内へのトランスフェクションを、アグロバクテリア仲介遺伝子伝達によって実施する。当業者に公知の１つの形質転換方法は、顕花植物のアグロバクテリア溶液への浸漬であり、そこでアグロバクテリアはＩＭＩ核酸を含み、その後、形質転換配偶子の交配である。アグロバクテリア仲介植物形質転換は、たとえばＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０）（Ｋｏｎｃｚ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌ，１９８６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３−３９６）またはＬＢＡ４４０４（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）株を用いて実施可能である。形質転換は、標準の形質転換および再生技術を用いて実施可能である（Ｄｅｂｌａｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１３：４７７７−４７８８；Ｇｅｌｖｉｎ，Ｓｔａｎｔｏｎ Ｂ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｒｏｂｅｒｔ Ａ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．−Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌ．，１９９５，−ｉｎ Ｓｅｃｔ，Ｒｉｎｇｂｕｃ Ｚｅｎｔｒａｌｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ：ＢＴ１１−Ｐ ＩＳＢＮ０−７９２３−２７３１−４；Ｇｌｉｃｋ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｒ．ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３ ３６０Ｓ．，ＩＳＢＮ ０−８４９３−５１６４−２）。たとえば、菜種を、子葉または胚軸形質転換を介して形質転換可能である（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ８：２３８−２４２；Ｄｅ Ｂｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：６９４−７０１）。アグロバクテリアおよび植物選択のための抗生物質の利用は、形質転換のために使用する二成分ベクターおよびアグロバクテリア株に依存する。菜種選別は通常、選択可能植物マーカーとしてカナマイシンを用いて実施する。アマへのアグロバクテリア仲介遺伝子伝達は、たとえば、Ｍｌｙｎａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ １３：２８２−２８５によって記述される技術を用いて実施可能である。さらに、大豆の形質転換は、たとえば欧州特許第０４２４ ０４７号、米国特許第５，３２２，７８３号、欧州特許第０３９７ ６８７号、米国特許第５，３７６，５４３号または米国特許第５，１６９，７７０号にて記述された技術を用いて実施可能である。トウモロコシの形質転換は、微粒子銃、ポリエチレングリコール仲介ＤＮＡ取り込みによって、またはシリコン炭化物繊維技術を介して実施可能である（たとえば、Ｆｒｅｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｗａｌｂｏｔ、「トウモロコシハンドブック（Ｔｈｅ ｍａｉｚｅ ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３） ＩＳＢＮ ３−５４０−９７８２６−７を参照のこと）。トウモロコシ形質転換の特定の例が、米国特許第５，９９０，３８７号にて見ることができ、コムギ形質転換の特定の例が、ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／０７２５６号で見ることができる。

本発明にしたがって、導入したＩＭＩポリヌクレオチドを、非クロモソーム自立複製内に組み込んだ場合、または植物クロモソーム内に統合した場合、安定に植物細胞内で維持され得る。あるいは、導入したＩＭＩポリヌクレオチドは、クロモソーム外非複製ベクター上に存在し、一過性に発現するか、一過性に活性であり得る。１つの実施形態において、相同組換え微生物を、ＩＭＩポリヌクレオチドがクロモソーム内に統合され、ベクターが、内生ＡＨＡＳ遺伝子を変更し、たとえば機能的に崩壊させ、ＩＭＩ遺伝子を作製するために、欠損、添加または置換が導入されるＡＨＡＳ遺伝子の少なくとも一部を含むように調製するように調製可能である。相同組換えを介した点変異を作製するために、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、キメラ形成法として公知の技術にて使用可能である（Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７（５）：１３２３−１３３０およびＫｍｉｅｃ，１９９９，Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ ８７（３）：２４０−２４７）。Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種における他の相同組換え手順もまた、当分野で周知であり、本明細書での使用に関して企図されている。

相同組換え体ベクター中で、微生物または植物内にて、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外来ＩＭＩ遺伝子と、内生ＡＨＡＳ遺伝子間で起こるように、ＩＭＩ遺伝子は、ＡＨＡＳ遺伝子の追加核酸によって、その５’および３’末端と隣接可能である。追加隣接ＡＨＡＳ核酸分子は、内在性遺伝子との首尾よい相同組換えのために十分な長さである。典型的に、キロ塩基までの隣接ＤＮＡ（５’および３’末端両方）の数百の塩基対がベクターに含まれる（たとえば、相同組み換えベクターの記述に関して、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．，ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ５１：５０３またはＰｈｙｓｃｏｎｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓでのｃＤＮＡに基づく組換えに関して、Ｓｔｒｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ，９５（８）：４３６８−４３７３を参照のこと）。しかしながら、ＩＭＩ遺伝子は通常、非常に少ないアミノ酸において、ＡＨＡＳと異なるので、隣接配列はいつも必要なわけではない。相同組換えベクターを、（たとえばポリエチレングリコール仲介ＤＮＡを介して）微生物または植物細胞に導入し、導入されたＩＭＩ遺伝子が、内生ＡＨＡＳ遺伝子に相同的に組換えられた細胞を、公知の技術を用いて選択する。

他の実施形態において、組換え微生物を、導入した遺伝子の制御された発現を許容する選択されたシステムを含んで産出可能である。たとえば、ｌａｃオペロンの制御下に配置したベクター上のＩＭＩ遺伝子の含有によって、ＩＰＴＧの存在下でのみＩＭＩ遺伝子の発現が可能になる。そのような制御システムは当分野で周知である。

クロモソーム外非複製ベクターまたはクロモソーム内に統合されたベクター中に存在するかどうか、ＩＭＩポリヌクレオチドは好ましくは、植物発現カセット内に存在する。植物発現カセットは好ましくは、たとえばポリアデニル化シグナルによる転写の終結のような、各配列がその機能を満たすことが可能であるように動作可能に連結した植物細胞内で、遺伝子発現を駆動可能である調節配列を含む。好ましいポリアデニル化シグナルは、Ｔｉ−プラスミドｐＴｉＡＣＨ５（Ｇｉｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８３５）のオクトピンシンターゼとして知られている遺伝子３、またはその機能的な等価物のような、アグロバクテリウム・ツメファシエンス ｔ−ＤＮＡから由来しているものであるが、また植物内で機能的に活性である、すべての他のターミネーターも適切である。植物遺伝子発現は非常にしばしば、転写レベルで制限されるので、植物発現カセットは好ましくは、ポリペプチド／ＲＮＡ比を増強するタバコモザイクウイルスからの、５’非翻訳リーダー配列を含むオーバードライブ−配列のような、翻訳エンハンサーのような他の動作可能に連結した配列を含む（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８６９３−８７１１）。植物発現ベクターの例には、Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，「左縁に近接して局在する選択可能なマーカーを有する新規植物二成分ベクター（Ｎｅｗ ｐｌａｎｔ ｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ）」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：１１９５−１１９７、Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．，１９８４，「植物形質転換のための二成分アグロバクテリウムベクター（Ｂｉｎａｒｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１、および「高等植物における遺伝子伝達のためのベクター（Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｐｌａｎｔ）」、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，ＶＯＬ．１，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｅｄｓ．：Ｋｕｎｇ ａｎｄ Ｒ．Ｗｕ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９３，Ｓ．１５−３８に詳述されたものが含まれる。

植物遺伝子発現は、適時に、細胞型優先、または組織優先様式にて遺伝子発現を与える適切なプロモーターに動作可能に連結されるべきである。本発明の発現カセットにて有用なプロモーターには、植物細胞内で転写を開始可能である任意のプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターには、限定はしないが、アグロバクテリウムおよびリゾビウムのような、植物中に発現される遺伝子を含む、植物、植物ウイルスおよびバクテリアから得られうるものが含まれる。

プロモーターは、構成的、誘導可能、発生段階優先、細胞型優先、組織優先または器官優先であり得る。構成的プロモーターは、ほとんどの条件下で活性である。構成的プロモーターの例には、ＣａＭＶ １９Ｓおよび３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）、ｓＸ ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２９９−１３０２）、ＳｅｐＩプロモーター、米アクチンプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９），ｐＥｍｕ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、Ｓｍａｓプロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０）、ＧＲＰ１−８プロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、マンノピンシンターゼ、ノパリンシンターゼおよびオクトピンシンターゼのような、アグロバクテリアのＴ−ＤＮＡからのプロモーター、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ｓｓｕＲＵＢＩＳＣＯ）プロモーターの小サブユニットなどが含まれる。

誘導可能プロモーターは、栄養素または代謝体の存在または不在、熱または低温度、光、病原体攻撃、嫌気性条件などのような、特定の環境状態下で活性である。たとえば、Ｂｒａｓｓｉｃａからのｈｓｐ８０プロモーターが、熱ショックによって誘導され、ＰＰＤＫプロモーターは光によって誘導され、タバコ、シロイヌナズナおよびトウモロコシからのＰＲ−１プロモーターは病原体の感染によって誘導可能であり、Ａｄｈ１プロモーターは低酸素および低温ストレスによって誘導される。植物遺伝子発現はまた、誘導可能なプロモーターを介して促進可能である（参照のために、Ｇａｔｚ，１９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：８９−１０８を参照のこと）。化学的に誘導可能なプロモーターが特に、時間特異的遺伝子発現が望まれる場合に適切である。そのようなプロモーターの例は、サリチル酸誘導可能プロモーター（ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９５／１９４４３号）、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：３９７−４０４）およびエタノール誘導可能プロモーター（ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９３／２１３３４号）である。

発生段階優先プロモーターは、好ましくは特定の発生の段階で発現する。組織および器官優先プロモーターには、葉、根、種子または木質部のような、特定の組織または器官にて好ましく発現するものが含まれる。組織優先および器官優先プロモーターの例には、限定はしないが、果物優先、胚珠優先、雄組織優先、種子優先、外皮優先、塊茎優先、茎優先、果皮優先および葉優先、柱頭優先、花粉優先、葯優先、花弁優先、萼片優先、小花柄優先、長角果優先、葉柄優先、根優先プロモーターなどが含まれる。種子優先プロモーターは、種子発生および／または発芽の間に好ましく発現する。たとえば、種子優先プロモーターは、胚優先、内胚乳優先、および種子殻優先であり得る。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １０：１０８を参照のこと。種子優先プロモーターの例には、限定はしないが、セルロースシンターゼ（ｃｅｌＡ）、Ｃｉｍ１、ガンマ−ゼイン、グロブリン−１、トウモロコシ１９ｋＤゼイン（ｃＺ１９Ｂ１）などが含まれる。

他の適切な組織優先または器官優先プロモーターには、菜種のためのナピン−遺伝子プロモーター（米国特許第５，６０８，１５２号）、Ｖｉｃｉａ ｆａｂａからのＵＳＰ−プロモーター（Ｂａｅｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２２５（３）：４５９−６７）、シロイヌナズナからのオレオシン−プロモーター（ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９８／４５４６１号）、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓからのファセオリン−プロモーター（米国特許第５，５０４，２００号）、アブラナからのＢｃｅ４−プロモーター（ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９１．１３９８０号）、またはレグミンＢ４プロモーター（ＬｅＢ４；Ｂａｅｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，２（２）：２３３−９）、ならびにトウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライ、米などのような単子葉植物中で、種子特異的発現を与えるプロモーターが含まれる。考慮されるべき適切なプロモーターは、オオムギからのｌｐｔ２またはｌｐｔ１−遺伝子プロモーター（ＰＣＴ出願番号第ＷＯ９５／１５３８９号およびＰＣＴ番号第ＷＯ９５／２３２３０号）またはＰＣＴ出願番号第ＷＯ９９／１６８９０号にて記述されたもの（オオムギホルデイン−遺伝子、米グルテリン遺伝子、米オリジン遺伝子、米プロラミン遺伝子、コムギグリアジン遺伝子、コムギグルテリン遺伝子、オートムギグルテリン遺伝子、ソルガムカシリン−遺伝子、およびライセカリン遺伝子からのプロモーター）である。

本発明の発現カセット中で有用である他のプロモーターには、限定はしないが、主要なクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーター、ヒストンプロモーター、Ａｐ３プロモーター、β−コングリシンプロモーター、ナピンプロモーター、大豆レシチンプロモーター、トウモロコシ１５ｋＤゼインプロモーター、２２ｋＤゼインプロモーター、２７ｋＤゼインプロモーター、ｇ−ゼインプロモーター、ロウ、シュリンケン１、シュリンケン２およびブロンズプロモーター、Ｚｍ１３プロモーター（米国特許第５，０８６，１６９号）、トウモロコシポリガラクトロナーゼプロモーター（ＰＧ）（米国特許第５，４１２，０８５号および第５，５４５，５４６号）およびＳＧＢ６プロモーター（米国特許第５，４７０，３５９号）ならびに合成または他の天然プロモーターが含まれる。

植物内の異種遺伝子発現を制御することにおけるさらなる柔軟性が、異種供給源からのＤＮＡ結合ドメインおよび応答要素（すなわち非植物供給源からのＤＮＡ結合ドメイン）を用いることによって得られ得る。そのような異種ＤＮＡ結合ドメインの例は、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン（Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ，１９８５，Ｃｅｌｌ ４３：７２９−７３６）である。

本発明は、植物、植物細胞および他の、非ヒト宿主細胞内での、本発明のポリヌクレオチド分子を発現するための発現カセットを提供する。発現カセットは、Ｉｍｉ核酸に動作可能に連結した、対象の植物、植物細胞または他の宿主細胞にて発現可能なプロモーターを含む。発現をクロロプラストに標的化するために必要である場合、発現カセットはまた、発現したＩＭＩタンパク質をクロロプラストに指向するために、クロロプラスト移行ペプチドをコードしている、動作可能に連結したクロロプラスト標的化配列を含み得る。

１つの実施形態において、Ｉｍｉ核酸は、発現のために、クロロプラストに対して標的化される。この様式において、Ｉｍｉ核酸が直接クロロプラスト内に挿入されない場合に、発現カセットが追加的に、対象の遺伝子産物をクロロプラストに指向させるために、クロロプラスト移送ペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む、クロロプラスト標的化配列を含み得る。そのような移送ペプチドが当分野で公知である。クロロプラスト標的化配列に関して、「動作可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、移送ペプチドをコードしている核酸配列（すなわちクロロプラスト−標的化配列）が、２つの配列が連続しており、同一のリーディングフレーム内であるように、本発明のＩｍｉ核酸に連結していることを意味する。たとえば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８、Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１、およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１を参照のこと。本発明のＩＭＩタンパク質が、天然のクロロプラスト移送ペプチドを含み得る一方で、当分野で公知の任意のクロロプラスト移送ペプチドが、クロロプラスト−標的化配列を、本発明の成熟ＩＭＩタンパク質をコードしているヌクレオチド配列の５’末端に動作可能に連結することによって、本発明の成熟ＩＭＩタンパク質のアミノ酸配列に融合可能である。

クロロプラスト標的化配列は当分野で公知であり、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ Ｓｉｌｖａ Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：７６９−７８０、Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（５）：３３３５−３３４２）、５−（エノールピルビニル）シキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）（Ａｒｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂ．２２（６）：７８９−８１０）、トリプトファン シンターゼ（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１１）：６０８１−６０８７）、プラストシアニン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０３５７−２０３６３）、コリスミ酸シンターゼ（Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２７４４７−２７４５７）、および光収穫クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Ｌａｍｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４９９６−１４９９９）が含まれる。また、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８、Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１を参照のこと。

Ｉｍｉ核酸またはＩｍｉ核酸を含む発現カセットをまた、そこでの発現のために、クロロプラスト内に導入可能である。クロロプラストの形質転換のための方法は当分野で公知である。たとえば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７、Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ （１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６を参照のこと。本方法は、選択可能マーカーを含み、相同組換えを介してＤＮＡをプラスミドゲノムに標的化する、ＤＮＡの粒子銃伝送に依存している。さらに、プラスミド形質転換を、核コードおよびプラスミド指向ＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現によって、サイレントプラスミド−骨トランスジーンのトランス活性化によって達成可能である。そのようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５にて報告されている。

クロロプラストに標的化されるべきＩｍｉ核酸は、植物核およびそのオルガネラ間でのコドン利用における差違に関して明らかにするために、クロロプラストでの発現のために最適化され得る。この様式において、対象の核酸は、クロロプラスト優先コドンを用いて合成し得る。たとえば、本明細書にて参照によって組み込まれている、米国特許第５，２８０，８３１号を参照のこと。クロロプラスト発現のために必要である場合、発現カセットはさらに、Ｉｍｉ核酸に動作可能に連結したクロロプラストプロモーターをさらに含み得る。そのようなクロロプラストプロモーターが当分野で公知である。

本発明の他の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。語句「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」および「組換え宿主細胞（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、本明細書で同義語として使用される。そのような語句は、特定の対象細胞を意味するだけでなく、そのような細胞の子孫または可能性のある子孫にも適用されることが理解される。特定の改変が、変異導入または環境の影響いずれかのために続く世代で発生しうるので、そのような子孫は、実際に親細胞と同一ではなくてよく、ただし、本明細書で使用される語句の範囲内に含まれる。宿主細胞は、任意の真核または原核細胞であり得る。たとえば、ＩＭＩポリヌクレオチドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのようなバクテリア細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または（チャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞のような）哺乳動物細胞、藻類、繊毛虫類、植物細胞、菌類またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのような他の微生物中で発現させることが可能である。他の適切な宿主細胞が当業者に公知である。

培養液中の真核または原核細胞宿主細胞のような、本発明の宿主細胞を、ＩＭＩポリヌクレオチドを産出（すなわち発現）させるために使用可能である。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いる、ＩＭＩポリペプチドを産出するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法には、適切な培地中で、（ＩＭＩポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターを導入したか、またはゲノムが、野生型またはＩＭＩポリペプチドをコードしている遺伝子を導入した）本発明の宿主細胞を、ＩＭＩポリペプチドが産出されるまで培養すること、が含まれる。他の実施形態において、方法にはさらに、培地または宿主細胞からＩＭＩポリペプチドを単離することが含まれる。本発明の他の態様は、単離ＩＭＩポリペプチド、およびその生物学的に活性な部分に関連する。「単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」または「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、組換え体ＤＮＡ技術によって産出された場合に、細胞性物質、または化学合成された場合、化学前駆体または他の化学物質を含まない。語句「細胞性物質を実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、ポリペプチドが、その中で天然に、または組換え体的に産出された細胞の細胞性成分から分離された、ＩＭＩポリペプチドの調製物を含む。１つの実施形態において、語句「実質的に細胞性物質を含まない」には、（本明細書でまた「夾雑ポリペプチド（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」と呼ばれる）非ＩＭＩ物質が約３０（乾燥重量）％よりすくない、より好ましくは約２０％よりすくない非ＩＭＩ物質、またより好ましくは約１０％より少ない非ＩＭＩ物質、最も好ましくは約５％より少ない非ＩＭＩ物質を含むＩＭＩポリペプチドの調製物が含まれる。

ＩＭＩポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分が、組換え的に産出される場合、好ましくはまた培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地がポリペプチド調製物の容量の約２０％より少ない、より好ましくは約１０％より少ない、最も好ましくは約５％より少ない。語句「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）」は、ポリペプチドが、ポリペプチドの合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されている、ＩＭＩポリペプチドの調製物を含む。１つの実施形態において、語句「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｆｒｅｅ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）」は、約３０（乾燥重量）％より少ない化学前駆体または化学物質、より好ましくは約２０（乾燥重量）％より少ない化学前駆体または化学物質、またより好ましくは約１０（乾燥重量）％より少ない化学前駆体または化学物質、最も好ましくは約５（乾燥重量）％より少ない化学前駆体または化学物質を含むＩＭＩポリペプチドの調節物を含む。好ましい実施形態において、単離ポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、ＩＭＩポリペプチドが由来した同一の有機体からの夾雑ポリペプチドを欠く。典型的には、そのようなポリペプチドは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、ｃｉｌｌａｔｅｓ、藻類または真菌のような微生物以外の植物中での、たとえばＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ＩＭＩポリペプチドの組換え発現によって産出される。

本発明のＩＭＩポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は種々に利用される。本発明の核酸およびアミノ酸配列を使用して、植物を形質転換し、それによって植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を変更できる。したがって、本発明は、（ａ）植物細胞を、１つ以上のＩｍｉ核酸を含む１つ以上の発現ベクターで形質転換すること、および（ｂ）前記植物細胞から、野生型植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加したトランスジェニック植物を生成することを含む、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加したトランスジェニック植物を産出する方法を提供する。１つの実施形態において、多重Ｉｍｉ核酸が異なるゲノムから誘導される。（ａ）植物細胞を、Ｉｍｉ核酸を含む発現ベクターで形質転換することで、前記核酸が非Ｉｍｉ１核酸である、および（ｂ）前記植物細胞から、野生型植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加したトランスジェニック植物を産出することを含む、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加したトランスジェニック植物を産出する方法も本発明に含まれる。

本発明は、１つ以上のＩｍｉ核酸の発現を改変することを含む、イミダゾリノン除草剤に対する植物の耐性を改変する方法を含む。イミダゾリノン除草剤に対する植物の耐性は、それぞれＩＭＩポリヌクレオチドの発現を増加させる、または減少させることによって達成されるように、増加または減少させることが可能である。好ましくは、イミダゾリノン除草剤に対する植物の耐性は、ＩＭＩポリヌクレオチドの発現を増加させることによって増加する。ＩＭＩポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の任意の方法によって改変可能である。ＩＭＩポリヌクレオチドの発現を増加させる方法が、植物がトランスジェニックまたは非トランスジェニックである場合に使用可能である。植物がトランスジェニックである場合、植物を、任意の上記ＩＭＩコード核酸を含むベクターで形質転換するか、または植物を、たとえば植物内の内生ＩＭＩポリヌクレオチドの発現を指向するプロモーターで形質転換可能である。本発明は、そのようなプロモーターが組織特異的であるか、発生的に調節されるように提供する。あるいは、非トランスジェニック植物は、天然のプロモーターを誘導することによって改変した、内生ＩＭＩポリヌクレオチド発現を有し得る。標的植物中の配列番号１にて定義したようなポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの発現は、制限はしないが、以下の例の１つ、（ａ）構成的プロモーター、（ｂ）化学物質誘導プロモーター、および（ｃ）たとえば亜鉛フィンガー誘導転写因子（Ｇｒｅｉｓｍａｎ ａｎｄ Ｐａｂｏ，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７）での改変プロモーター過剰発現、によって実施可能である。

好ましい実施形態において、ＩＭＩポリヌクレオチドの転写を、Ｇｒｅｉｓｍａｎ ａｎｄ Ｐａｂｏ，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：６５７によって記述され、サンガモ バイオサイエンセズ社（Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によって製造された、亜鉛−フィンガー誘導転写因子（ＺＦＰｓ）を用いて調節する。これらのＺＦＰｓは、ＤＮＡ認識ドメインと、ＩＭＩ核酸のような標的核酸の活性化または抑制を引き起こす機能的ドメイン両方を含む。したがって、ＺＦＰｓの活性化および抑制は、上述ＩＭＩポリヌクレオチドプロモーターを特異的に認識し、植物内でのＩＭＩポリヌクレオチド発現を増加または減少させるために使用し、それによって植物の除草剤耐性を調節することで、実施可能である。

以上でさらに詳細に記述したように、本発明の方法によって産出される植物は単子葉植物または双子葉植物であり得る。植物は、たとえば、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オート麦、ライコムギ、米、オオムギ、大豆、ピーナッツ、コットン、菜種およびアブラナ、マニホット、コショウ、ひまわりおよびマンジュギク、ジャガイモのようなナス科植物、タバコ、ナスおよびトマト、ビシア種、エンドウマメ、ムラサキウマゴヤシ、コーヒー、カカオ、茶、サリックス種、油やし、ココナッツ、多年生牧草、飼料作物から選択し得る。飼料作物には、限定はしないが、ウィートグラス、カナリーグラス、ブロムグラス、ウィルドリグラス、ブルーグラス、オーチャードグラス、ムラサキウマゴヤシ、サルホイン、バーズフット、トレホイル、アルサイククローバー、レッドクローバーおよびスイートクローバーが含まれる。好ましい実施形態において、植物はコムギ植物またはライコムギ植物である。上記の方法のそれぞれで、植物細胞には、制限はしないが、プロトプラスト、配偶子産出細胞、および全植物に再生する細胞が含まれる。本明細書において語句「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は、少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドのすべてまたは一部を含む、任意の植物、植物細胞、カルス、植物組織、または植物部分を意味する。多くの場合、すべてまたは一部の組換えポリヌクレオチドは、クロモソームまたは安定クロモソーム外要素に安定に統合され、続く世代に受け継がれる。

上述のように、本発明は、野生型の植物または種子と比較して、植物または種子のイミダゾリノン耐性を増加させるための組成物および方法を教示している。好ましい実施形態において、好ましくはおよそ１０〜３００ｇ ａｉ ｈａ^-1、より好ましくは２０〜１６０ｇ ａｉ ｈａ^-1、最も好ましくは４０〜８０ｇ ａｉ ｈａ^-1、のイミダゾリノン除草剤適用に抵抗するように、コムギ植物または種子のイミダゾリノン耐性を増加させる。本明細書において、イミダゾリノン除草剤適用に「抵抗する（ｗｉｔｈｓｔａｎｄ）」ことは、植物がそのような適用によって殺されず、または傷つかないことを意味する。

本発明は、それぞれ、野生型植物、植物部分、植物器官、植物組織、植物細胞、種子または宿主細胞と比較して、少なくとも１つのイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加した、植物、植物部分、植物器官、植物組織、植物細胞、種子および宿主細胞を提供する。そのような「野生型植物、植物部分、植物器官、植物組織、植物細胞、種子または宿主細胞（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｐｌａｎｔ、ｐｌａｎｔ ｐａｒｔ、ｐｌａｎｔ ｏｒｇａｎ、ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ、ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ、ｓｅｅｄ ｏｒ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５６２５の植物の除草剤耐性特徴、および／または本発明のＩｍｉ核酸に関して野生型である、それぞれ植物、植物部分、植物器官、植物組織、植物細胞、種子または宿主細胞を意味する意図がある。すなわち、そのような野生型植物、植物部分、植物器官、植物組織、植物細胞、種子または宿主細胞は、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５６２５の植物の除草剤耐性特徴、および／または本発明のＩｍｉ核酸を含まない。語句「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」の利用はしたがって、植物、植物部分、植物器官、植物組織、植物細胞、種子または宿主細胞が、そのゲノム内で組換えＤＮＡを欠く、および／または本発明の除草剤耐性特徴およびＩｍｉ核酸とは異なる除草剤耐性特徴および／またはＩｍｉ核酸を含まない、ことを暗示する意図はない。

雑草、およびコムギまたはライコムギ植物にイミダゾリノン除草剤を適用することを含む、コムギまたはライコムギ植物の周辺内の雑草を制御する方法もまたさらに本明細書で提供され、そこでコムギまたはライコムギ植物は、野生型コムギまたはライコムギ植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加しており、またイミダゾリノン耐性コムギまたはライコムギ植物は、少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含む。１つの実施形態において、植物は、多重Ｉｍｉ核酸を含む。他の実施形態において、植物は、Ｉｍｉ１核酸を含む。イミダゾリノンに対する耐性が増加したコムギおよびライコムギを提供することによって、コムギまたはライコムギ植物を雑草から保護するために広く種々の処方を使用可能であり、これによって植物の生長を増強し、栄養に対する競争を減少させる。イミダゾリノン除草剤を、本明細書で記述したコムギ植物の周辺の領域中の雑草の、発芽前、発芽後、植え付け前および植え付け後制御のために、それ自体で使用可能であり、またはイミダゾリノン除草剤処方を、他の添加物を含んで使用可能である。また、イミダゾリン除草剤は種子処理に使用可能である。イミダゾリノン除草剤処方中で見られる添加物には、他の除草剤、界面活性剤、アジュバント、拡散剤、固着剤、安定剤などが含まれる。イミダゾリノン除草剤処方は、湿潤または乾燥調製物であり得、限定はしないが、流動性粉末、乳化可能濃縮物および液体濃縮物が含まれ得る。イミダゾリノン除草剤および除草剤処方を、たとえば噴霧、注水、ダスティングのような従来の方法にしたがって適用可能である。

本発明はさらに、本発明の選択可能マーカー遺伝子を含む形質転換ベクターを提供する。選別マーカー遺伝子は、本発明のＩｍｉ核酸に動作可能に連結した宿主細胞中の発現を駆動するプロモーターを含む。形質転換ベクターはさらに、宿主細胞中で発現されるべき対象の遺伝子を含み、所望の場合、本発明のポリヌクレオチドに動作可能に連結する、クロロプラスト−標的化配列を含み得る。

本発明はさらに、対象の遺伝子で形質転換された細胞に関して選択するために、本発明の形質転換ベクターを用いるための方法を提供する。そのような方法には、形質転換ベクターでの宿主細胞の形質変換、非形質変換宿主細胞を殺すか、成長を阻害する、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素除草剤のレベルに細胞を暴露すること、および除草剤の存在下での成長のその能力によって、形質変換宿主細胞を同定すること、が含まれる。本発明の１つの実施形態において、宿主細胞は、植物細胞であり、選択可能マーカー遺伝子が、宿主細胞内での発現を駆動するプロモーターを含む。

本発明の形質転換ベクターを、対象の遺伝子で形質転換した植物を産出するために使用可能である。形質転換ベクターは、本発明の選択可能マーカーと、導入され、典型的には形質転換植物中で発現するべき対象の遺伝子を含み得る。そのような選択可能なマーカー遺伝子は、宿主細胞内の発現を駆動するプロモーターと動作可能に連結した、本発明のＩｍｉ核酸を含む。Ｉｍｉ核酸は、配列番号１にて定義されたようなポリヌクレオチド、配列番号２にて定義されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、いずれかのこれらのポリヌクレオチド配列の機能的断片および変異体を含み、そこで断片または変異体は、野生型ＡＨＡＳポリペプチドに相当する位置９６（配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置に相当する）で、アラニンのスレオニンへの置換を含むポリペプチドをコードしている。植物および植物細胞での使用のために、形質転換ベクターは、植物細胞内での発現を駆動するプロモーターに動作可能に連結した、本発明のＩｍｉ核酸を含む、選択可能マーカー遺伝子を含む。

本発明はまた、本発明のＩｍｉ核酸に動作可能に連結した、植物中の発現を駆動するプロモーターを含む植物発現ベクターに関する。Ｉｍｉ核酸は、配列番号１にて定義されたようなポリヌクレオチド、配列番号２にて定義されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、いずれかのこれらのポリヌクレオチド配列の機能的断片および変異体を含み、そこで断片または変異体は、野生型ＡＨＡＳポリペプチドに相当する位置９６で、アラニンのスレオニンへの置換を含むポリペプチドをコードしている。本発明の植物発現ベクターは、特定のプロモーターには依存せず、そのようなプロモーターは植物細胞中での遺伝子発現を駆動可能であるのみである。好ましいプロモーターには、構成的プロモーターおよび組織優先プロモーターが含まれる。

本発明の対象の遺伝子は、所望の結果に依存して変化する。たとえば、表現型における種々の変化は、植物中の脂肪酸組成物を改変すること、植物のアミノ酸含量を変えること、植物の昆虫および／または病原体防御機構を変えることなどを含んで興味深い。これらの結果は、異種産物の発現、または植物中の内生産物の発現の増加を提供することによって達成可能である。あるいは、結果は、１つ以上の内生産物、特に植物中の酵素または共同因子の減少のために提供することによって達成可能である。これらの変化は結果として、形質転換植物の表現型での変化となる。

本発明の１つの実施形態において、対象の遺伝子には、たとえばＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ毒素タンパク質遺伝子のような、昆虫耐性遺伝子が含まれる（米国特許第５，３６６，８９２号、第５，７４７，４５０号、第５，７３６，５１４号、第５，７２３，７５６号、第５，５９３，８８１号およびＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９）。

本発明のＩＭＩタンパク質またはポリペプチドは、たとえばアブラナ植物から精製可能であり、組成物中で使用可能である。また、本発明のＩＭＩタンパク質をコードしている単離Ｉｍｉ核酸を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母のような微生物中で、本発明のＩＭＩタンパク質を発現するために使用可能である。発現したＩＭＩタンパク質を、当業者に公知の任意の方法によって、大腸菌または酵母の抽出物から精製可能である。

本発明の特定の実施形態において、本方法には、除草剤耐性または除草剤抵抗性植物の利用が含まれ得る。「除草剤耐性がある（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）」または「除草剤抵抗性がある（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」植物によって、正常または野生型植物を通常殺すか、または成長を阻害しうるレベルにて、少なくとも１つの除草剤に対して耐性または抵抗性である植物を意図する。本発明の１つの実施形態において、本発明の除草剤耐性植物は、ＩＭＩタンパク質をコードしているＩｍｉ核酸を含む。

本発明のために、語句「除草剤耐性がある」および「除草剤抵抗性がある」は、同義語的に使用され、等価の意味および等価の目的を有することが意図される。同様に、語句「除草剤耐性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」および「除草剤抵抗性（ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」は同義語的に使用され、等価の意味および等価の範囲を有することが意図される。同様に、語句「イミダゾリノン抵抗性がある（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）」および「イミダゾリノン抵抗性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」は同義語的に使用され、それぞれ「イミダゾリノン耐性がある（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｔ）」および「イミダゾリノン耐性（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」と等価の意味および等価の範囲を有することが意図される。

本発明は、少なくとも１つの除草剤、特にＡＨＡＳ酵素の活性を干渉する除草剤、より特にイミダゾリノンまたはスルホニル尿素除草剤に対する耐性または抵抗性が増加した植物、植物組織、植物細胞および宿主細胞を提供する。好ましい量または濃度の除草剤が、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「効果的濃度（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」である。「有効量」または「効果的な濃度」によって、同様の、野生型植物、植物組織、植物細胞、小胞子または宿主細胞を殺すか、成長を阻害するのに十分であるが、前記量が、本発明の除草剤抵抗性植物、植物組織、植物細胞、小胞子および宿主細胞を殺さず、またひどく成長を阻害しない、それぞれ量および濃度を意図する。典型的に、有効量の除草剤は、対象の雑草を殺すために、農業産出システムにて通常使用される量である。そのような量は、当業者に公知であるか、または当分野で公知の方法を用いて容易に決定することができる。さらに、農業産出システムにおける除草剤の有効量は、インビトロ植物培養システムにおける除草剤の有効量とは、実質的に異なりうることが認識される。

本発明のＩｍｉ核酸を、限定はしないが、単子葉植物および双子葉植物を含む、任意の植物種の形質転換のために使用し得る。対象の植物種の例には、限定はしないが、モロコシおよびトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、アブラナ種（たとえばＢ．ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｒａｐａ、Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、特に種油の供給源として有用なアブラナ種、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａtｉｖａ）、米（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ，Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（たとえばトウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕ ｇｌａｕｃｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）、アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ））、ひまわり（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．Ｔｕｒｇｉｄｕｍ ｓｓｐ．ｄｕｒｕｍ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、コットン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ種）、ココナッツ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、シトラス木（Ｃｉｔｒｕｓ種）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）、茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、バナナ（Ｍｕｓａ種）、アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ）、グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ）、マンゴ（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ）、オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ）、パパイヤ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ）、アーモンド（Ｐｒｕｍｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）、砂糖大根（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ種）、オートムギ、オオムギ、野菜類、観賞植物類および針葉樹が含まれる。好ましくは、本発明の植物は、栽培品種植物（たとえば、ひまわり、アブラナ種、コットン、糖、ビート、大豆、ピーナッツ、ムラサキウマゴヤシ、ベニバナ、タバコ、モロコシ、米、コムギ、ライムギ、オオムギライコムギ、ソルガム、キビなど）である。

本発明の除草剤抵抗性植物は、雑草を制御するための方法で使用される。したがって、本発明はさらに、本発明の除草剤抵抗性植物の周辺の雑草を制御するための方法を提供する。本方法は、雑草および除草剤抵抗性植物に、有効量の除草剤を適用することを含み、そこで前記植物は、野生型植物と比較して、少なくとも１つの除草剤、特にイミダゾリノンまたはスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性が増加している。雑草を制御するためのそのような方法において、本発明の除草剤抵抗性植物は、好ましくは、限定はしないが、ひまわり、ムラサキウマゴヤシ、アブラナ種、大豆、コットン、ベニバナ、ピーナッツ、タバコ、トマト、ジャガイモ、コムギ、米、トウモロコシ、ソルガム、オオムギ、ライムギ、キビおよびソルガムを含む、農作物植物である。

除草剤、特にイミダゾリノンおよびスルホニル尿素除草剤に対する抵抗性が増加した植物を提供することによって、広く種々の処方を、雑草から植物を保護するために使用可能であり、これによって植物の生長を増強し、栄養に対する競争を減少させる。除草剤を、本明細書で記述した植物の周辺の領域中の雑草の、発芽前、発芽後、植え付け前および植え付け後制御のために、それ自体で使用可能であり、またはイミダゾリノン除草剤処方を、他の添加物を含んで使用可能である。除草剤はまた、種子処理として使用可能でもある。すなわち、効果的な濃度または有効量の除草剤、または効果的な濃度または有効量の除草剤を含む組成物を、種子の播種の前、または間に、種子に直接適用可能である。イミダゾリノンまたはスルホニル尿素除草剤処方または組成物中でみられる添加剤には、他の除草剤、界面活性剤、アジュバント、拡散剤、固着剤、安定剤などが含まれる。除草剤処方は、湿潤または乾燥調製物であり得、限定はしないが、流動性粉末、乳化可能濃縮物および液体濃縮物が含まれ得る。除草剤および除草剤処方を、たとえば噴霧、注水、ダスティングのような従来の方法にしたがって適用可能である。

本発明は、少なくとも１つの除草剤、特にＡＨＡＳ阻害除草剤、より特にイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加した非トランスジェニックおよびトランスジェニック種子を提供する。そのような種子には、たとえば、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５６２５の植物の除草剤耐性特徴を含む非トランスジェニックコムギ種子、およびＩＭＩタンパク質をコードしている本発明のＩｍｉ核酸分子を含むトランスジェニック種子が含まれる。

本発明は、除草剤抵抗性植物、特に除草剤抵抗性コムギまたはライコムギ植物を、有性生殖を含む従来の植物交配を介して産出するための方法を提供する。本方法は、除草剤に対して抵抗性ではない第二植物に、除草剤に対して抵抗性である第一植物を交配することを含む。第一植物は、たとえば、少なくとも１つの除草剤耐性ＩＭＩタンパク質をコードしている本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物、およびＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５６２５の植物の除草剤耐性特徴を含む非トランスジェニックコムギ植物を含む、本発明の任意の除草剤抵抗性植物であり得る。第二植物は、第一植物と交配した時に、成長可能な子孫植物（すなわち種子）を産出可能である任意の植物であり得る。典型的には、必須ではないが、第一および第二植物が同一の種のものである。本発明の方法はさらに、第一交配種の、第一または第二植物いずれかと同一の株または遺伝子型の植物への戻し交配の１つ以上の世代を含み得る。あるいは、第一交配種または任意の続く交配種の子孫を、第一または第二植物いずれかとは異なる株または遺伝子型のものである第三植物と交配可能である。本発明の方法はさらに、第一植物の除草剤耐性特徴を含む植物を選択することを含む。

本発明はさらに、有性生殖を含む従来の植物交配を介して、植物の除草剤抵抗性を増加させるため、特に除草剤抵抗性コムギ植物のための方法を提供する。本方法は、除草剤に対して抵抗性である第一植物を、除草剤に対して抵抗性であり得る、またはありえなくてよい、または第一植物より異なる除草剤または除草剤類に対して抵抗性であり得る、第二植物と交配することを含む。第一植物は、たとえばＩＭＩタンパク質をコードしている、少なくとも１つの本発明のＩｍｉ核酸を含むトランスジェニック植物、およびＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５６２５のコムギ植物の除草剤耐性特性を含む、非トランスジェニックコムギおよびライコムギ植物を含む、任意の本発明の除草剤抵抗性植物であり得る。第二植物は、第一植物と交配した時に、成長可能子孫植物（すなわち種子）を産出可能である任意の植物であり得る。典型的には、必須ではないが、第一および第二植物は同一の種のものである。本発明の本方法によって産出される子孫植物は、第一または第二植物いずれかまたは両方と比較したとき、除草剤に対する抵抗性が増加している。第一および第二植物が異なる除草剤に対して抵抗性である時に、子孫植物は、第一および第二植物の混合除草剤耐性特性を有し得る。本発明の方法はさらに、第一交配種の、第一または第二植物いずれかと同一の株または遺伝子型の植物への戻し交配の１つ以上の世代を含み得る。あるいは、第一交配種または任意の続く交配種の子孫を、第一または第二植物いずれかとは異なる株または遺伝子型のものである第三植物と交配可能である。本発明の方法はさらに、第一植物、第二植物、または第一植物と第二植物両方の除草剤耐性特徴を含む植物を選択することを含む。

本発明の植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであり得る。イミダゾリノンに対する抵抗性が増加している非トランスジェニックコムギ植物の例は、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．５６２５を有するコムギ植物（Ｓｈｉｌｏｈ−８）、または変異体、組換え体、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．５６２５を有する植物の遺伝工学的に改変した誘導体、またはＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．５６２５を有する植物の任意の子孫、または任意のこれらの植物の子孫である植物、またはＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．５６２５を有する植物の除草剤耐性特徴を含む植物、である。

本発明はまた、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチド分子、発現カセット、または形質転換ベクターで形質転換された植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子および非ヒト宿主細胞も提供する。そのような形質転換植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子および非ヒト宿主細胞は、それぞれ非形質転換植物、植物組織、植物細胞、または非ヒト宿主細胞を殺すか、または成長を阻害する除草剤のレベルで、少なくとも１つの除草剤に対する耐性または抵抗性が増強している。好ましくは、本発明の形質転換植物、植物組織、植物細胞および種子は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａおよび農作物植物である。

本発明は、イミダゾリノン除草剤、スルホニル尿素除草剤、トリアゾロピリミジン除草剤、ピリミジニルオキシ安息香酸除草剤、スルホニルアミノ−カルボニルチアゾリノン除草剤およびそれらの混合物からなる群から選択される、少なくとも１つのＡＨＡＳ阻害除草剤の利用を含む方法を提供する。これらの方法において、ＡＨＡＳ阻害除草剤は、限定はしないが、種子処理、土壌処理および葉面処理を含む、当分野で公知の任意の方法によって適用可能である。

適用の前に、ＡＨＡＳ阻害除草剤を、たとえば溶液、エマルジョン、懸濁液、ダスト、粉末、ペーストおよび顆粒のような、慣習的処方内に変換可能である。使用形態は、特定の意図する目的に依存し、それぞれの場合、きめの細かい、および本発明にしたがった化合物の分散を確実にすべきである。

処方は、公知の様式（たとえば概説のために、米国特許第３，０６０，０８４号、欧州特許第ＥＰ−Ａ７０７ ４４５号（液体濃縮物に関して）、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，「Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｃ．４，１９６７，１４７−４８，Ｐｅｒｒｙ’ｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６３，ページ８−５７およびｅｔ ｓｅｑ．国際特許第ＷＯ９１／１３５４６号、米国特許第４，１７２，７１４号、米国特許第４，１４４，０５０号、米国特許第３，９２０，４４２号、米国特許第５，１８０，５８７号、米国特許第５，２３２，７０１号、米国特許第５，２０８，０３０号、英国特許第２，０９５，５５８号、米国特許第３，２９９，５６６号、Ｋｌｉｎｇｍａｎ，Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｓ ａ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６１，Ｈａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｗｅｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，８ｔｈ Ｅｄ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９およびＭｏｌｌｅｔ，Ｈ，Ｇｒｕｂｅｍａｎｎ，Ａ．，Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ），２００１，２．Ｄ．Ａ．Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，１９９８（ＩＳＢＮ０−７５１４−０４４３−８）を参照のこと、たとえば、溶媒および／または担体のような農薬の処方に適切な補助剤、所望なら乳化剤、界面活性剤および分散剤、保存剤、消泡剤、抗凝固剤、種子処理処方のためにはまた任意に着色料および／または結合剤および／またはゲル化剤で、活性化合物を伸ばすことによって調製する。

適切な溶媒の例は、水、芳香族溶媒（たとえばＳｏｌｖｅｓｓｏ製品、キシレン）、パラフィン類（たとえばミネラル油画分）、アルコール類（たとえば、メタノール、ブタノール、ペンタノール、ベンジルアルコール）、ケトン類（たとえば、シクロヘキサノン、γ−ブチロラクトン）、ピロリドン類（ＮＭＰ、ＮＯＰ）、酢酸塩類（グリコール二酢酸）、グリコール類、脂肪酸ジメチルアミド類、脂肪酸類および脂肪酸エステル類である。原則的に、溶媒混合液も使用し得る。

適切な担体の例には、土壌天然ミネラル（たとえばカオリン類、粘土、タルク、チョーク）および土壌合成ミネラル（たとえば高分散シリカ、ケイ酸）があげられる。

適切な乳化剤は、非イオン性およびアニオン性乳化剤（たとえば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル類、アルキルスルホン酸類およびアリールスルホン酸類）があげられる。

分散剤の例には、リグニン硫酸廃棄物液体およびメチルセルロースがあげられる。

使用される適切な界面活性剤は、アルカリ金属、アルカリ土類金属およびリグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、のアンモニア塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、脂肪アルコール硫酸塩、脂肪酸および硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル類、さらに硫酸化ナフタレンおよびナフタレン誘導体の、ホルムアルデヒドとの濃縮物、フェノールおよびホルムアルデヒドとのナフタレンの、またはナフタレンスルホン酸の濃縮物、ポリオキシエチレンオクチルフェノールエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェノールポリグリコールエーテル類、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール類、アルコールおよび脂肪アルコールエチレンオキシド濃縮物、エトキシ化カストール油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、エトキシ化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル類、リグノ硫酸廃棄物液体およびメチルセルロースがあげられる。

直接噴霧可能な溶液、エマルジョン、ペーストまたは油分散液の調製のために適切な物質は、ケロセンスまたはディーゼル油、さらにはコールタール油、および植物または動物由来の油、たとえばトルエン、キシレン、パラフィン、テトラヒドロナフタレン、アルキル化ナフタレンまたはその誘導体、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、イソホロンのような脂肪族、環状および芳香族炭化水素のような、中〜高沸点のミネラル油画分、高極性溶媒、たとえばジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドンまたは水である。

また、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコールのような抗凝固剤および殺菌剤を処方に加えることができる。

適切な消泡剤は、たとえばシリコンまたはステアリン酸マグネシウムに基づく消泡剤である。

適切な保存剤は、たとえばジクロロフェンおよびエンジルアルコールヘミホルマルである。

種子処理処方はさらに、結合剤および任意に着色料を含み得る。

結合剤を、処理の後、種子上の活性物質の接着を改善するために加えることができる。適切な結合剤は、ブロックコポリマーＥＯ／ＰＯ界面活性剤であるが、またポリビニルアルコール類、ポリビニルピロリドン類、ポリアクリル酸塩類、ポリメタクリル酸塩類、ポリブテン類、ポリイソブチレン類、ポリスチレン、ポリエチレンアミン類、ポリエチレンアミド類、ポリエチレンイミン類（Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標）、Ｐｏｌｙｍｉｎ（登録商標））、ポリエーテル類、ポリウレタン類、ポリビニル酢酸塩、チロースおよびこれらのポリマーに由来するコポリマー類である。

任意に、また着色料を処方内に含めることが可能である。種子処理処方のために適切な着色料または染料は、Ｒｈｏｄａｍｉｎ Ｂ，Ｃ．Ｉ．Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｒｅｄ １１２、Ｃ．Ｉ．Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｒｅｄ １、色素ブルー１５：４、色素ブルー１５：３、色素ブルー１５：２、色素ブルー１５：１、色素ブルー８０、色素イエロー１、色素イエロー１３、色素レッド１１２、色素レッド４８：２、色素レッド４８：１、色素レッド５７：１、色素レッド５３：１、色素オレンジ４３、色素オレンジ３４、色素オレンジ５、色素グリーン３６、色素グリーン７、色素ホワイト６、色素ブラウン２５、塩基性バイオレット１０、塩基性バイオレット４９、酸性レッド５１、酸性レッド５２、酸性レッド１４、酸性ブルー９、酸性イエロー２３、酸性レッド１０、塩基性レッド１０８である。

適切なゲル化剤の例は、カラギーン（Ｓａｔｉａｇｅｌ（登録商標））である。

粉末、分散のための物質、および粉塵化可能産物を、活性基質を固体担体と混合するか、または同時に製粉することによって調製可能である。

顆粒、たとえばコートされた顆粒、浸透顆粒および均質顆粒を、活性化合物を固体担体に結合させることによって調製可能である。固体担体の例には、シリカゲル、ケイ酸、タルク、カオリン、アタクレー、リメストン、石灰、チョーク、赤土、黄土、粘土、白雲石珪藻土、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、酸化マグネシウム、土壌合成物質、たとえば硫酸アンモニア、リン酸アンモニア、硝酸アンモニア、尿素のような肥料、および穀草類穀粉、樹皮穀粉、木粉、堅果殻粉のような植物由来の産物、セルロース粉末および他の固体担体があげられる。

一般的に、処方は、０．０１〜９５質量％、好ましくは０．１〜９０質量％のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む。この場合、ＡＨＡＳ阻害除草剤は、９０質量％〜１００質量％、好ましくは９５質量％〜１００質量％の純度（ＮＭＲスペクトルにしたがって）にて使用する。種子処理の目的のために、代表的な処方は、活性化合物の０．０１〜６０重量％、好ましくは０．１〜４０質量％の即時使用調製物中の濃度を得られる２〜１０倍に希釈可能である。

ＡＨＡＳ阻害除草剤は、それらの処方の形態、またはそこから調製される使用形態で、たとえば直接噴霧可能溶液、粉末、懸濁液または分散液、エマルジョン、油分散、ペースト、粉塵化可能産物、拡散のための物質、または顆粒の形態で、噴霧、霧化、粉塵化、拡散または注入の方法によって、使用可能である。使用形態は、意図した目的に完全に依存し、これらは、それぞれの場合で、本発明にしたがったＡＨＡＳ阻害除草剤の最も良好な可能性のある分散を確実にする意図がある。

水性使用形態は、水を加えることによって、エマルジョン濃縮物、ペーストまたは可溶性粉末（噴霧可能粉末、油分散）から調製可能である。エマルジョン、ペーストまたは油分散を調製するために、そのまま、または油または溶媒中に溶解した基質を、水、タッキファイヤー、分散剤または乳化剤の方法によって、水中で均質化可能である。しかしながら、活性基質、湿潤剤、タッキファイヤー、分散剤または乳化剤、必要であれば、溶媒または油からなる濃縮物を調製可能でもあり、そのような濃縮物は水での希釈液のために適切である。

即時使用調製物中の活性化合物濃縮物は、比較的広い範囲内で変化し得る。一般的に、これらは質量あたり０．０００１〜１０％、好ましくは０．０１〜１％である。

ＡＨＡＳ阻害除草剤はまた、超低容量処理（ＵＬＶ）にて首尾よく使用し得、９５活性化合物の質量％以上を含む処方に適用可能であり、または添加物なしに活性化合物を適用することさえ可能である。

以下は処方の例である。
１．葉面適用のための、水での希釈用産物。種子処理目的のために、そのような産物を、希釈した、または希釈しない種子に適用し得る。
Ａ）水溶性濃縮物（ＳＬ、ＬＳ）
１０部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、９０部分／質量の水または水溶性溶媒中に希釈する。あるいは、湿潤剤または他の補助剤を加える。ＡＨＡＳ阻害剤を、水希釈に際して溶解し、それによって、１０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。
Ｂ）分散性濃縮物（ＤＣ）
２０部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、１０部分／質量の分散剤、たとえばポリビニルピロリドンを添加して、７０部分／質量のクロロヘキサノン中に希釈する。水での希釈によって分散し、それによって、２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。
Ｃ）乳化性濃縮物（ＥＣ）
１５部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムとヒマシ油エトキシレート（それぞれの場合、５部分／質量）を添加して、７部分／質量のキシレン中に希釈する。水での希釈によってエマルジョンを得、１５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。
Ｄ）エマルジョン（ＥＷ、ＥＯ、ＥＳ）
２５部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウムとヒマシ油エトキシレート（それぞれの場合、５部分／質量）を添加して、３５部分／質量のキシレン中に希釈する。混合液を、乳化機械（たとえばＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）によって、３０部分／質量の水中に導入し、均質なエマルジョンを得る。水での希釈によってエマルジョンを得、２５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。
Ｅ）懸濁液（ＳＣ、ＯＤ、ＦＳ）
攪拌ボールミル中、２０部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、１０部分／質量の分散剤、湿潤剤、および７０部分／質量の水または有機溶媒を加えて粉末状にし、細かなＡＨＡＳ阻害除草剤懸濁液を得る。水での希釈によって、ＡＳＡＨ阻害除草剤の安定懸濁液を得、それによって、２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。
Ｆ）水分散性顆粒および水可溶性顆粒（ＷＧ、ＳＧ）
５部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、５０部分／質量の分散剤および湿潤剤を加えて、細かく粉末とし、技術的適用（たとえば押し出し、スプレータワー、流動ベッド）によって、水分散性または水溶性顆粒として作製する。水での希釈によって、ＡＨＡＳ阻害除草剤の安定分散または溶液を得、これによって、５０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。
Ｇ）水分散性粉末および水溶性粉末（ＷＰ、ＳＰ、ＳＳ、ＷＳ）
７５部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、ローター固定子ミル中で、２５部分／質量の分散剤、湿潤剤およびシリカゲルを加えて粉末にする。水での希釈によってＡＨＡＳ阻害除草剤の安定分散または溶液を得、これによって、７５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。
Ｉ）ゲル−処方（ＧＦ）
攪拌ボールミル中、２０部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、１０部分／質量の分散剤、１部分／質量のゲル化剤、湿潤剤、および７０部分／質量の水または有機溶媒を加えて粉末状にし、細かなＡＨＡＳ阻害除草剤懸濁液を得る。水での希釈によって、ＡＨＡＳ阻害除草剤の安定懸濁液を得、これによって、２０％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。このゲル処方は、種子処理として適切である。

２．葉面適用のために未希釈で適用される産物。種子処理目的のために、そのような産物を、希釈した種子に適用し得る。
Ａ）粉塵性粉末（ＤＰ、ＤＳ）
５部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を、細かく粉末にし、９５部分／質量の細かく分割したカオリンと密接に混合する。これによって、５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む粉塵性粉末を得る。
Ｂ）顆粒（ＧＲ、ＦＧ、ＧＧ、ＭＧ）
１／２部分／質量のＡＨＡＳ阻害除草剤を細かく粉末にし、９５．５部分／質量の単体と結合させ、それによって０．５％（ｗ／ｗ）のＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方を得る。現在の方法は、押し出し、スプレー乾燥または流動ベッドである。これによって、葉利用のために、未希釈で適用される顆粒を得る。

従来の種子処理処方には、たとえば流動性濃縮物ＦＳ、溶液ＬＳ、乾燥処理のための粉末ＤＳ、スラリー処理のための水分散粉末ＷＳ、水溶性粉末ＳＳおよびエマルジョンＥＳおよびＥＣ、およびゲル処方ＧＦが含まれる。これらの処方は、希釈または未希釈種子に適用可能である。種子への適用は、播種の前に、種子上に直接実施する。

好ましい実施形態において、ＦＳ処方を種子処理のために使用する。典型的には、ＦＳ処方は、１〜８００ｇ／ｌの活性成分、１〜２００ｇ／ｌの界面活性剤、０〜２００ｇ／ｌの抗凝固剤、０〜４００ｇ／ｌの結合剤、０〜２００ｇ／ｌの色素および１リットルまでの溶媒、好ましくは水を含み得る。

本発明は、本発明の除草剤抵抗性植物の非トランスジェニックおよびトランスジェニック種子を提供する。そのような種子には、たとえば、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｕｍｂｅｒ ５６２５の植物の除草剤耐性特徴を含む、非トランスジェニックコムギ種子、およびＩＭＩタンパク質をコードしている本発明のポリヌクレオチド分子を含むトランスジェニック種子が含まれる。

種子処理のために、本発明にしたがった除草剤抵抗性植物の種子を、除草剤、好ましくは、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロロスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イミダゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、ピリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメトゥロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザルノックス、イマザピック、イマザピル、イマザクイン、イマゼタプル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノックスラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、ピリチオバックおよびこれらの混合物からなる群より選択される除草剤で、またはＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方で処理する。

語句種子処理には、種子ドレッシング、種子コーティング、種子ダスティング、種子浸漬、種子ペレッティングのような、当分野で公知のすべての適切な種子処理技術が含まれる。

本発明の１つの変異体にしたがって、本発明のさらなる目的は、任意の１つ以上の固体または液体の、農業的に許容可能な担体と、および／または任意に１つ以上の農業的に許容可能な界面活性剤と、組成物／処方（たとえば顆粒処方）として、ＡＨＡＳ阻害除草剤を含む顆粒処方の、特に種子ドリル内への適用によって、土壌を処理する方法である。本方法は、たとえば穀類、トウモロコシ、コットンおよびひまわりの苗床で有利に使用される。

本発明はまた、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロン、クロリムロン、クロルスルフロン、シノスルフロン、シクロスルファムロン、エタメトスルフロン、エトキシスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロン、ホラムスルフロン、ハロスルフロン、イミダゾスルフロン、ヨードスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロン、ニコスルフロン、オキサスルフロン、ピリミスルフロン、プロスルフロン、ピラゾスルフロン、リムスルフロン、スルホメトゥロン、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフロキシスルフロン、トリフルスルフロン、トリトスルフロン、イマザメタベンズ、イマザルノックス、イマザピック、イマザピル、イマザクイン、イマゼタプル、クロランスラム、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラム、ペノックスラム、ビスピリバック、ピリミノバック、プロポキシカルバゾン、フルカルバゾン、ピリベンゾキシム、ピリフタリド、およびピリチオバックからなる群より選択される少なくとも１つのＡＨＡＳ阻害除草剤を含む種子処理処方でコートした、または含む種子も含む。

語句、種子は、真の種子、種子一部、吸枝、球茎、球根、果実、塊茎、穀物粒、挿し木、切断根などを含むすべての種類の種子および植物珠芽を含むがこれに限定されす、好ましい実施形態では真の種子を意味する。

語句「コートされたおよび／または含む（Ｃｏａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｄ／ｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は一般的に、適用の方法に依存して、成分のより多くの、または少ない部分が増殖産物内に浸潤しうるけれども、活性成分が、ほとんどの場合に関して、適用の時点で珠芽の表面上に存在することを意味する。前記増殖産物を（再び）植え付ける場合、活性成分を吸収し得る。

ＡＨＡＳ阻害除草剤での、またはＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方での種子処理適用は、植物の播種の前、および植物の出芽の前に、種子に噴霧または散粉することによって実施される。

種子の処理において、相当する処方を、有効量のＡＨＡＳ阻害除草剤、またはＡＨＡＳ阻害除草剤を含む処方で、種子を処理することによって適用する。したがって、適用率は、一般的に種子１００ｋｇあたり０．１ｇ〜１０ｋｇのａ．ｉ．（またはａ．ｉ．の混合液、または処方）、好ましくは１００ｋｇ種子あたり１ｇ〜５ｋｇ、特に１００ｋｇ種子あたり１ｇ〜２．５ｋｇである。レタスのような特定の農作物のために、率はより高くてよい。

本発明は、ＡＨＡＳ阻害除草剤と、播種前および／または発芽後に、本発明にしたがった抵抗性植物の種子を接触させることを含む、望まない野菜と対抗するため、または雑草を制御するための方法を提供する。本方法にはさらに、たとえば、田畑中の土壌、または温室中の培養培地中に、種子を播種することが含まれ得る。本方法は特に、種子の直接近接場における望まない野菜と対抗すること、または雑草を制御することで利用される。

望まない野菜の制御は、雑草を殺すこと、および／または雑草の正常の成長を遅延または阻害することと理解される。最も広い意味では、雑草は、望まない局所で成長するすべての植物を意味すると理解される。

本発明の雑草には、たとえば、双子葉植物および単子葉植物雑草が含まれる。双子葉植物雑草には、限定はしないが、属；シナピス、レピジウム、ガリウム、ステラリア、マトリカリア、アンテミス、ガリンソガ、チェノポディウム、ウルチカ、セネシオ、アマランタス、ポルツラカ、キサンチウム、コンボルブルス、イポモエア、ポリゴヌム、セスバニア、アムブロシア、シルシウム、カルダス、ソンカス、ソラヌム、ロリッパ、ロタラ、リンデルニア、ラミウム、ベロニカ、アブチロン、エメックス、ダチュラ、ビオラ、ガレオプシス、パパベル、センタウレア、トリホリウム、ラヌンクルスおよびタラキサカムの雑草が含まれる。単子葉植物雑草には、限定はしないが、属；エチノクロア、セタリア、パニカム、ディジタリア、フェレウム、ポア、フェステュカ、エレウシン、ブラキアリア、ロリウム、ブロムス、アヴェナ、シペルス、ソルガム、アグロピロン、シノド、モノコリア、フィンブリスチスリス、サギッタリア、エレオカリス、スクリプス、パサパルム、イスチャエマム、スフェノクレア、ダクチロクテニウム、アガロスティス、アロペクルスおよびアペラの雑草が含まれる。

さらに、本発明の雑草には、たとえば望まない場所で成長している農作物植物が含まれる。たとえば、トウモロコシが大豆植物の田畑で望まれない場合、大豆植物を主に含む田畑に存在する自発的トウモロコシ植物は雑草と認識可能である。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは１以上の（すなわち少なくとも１つの）文法上の冠詞の対象を意味して本明細書で使用される。例のために、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つ以上の要素を意味する。

本明細書において、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ，）」のような変形は、言及された要素、整数または段階、または要素、整数または段階の群を含むことが意図されると理解されるが、任意の他の要素、整数または段階、または要素、整数または段階の群を排除することが意図されるとは理解されない。

以下の実施例は、例示の方法によって存在し、制限のためではない。

耐性コムギ株の変異誘発および選別
１，５００Ｓｈｉｌｏｈ品種種子の試料を、１，０００ｍｌのビーカー中にそれぞれ配置し、種子レベル上少なくとも１インチまで脱イオン水で覆う。次いでビーカーを、４度にて１５〜２０時間、冷蔵庫内に配置する。種子試料を冷蔵庫から取り出し、ビーカーを室温に置くことによって、およそ３時間にわたり室温にまでする。いくつかの場合に、加温処理を、ビーカーに脱イオン水を加えることによって加速した。

脱イオン水を種子から抜き取り、ビーカーを、種子レベル上少なくとも１インチまで、ナトリウムアジド溶液で満たした。ナトリウムアジド溶液は、２７．２１８ｇ ＫＨ₂ＰＯ₄を、１，５００ｍｌの脱イオン水に加え、この溶液を濃Ｈ₃ＰＯ₄にてｐＨ３とし、最終溶液を脱イオン水にて２Ｌの容量とすることによって調製した。使用の直前に、０．２６０４ｇ ＮａＮ₃を加え、溶液を暗所で保管した。ナトリウムアジド溶液を種子に加えた後、時折攪拌しながら、ビーカーを暗所にて室温で２時間インキュベートした。

ナトリウムアジド処理溶液をデカンタし、種子試料を脱イオン水で２回洗浄した。次いで種子試料を、種子レベル上少なくとも１インチ、脱イオン水で覆い、室温で１時間、ときおり攪拌しながら浸漬した。脱イオン水をデカンタし、種子をペーパータオル上で乾燥するまで均一に広げた。種子を５フィート×４０フィートプロットにて、Ｂｅｒｔｈｏｕｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ周辺の農地に植えた。およそ１５ポンドのＭ２種子を回収し、およそ４６６，０００種子をＰｌａｔｔｅｖｉｌｌｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ周辺に植えた。農地は１×（４０ｇ ａｉ ｈａ^-1（イマザモックス））または２×（８０ｇ ａｉ ｈａ^-1（イマザモックス））で噴霧した。

除草剤に耐性の植物を同定し、１ガロンポット内に移植し、４５°Ｆにて４週間春化の状況にした。１４の単一植物選別を、２×率面積で実施した。耐性Ｍ２植物を春化から出しＢｅｒｔｈｏｕｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ温室にて育て、Ｍ３植物を、Ｂｅｒｔｈｏｕｄ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ近くに、およそ４フィート×５フィートプロットで植えた。植物が三つ葉の段階であるときに、プロットを８０ｇ ａｉ ｈａ^-1（イマザモックス）で噴霧し、１４子孫の結果を表１で示したように評価した。

Ｓｈｉｌｏｈ−０８の１２の種子を、Ｂｅｒｔｈｏｕｄ，Ｃｏｌｏｒａｄ温室中で播き、三つ葉段階にて、４０ｇ ａｉ ｈａ^-1で選択し、結果によって、除草剤同型反応を確認した。

Ｓｈｉｌｏｈ−８の公知のＡｌｓ１株との２つの試験−交配実験を実施した。両方の実験によって、Ｆ２集団中の耐性に対する遺伝的細胞分離がないことを示しており、このことは、Ｓｈｉｌｏｈ−８が、除草剤耐性に関して、Ａｌｓ１に対する対立遺伝子であったことを示唆している。結果を表２および３にて示している。

Ｓｈｉｌｏｈ−８コムギ株の分子特性化
続く分子特性化によって、Ｓｈｉｌｏｈ−０８株が、Ａｌｓ１遺伝子の１４２位にて、アデニンからグアニン塩基対への置換を有することが明らかになった。この変異体Ａｌｓ１ポリヌクレオチドは、野生型ＡＨＡＳポリペプチドに相当する位置９６で、アラニンのスレオニンへの置換を有し、イミダゾリノン除草剤に対する耐性を植物にて与える、変異体ＡＨＡＳポリペプチドをコードしている。Ｓｈｉｌｏｈ−８株は、Ａｌｓ２またはＡｌｓ３遺伝子中で変異を持たなかった。

Ｓｈｉｌｏｈ−８株のイミダゾリノン耐性形質の特性化
次いで、農業および比較イミダゾリノン除草剤イマザモックス耐性を田畑状況下で評価した。表４は、Ｓｈｉｌｏｈ−８と、野生型Ｓｈｉｌｏｈ−８植物を比較する収率および農業評価を要約している。これらの試験は、不完全ブロック無作為三複製デザインを用いる典型的な穀草類評価実験であった。プロットは、回収時１．５４ｍ×４．６２ｍであった。表５は、Ｓｈｉｌｏｈ−８と、標準の耐性対照９８０４間の、多田畑イミダゾリノン除草剤イマザモックス耐性比較を要約している。これらのプロットは、単一列１ｍから１．５４ｍ×４．６２ｍプロットの範囲であった。

１ 適用した田畑、温室に対する移植終了およびレーティング
２ 春適用、適用後、温度が１９°Ｆ夜に降下した
本明細書で言及したすべての発行物および特許明細書は、本発明の当業者のレベルの指標である。すべての発行物および特許明細書は、各個々の発行物または特許明細書が特に、そして個々に、参照によって組み込まれるように示唆されているように同様の程度まで、参照によって本明細書にて組み込まれている。

前述発明が、例示の方法によって、そして理解の明確化の目的のための例によって、詳細に記述されて来ているが、特定の変化および変形例が、添付する請求項の範囲内で実施され得ることが明確である。

Ｓｈｉｌｏｈ−８ Ｉｍｉ１核酸（配列番号１）、野生型Ａｌｓ１核酸（配列番号３）、およびコンセンサス核酸配列（配列番号５）のｃＤＮＡ配列のアライメントを示している。Ｉｍｉ１配列中で置換された塩基対を太文字で示している。 Ｓｈｉｌｏｈ−８ ＩＭＩポリペプチド（配列番号２）、野生型ＡＬＳ１ポリペプチド（配列番号４）、およびコンセンサスアミノ酸配列（配列番号６）の予想されるアミノ酸配列のアラインメントを示している。ＩＭＩ１配列中で置換されたアミノ酸を太文字で示している。 種々のＡＨＡＳ阻害剤に対する耐性に関与するＡＨＡＳ遺伝子中の保存アミノ酸配列の略図的代表である。耐性に関与する特定のアミノ酸部位が下線で示されている。（Ｄｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ｃ．Ｖ．，１９９７，「除草剤活性における、改変標的部位に依存した除草剤耐性の、生理学的、生化学的および分子的態様（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｔｅｒｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅｓ ｉｎ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．）」、Ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＩＯＳ Ｐｒｅｓｓ Ａｍｅｒｓｔｅｒｄａｍ，ｐ．１５９−１８５からの改変）。

Claims (75)

1. （ａ）野生型ＡＨＡＳタンパク質と比較して、結果としてＩＭＩタンパク質中のアラニンがスレオニンに置換される、ドメインＣ中の変異を含み、前記アラニンからスレオニンへの置換が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置である、ＩＭＩタンパク質をコードしている、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸、
   （ｂ）配列番号１にて列挙されたポリヌクレオチド配列を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、および
   （ｃ）配列番号２にて列挙されたアミノ酸配列を含むＩＭＩタンパク質をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、
   からなる群より選択される少なくとも１つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含むコムギ植物であって、該植物の前記Ｉｍｉ核酸により、野生型コムギ植物と比較してイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増大されたコムギ植物。
2. （ａ）のＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸を含む、請求項１のコムギ植物。
3. （ｂ）のＩｍｉ核酸を含む、請求項１のコムギ植物。
4. （ｃ）のＩｍｉ核酸を含む、請求項１のコムギ植物。
5. Ｓｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸が、
   （ｉ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
   （ｉｉ）配列番号２を含むポリペプチドをコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
   （ｉｉｉ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含むＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び
   （ｉｖ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含むＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
   からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１または２のコムギ植物。
6. トランスジェニック植物ではない、請求項１〜５のいずれか一項のコムギ植物。
7. トランスジェニック植物である、請求項１〜５のいずれか一項のコムギ植物。
8. 前記イミダゾリノン除草剤が、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、およびメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートと、メチル２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物、並びにこれらの混合物からなる群より選択される請求項１〜７のいずれか一項のコムギ植物。
9. 前記イミダゾリノン除草剤が、５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸である請求項１〜８のいずれか一項のコムギ植物。
10. 前記イミダゾリノン除草剤が、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸である、請求項１〜８のいずれか一項のコムギ植物。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項のコムギ植物の植物部分であって、少なくとも１つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含む植物部分。
12. 請求項１〜１０のいずれか一項のコムギ植物の植物細胞であって、少なくとも１つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含む植物細胞。
13. 請求項１〜１０のいずれか一項のコムギ植物によって産出される種子であって、少なくとも１つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含む種子。
14. ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含むコムギ植物であって、
    （ａ）前記コムギ植物がＳｈｉｌｏｈ−８株の植物であるか、
    （ｂ）前記コムギ植物が、Ｓｈｉｌｏｈ−８株の植物の組換え体または遺伝工学的に改変された誘導体であるか、
    （ｃ）前記コムギ植物が、Ｓｈｉｌｏｈ−８株の植物の子孫であるか、または
    （ｄ）前記コムギ植物が、（ａ）〜（ｃ）の植物のいずれかの子孫である、
    コムギ植物であり、且つ前記コムギ植物が、突然変異、又は組み換え体または遺伝子工学技術によって得られたコムギ植物。
15. トリチカム・アエスチバム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）コムギ植物である請求項１４のコムギ植物。
16. 野生型コムギ植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増大している請求項１４又は１５のコムギ植物。
17. 前記イミダゾリノン除草剤が、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−）イミダゾリン−２−イル−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、およびメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートとメチル２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１６のコムギ植物。
18. 請求項１４〜１７のいずれか一項のコムギ植物の植物部分であって、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含む植物部分。
19. 請求項１４〜１７のいずれか一項のコムギ植物の植物細胞であって、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含む植物細胞。
20. 請求項１４〜１７のいずれか一項のコムギ植物によって産出される種子であって、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含む種子。
21. （ａ）野生型ＡＨＡＳタンパク質と比較して、結果としてＩＭＩタンパク質中のアラニンがスレオニンに置換されるドメインＣ中の変異を含み、前記アラニンからスレオニンへの置換が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置である、ＩＭＩタンパク質をコードしている、Ｓｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸、
    （ｂ）配列番号１にて列挙されたポリヌクレオチド配列を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、および
    （ｃ）配列番号２にて列挙されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、
    からなる群より選択される少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含むライコムギ植物であって、該植物の、Ｉｍｉ核酸により、野生型ライコムギ植物と比較してイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増大されたライコムギ植物。
22. （ａ）のＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸を含む請求項２１のライコムギ植物。
23. （ｂ）のＩｍｉ核酸を含む請求項２１のライコムギ植物。
24. （ｃ）のＩｍｉ核酸を含む請求項２１のライコムギ植物。
25. Ｓｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸が、
    （ｉ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号２を含むポリペプチドをコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含むＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び
    （ｉｖ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含むＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項２１または２２のライコムギ植物。
26. トランスジェニックまたは非トランスジェニック植物である、請求項２１〜２５のいずれか一項のライコムギ植物。
27. 請求項２１〜２６のいずれか一項のライコムギ植物の植物部分であって、少なくとも１つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含む植物部分。
28. 請求項２１〜２６のいずれか一項のライコムギ植物の植物細胞であって、少なくとも１つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含む植物細胞。
29. 請求項２１〜２６のいずれか一項のライコムギ植物によって産出される種子であって、少なくとも一つのＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸を含む種子。
30. ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含むライコムギ植物であって、
    （ａ）前記ライコムギ植物が、Ｓｈｉｌｏｈ−８株の植物の組換え体または遺伝工学的に改変された誘導体であるか、
    （ｂ）前記ライコムギ植物が、Ｓｈｉｌｏｈ−８株の植物の子孫であるか、または
    （ｃ）前記ライコムギ植物が、（ａ）〜（ｂ）の植物のいずれかの子孫である、
    ライコムギ植物。
31. 前記植物が、野生型ライコムギ植物と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している、請求項３０のライコムギ植物。
32. 請求項３０または３１のライコムギ植物の植物部分であって、Ｓｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含む植物部分。
33. 請求項３０または３１のライコムギ植物の植物細胞であって、Ｓｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含む植物細胞。
34. 請求項３０または３１のライコムギ植物によって産出される種子であって、ＡＴＣＣ Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＰＴＡ−５６２５で寄託されている種子株であるＳｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含む種子。
35. （ａ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号２を含むポリペプチドをコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、及び
    （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの配列に相補的であるポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の相補体が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離Ｉｍｉ核酸であって、当該Ｉｍｉ核酸が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、コムギ又はライコムギ植物の除草剤耐性を増大させるＡＨＡＳポリペプチドをコードする単離Ｉｍｉ核酸。
36. 請求項３５のＩｍｉ核酸に動作可能に連結したプロモーターを含む発現カセット。
37. 前記プロモーターが、バクテリア、真菌細胞、動物細胞または植物細胞中での遺伝子発現を生じさせることが可能である請求項３６の発現カセット。
38. 請求項３６または３７の発現カセットで形質転換した非ヒト宿主細胞。
39. 前記宿主細胞が、バクテリア、真菌細胞、動物細胞および植物細胞からなる群より選択される請求項３８の宿主細胞。
40. 対象の遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子を含む形質転換ベクターであって、前記選択可能マーカー遺伝子が請求項３５のＩｍｉ核酸に動作可能に連結したプロモーターを含み、前記プロモーターが宿主細胞内で発現を生じさせる形質転換ベクター。
41. 前記宿主細胞が、バクテリア、真菌細胞、動物細胞および植物細胞からなる群より選択される請求項４０の形質転換ベクター。
42. 形質転換植物のゲノム内に安定に組み込まれた、植物細胞中に発現を生じさせるプロモーターに動作可能に連結したＩｍｉ核酸を含むポリヌクレオチド分子を含む形質転換植物であって、前記Ｉｍｉ核酸が、
    （ａ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号２を含むポリペプチドをコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、及び
    （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のいずれかの配列に相補的なポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の相補体が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み、前記ＩＭＩ核酸が、前記植物に、非形質転換植物細胞と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する増加した耐性を与える形質転換植物。
43. 前記プロモーターが、構成プロモーターおよび組織優先プロモーターからなる群より選択される請求項４２の形質転換植物。
44. 前記Ｉｍｉ核酸がさらに、動作可能に連結したクロロプラスト標的化配列を含む請求項４２または４３の形質転換植物。
45. 形質転換植物の前記ＡＨＡＳ活性が、非形質転換植物と比較して増加している請求項４２〜４４のいずれか一項の形質転換植物。
46. 前記イミダゾリノン除草剤が、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル）−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−３−キノリンカルボン酸、５−エチル−２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−（メトキシメチル）−ニコチン酸、２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−５−メチルニコチン酸、およびメチル６−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｍ−トルエートと、メチル２−（４−イソプロピル−４−メチル−５−オキソ−２−イミダゾリン−２−イル）−ｐ−トルエートとの混合物、およびこれらの混合物からなる群より選択される請求項４２の形質転換植物。
47. 前記形質転換植物が双子葉植物または単子葉植物である請求項４２〜４６のいずれか一項の形質転換植物。
48. 前記双子葉植物が、ひまわり、大豆、コットン、ナタネ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、たばこ、トマト、じゃがいも、砂糖大根、ムラサキウマゴヤシ、ベニバナおよびピーナッツからなる群より選択される請求項４７の形質転換植物。
49. 前記単子葉植物が、コムギ、米、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、麦、ライコムギ、キビおよびソルガムからなる群より選択される請求項４７の形質転換植物。
50. 請求項４２〜４９のいずれか一項の形質転換植物の種子であって、少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含む種子。
51. 形質転換植物のゲノム内に安定して組み込まれた、植物細胞の発現を生じさせるプロモーターに動作可能に連結したＩｍｉ核酸を含むポリヌクレオチド分子を含む、形質転換植物細胞であって、前記Ｉｍｉ核酸が、
    （ａ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号２を含むポリペプチドをコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、及び
    （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）のいずれかの配列に相補的なポリヌクレオチド配列であって、該ポリヌクレオチド配列の相補体が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み、前記Ｉｍｉ核酸が、前記植物細胞に、非形質転換植物細胞と比較して、イミダゾリノン除草剤に対する増加した耐性を与える形質転換植物細胞。
52. 雑草および植物に、有効量のイミダゾリノン除草剤を適用することを含む、植物の周辺の雑草を制御するための方法であって、前記植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性が、野生型植物と比較して増加しており、前記植物が、
    （ａ）野生型ＡＨＡＳタンパク質と比較して、結果としてＩＭＩタンパク質中のアラニンがスレオニンに置換される、ドメインＣ中の変異を含み、前記アラニンからスレオニンへの置換が、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置である、ＩＭＩタンパク質をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸、
    （ｂ）配列番号１にて列挙されたポリヌクレオチド配列を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、および
    （ｃ）配列番号２にて列挙されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ核酸、
    からなる群より選択される、突然変異、又は組み換え体または遺伝子工学技術で得られた少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含む制御方法。
53. Ｓｈｉｌｏｈ−８株のＩｍｉ１核酸が、
    （ｉ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号２を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、当該ポリヌクレオチド配列が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含むＡＨＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、及び
    （ｉｖ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列が野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させ、且つ配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を含む、ポリヌクレオチド配列、
    からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項５２の方法。
54. 雑草および植物に、有効量のイミダゾリノン除草剤を適用することを含む、植物の周辺の雑草を制御するための方法であって、前記植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性が、野生型植物と比較して増加しており、前記植物がコムギまたはライコムギ植物であって、Ｓｈｉｌｏｈ−８株の植物の除草剤耐性特性を含む制御方法。
55. （ａ）植物細胞を、植物細胞内での発現を駆動するプロモーターに動作可能に連結したＩｍｉ核酸を含むポリヌクレオチド分子で形質転換すること、および
    （ｂ）前記植物細胞から、野生型植物と比較してイミダゾリノン除草剤に対して耐性が増加しているトランスジェニック植物を再生すること、
    を含むイミダゾリノン除草剤に対する耐性が増加している形質転換植物を製造する方法であって、前記Ｉｍｉ核酸が、
    （ｉ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｉｉ）配列番号２を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、及び
    （ｉｖ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み、且つ
    前記Ｉｍｉ核酸が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させるＡＨＡＳポリペプチドをコードする製造方法。
56. 前記プロモーターが、構成プロモーターおよび組織優先プロモーターからなる群より選択される請求項５５の方法。
57. 前記ポリヌクレオチド分子がさらに、動作可能に連結したクロロプラスト標的化配列を含む請求項５５また５６の方法。
58. 形質転換植物の前記ＡＨＡＳ活性が、非形質転換植物と比べて増加している請求項５５〜５７のいずれか一項の方法。
59. 前記除草剤が、イミダゾリノン除草剤である請求項５５〜５８のいずれか一項の方法。
60. 形質転換段階の前に、前記植物細胞が少なくとも１つの除草剤に対する抵抗性を含む請求項５５〜５９ずれか一項の方法。
61. 形質転換段階の前に、前記植物細胞が少なくとも１つのＩｍｉ核酸を含む請求項５５〜６０のいずれか一項の方法。
62. 植物細胞の発現を生じさせるプロモーターに動作可能に連結したＩｍｉ核酸を含むポリヌクレオチド分子で植物細胞を形質転換すること、および形質転換した植物細胞から形質転換植物を再生することを含む、植物のＡＨＡＳ活性を増加させるための方法であって、Ｉｍｉ核酸が、
    （ａ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号２を含むポリペプチドをコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み、ＡＨＡＳ活性を、非形質転換植物と比較して、形質転換植物またはその少なくとも一部分にて増大させ、且つ
    前記Ｉｍｉ核酸が野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させるＡＨＡＳポリペプチドをコードする方法。
63. 植物細胞を、植物形質転換ベクターで形質転換すること、
    形質転換植物細胞を、非形質転換植物細胞の増殖を阻害する濃度の少なくとも１種の除草剤に暴露すること、および
    除草剤の存在下での形質転換植物の増殖能力によって、形質転換植物を同定すること、
    の段階を含む、形質転換植物細胞を選択するための方法であって、
    前記植物形質転換ベクターが、植物細胞の発現を生じさせるプロモーターを含み、Ｉｍｉ核酸に動作可能に連結する、選択可能なマーカー遺伝子を含み、前記Ｉｍｉ核酸が、
    （ａ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号２を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み、且つ
    前記Ｉｍｉ核酸が野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、植物のイミダゾリノン除草剤に対する耐性を増大させるＡＨＡＳポリペプチドをコードする方法。
64. 前記植物形質転換ベクターがさらに、対象の少なくとも１つの遺伝子を含む請求項６３の方法。
65. さらに、形質転換植物細胞から、形質転換植物を再生する段階を含む請求項６３または６４の方法。
66. 雑草および形質転換植物に有効量のイミダゾリノン除草剤を適用することを含む、形質転換植物周辺の雑草を制御する方法であって、前記形質転換植物が、非形質転換植物と比較して、除草剤に対する抵抗性が増加しており、形質転換植物が、そのゲノム内に、植物細胞における遺伝子発現を生じさせるプロモーターと動作可能に連結したＩｍｉ核酸を含む少なくとも１つの発現カセットを含み、前記Ｉｍｉ核酸が、
    （ａ）配列番号１を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号２を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｃ）配列番号１にて列挙したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    （ｄ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードしているＳｈｉｌｏｈ−８株のポリヌクレオチド配列であって、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するＩＭＩタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、
    からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含み、且つ
    前記Ｉｍｉ核酸が、野生型ＡＨＡＳポリペプチドと比較して、コムギ又はライコムギ植物の除草剤耐性を増大させるＡＨＡＳポリペプチドをコードする方法。
67. （ａ）配列番号２を含むアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号１を含むヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列、
    （ｃ）配列番号２にて列挙したアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むアミノ酸配列であって、ポリペプチドが除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性を含み、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するアミノ酸配列、
    （ｄ）配列番号１にて列挙したヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列であって、ポリペプチドが除草剤抵抗性ＡＨＡＳ活性を含み、配列番号４の位置４８に対応するアミノ酸位置でアラニンからスレオニンへの置換を有するアミノ酸配列、
    からなる群より選択されるＳｈｉｌｏｈ−８株のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
68. 除草剤に対して抵抗性である第一植物を、第二植物と交配させることを含む、除草剤抵抗性植物を製造するための方法であって、前記第一植物が、請求項１〜１０、１４〜１７、２１〜２６、３０〜３１および４２〜４９のいずれか一項の植物である製造方法。
69. さらに、除草剤に対して抵抗性である子孫植物に関して選択することを含む請求項６８の方法。
70. 請求項６８または６９の方法によって製造された除草剤抵抗性植物。
71. 請求項７０の植物の種子であって、第一植物の除草剤抵抗性特性を有する種子。
72. 第一植物を、第二植物と交配させることを含む、植物の除草剤抵抗性を増加するための方法であって、前記第一植物が、請求項１〜１０、１４〜１７、２１〜２６、３０〜３１、４２〜４９および７０のいずれか一項の植物である方法。
73. さらに、第二植物の除草剤抵抗性と比較して、除草剤抵抗性が増加している子孫植物に関して選択することを含む請求項７２の方法。
74. 請求項７２または７３の方法によって産出された植物。
75. 請求項７４の植物の種子であって、除草剤抵抗性が増加している種子。

Images