CN101443450B

CN101443450B - 植物中牵涉增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的新型突变

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Publication number: CN101443450B
Application number: CN2005800471136A
Authority: CN
Inventors: J·莫法特; R·布伦斯; I·伯克; B·辛格
Original assignee: AGRIPRO WHEAT; BASF Agrochemical Products BV
Current assignee: AGRIPRO WHEAT; BASF Agrochemical Products BV
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2005-12-01
Publication date: 2012-06-06
Anticipated expiration: 2025-12-01
Also published as: AR051690A1; WO2006060634A3; EP1824981A4; US20090029860A1; UA97623C2; RU2007124688A; AR078072A2; RU2525933C2; CN101443450A; AU2005311754B2; CA2588900A1; US9175299B2; EP1824981A2; AU2005311754A1; CA2588900C; BRPI0518764A2; WO2006060634A2; MX2007006157A; JP2008521443A; JP5535438B2

Abstract

本发明涉及编码多肽的核酸，当所述多肽在植物中表达时，其赋予植物对于咪唑啉酮类和/或其他乙酰羟基酸合酶(AHAS)抑制性除草剂的耐受性。本发明还提供了具有增加的对于咪唑啉酮类和/或其他AHAS抑制性除草剂的耐受性的植物。更特别地，本发明包括包含至少一种IMI核酸的植物。本发明还包括由这些植物产生的种子以及控制在这些小麦植物附近的杂草的方法。

Description

植物中牵涉增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的新型突变

发明领域

本发明总体来说涉及具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的植物。更具体地，本发明涉及通过诱变、杂交育种和转化而获得的植物，其具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。

发明背景

由Als核酸编码的乙酰羟酸合酶(AHAS；EC 4.1.3.18；乙酰乳酸合酶(ALS))是催化缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸这些支链氨基酸的生物化学合成的第一个酶(Singh B.K.，1999，Biosynthesis ofvaline，leucine and isoleucine in：Singh，B.K.(Ed)Plant aminoacids.Marcel Dekker Inc.New York，New York，第227-247页)。AHAS是四个结构上不同的除草剂家族的作用位点，所述四个除草剂家族包括磺酰脲类(LaRossa RA和Falco SC，1984，Trends Biotechnol.2：158-161)、咪唑啉酮类(Shaner等人，1984，Plant Physiol.76：545-546)、三唑并嘧啶类(Subramanian和Gerwick，1989，Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines in(ed)Whitaker JR，Sonnet PE Biocatalysis in agriculturalbiotechnology.ACS Symposium Series，American Chemical Society.Washington，D.C.第277-288页)和嘧啶基氧基苯甲酸酯类(Subramanian等人，1990，Plant Physiol.94：239-244)。由于它们在非常低的施用率时的有效性和在动物中的相对无毒性，咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂被广泛地用于现代农业。通过抑制AHAS活性，这些除草剂家族阻止易感植物(包括许多杂草物种)的进一步生长和发育。商购可获得的咪唑啉酮类除草剂的几个实例是PURSUIT

(咪草烟)、SCEPTER

(灭草喹)和ARSENAL

(灭草烟)。磺酰脲类除草剂的实例是绿磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆、醚磺隆、酰嘧磺隆、fluzasulfuron、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆和吡氯磺隆。

由于它们的高效性和低毒性，喜欢将咪唑啉酮类除草剂通过在大范围植被的顶部的上方喷洒来施用。在大范围植被的顶部的上方喷施除草剂的能力减少了与种植场的建立和维护有关的费用，且减少了在使用这样的化学药品之前对场所准备的需要。在想要的耐受物种的顶部的上方进行喷施也因为不存在竞争物种而导致获得想要的物种的最大生产潜力。然而，使用这样的上方喷施(spray-over)技术依赖于在上方喷施区域中存在想要的植被的耐受咪唑啉酮类的物种。

在主要的农作物中，一些豆科物种例如大豆，由于其快速代谢除草剂化合物的能力而天然地对咪唑啉酮类除草剂具有耐受性(Shaner和Robson，1985，Weed Sci.33：469-471)。其他作物例如玉米(Newhouse等人，1992，Plant Physiol.100：882-886)和水稻(Barrett等人，1989，Crop Safeners for Herbicides，AcademicPress New York，pp.195-220)对于咪唑啉酮类除草剂易感。对于咪唑啉酮类除草剂的不同敏感性依赖于特定除草剂的化学性质和在各植物中所述化合物从毒性至非毒性形式的不同代谢(Shaner等人，1984，Plant Physiol.76：545-546；Brown等人，1987，Pestic.Biochem.Physiol.27：24-29)。其他植物生理学差异例如吸收和转运也在敏感性上起着重要作用(Shaner和Robson，1985，Weed Sci.33：469-471)。

在玉米(Zea mays)、欧洲油菜(Brassica napus)、大豆(Glycinemax)和烟草(Nicotiana tabacum)中使用种子、小孢子、花粉和愈伤组织诱变已成功地产生了耐受咪唑啉酮类、磺酰脲类和三唑并嘧啶类的作物栽培种(Sebastian等人，1989，Crop Sci.29：1403-1408；Swanson等人，1989，Theor.Appl.Genet.78：525-530；Newhouse等人，1991，Theor.Appl.Genet.83：65-70；Sathasivan等人，1991，Plant Physiol.97：1044-1050；Mourand等人，1993，J.Heredity84：91-96)。在所有情况下，单一的、部分显性的核基因提供了抗性。之前也在普通小麦Fidel栽培种(Triticum aestivum L.cv.Fidel)的种子诱变后分离出了4种耐受咪唑啉酮的小麦植物(Newhouse等人，1992，Plant Physiol.100：882-886)。遗传研究确认了，单一的、部分显性的基因提供了耐受性。基于等位基因的研究，作者推断出4种已鉴定的品系中的突变定位于相同的基因座。Fidel栽培种耐受性基因中的一个被命名为FS-4(Newhouse等人，1992，Plant Physiol.100：882-886)。

AHAS-抑制剂复合物的三维构象的基于计算机的建模预测了所提出的抑制剂结合袋中的几个氨基酸作为位点，在所述位点上诱导的突变可能提供对于咪唑啉酮的选择性耐受性(Ott等人，1996，J.Mol.Biol.263：359-368)。用在AHAS酶的所提出的结合位点中的这些合理设计的突变之中的一些突变产生了烟草植物，这些烟草植物事实上已展示出对于单一类别的除草剂的特异性耐受性(Ott等人，1996，J.Mol.Biol.263：359-368)。

在许多专利中也已报道了对于咪唑啉酮类除草剂的植物耐受性。美国专利号4,761,373、5,331,107、5,304,732、6,211,438、6,211,439和6,222,100概括性地描述了改变的Als核酸在植物中引发除草剂耐受性的用途，并且具体地公开了某些耐受咪唑啉酮的玉米品系。美国专利号5,013,659公开了展示出除草剂耐受性的植物，其在一个或多个保守区域中具有至少一个氨基酸的突变。此处描述的突变编码对于咪唑啉酮类和磺酰脲类的交叉耐受性或磺酰脲类特异性耐受性，但未描述咪唑啉酮类特异性耐受性。此外，美国专利号5,731,180和美国专利号5,767,361描述了在野生型单子叶植物AHAS氨基酸序列中具有单个氨基酸置换的分离的基因，所述置换导致产生咪唑啉酮类特异性耐受性。

目前为止，除了在FS-4耐受咪唑啉酮类的品系中的突变外，现有技术还未描述过在Als1基因中的赋予增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的突变。现有技术也未曾描述过这样的耐受咪唑啉酮类的小麦或黑小麦植物，所述植物包含至少一个改变的来自普通小麦(Triticum aestivum)Shiloh栽培种的Als核酸。因此，本领域需要的是鉴定赋予对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的其他突变。本领域还需要具有增加的对于除草剂例如咪唑啉酮的耐受性并且包含至少一个改变的Als核酸的小麦植物和黑小麦植物。还需要用于在这样的小麦植物和黑小麦植物的附近控制杂草生长的方法。这些组合物和方法允许，当对包含小麦植物和黑小麦植物的区域施用除草剂时，可采用上方喷施技术。

发明概述

本发明提供了包含IMI核酸的小麦植物，其中所述小麦植物，与野生型植物相比，具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。所述小麦植物可包含1、2、3或更多个IMI等位基因。在一个实施方案中，所述小麦植物包含至少一种IMI核酸。在另一个实施方案中，所述至少一种IMI核酸是Imi1核酸。在另一个实施方案中，所述至少一种IMI核酸包括普通小麦IMI核酸。在另一个实施方案中，所述至少一种IMI核酸包括Shiloh栽培种的IMI核酸。在另一个实施方案中，小麦植物包含位于不同基因组上的多种IMI核酸。在另一个实施方案中，所述多种IMI核酸包括普通小麦Shiloh栽培种的Imi1核酸。优选地，所述Shiloh栽培种的Imi1核酸编码在选自结构域A、结构域B、结构域C、结构域D和结构域E的保守氨基酸序列中包含突变的蛋白质。更优选地，所述突变存在于保守的结构域C中。还提供了来源于此处所描述的小麦植物的植物部分和植物种子。

本发明还提供了包含IMI核酸的黑小麦植物，其中所述黑小麦植物，与野生型黑小麦植物相比，具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。在一个实施方案中，所述黑小麦植物包含至少一种IMI核酸。在另一个实施方案中，所述至少一种IMI核酸是Imi1核酸。在另一个实施方案中，所述至少一种IMI核酸包括普通小麦Shiloh栽培种的IMI核酸。在另一个实施方案中，所述小麦植物包含位于不同基因组上的多种IMI核酸。在另外一个实施方案中，所述多种IMI核酸包括Shiloh栽培种的Imi1核酸。在另一个实施方案中，所述IMI核酸编码在选自结构域A、结构域B、结构域C、结构域D和结构域E的保守氨基酸序列中包含突变的蛋白质。更优选地，所述突变存在于保守的结构域C中。更加优选地，所述突变编码在ALS多肽的位置96上具有丙氨酸至苏氨酸的置换的多肽。还提供了来源于此处所描述的黑小麦植物的植物部分和植物种子。

本发明的IMI核酸可包含选自下列的多核苷酸序列：SEQ ID NO：1中定义的多核苷酸；编码SEQ ID NO：2中定义的多肽的多核苷酸序列；包含前述多核苷酸中的任何多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和与前述多核苷酸中的任何多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明的植物可以是转基因的或非转基因的。具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的非转基因小麦植物的例子是具有ATCC专利保藏指定编号PTA-5625的小麦植物；或具有ATCC专利保藏指定编号PTA-5625的植物的突变体、重组体或基因工程衍生物；或具有ATCC专利保藏指定编号PTA-5625的植物的任何后代；或作为这些植物中的任何植物的后代的植物。

除了本发明的组合物外，还提供了几种方法。此处描述了改变植物对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的方法，其包括改变IMI核酸在植物中的表达。还描述了产生具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的转基因植物的方法，其包括用包含一个或多个IMI核酸的表达载体转化植物细胞并从所述植物细胞产生植物。本发明还包括控制在小麦或黑小麦植物附近的杂草的方法，其包括向所述杂草和向所述小麦或黑小麦植物施用咪唑啉酮类除草剂，其中所述小麦或黑小麦植物与野生型小麦或黑小麦植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并且其中所述植物包含一种或多种IMI核酸。在这些方法的一些优选的实施方案中，所述植物包含位于不同小麦基因组上的多种IMI核酸。

还提供了包含一种或多种本发明的IMI核酸的表达盒、转化载体、转化的非人宿主细胞以及转化的植物、植物细胞、植物部分和种子。

附图简述

图1显示了Shiloh-8Imi1核酸(SEQ ID NO：1)、野生型Als1核酸(SEQ ID NO：3)和共有核酸序列(SEQ ID NO：5)的cDNA序列的比对。Imi1序列中被置换的碱基对以粗体标示。

图2显示了Shiloh-8IMI1多肽的推导的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)、野生型ALS1多肽(SEQ ID NO：4)和共有氨基酸序列(SEQ IDNO：6)的比对。IMI1序列中被置换的氨基酸以粗体标示。

图3是AHAS基因中牵涉对于各种AHAS抑制剂的耐受性的保守氨基酸序列的示意图。负责耐受性的特异氨基酸位点由下划线标示。(修改自Devine，M.D.和Eberlein，C.V.，1997，Physiological，biochemical，and molecular aspects of herbicide tolerance basedon altered target sites in Herbicide Activity：Toxicity，Biochemistry，and Molecular Biology，IOS Press Amersterdam，p.159-185)。

发明详述

本发明旨在编码多肽的分离的核酸，所述多肽当在植物中表达时赋予增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。本发明还旨在具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的小麦或黑小麦植物、小麦或黑小麦植物的部分以及小麦或黑小麦植物的细胞。本发明还包括由此处所描述的小麦或黑小麦植物产生的种子，和用于控制在此处所描述的小麦或黑小麦植物附近的杂草的方法。

如此处所用的，术语“小麦植物”是指为小麦属(Triticum)的成员的植物。本发明的小麦植物可以是小麦属的成员，包括但不限于，普通小麦(T.aestivum)、圆柱小麦(T.turgidum)、提莫非维小麦(T.timopheevii)、一粒小麦(T.monococcum)、茹科夫斯基小麦(T.zhukovskyi)和乌拉尔图小麦(T.urartu)及其杂交种。本发明所包括的普通小麦亚种的实例是aestivum(普通小麦)、compactum(密穗小麦)、macha(马卡小麦)、vavilovi(瓦氏小麦)、spelta(斯佩尔特小麦)和sphaecrococcum(球粒小麦)。本发明所包括的圆柱小麦亚种的实例是turgidum(圆柱小麦)、carthlicum(波斯小麦)、dicoccom(双粒小麦)、durum(硬粒小麦)、paleocolchicum(科尔希二粒小麦)、polonicum(波兰小麦)、turanicum(东方小麦)和dicoccoides(野生二粒小麦)。本发明所包括的一粒小麦亚种的实例是monococcum(一粒小麦)和aegilopoides(野生一粒小麦)。在本发明的一个实施方案中，所述小麦植物是普通小麦(Triticumaestivum L.)物种的成员，更特别地，是Shiloh栽培种。

除非另外通过上下文清楚地指出，否则术语“小麦植物”希望包括任何成熟或发育阶段的小麦植物，以及取自或来源于任何这样的植物的任何组织或器官(植物部分)。植物部分包括，但不限于，茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体等。本发明还包括由本发明的小麦植物产生的种子。在一个实施方案中，关于与野生型小麦植物种子相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，所述种子是纯育的(true breeding)。

本发明还包括具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的黑小麦植物，黑小麦植物部分和黑小麦植物细胞。如此处所用的，“黑小麦植物”是指通过将黑麦植物(黑麦(Secale cereale))和四倍体小麦植物(例如圆柱小麦)或六倍体小麦植物(例如普通小麦)杂交而产生的植物。本发明还包括由此处所描述的黑小麦植物产生的种子以及用于控制在此处所描述的黑小麦植物附近的杂草的方法。

本发明描述了包含至少一种IMI核酸的小麦植物，其中所述小麦植物，与野生型植物相比，具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。本发明的小麦植物可能具有来自不同基因组的多种IMI核酸，因为这些植物可包含超过1个基因组。例如，普通小麦这种小麦植物包含称作A、B和D基因组的3个基因组。因为AHAS是必需的代谢酶，因此假定各基因组具有至少一个编码AHAS酶的基因(即至少一个Als基因)，其通常和其他代谢酶一起在已进行作图的六倍体小麦中被看到。如此处所用的，术语“Als基因座”是指Als基因在基因组中的位置，术语“Als基因”和“Als核酸”是指编码AHAS酶的核酸。各基因组上的Als核酸与另一个基因组上的Als核酸的差异在于其核苷酸序列。本领域技术人员可通过本领域技术人员已知的遗传杂交和/或测序法或外切核酸酶消化法来确定各Als核酸所起源的基因组。如此处所用的，术语“Als1核酸“、“Als2核酸”和“Als3核酸”是指位于三个不同基因组上的Als核酸。对于本发明来说，Als3基因座位于A基因组上，Als2基因座位于B基因组上，和Als1基因座位于D基因组上。也是对于本发明来说，来源于A、B或D基因组的IMI核酸不同，并分别称为Imi3、Imi2或Imi1核酸。

如此处所用的，术语“IMI核酸”是指具有这样的序列的Als核酸，所述序列从野生型Als核酸突变而来并且赋予其中表达该序列的植物以增加的咪唑啉酮类耐受性。如此处所用的，术语“Imi1核酸”、“Imi2核酸”和“Imi3核酸”分别为涉及Als1、Als2和Als3基因的咪唑啉酮类耐受性等位基因的IMI核酸。因为小麦植物具有2个拷贝的各基因组，所以小麦植物包含两个拷贝的各特定Als核酸。例如，普通小麦这种小麦植物包含各两个拷贝的A、B和D基因组，从而包含各两个拷贝的Als3、Als2和Als1基因。如此处所用的，术语“IMI等位基因”是指单个拷贝的特定IMI核酸。因此，对于本发明来说，小麦植物可具有两个Imi1等位基因，两个拷贝的D基因组中的每个拷贝上存在一个。

在另一个实施方案中，小麦植物包含多种IMI核酸。如此处所用的，当描述包含“多种IMI核酸”的植物时，短语“多种IMI核酸”是指植物中存在不同的IMI核酸，而不是指所述植物在特定的Als基因座上是纯合的还是杂合的。例如，包含多种IMI核酸的植物可包含Imi1和Imi2核酸，而不是具有两个拷贝的Imi1核酸。

Imi1类别的核酸包括由Newhouse等人(1992 Plant Physiol.100：882-886)描述的FS-4基因和下面更详细描述的Shiloh-8基因。每个Imi类别可包括来自不同小麦品种的成员。因此，每个Imi类别包括这样的IMI核酸，即所述IMI核酸在其核苷酸序列方面不同，但通过使用本领域技术人员已知的遗传研究还是被标明为来源于或位于相同的小麦基因组。

因此，本发明包括包含至少一种IMI核酸的小麦植物，其中所述小麦植物与野生型植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并且其中所述至少一种IMI核酸是Imi1核酸。在优选的实施方案中，Imi1核酸包含SEQ ID NO：1中所示的多核苷酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述小麦植物包含多种IMI核酸。

本发明还包括耐受咪唑啉酮类的黑小麦植物。如此处所用的，“黑小麦植物”是指通过黑麦植物(黑麦)与四倍体小麦植物(例如圆柱小麦)或六倍体小麦植物(例如普通小麦)杂交而产生的植物。对于本发明来说，耐受咪唑啉酮类的黑小麦植物包含至少一种IMI核酸，其中所述黑小麦植物与野生型植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并且其中所述至少一种IMI核苷酸是Imi1核酸。在优选的实施方案中，所述Imi1核酸包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述黑小麦植物包含多种IMI核酸。

如此处关于核酸所用的，术语“来自”是指核酸“位于”或“来源于”特定的基因组。术语“位于”是指在包含在该特定基因组内的核酸。如此处还关于基因组所用的，术语“来源于”是指已从该基因组中取出或分离的核酸。术语“分离的”在下面进行了更详细的定义。

本发明包括包含1、2、3或更多个IMI等位基因的小麦植物，其中所述小麦植物与野生型植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。所述IMI等位基因可包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO：1中定义的多核苷酸；编码SEQ ID NO：2中定义的多肽的多核苷酸；包含前述多核苷酸中的任何多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和与前述多核苷酸中的任何多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还包括包含1、2、3或更多个IMI等位基因的黑小麦植物，其中所述黑小麦植物与野生型植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。所述IMI等位基因可包含选自下列的多核苷酸序列：SEQ ID NO：1中定义的多核苷酸；编码SEQ ID NO：2中定义的多肽的多核苷酸；包含前述多核苷酸中的任何多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和与前述多核苷酸中的任何多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个实施方案中，小麦植物或黑小麦植物包含两种不同的IMI核酸。优选地，两种核酸中的至少一种是Imi1核酸。更优选地，两种IMI核酸中的至少一种包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，小麦植物或黑小麦植物包含一种IMI核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，小麦植物包含多于两种的IMI核酸，其中每种IMI核酸来自不同的基因组。优选地，所述IMI核酸中的至少一种包含编码SEQ ID NO：2的多肽序列的多核苷酸序列，或包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。

在本发明的优选实施方案中，分离的IMI核酸编码在结构域中包含突变的氨基酸序列，所述结构域在数种AHAS蛋白中是保守的。这些保守的结构域在此处被称作结构域A、结构域B、结构域C、结构域D和结构域E。图3显示了AHAS蛋白中的各结构域的一般定位。结构域A包含氨基酸序列AITGQVPRRMIGT(SEQ ID NO：7)。结构域B包含氨基酸序列QWED(SEQ ID NO：8)。结构域C包含氨基酸序列VFAYPGGASMEIHQALTRS(SEQ ID NO：9)。结构域D包含氨基酸序列AFQETP(SEQ ID NO：10)。结构域E包含氨基酸序列IPSGG(SEQ IDNO：11)。本发明还考虑到，在所述保守的结构域中存在轻微的变异，例如在苍耳(cockleber)植物中，结构域E中的丝氨酸残基被丙氨酸残基替代。

因此，本发明包括包含这样的IMI核酸的小麦植物或黑小麦植物，所述IMI核酸编码在选自结构域A、结构域B、结构域C、结构域D和结构域E的保守结构域中具有突变的氨基酸序列。在一个实施方案中，小麦植物或黑小麦植物包含编码在结构域E中具有突变的氨基酸序列的IMI核酸。在其他优选的实施方案中，保守结构域中的突变发生在下列由下划线标示的位置处：AITGQVPRRMIGT(SEQ ID NO：7)、QWED(SEQ ID NO：8)、VFAYPGGASMEIHQALTRS(SEQ ID NO：9)、AFQETP(SEQ ID NO：10)和IPSGG(SEQ ID NO：11)。一个优选的置换是结构域C中的丙氨酸至苏氨酸的置换。更加优选地，所述置换是在ALS多肽的位置96上的丙氨酸至苏氨酸的置换。

本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞或其他宿主细胞对于至少一种除草剂的耐受性或抗性的方法，所述除草剂干扰AHAS酶的活性。本发明还提供了对于至少一种除草剂特别是AHAS抑制性除草剂具有耐受性的植物、植物细胞、植物部分、植物器官、植物组织、种子和宿主细胞。优选地，这样的AHAS抑制性除草剂是咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂或其混合物。更优选地，这样的除草剂是咪唑啉酮类除草剂或者两种或更多种咪唑啉酮类除草剂的混合物。对于本发明，咪唑啉酮类除草剂包括，但不限于，PURSUIT

(咪草烟)、CADRE(甲灭草烟)、RAPTOR

(咪草啶酸)、SCEPTER

(灭草喹)、ASSERT

(imazethabenz)、ARSENAL

(灭草烟)、前述除草剂中任一种的衍生物和前述除草剂中两种或更多种的混合物，例如，灭草烟/咪草啶酸(ODYSSEY

)。更具体地，咪唑啉酮类除草剂可选自，但不限于，2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4-异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧]酸、[5-乙基-2-(4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸、和[6-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯与[2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。优选使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。特别优选使用[2-(4-异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸。

对于本发明，磺酰脲类除草剂包括，但不限于，绿磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、氟嘧磺隆、醚磺隆、amidosulfiuon、fluzasulfuron、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡氯磺隆、四唑嘧磺隆、cyclosulfuron、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、碘磺隆(iodosulfuron)、环氧嘧磺隆、甲磺胺磺隆、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、前述除草剂中任一种的衍生物、和前述除草剂中两种或更多种的混合物。本发明的三唑并嘧啶类除草剂包括，但不限于，氯酯磺草胺(cloransulam)、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。本发明的嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂包括，但不限于，双草醚(bispyribac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草醚(pyriminobac)、嘧啶肟草醚和环酯草醚。磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂包括，但不限于，氟酮磺隆(flucarbazone)和丙苯磺隆(propoxycarbazone)。

要认识到，嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂和嘧啶基硫代苯甲酸酯类除草剂紧密相关，并且由Weed Science Society of America都归纳在后一名称的标题之下。因此，本发明的除草剂还包括嘧啶基硫代苯甲酸酯类除草剂，包括，但不限于，上述的嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂。

此处描述的小麦植物可以是转基因的小麦植物或非转基因的小麦植物。类似地，此处描述的黑小麦植物可以是转基因的黑小麦植物或非转基因的黑小麦植物。如此处所用的，术语“转基因的”是指包含至少一种重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，所述重组多核苷酸的全部或部分被稳定地整合入染色体或稳定的染色体外元件中，从而使其传递至连续世代。对于本发明来说，术语“重组多核苷酸”是指已通过基因工程而改变、重排或修饰的多核苷酸。实例包括连接或接合至异源序列的任何经克隆的多核苷酸。术语“重组的”不是指由天然发生的事件例如自发突变而造成的或者通过非自发诱变并随后进行选择育种而产生的多核苷酸的改变。包含由于非自发诱变和选择育种而产生的突变的植物在此处被称为非转基因植物，并包括在本发明中。在其中小麦植物或黑小麦植物是转基因的并包含多种IMI核酸的实施方案中，所述核酸可来源于不同的基因组或来自相同的基因组。可选择地，在其中小麦植物或黑小麦植物是非转基因的并包含多种IMI核酸的实施方案中，所述核酸位于不同的基因组上或位于相同的基因组上。

包含一种IMI核酸的非转基因小麦植物栽培种的实例是以专利保藏指定编号PTA-5625保藏在ATCC的植物栽培种，其在此处称为Shiloh-8品系。所述Shiloh-8品系包含Imi1核酸。相应于Shiloh-8基因的部分长度的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1中。

在2003年10月30日将Shiloh-8品系的2500粒种子(称为i4417-8)保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia)。根据涉及微生物保藏的布达佩斯条约的条款和规定进行这些保藏。保藏至少30年的期限，并且在ATCC接受最近一份提供保藏样品的请求后至少5年期间进行保藏。保藏的种子被给予专利保藏指定编号PTA-5625。

本发明包括具有专利保藏指定编号PTA-5625的小麦植物；具有专利保藏指定编号PTA-5625的植物的突变体、重组体或基因工程衍生物；具有专利保藏指定编号PTA-5625的植物的任何后代；和作为这些植物中的任何植物的后代的植物。在优选的实施方案中，本发明的小麦植物额外地拥有具有专利保藏指定编号PTA-5625的植物的除草剂耐受性特征。

还包括在本发明中的是此处描述的Shiloh-8小麦植物的杂交种和Shiloh-8与另一种小麦植物的杂交种。所述的其他小麦植物包括，但不限于，普通小麦Fidel栽培种和拥有突变型基因FS-1、FS-2、FS-3或FS-4的任何小麦植物。(参见美国专利号6,339,184和美国专利申请号08/474,832)。

术语“栽培种”和“品种”是指由于共有共同的一组特征或性状而定义的物种内植物群，所述特征或性状被本领域技术人员接受为足以区分一种栽培种或品种与另一种栽培种或品种。关于任何给定的栽培种或品种的所有植物在整个基因或分子水平上将是遗传同一的或者任何给定的植物在所有基因座上将是纯合的方面没有任何暗示。如果当纯育的栽培种或品种自花传粉时，所有后代都包含该性状，那么该栽培种或品种被认为对于特定性状来说是“纯育的”。术语“培育系(breeding line)”和“品系(line)”是指由于共有共同的一组特征或性状而定义的栽培种内植物群，所述特征或性状被本领域技术人员接受为足以区分一个培育系或品系与另一个培育系或品系。关于任何给定的培育系或品系的所有植物在整个基因或分子水平上将是遗传同一的或者任何给定的植物在所有基因座上将是纯合的方面没有任何暗示。如果当纯育的品系或培育系自花传粉时，所有后代都包含该性状，那么该培育系或品系被认为对于特定性状来说是“纯育的”。在本发明中，所述性状由小麦或黑小麦植物或种子的Als基因中的突变而产生。

此外，在此处使用术语“栽培种”和“品种”不是希望将本发明的植物限定于一种或多种植物品种。虽然本发明包括植物品种，但本发明的植物包括包含ATCC专利保藏号5625的植物的除草剂耐受性特性和/或一种或多种本发明的IMI核酸的任何植物。

要理解，本发明的小麦或黑小麦植物除了IMI核酸外还可包含野生型Als核酸。如实施例1中所描述的，考虑了Shiloh-8品系只在多种AHAS同工酶的一种酶中包含突变。因此，本发明包括除了一种或多种野生型Als核酸外还包含至少一种IMI核酸的小麦植物或黑小麦植物。

除了小麦和黑小麦植物外，本发明还包括分离的IMI蛋白和核酸。所述核酸包含选自下列的多核苷酸：SEQ ID NO：1中定义的多核苷酸；编码SEQ ID NO：2中定义的多肽的多核苷酸；包含前述多核苷酸中的任何多核苷酸的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和与前述多核苷酸中的任何多核苷酸互补的多核苷酸。在优选的实施方案中，所述IMI核酸包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列。

术语“AHAS蛋白”、“AHAS多肽”、“ALS蛋白”和“ALS多肽”是指乙酰羟酸合酶蛋白，而术语“IMI蛋白”或“IMI多肽”是指从野生型AHAS蛋白进行突变的并且当在其中表达时赋予植物、植物细胞、植物部分、植物种子或植物组织增加的咪唑啉酮类耐受性的任何AHAS蛋白。在优选的实施方案中，所述IMI蛋白包含由包含SEQ ID NO：1的多核苷酸序列编码的多肽。这样的IMI蛋白包含耐受除草剂的AHAS活性，特别是耐受咪唑啉酮类的AHAS活性。这样的耐受除草剂的AHAS活性可通过AHAS活性测定法进行评价。参见，例如，Singh等人(1988)Anal.Biochem.171：173-179(此处引用作为参考)。

在另一个优选的实施方案中，所述IMI蛋白包含含有SEQ ID NO：2的多肽。如也在此处所用的，术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性或分枝的、单链或双链的RNA或DNA或其杂合物。所述术语也包括RNA/DNA杂合体。这些术语还包括位于基因的编码区的3′和5′末端的非翻译序列：从基因的编码区的5′末端向上游至少大约1000个核苷酸的序列和从基因的编码区的3′末端向下游至少大约200个核苷酸的序列。不常用的碱基，例如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其他碱基也可用于反义、dsRNA和核酶配对。例如，已显示出包含尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA，并且为基因表达的有效的反义抑制剂。也可进行其他修饰，例如对RNA的磷酸二酯主链或核糖糖基团中的2′-羟基的修饰。反义多核苷酸和核酶可以完全由核糖核苷酸组成，或者可以包含混合的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。可通过任何方法，包括基因组制备、cDNA制备、体外合成、RT-PCR和体外或体内转录，来产生本发明的多核苷酸。

“分离的”核酸分子是基本上与存在于所述核酸的天然来源中的其他核酸分子(即，编码其他多肽的序列)分开的分子。优选地，“分离的”的核酸不含有在其天然出现的复制子中天然地位于所述核酸侧翼的序列中的一些序列(即，位于所述核酸的5′和3′末端的序列)。例如，经克隆的核酸被认为是分离的。在各种不同的实施方案中，分离的IMI核酸分子可以包含少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在所述核酸所来源的细胞(例如，普通小麦细胞)的基因组DNA中天然地位于所述核酸分子的侧翼。如果核酸已通过人工干预而改变，或被置于并非其天然位点的基因座或位置中时，或者如果核酸通过土壤杆菌感染法、生物射弹法或任何其他的植物转化方法而被导入细胞中，那么该核酸也被认为是分离的。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，可以不含有与其天然地结合的其他细胞材料中的一些，或者当通过重组技术来产生时不含有培养基，或者当化学合成时不含有化学药品前体或其他化学药品。

特别地从“分离的核酸”的定义中排除的是：作为体外核酸制备物或作为转染的/转化的宿主细胞制备物存在的天然发生的染色体(例如染色体分散体(chromosome spreads))、人工染色体文库、基因组文库和cDNA文库，其中所述宿主细胞是体外异质制备物或以单个集落的异质群进行涂板。特别地排除的还有，其中指定核酸的数目低于载体中的核酸插入物数目的5％的上述文库。进一步特别地排除的是，全细胞基因组DNA或全细胞RNA制备物(包括经机械剪切或酶促消化的全细胞制备物)。更进一步特别地排除的是全细胞制备物，其作为体外制备物或作为通过电泳分开的异质混合物(其中本发明的核酸还未与电泳介质中的异质核酸进一步分开(例如，通过从琼脂糖凝胶或尼龙印迹中的异质条带群体中切取单个条带来进一步分开))提供。

本发明的核酸分子例如包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子或其部分，可使用标准的分子生物学技术和此处提供的序列信息进行分离。例如，可使用SEQ ID NO：1的全部或部分从普通小麦文库中分离出普通小麦IMI cDNA。此外，包含SEQ ID NO：1的全部或部分的核酸分子可使用基于该序列设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应来分离。例如，可从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等人，1979，Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取方法)，cDNA可使用逆转录酶(例如，Moloney MLV逆转录酶，其可从Gibco/BRL，Bethesda，MD获得；或AMV逆转录酶，其可从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL获得)进行制备。可基于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列来设计用于聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物。可按照标准的PCR扩增技术，使用cDNA或可选择地使用基因组DNA作为模板和使用合适的寡核苷酸引物来扩增本发明的核酸分子。可将如此扩增的核酸分子克隆入合适的载体中，并通过DNA序列分析来进行表征。此外，相应于IMI核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准的合成技术，例如使用自动DNA合成仪来制备。

本发明的IMI核酸可包含编码IMI蛋白的序列(即，“编码区”)以及5′非翻译序列和3′非翻译序列。可选择地，本发明的核酸分子可以只包含IMI基因的编码区，或者可以包含从基因组DNA分离的完整基因组片段。将这些序列的编码区标示为“ORF位置”。此外，本发明的核酸分子可包含IMI基因的编码区的一部分，例如，可用作探针或引物的片段。通过从普通小麦中克隆IMI基因而确定的核苷酸序列允许产生探针和引物，所述探针和引物被设计用于鉴定和/或克隆在其他细胞类型和生物体中的IMI同源物以及来自其他小麦植物和相关物种的IMI同源物。编码区的部分也可以编码IMI蛋白的生物学活性片段。

如此处所用的，术语IMI蛋白的“生物学活性部分”是希望包括这样的IMI蛋白的部分例如结构域/基元，其当在植物中产生时，使得所述植物与野生型植物相比对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性增加。在下面的实施例中提供了用于定量增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的方法。IMI蛋白的生物学活性部分包括来源于SEQ ID NO：2的肽，其包含比全长IMI蛋白少的氨基酸并且当在植物中表达时给予增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。一般地，生物学活性部分(例如，长度为例如5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100个或更多个氨基酸的肽)包括具有IMI蛋白的至少一种活性的结构域或基元。此外，其他生物学活性部分(其中所述多肽的其他区域缺失)可通过重组技术来制备，并就此处所描述的一种或多种活性对其进行评价。优选地，IMI蛋白的生物学活性部分包括一个或多个选自结构域A、结构域B、结构域C、结构域D和结构域E的保守结构域，其中所述保守结构域包含突变。

本发明还提供了IMI嵌合或融合多肽。如此处所用的，IMI“嵌合多肽”或“融合多肽”包含有效地连接至非IMI多肽的IMI多肽。“非IMI多肽”是指具有基本上不与IMI多肽相同的氨基酸序列的多肽，例如不是IMI同工酶的多肽，该肽执行与IMI多肽不同的功能。如此处所用的，关于融合多肽，术语“有效地连接”是希望表示，IMI多肽和非IMI多肽以这样的方式相互融合，即使两个序列都实现归因于所用序列的所计划的功能。可将非IMI多肽融合至IMI多肽的N-末端或C-末端。例如，在一个实施方案中，融合多肽是其中IMI序列融合至GST序列的C-末端的GST-IMI融合多肽。这样的融合多肽可有助于重组IMI多肽的纯化。在另一个实施方案中，融合多肽是在其N-末端包含异源信号序列的IMI多肽。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，可通过使用异源信号序列来增加IMI多肽的表达和/或分泌。

可通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失引入SEQ ID NO：1的核苷酸序列中从而将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的多肽中，来产生编码与SEQ ID NO：2的多肽具有一定百分比的序列同一性的IMI多肽的分离的核酸分子。可通过标准的技术例如定位诱变和PCR介导的诱变来将突变引入SEQ ID NO：1的序列中。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸置换。

“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的置换。在本领域已定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，IMI多肽中预测的非必需氨基酸优选地用另一种来自相同侧链家族的氨基酸残基替代。可选择地，在另一个实施方案中，可沿着IMI编码序列的全部或部分随机地引入突变(例如通过饱和诱变)，并就此处描述的IMI活性来筛选所得的突变体以鉴定保留了IMI活性的突变体。在诱变SEQ ID NO：1的序列后，可重组表达所编码的多肽，并如下面实施例中所描述的，通过分析表达所述多肽的植物的咪唑啉酮类耐受性来确定所述多肽的活性。

为确定两个氨基酸序列的序列同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对(例如，可在一个多肽的序列中引入缺口以获得与另一个多肽的最佳比对)。然后比较处于对应的氨基酸位置上的氨基酸残基。当一个序列中的位置被与另一个序列中对应位置上的氨基酸相同的氨基酸残基占据时，那么所述分子在该位置上是同一的。可在两个核酸序列之间进行相同类型的比较。两个序列之间的序列同一性百分数是由所述序列所共有的相同位置的数目的函数(即，序列同一性百分数＝相同位置的数目/位置总数×100)。对于本发明来说，使用Vector NTI 6.0(PC)软件包(InforMax，7600 Wisconsin Ave.，Bethesda，MD 20814)来确定两个核酸或多肽序列之间的序列同一性百分数。使用15的缺口开放罚分(gap opening penalty)和6.66的缺口延伸罚分(gap extension penalty)来确定两个核酸的同一性百分数。使用10的缺口开放罚分和0.1的缺口延伸罚分来确定两个多肽的同一性百分数。所有其他参数被设置为缺省设置。

要理解，对于确定序列同一性的目的，当将DNA序列和RNA序列比较时，胸腺嘧啶核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。优选地，本发明的分离的IMI核酸与SEQ ID NO：1中所示的整个多核苷酸序列具有至少大约50-60％，优选地至少大约60-70％，和更优选地至少大约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，和最优选地至少大约96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在另一个实施方案中，本发明所包括的分离的IMI核酸与SEQ ID NO：1中所示的整个多核苷酸序列具有至少大约50-60％，优选地至少大约60-70％，和更优选地至少大约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，和最优选地至少大约96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

优选地，本发明的分离的IMI多肽与SEQ ID NO：2中所示的整个氨基酸序列具有至少大约50-60％，优选地至少大约60-70％，和更优选地至少大约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，和最优选地至少大约96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在另一个实施方案中，本发明所包括的分离的IMI多肽与SEQ ID NO：2中所示的整个氨基酸序列具有至少大约50-60％，优选地至少大约60-70％，和更优选地至少大约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，和最优选地至少大约96％、97％、98％、99％或更高的同一性。

此外，可产生最佳的IMI核酸。优选地，最佳的IMI核酸编码IMI多肽，所述IMI多肽，当其在植物中过表达时，调节植物对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并更优选地增加植物对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。如此处所用的，“最佳的”是指经基因工程改造以增加其在给定的植物或动物中的表达的核酸。为了给植物提供最佳的IMI核酸，可以修饰基因的DNA序列以使之1)包含由高度表达的植物基因所偏爱的密码子；2)包含基本上与在植物中发现的A+T含量相同的在核苷酸碱基组成中的A+T含量；3)形成植物起始序列；4)消除引起RNA的去稳定化、不适当的聚腺苷酸化、降解和终止的序列，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。可通过使用一般在植物中或在特定植物中密码子使用的分布频率来获得植物中IMI核酸的增加的表达。可在EPA 0359472；EPA 0385962；PCT申请号WO 91/16432；美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；Perlack等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：3324-3328；和Murray等人，1989，Nucleic AcidsRes.17：477-498中找到用于优化植物中的核酸表达的方法。

如此处所用的，“偏爱密码子使用频率”是指由特定的宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定的氨基酸中所展示出的偏爱性。为确定基因中特定密码子的使用频率，将该密码子在基因中出现的次数除以确定相同氨基酸的所有密码子在基因中出现的总次数。类似地，可通过对在大量由宿主细胞表达的基因中偏爱密码子使用频率求平均值，来计算由该宿主细胞所展示的偏爱密码子使用频率。优选地，该分析限定于由宿主细胞高度表达的基因。首先通过确定单个密码子的使用频率与宿主细胞的单个密码子的使用频率的百分比偏差，然后获得所有密码子范围的平均偏差，来计算合成基因的偏爱密码子使用频率与宿主细胞所采用的偏爱密码子使用频率的百分比偏差。如此处所定义的，该计算包括唯一的密码子(即，ATG和TGG)。概括地来说，优化的基因的密码子使用与宿主细胞的密码子使用的总平均偏差采用公式1A＝n＝1 Z X_n-Y_n X_n×100 Z来计算，其中X_n＝密码子n在宿主细胞中的使用频率；Y_n＝密码子n在合成基因中的使用频率；n表示确定氨基酸的单独密码子；密码子的总数为Z。对于所有氨基酸，密码子使用频率的总偏差A应当优选地小于大约25％，更优选地小于大约10％。

因此，可这样优化IMI核酸，即使其密码子使用的分布频率优选地与高度表达的植物基因的密码子使用的分布频率偏离不超过25％，更优选地不超过大约10％。此外，要考虑简并性的第三个碱基的G+C含量百分数(单子叶植物似乎在该位置上喜好G+C，而双子叶植物则不是)。还要认识到，XCG(其中X是A、T、C或G)核苷酸在双子叶植物中是最不偏爱的密码子，而在单子叶植物和双子叶植物中都要避免XTA密码子。本发明的优化的IMI核酸还优选地使CG和TA双联体回避指数(avoidance indices)充分接近所选择的宿主植物(即，普通小麦)的回避指数。更优选地，这些指数与宿主的指数偏离不超过大约10-15％。

除了编码上述IMI多肽的核酸分子外，本发明的另一个方面涉及对于所述核酸分子来说为反义核酸的分离的核酸分子。反义多核苷酸被认为通过特异性地结合靶多核苷酸并干扰靶多核苷酸的转录、剪接、转运、翻译和/或稳定性来抑制靶多核苷酸的基因表达。在现有技术中描述了用于将反义多核苷酸靶向染色体DNA、初级RNA转录物或经加工的mRNA的方法。优选地，所述靶区域包括剪接位点、翻译起始密码子、翻译终止密码子和开放阅读框架内的其他序列。

术语“反义”，对于本发明来说，是指包含这样的多核苷酸的核酸，所述多核苷酸充分地与基因、初级转录物或经加工的mRNA的全部或部分互补，从而干扰内源基因的表达。“互补的”多核苷酸是能够按照标准的Watson-Crick互补法则进行碱基配对的多核苷酸。具体地，嘌呤将和嘧啶进行碱基配对，从而形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)(在DNA的情况下)或腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)(在RNA的情况下)这样的组合。要理解，即使两个多核苷酸相互之间不完全互补，它们也可以相互杂交，条件是各具有至少一个基本上与另一方互补的区域。术语“反义核酸”包括单链RNA以及可被转录以产生反义RNA的双链DNA表达盒。“活性”反义核酸是能够选择性地与编码多肽的初级转录物或mRNA杂交的反义RNA分子，所述多肽与SEQ ID NO：2的多肽序列具有至少80％的序列同一性。

除了上述的IMI核酸和多肽外，本发明还包括附着至一个部分的这些核酸和多肽。这些部分包括，但不限于，检测部分、杂交部分、纯化部分、递送部分、反应部分、结合部分等。具有附着的部分的核酸的典型组是探针和引物。探针和引物通常包含基本上分离的寡核苷酸。所述寡核苷酸通常包含这样的核苷酸序列的区域，所述区域在严紧条件下与SEQ ID NO：1中所示的序列的有义链的、SEQ ID NO：1中所示的序列的反义序列的、或其天然发生的突变体的至少大约12个、优选地大约25个、更优选地大约40、50或75个连续核苷酸杂交。基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的引物可在用于克隆IMI同源物的PCR反应中使用。基于所述IMI核苷酸序列的探针可用于检测编码相同或同源多肽的转录物或基因组序列。在优选的实施方案中，探针还包含附着至其上的标记基团，例如，所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这样的探针可用作基因组标记物测试试剂盒的一部分，所述试剂盒用于例如通过测量细胞样品中编码IMI的核酸的水平，例如检测IMI mRNA水平，来鉴定表达IMI多肽的细胞，或者用于确定基因组IMI基因是否已经突变或删除。

本发明还提供了包含上述IMI核酸的分离的重组表达载体，其中所述载体在宿主细胞中的表达导致与野生型宿主细胞相比对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性增加。如此处所用的，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指可将另外的DNA片段连接入其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA片段可被连接入病毒基因组中。某些载体能够在其中引入了它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合入宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组而被复制。此外，某些载体能够指导它们所有效地连接的基因的表达。这样的载体在此处称为“表达载体”。一般地，用于重组DNA技术中的表达载体通常以质粒的形式存在。在本说明书中，由于质粒是最普遍使用的载体形式，因此“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本发明意在包括发挥等同功能的诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)的其他形式的表达载体。

本发明的重组表达载体以适合于在宿主细胞中表达本发明的核酸的形式包含所述核酸，这意味着重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞而选择的一个或多个调控序列，所述调控序列有效地连接至待表达的核酸序列。关于重组表达载体，“有效地连接”是希望表示，目的核苷酸序列以允许所述核酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当所述载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)的方式连接至所述调控序列。术语“调控序列”是希望包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。这样的调控序列描述于，例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)；和Gruber和Crosby，in：Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，编者Glick和Thompson，第7章，89-108，CRC Press：Boca Raton，Florida中，包括其中的参考文献。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的序列和只在某些宿主细胞中或在某些条件下指导所述核苷酸序列的表达的序列。本领域技术人员将会认识到，表达载本的设计可依赖于诸如待转化的宿主细胞的选择、想要的多肽的表达水平等的这些因素。本发明的表达载体可被引入宿主细胞中，从而产生由此处描述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或肽(例如，IMI多肽、融合多肽等)。

在本发明的一个优选实施方案中，在植物以及植物细胞诸如单细胞植物细胞(例如藻类)(参见Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology 1(3)：239-251，和其中的参考文献)和来自高等植物(例如，种子植物，例如作物植物)的细胞中表达所述IMI多肽。可通过任何方法，包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、土壤杆菌感染、生物射弹等，将IMI多核苷酸“引入”植物细胞中。

可在Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其他实验室手册例如Methods in Molecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，ed：Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法。由于增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性是希望被遗传入广泛的植物中的普遍性状，所述植物是例如玉米，小麦，黑麦，燕麦，黑小麦，水稻，大麦，大豆，花生，棉花，油菜籽(rapeseed)和canola，木薯，胡椒，向日葵和万寿菊(tagetes)，茄科植物如马铃薯、烟草、茄子和西红柿，野豌豆属(Vicia)物种，豌豆，苜蓿，灌木植物(咖啡、可可、茶)，柳属(Salix)物种，树(油棕、椰子)，多年生草，和饲料作物，因此作为本发明的另一个实施方案，这些植物也是用于基因工程改造的优选的靶植物。在优选的实施方案中，所述植物是小麦植物。饲料作物包括，但不限于，冰草、虉草、雀麦、披碱草、早熟禾、鸭茅、苜蓿、Salfoin、百脉根、杂种车轴草、红车轴草和草木樨(Sweet Clover)。

在本发明的一个实施方案中，通过土壤杆菌介导的基因转移来完成将IMI多核苷酸转染入植物中。本领域技术人员已知的一个转化方法是将有花植物浸入土壤杆菌溶液中，其中所述土壤杆菌包含IMI核酸，然后培育所述转化的配子。可使用例如GV3101(pMP90)(Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株来进行土壤杆菌介导的植物转化。可通过标准的转化和再生技术(Deblaere等人，1994，Nucl.Acids.Res.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B.和Schilperoort，Robert A，Plant Molecular BiologyManual，第2版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995，-inSect.，Ringbuc Zentrale Signatur：BT11-P ISBN 0-7923-2731-4；Glick，Bernard R.和Thompson，John E.，Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，Boca Raton：CRC Press，1993 360 S.，ISBN 0-8493-5164-2)来进行转化。例如，可通过子叶或下胚轴转化(Moloney等人，1989，Plant Cell Report 8：238-242；De Block等人，1989，Plant Physiol.91：694-701)来转化油菜籽。使用抗生素进行土壤杆菌和植物的选择依赖于用于转化的二元载体和土壤杆菌菌株。通常使用卡那霉素作为可选择的植物标记进行油菜籽的选择。可使用例如由Mlynarova等人，1994，Plant Cell Report13：282-285所描述的技术来进行土壤杆菌介导的向亚麻的基因转移。此外，可使用例如在欧洲专利号0424 047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397 687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中所描述的技术来进行大豆的转化。可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA吸收，或者通过碳化硅纤维技术，来获得玉米的转化。(参见，例如，Freeling和Walbot″The maize handbook″Springer Verlag：New York(1993)ISBN 3-540-97826-7)。在美国专利号5,990,387可找到玉米转化的具体实例，在PCT申请号WO 93/07256中可找到小麦转化的具体实例。

根据本发明，如果所引入的IMI多核苷酸被合并入非染色体自主复制子中或被整合入植物染色体中，那么其可稳定地保持在植物细胞中。可选择地，所述引入的IMI多核苷酸可存在于染色体外非复制性载体上，并且短暂地表达或短暂地具有活性。在一个实施方案中，可产生其中IMI多核苷酸被整合入染色体中的同源重组微生物，制备包含AHAS基因的至少一部分的载体，在所述AHAS基因的至少一部分中已导入缺失、添加或置换，从而改变例如功能性地破坏了内源AHAS基因并产生了IMI基因。为了通过同源重组来产生点突变，可在称为嵌合修复术(chimeraplasty)(Cole-Strauss等人，1999，NucleicAcids Research 27(5)：1323-1330；和Kmiec，1999，Gene therapyAmerican Scientist 87(3)：240-247)的技术中使用DNA-RNA杂合体。小麦属物种中的其他同源重组方法在本领域中是熟知的，并且考虑在此使用。

在同源重组载体中，可在IMI基因的5′和3′末端，于侧翼连接AHAS基因的另外的核酸分子以使得在微生物或植物中由载体所携带的外源IMI基因和内源AHAS基因之间能够发生同源重组。另外的侧翼AHAS核酸分子的长度足以成功地进行与内源基因的同源重组。一般地，在载体中包含数百个碱基对至数千个碱基对的侧翼DNA(在5′和3′末端)(参见，例如，Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.，1987，Cell51：503，关于同源重组载体的描述，或Strepp等人，1998，PNAS，95(8)：4368-4373，关于(小立碗藓(Physcomitrella patens))中基于cDNA的重组)。然而，因为IMI基因通常在非常少的氨基酸上与AHAS基因不同，因此侧翼序列不一定总是必需的。将同源重组载体引入微生物或植物细胞中(例如，通过聚乙二醇介导的DNA)，并使用本领域已知的技术选择其中所引入的IMI基因已与内源AHAS基因同源重组的细胞。

在另一个实施方案中，可产生包含挑选出的系统的重组微生物，所述挑选出的系统允许所引入的基因的受调控的表达。例如，在载体上包含IMI基因并使之位于乳糖操纵子的控制之下允许所述IMI基因只在IPTG存在的情况下表达。这些调控系统在本领域是熟知的。

无论是存在于染色体外非复制性载体之中还是存在于整合入染色体中的载体之中，所述IMI多核苷酸优选地存在于植物表达盒中。植物表达盒优选地包含能够驱动在植物细胞中的基因表达的调控序列，所述调控序列有效地进行连接，从而各序列可实现其功能，例如，通过多腺苷酸化信号来产生转录终止。优选的多腺苷酸化信号是来源于根瘤土壤杆菌t-DNA，例如Ti质粒pTiACH5的称为章鱼碱合酶的基因3的多腺苷酸化信号(Gielen等人，1984，EMBO J.3：835)或其功能等价物，但在植物中具有功能性活性的所有其他终止子也是合适的。因为植物基因表达常常不局限于转录水平，因此植物表达盒优选地包含其他有效地连接的序列如翻译增强子，例如包含来自烟草花叶病毒的5′非翻译前导序列(其增加多肽/RNA比率)的超驱动序列(overdrive-sequence)(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括在下列文献中详述的那些：Becker，D.等人，1992，New plant binary vectors with selectablemarkers located proximal to the left border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium vectorsfor plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；和Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，in：TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，eds.：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，S.15-38。

植物基因表达盒应当有效地连接至合适的启动子，所述启动子以适时的、细胞类型偏爱的或组织偏爱的方式提供基因表达。用于本发明的表达盒的启动子包括能够在植物细胞中起始转录的任何启动子。这样的启动子包括但不限于可从植物、植物病毒和包含在植物中表达的基因的细菌例如土壤杆菌属(Agrobacterium)和根瘤菌属(Rhizobium)中获得的启动子。

启动子可以是组成型、诱导型、发育阶段偏爱型、细胞类型偏爱型、组织偏爱型或器官偏爱型的。组成型启动子在大多数情况下具有活性。组成型启动子的实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)，sX CaMV 35S启动子(Kay等人，1987，Science 236：1299-1302)，Sep1启动子，水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell 2：163-171)，拟南芥(Arabidopsis)肌动蛋白启动子，遍在蛋白启动子(Christensen等人，1989，PlantMolec.Biol.18：675-689)，pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)，玄参花叶病毒35S启动子，Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J.3：2723-2730)，GRP1-8启动子，肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5,683,439)，来自土壤杆菌的T-DNA例如甘露碱合酶、胭脂碱合酶和章鱼碱合酶的启动子，二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)的启动子，等等。

诱导型启动子在某些环境条件例如营养物或代谢物存在或不存在、热或冷、光照、病原体攻击、缺氧条件等情况下是有活性的。例如，来自芸苔属(Brassica)的hsp80启动子由热激诱导；PPDK启动子由光照诱导；来自烟草、拟南芥和玉米的PR-1启动子由病原体的感染诱导；以及Adh1启动子由低氧和冷胁迫诱导。通过诱导型启动子也可以促进植物基因的表达(关于综述，参见Gatz，1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。如果想要时间特异的基因表达，那么可化学诱导的启动子是特别适合的。这样的启动子的实例是水杨酸诱导型启动子(PCT申请号WO 95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)和乙醇诱导型启动子(PCT申请号WO 93/21334)。

发育阶段偏爱型启动子优选地在某些发育阶段表达。组织和器官偏爱型启动子包括优选地在某些组织或器官例如叶、根、种子或木质部中表达的启动子。组织偏爱型和器官偏爱型启动子的实例包括，但不限于果实偏爱型、胚珠偏爱型、雄性组织偏爱型、种子偏爱型、珠被偏爱型、块茎偏爱型、叶柄(stalk)偏爱型、果皮偏爱型、和叶偏爱型、柱头偏爱型、花粉偏爱型、花药偏爱型、花瓣偏爱型、萼片偏爱型、花梗偏爱型、长角果偏爱型、茎偏爱型、根偏爱型启动子等。种子偏爱型启动子优选地在种子发育和/或萌发期间表达。例如，种子偏爱型启动子可以是胚偏爱型、胚乳偏爱型和种皮偏爱型启动子。参见Thompson等人，1989，BioEssays 10：108。种子偏爱型启动子的实例包括，但不限于，纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉米的19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。

其他合适的组织偏爱型或器官偏爱型启动子包括来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、来自蚕豆(Viciafaba)的USP启动子(Baeumlein等人，1991，Mol Gen Genet.225(3)：459-67)、来自拟南芥的油质蛋白启动子(PCT申请号WO98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(美国专利号5,504,200)、来自芸苔属的Bce4启动子(PCT申请号WO91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，PlantJournal，2(2)：233-9)，以及在单子叶植物例如玉米、大麦、小麦、黑麦、水稻等中赋予种子特异性表达的启动子。引人注意的合适的启动子是来自大麦的lpt2或lpt1基因启动子(PCT申请号WO 95/15389和PCT申请号WO 95/23230)或在PCT申请号WO 99/16890中描述的那些(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、水稻的谷蛋白基因、水稻的水稻素基因、水稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁的kasirin基因和黑麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。

可用于本发明的表达载体的其他启动子包括，但不限于，主要叶绿素II a/b结合蛋白启动子，组蛋白启动子，Ap3启动子，β-伴大豆球蛋白(β-conglycin)启动子，油菜籽蛋白启动子，大豆凝血素启动子，玉米的15kD玉米醇溶蛋白启动子，22kD玉米醇溶蛋白启动子，27kD玉米醇溶蛋白启动子，g-玉米醇溶蛋白启动子，waxy、shrunken 1、shrunken 2和bronze启动子，Zm13启动子(美国专利号5,086,169)、玉米的多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利号5,470,359)，以及合成的启动子或其他天然启动子。

通过使用来自异源来源的DNA结合结构域和应答元件(即，来自非植物来源的DNA结合结构域)可获得在植物中控制异源基因表达的额外灵活性。这样的异源DNA结合结构域的实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell 43：729-736)。

本发明提供了用于在植物、植物细胞和其他非人宿主细胞中表达本发明的多核苷酸分子的表达盒。所述表达盒包含可在目的植物、植物细胞或其他宿主细胞中表达并且有效地连接至IMI核酸的启动子。如果需要将表达靶向叶绿体，那么所述表达盒还可以包含有效地连接的叶绿体靶向序列，该序列编码将表达的IMI蛋白导向叶绿体的叶绿体转运肽。

在一个实施方案中，将IMI核酸靶向叶绿体以进行表达。这样，在不将IMI核酸直接插入叶绿体的情况下，表达盒可额外地包含叶绿体靶向序列，所述叶绿体靶向序列包含编码将目的基因产物导向叶绿体的叶绿体转运肽的核苷酸序列。这样的转运肽在本领域中是已知的。关于叶绿体靶向序列，“有效地连接”是表示，将编码转运肽的核酸序列(即叶绿体靶向序列)如此连接至本发明的IMI核酸，从而使这两个序列邻接并在同一个阅读框中。参见，例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。尽管本发明的IMI蛋白可包含天然的叶绿体转运肽，但可以通过将叶绿体靶向序列有效地连接至编码本发明的成熟IMI蛋白的核苷酸序列的5′末端来将本领域已知的任何叶绿体转运肽融合至本发明的成熟IMI蛋白的氨基酸序列。

叶绿体靶向序列在本领域中是已知的，包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇丙酮酰基)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人(1995)J Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸合酶(Schmidt等人(1993)J Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；和集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还可参见Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)PlantPhysiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。

还可将IMI核酸或包含IMI核酸的表达盒引入为了在其中进行表达的叶绿体。用于叶绿体的转化的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。所述方法依赖于包含选择标记的DNA的基因枪递送和通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，可通过核编码和质体定向的RNA聚合酶的组织偏爱型表达来反式激活沉默的质体所携带的转基因，从而完成质体转化。在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中已报导了这样的系统。

为了在叶绿体中表达，可优化被靶向叶绿体的IMI核酸以解决植物的细胞核和该细胞器之间的密码子使用方面的差异。这样，可使用叶绿体偏爱密码子来合成目的核酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，此处引用作为参考。如果必需进行叶绿体表达，那么表达盒还可包含有效地连接至IMI核酸的叶绿体启动子。这样的叶绿体启动子在本领域内是已知的。

本发明的另一个方面涉及其中已引入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此可互换使用。要理解，这样的术语不仅是指特定的受试细胞，而且其也用于指这样的细胞的后代或潜在的后代。因为由于突变或环境影响的原因某些修饰可在以后的世代中发生，所以这样的后代实际上可以不与亲本细胞相同，但仍然包括在此处所用的该术语的范围之内。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，可在细菌细胞例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫、植物细胞、真菌或其他微生物如谷氨酸棒杆菌中表达IMI多核苷酸。其他合适的宿主细胞对于本领域技术人员来说是已知的。

本发明的宿主细胞，例如培养中的原核或真核宿主细胞，可用于产生(即，表达)IMI多核苷酸。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞来产生IMI多肽的方法。在另一个实施方案中，所述方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(所述宿主细胞中已引入了编码IMI多肽的重组表达载体，或其基因组中已引入了编码野生型或IMI多肽的基因)直至产生IMI多肽。在另一个实施方案中，所述方法还包括从培养基或宿主细胞中分离IMI多肽。本发明的另一个方面涉及分离的IMI多肽及其生物学活性部分。“分离的”或“纯化的”多肽或其生物学活性部分，当由重组DNA技术产生时不含细胞材料中的一些，或当通过化学合成时不含化学药品前体或其他化学药品。表述“基本不含细胞材料”包括其中所述多肽与细胞的一些细胞组分分开的IMI多肽制剂，在所述细胞中该多肽天然地或重组地产生。在一个实施方案中，表述“基本上不含细胞材料”包括这样的IMI多肽制剂，所述制剂具有低于大约30％(按干重计)的非IMI物质(此处也称为“污染性多肽”)，更优选地低于大约20％的非IMI物质，更加优选地低于大约10％的非IMI物质，和最优选地低于大约5％的非IMI物质。

当重组产生IMI多肽或其生物学活性部分时，基本上不含培养基也是优选的，即培养基的存在量低于大约20％，更优选地低于大约10％，和最优选地低于大约5％的多肽制剂的体积。表述“基本上不含化学药品前体或其他化学药品”包括其中所述多肽与参与合成该多肽的化学药品前体或其他化学药品分开的IMI多肽制剂。在一个实施方案中，表述“基本上不含化学药品前体或其他化学药品”包括这样的IMI多肽制剂，所述制剂具有低于大约30％(按干重计)的化学药品前体或化学药品，更优选地低于大约20％的化学药品前体或化学药品，更加优选地低于大约10％的化学药品前体或化学药品，和最优选地低于大约5％的化学药品前体或化学药品。在优选的实施方案中，分离的多肽或其生物学活性部分，没有来自IMI多肽所源自的相同生物的污染性多肽。一般地，通过例如在除了普通小麦之外的植物或者微生物如谷氨酸棒杆菌、纤毛虫、藻类或真菌中重组地表达普通小麦IMI多肽来产生这样的多肽。

本发明的IMI多核苷酸和多肽序列具有多种用途。本发明的核酸和氨基酸序列可用于转化植物，从而调节植物对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。因此，本发明提供了产生具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的转基因植物的方法，其包括，(a)用一种或多种包含一种或多种IMI核酸的表达载体转化植物细胞，和(b)从所述植物细胞产生与野生型植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的转基因植物。在一个实施方案中，多种IMI核酸来源于不同的基因组。本发明还包括产生具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的转基因植物的方法，其包括，(a)用包含IMI核酸的表达载体转化植物细胞，其中所述核酸是非Imi1核酸，和(b)从所述植物细胞产生与野生型植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的转基因植物。

本发明包括改变植物对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性的方法，其包括改变一种或多种IMI核酸的表达。可增加或减小植物对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，这可分别通过增加或减少IMI多核苷酸的表达来实现。优选地，通过增加IMI多核苷酸的表达来增加植物对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。可通过本领域技术人员已知的任何方法来改变IMI多核苷酸的表达。可使用增加IMI多核苷酸的表达的方法，其中所述植物是转基因的或非转基因的。例如，在当植物是转基因植物的情况下，可用包含上述IMI编码性核酸中的任何核酸的载体转化所述植物，或可用指导内源IMI多核苷酸在植物中表达的启动子转化所述植物。本发明规定，这样的启动子可以是组织特异性的或随着发育受到调控的。可选择地，非转基因植物可以具有通过诱导天然启动子而修饰的内源IMI多核苷酸表达。可通过但不限于下列实例中的一个实例来进行包含SEQ ID NO：1中定义的多核苷酸序列的多核苷酸在靶植物中的表达：(a)组成型启动子，(b)化学药品诱导的启动子，和(c)、具有例如来源于转录因子的锌指的、过表达的、经工程改造的启动子(Greisman和Pabo，1997，Science 275：657)。

在优选的实施方案中，使用如Greisman和Pabo，1997，Science275：657中描述的并由Sangamo Biosciences，Inc.生产的来源于转录因子的锌指(ZFP)来调节IMI多核苷酸的转录。这些ZFP包含DNA识别结构域和引起靶核酸例如IMI核酸激活或抑制的功能结构域。因此，可产生特异性地识别上述的IMI多核苷酸启动子的激活性和抑制性ZFP，并将其用于增加或减少IMI多核苷酸在植物中的表达，从而调节植物的除草剂耐受性。

如上面更详细描述的，由本发明的方法产生的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。例如，所述植物可选自玉米，小麦，黑麦，燕麦，黑小麦，水稻，大麦，大豆，花生，棉花，油菜籽，canola，木薯，胡椒，向日葵，万寿菊，茄科植物，马铃薯，烟草，茄子，西红柿，野豌豆属物种，豌豆，苜蓿，咖啡，可可，茶，柳属物种，油棕，椰子，多年生草，和饲料作物。饲料作物包括，但不限于，冰草、虉草、雀麦、披碱草、早熟禾、鸭茅、苜蓿、Salfoin、百脉根、杂种车轴草、红车轴草和草木樨。在优选的实施方案中，所述植物是小麦植物或黑小麦植物。在上述方法的每一个中，所述植物细胞包括，但不限于，原生质体、产生配子的细胞和再生成完整植物的细胞。如此处所用的，术语“转基因的”是指包含至少一种重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，重组多核苷酸的全部或部分被稳定地整合入染色体或稳定的染色体外元件中，从而使其传递至连续世代。

如上所述，本发明教导了用于增加(与野生型植物或种子相比)植物或种子的咪唑啉酮类耐受性的组合物和方法。在优选的实施方案中，增加小麦植物或种子的咪唑啉酮类耐受性，从而使所述植物或种子可经受住优选地大约10-300g ai ha^-1，更优选地20-160g ai ha^-1，和最优选地40-80g ai ha^-1的咪唑啉酮类除草剂的施用。如此处所用的，“经受住”咪唑啉酮类除草剂的施用是表示植物不被这样的施用杀死或损伤。

本发明提供了，当分别与野生型植物、植物部分、植物器官、植物组织、植物细胞、种子或宿主细胞相比时，具有增加的对于至少一种咪唑啉酮类除草剂的耐受性的植物、植物部分、植物器官、植物组织、种子和宿主细胞。这样的“野生型植物、植物部分、植物器官、植物组织、植物细胞、种子或宿主细胞”是表示，关于ATCC专利保藏号5625的植物的除草剂耐受性特征和/或本发明的IMI核酸，所述植物、植物部分、植物器官、植物组织、植物细胞、种子或宿主细胞分别是野生型的。也就是说，这样的野生型植物、植物部分、植物器官、植物组织、植物细胞、种子或宿主细胞不包含ATCC专利保藏号5625的植物的除草剂耐受性特征和/或不包含本发明的IMI核酸。因此，术语“野生型”的使用不是希望表示植物、植物部分、植物器官、植物组织、植物细胞、种子或宿主细胞在其基因组中缺少重组DNA，和/或不包含与本发明的那些除草剂耐受性特征和IMI核酸不同的除草剂耐受性特征和/或IMI核酸。

另外，此处还提供了控制在小麦或黑小麦植物附近的杂草的方法，其包括向所述杂草和向所述小麦或黑小麦植物施用咪唑啉酮类除草剂，其中所述小麦或黑小麦植物与野生型小麦或黑小麦植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并且其中所述耐受咪唑啉酮类的小麦或黑小麦植物包含至少一种IMI核酸。在一个实施方案中，所述植物包含多种IMI核酸。在另一个实施方案中，所述植物包含Imi1核酸。通过提供具有增加的对于咪唑啉酮类的耐受性的小麦和黑小麦植物，可使用多种制剂来保护小麦和黑小麦植物免受杂草的侵害，从而增强植物的生长和减少对营养物的竞争。可单独地使用咪唑啉酮类除草剂以在苗前(pre-emergence)、苗后(post-emergence)、植前(pre-planting)和植时(at planting)控制位于此处所描述的小麦植物周围区域内的杂草，或者可使用包含其他添加剂的咪唑啉酮类除草剂制剂。也可将咪唑啉酮类除草剂用于种子处理。在咪唑啉酮类除草剂制剂中存在的添加剂包括其他除草剂、去污剂、佐剂、铺展剂、粘着剂、稳定剂等。咪唑啉酮类除草剂制剂可以是湿润的或干燥的制剂，并可以包括但不限于可流动性粉剂(flowable powders)、乳油和液体浓缩剂(liquid concentrates)。可按照常规方法，例如通过喷洒、灌溉、撒粉(dusting)等来施用咪唑啉酮类除草剂和除草剂制剂。

本发明还提供了包含本发明的选择标记基因的转化载体。所述选择标记基因包含在宿主细胞中驱动表达的启动子，该启动子有效地连接至本发明的IMI核酸。转化载体可额外地包含待在宿主细胞中表达的目的基因，并且如果想要还可包含有效地连接至本发明的多核苷酸的叶绿体靶向序列。

本发明还提供了使用本发明的转化载体以选择转化有目的基因的细胞的方法。这些方法包括用转化载体转化宿主细胞，将所述细胞暴露于可杀死未转化的宿主细胞或抑制其生长的咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂水平，并通过其在除草剂存在的情况下生长的能力来鉴定转化的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞，并且所述选择标记基因包含在植物细胞中驱动表达的启动子。

本发明的转化载体可用于产生转化有目的基因的植物。所述转化载体包含本发明的选择标记基因以及待被引入并通常在转化的植物中表达的目的基因。这样的选择标记基因包含与在宿主细胞中驱动表达的启动子有效地连接的本发明的IMI核酸。所述IMI核酸包含SEQ IDNO：1中所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的多核苷酸序列，和这些多核苷酸序列中任一序列的功能性片段和变体，其中所述片段或变体编码在相应于野生型AHAS多肽的位置98上包含丙氨酸至苏氨酸的置换的多肽。为了在植物和植物细胞中使用，所述转化载体包含选择标记基因，所述选择标记基因含有与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的本发明的IMI核酸。

本发明还涉及包含在植物中驱动表达的启动子的植物表达载体，所述启动子有效地连接至本发明的IMI核酸。所述IMI核酸包含SEQ IDNO：1中所示的多核苷酸序列，编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的多核苷酸序列，和这些多核苷酸序列中任一序列的功能性片段和变体，其中所述片段或变体编码在相应于野生型AHAS多肽的位置98上包含丙氨酸至苏氨酸的置换的多肽。本发明的植物表达载体不依赖于特定的启动子，只要这样的启动子能够在植物细胞中驱动基因表达。优选的启动子包括组成型启动子和组织偏爱型启动子。

本发明的目的基因依赖于想要的结果而变化。例如，表型的各种变化可以是所感兴趣的，包括改变植物的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的昆虫和/或病原体防御机制等。这些结果可通过在植物中提供异源产物的表达或增加的内源产物的表达来获得。可选择地，可通过在植物中提供一种或多种内源产物特别是酶或辅因子的表达减少来获得所述结果。这些改变导致转化的植物的表型发生变化。

在本发明的一个实施方案中，目的基因包括昆虫抗性基因，例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒素蛋白基因(美国专利号5,366,892、5,747,450、5,736,514、5,723,756、5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene 48：109)。

本发明的IMI蛋白或多肽可从例如canola植物中纯化，并可用于组合物中。此外，编码本发明的IMI蛋白的分离的IMI核酸可用于在微生物例如大肠杆菌(E.coli)或酵母中表达本发明的IMI蛋白。可通过对于本领域技术人员来说已知的任何方法从大肠杆菌或酵母的提取物中纯化表达的IMI蛋白。

在本发明的某些实施方案中，所述方法涉及使用耐受除草剂的或抗除草剂的植物。“耐受除草剂的”或“抗除草剂的”植物，是希望表示，植物对于处于通常可杀死正常或野生型植物或者抑制其生长的水平上的至少一种除草剂具有耐受性或抗性。在本发明的一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物包含编码IMI蛋白的IMI核酸。

对于本发明，术语“耐受除草剂的”和“抗除草剂的”可互换使用，并且希望具有等同的意思和等同的范围。类似地，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”可互换使用，并且希望具有等同的意思和等同的范围。同样地，术语“抗咪唑啉酮类的”和“咪唑啉酮类抗性”可互换使用，并且希望分别与术语“耐受咪唑啉酮类的”和“咪唑啉酮类耐受性”具有等同的意思和等同的范围。

本发明提供了具有增加的对于至少一种除草剂(特别是干扰AHAS酶的活性的除草剂，更特别地是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂)的抗性或耐受性的植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞。优选的除草剂量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。“有效量”和“有效浓度”分别意指这样的量和浓度，即所述量和浓度足以杀死或抑制相似的野生型植物、植物组织、植物细胞、小孢子或宿主细胞的生长，但所述量不杀死或不同样严重地抑制本发明的抗除草剂的植物、植物组织、植物细胞、小孢子和宿主细胞的生长。通常，除草剂的有效量是在农业生产系统中为了杀死目的杂草而常规使用的量。这样的量对于本领域技术人员来说是已知的，或可以使用本领域已知的方法而容易地确定。此外，要认识到，农业生产系统中的除草剂的有效量可能与体外植物培养系统中的除草剂的有效量显著不同。

本发明可用于任何植物物种的转化，所述植物物种包括，但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括，但不限于，玉米或玉蜀黍(Zea mays)，芸苔属物种(Brassica sp.)(例如，欧洲油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))，特别是用作种子油来源的芸苔属物种，苜蓿(紫苜蓿(Medicagosativa))，水稻(Oryza sativa)，黑麦(Secale cereale)，高梁(两色高梁(Sorghum bicolor)、高梁(Sorghum vulgare))，稷(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、小米(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))，向日葵(Helianthus annuus)，红花(Carthamus tinctorius)，小麦(普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(T.Turgidum ssp.durum))，大豆(Glycine max)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(Solanum tuberosum)，落花生(Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(Ipomoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(Ananascomosus)，柑桔树(柑桔属物种(Citrus spp.))，可可(Theobromacacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))，鳄梨(Persea americana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidiumgua java)，芒果(Mangifera indica)，橄榄(油橄榄(Olea europaea))，番木瓜(Carica papaya)，腰果(Anacardium occidentale)，全缘叶澳洲坚果(Macadamia integrifolia)，扁桃(Prunus amygdalus)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))，燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，向日葵、芸苔属物种、棉花、甜菜、大豆、花生、苜蓿、红花、烟草、玉米、水稻、小麦、黑麦、大麦、黑小麦、高梁、稷等)。

本发明的抗除草剂植物可在用于控制杂草的方法中使用。因此，本发明还提供了在本发明的抗除草剂的植物附近控制杂草的方法。所述方法包括向杂草和向抗除草剂的植物施用有效量的除草剂，其中，所述植物，当与野生型植物相比较时，具有增加的对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性。在此类用于控制杂草的方法中，本发明的抗除草剂的植物优选地是作物植物，包括，但不限于，向日葵、苜蓿、芸苔属物种、大豆、棉花、红花、花生、烟草、西红柿、马铃薯、小麦、水稻、玉米、高梁、大麦、黑麦、稷和高梁。

通过提供具有增加的对于除草剂特别是咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂的抗性的植物，可使用多种制剂来保护植物免受杂草的侵害，从而增强植物的生长和减少对营养物的竞争。可单独地使用除草剂以在苗前、苗后、植前和植时控制位于此处所描述的植物周围区域内的杂草，或者可使用包含其他添加剂的咪唑啉酮类除草剂制剂。也可将除草剂用于种子处理。即，在种子播种前或播种过程中，可将有效浓度或有效量的除草剂、或包含有效浓度或有效量的除草剂的组合物直接施用于种子。可在咪唑啉酮类或磺酰脲类除草剂制剂或组合物中使用的添加剂包括其他除草剂、去污剂、佐剂、铺展剂、粘着剂、稳定剂等。除草剂制剂可以是湿润的或干燥的制剂，并可以包括但不限于可流动性粉剂、乳油和液体浓缩剂。可按照常规方法，例如通过喷洒、灌溉、撒粉、包被等来施用除草剂和除草剂制剂。

本发明提供了具有增加的对于至少一种除草剂(特别是AHAS抑制性除草剂，更特别地是咪唑啉酮类除草剂)的耐受性的非转基因和转基因种子。这样的种子包括，例如，包含具有ATCC专利保藏号5625的植物的除草剂耐受性特征的非转基因小麦种子，和包含编码IMI蛋白的本发明的IMI核酸分子的转基因种子。

本发明提供了通过常规的植物育种法(包括有性繁殖)来产生抗除草剂的植物特别是抗除草剂的小麦或黑小麦植物的方法。所述方法包括将抗除草剂的第一植物和不抗除草剂的第二植物杂交。所述第一植物可以是本发明的抗除草剂的植物中的任何植物，包括，例如，包含编码抗除草剂的IMI蛋白的本发明多核苷酸中至少一种多核苷酸的转基因植物，和包含具有ATCC专利保藏号5625的小麦植物的除草剂耐受性特征的非转基因小麦植物。所述第二植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有生活力的后代植物(即，种子)的任何植物。通常，但非必需地，第一和第二植物是相同的物种。本发明的方法还可包括将第一次杂交的后代植物回交一代或多代，产生具有与第一或第二植物相同的品系或表型的植物。可选择地，可使第一次杂交或任何随后的杂交的后代进行杂交，以产生具有与第一或第二植物不同的品系或表型的第三植物。本发明的方法可额外地包括选择包含第一植物的除草剂耐受性特征的植物。

本发明还提供了通过常规的植物育种法(包括有性繁殖)来增加植物特别是抗除草剂的小麦植物的除草剂抗性的方法。所述方法包括将抗除草剂的第一植物和第二植物杂交，所述第二植物可以抗或不抗除草剂，或者可以抗相对于第一植物来说不同的除草剂。所述第一植物可以是本发明的抗除草剂的植物中的任何植物，包括，例如，包含编码IMI蛋白的本发明IMI核酸中至少一种IMI核酸的转基因植物，和包含具有ATCC专利保藏号5625的小麦植物的除草剂耐受性特征的非转基因小麦和黑小麦植物。所述第二植物可以是当与第一植物杂交时能够产生有生活力的后代植物(即，种子)的任何植物。通常，但非必需地，第一和第二植物是相同的物种。由本发明的该方法产生的后代植物，当与第一或第二植物或两者相比时，具有增加的对于除草剂的抗性。当第一和第二植物抗不同的除草剂时，后代植物将具有组合的第一和第二植物的除草剂耐受性特征。本发明的方法还可包括将第一次杂交的后代植物回交一代或多代，产生具有与第一或第二植物相同的品系或表型的植物。可选择地，可使第一次杂交或任何随后的杂交的后代进行杂交，以产生具有与第一或第二植物不同的品系或表型的第三植物。本发明的方法可额外地包括选择包含第一植物、第二植物或第一和第二植物两者的除草剂耐受性特征的植物。

本发明的植物可以是转基因或非转基因的。具有增加的对于咪唑啉酮类的抗性的非转基因小麦植物的实例是具有ATCC专利保藏号5625的小麦植物(Shiloh-8)；或具有ATCC专利保藏号5625的植物的突变体、重组体或基因工程衍生物；或具有ATCC专利保藏号5625的植物的任何后代；或作为这些植物中的任何植物的后代的植物；或包含具有ATCC专利保藏号5625的植物的除草剂耐受性特征的植物。

本发明还提供了用本发明的至少一种多核苷酸分子、表达盒或转化载体转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞。此类转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子和非人宿主细胞具有增加的对于至少一种除草剂的耐受性或抗性，所述除草剂处于分别杀死或抑制未转化的植物、植物组织、植物细胞或非人宿主细胞的除草剂水平。优选地，本发明的转化的植物、植物组织、植物细胞和种子是拟南芥(Arabidopsis thaliana)和作物植物。

本发明提供了包括使用至少一种AHAS抑制性除草剂在内的方法，所述AHAS抑制性除草剂选自咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑并嘧啶类除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯类除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮类除草剂及其混合物。在这些方法中，可通过本领域已知的任何方法，包括，但不限于，种子处理、土壤处理和叶处理，来施用AHAS抑制性除草剂。

在施用之前，可将AHAS抑制性除草剂转变成惯用的制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉末(dusts)、粉剂、糊剂和颗粒剂。使用形式取决于特定的所希望的目的；在各个情况下，应当确保本发明的化合物的精细和均匀的分布。

以已知的方式制备制剂(参见例如，关于综述可见US 3,060,084，EP-A 707 445(对于液体浓缩剂)，Browning，″Agglomeration″，Chemical Engineering，Dec.4，1967，147-48，Perry’s ChemicalEngineer’s Handbook，第4版，McGraw-Hill，New York，1963，第8-57页，以及下列，WO 91/13546，US 4,172,714，US 4,144,050，US 3,920,442，US 5,180,587，US 5,232,701，US 5,208,030，GB2,095,558，US 3,299,566，Klingman，Weed Control as a Science。John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等人，WeedControl Handbook，第8版，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1989，和Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulationtechnology，Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，2.D.A.Knowles，Chemistry and Technology of AgrochemicalFormulations，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，1998(ISBN 0-7514-0443-8))，例如通过用适合于配制农用化学药品的辅助剂例如溶剂和/或载体扩充活性化合物，如果想要，可使用乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、防沫剂、防冻剂，对于种子处理制剂还任选地可用着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂。

合适的溶剂的实例是水、芳香族溶剂(例如Solvesso产品，二甲苯)、石蜡(例如矿物油级分)、醇类(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮类(例如环己酮、γ-丁内酯)、吡咯烷酮(NMP，NOP)、乙酸酯(乙二醇二乙酸酯)、二醇类、脂肪酸二甲基酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯。原则上，也可使用溶剂混合物。

合适的载体的实例是磨细的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)和磨细的合成矿物(例如高度分散的二氧化硅、硅酸盐)。

合适的乳化剂是非离子和阴离子型乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)。

分散剂的实例是木质素-亚硫酸盐(酯)废液和甲基纤维素。

所用的合适的表面活性剂是木素质磺酸、萘磺酸、苯酚磺酸、二丁基萘磺酸、烷基芳基磺酸、烷基硫酸、烷基磺酸、脂肪醇硫酸酯、脂肪酸和硫酸化脂肪醇二醇醚的碱金属、碱土金属和铵盐，此外还有磺化萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、聚氧乙烯辛基苯酚醚、乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚、壬基苯酚、烷基苯酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂基苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷缩合物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、月桂醇聚乙二醇醚缩醛、山梨糖醇酯、木质素亚硫酸盐(酯)废液和甲基纤维素。

适合用于制备可直接喷施的溶液、乳液、糊剂或油分散体的物质是具有中至高沸点的矿物油级分，例如煤油或柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油，脂族烃、环烃和芳族烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘或其衍生物，甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，环己醇，环己酮，异佛尔酮，高极性溶剂，例如二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。

也可向制剂中加入防冻剂，例如甘油、乙二醇、丙二醇和杀菌剂。

合适的防沫剂是例如基于硅氧烷或硬脂酸镁的防沫剂。

合适的防腐剂是例如双氯酚和enzylalkoholhemiformal。

种子处理制剂可额外地包含粘合剂和任选地着色剂。

可加入粘合剂以在处理后促进活性材料在种子上的附着。合适的粘合剂是嵌段共聚物EO/PO表面活性剂，还有聚乙烯醇类、聚乙烯吡咯烷酮类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚丁烯类、聚异丁烯类、聚苯乙烯、聚乙烯胺类、聚乙烯酰胺类、聚乙烯亚胺类(Lupasol

、Polymin

)、聚醚、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、纤基乙酸钠和源自这些聚合物的共聚物。

任选地，制剂中还可包含着色剂。种子处理制剂的合适的着色剂或染料是罗丹明B、C.I.颜料红112、C.I.溶剂红1、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。

合适的胶凝剂的实例是角叉菜(Satiagel)。

可通过将活性物质与固体载体混合或相伴碾磨来制备粉末、用于撒播的材料和粉剂产品(dustable products)。

可通过将活性物质结合至固体载体来制备颗粒剂，例如包被的颗粒剂、浸渍的颗粒剂和均质的颗粒剂。固体载体的实例是矿物土，例如硅胶，硅酸盐，滑石，高岭土，attaclay，石灰石，石灰，白垩，红玄武土，黄土，粘土，白云石，硅藻土，硫酸钙，硫酸镁，氧化镁，磨细的合成材料，肥料，例如，硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素，和植物来源的产物，例如谷类粗粉、树皮粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉，纤维素粉末，和其他固体载体。

一般地，制剂包含0.01-95wt％的，优选地0.1-90wt％的AHAS抑制性除草剂。在该情况下，以90wt％-100wt％的纯度，优选地以95wt％-100wt％的纯度(根据NMR谱)使用AHAS抑制性除草剂。对于种子处理目的，可将各个制剂稀释2-10倍，从而导致即时可用的制备物中的浓度为0.01-60wt％，优选地0.1-40wt％的活性化合物。

可就这样使用AHAS抑制性除草剂，或者以其制剂的形式或从中制备的使用形式进行使用，例如以可直接喷洒的溶液、粉剂、悬浮液或分散体、乳液、油分散体、糊剂、粉剂产品、用于撒播的材料、或颗粒剂的形式进行使用，通过喷洒、雾化、撒粉、撒播或灌注进行施用。使用形式完全取决于想要的目的；其希望在每种情况下确保本发明的AHAS抑制性除草剂的最佳可能的分布。

可通过加入水而从乳液浓缩物、糊剂或可湿性粉剂(可喷洒的粉末、油分散体)制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，借助于湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂可将就这样的或溶解在油或溶剂中的物质在水中进行均质化。然而，也可能制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂和如果合适还有溶剂或油组成的浓缩物，这样的浓缩物适合于用水进行稀释。

即时可用的制剂中的活性化合物浓度可在相对宽的范围内变化。一般地，其为0.0001-10wt％，优选地0.01-1wt％。

AHAS抑制性除草剂还可成功地用于超低容量过程(ULV)中，从而可能施用包含超过95wt％的活性化合物的制剂，或甚至施用无添加剂的活性化合物。

下面是制剂的实例：

1.用于叶面施用的用水稀释的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释或未稀释的形式施用于种子。

A)水溶性浓缩物(SL、LS)

将10重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在90重量份的水或水溶性溶剂中。作为选择，可加入湿润剂或其他辅助剂。在用水稀释时，AHAS抑制性除草剂溶解，由此获得具有10％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。

B)可分散的浓缩物(DC)

将20重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了10重量份的分散剂例如聚乙烯吡咯烷酮的70重量份的环己酮中。用水稀释产生分散体，由此获得具有20％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。

C)乳油(EC)

将15重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每种情况下为5重量份)的7重量份的二甲苯中。用水稀释产生乳剂，由此获得具有15％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。

D)乳剂(EW、EO、ES)

将25重量份的AHAS抑制性除草剂溶解在添加了十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(在每种情况下为5重量份)的35重量份的二甲苯中。借助于乳化器(例如Ultraturrax)将该混合物导入30重量份的水中，并制备成均一的乳剂。用水稀释产生乳剂，由此获得具有25％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。

E)悬浮剂(SC、OD、FS)

在搅动式球磨机中，将20重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了10重量份的分散剂、湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。

F)水分散性颗粒剂和水溶性颗粒剂(WG、SG)

将50重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了50重量份的分散剂和湿润剂的情况下精细地进行碾磨，并借助于技术器具(例如挤出、喷雾塔、流化床)而制备为水分散性或水溶性的颗粒。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有50％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。

G)水分散性粉剂和水溶性粉剂(WP、SP、SS、WS)

将75重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了25重量份的分散剂、湿润剂和硅胶的情况下在转子-定子研磨机中进行碾磨。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，由此获得具有75％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。

I)凝胶制剂(GF)

在搅动式球磨机中，将20重量份的AHAS抑制性除草剂在加入了10重量份的分散剂、1份重量的凝胶剂湿润剂和70重量份的水或有机溶剂的情况下粉碎成粉末，从而产生精细的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生AHAS抑制性除草剂的稳定的悬浮液，由此获得具有20％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。该凝胶制剂适合用于种子处理。

2.用于叶面施用的非稀释地施用的产品。对于种子处理目的，可将这样的产品以稀释的形式施用于种子。

A)粉剂(DP、DS)

将5重量份的AHAS抑制性除草剂精细地碾磨，并紧密地与95重量份的精细粉碎的高岭土混合。这产生了具有5％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的粉剂产品。

B)颗粒剂(GR、FG、GG、MG)

将0.5重量份的AHAS抑制性除草剂精细地碾磨。并将其与95.5重量份的载体组合，由此获得具有0.5％(w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。现有的方法是挤出、喷雾干燥或流化床。这产生了用于叶面使用的非稀释地施用的颗粒剂。

常规的种子处理制剂包括例如可流动性浓缩物(flowableconcentrates)FS、液剂LS、用于干处理的粉剂DS、用于浆处理的水分散性粉剂WS、水溶性粉剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可以以稀释的或未稀释的形式施用于种子。在播种前施用于种子，或直接施用在种子上。

在优选的实施方案中，使用FS制剂进行种子处理。一般地，FS制剂可包含1-800g/l的活性成分、1-200g/l的表面活性剂、0-200g/l的防冻剂、0-400g/l的粘合剂、0-200g/l的色素和直至1升的溶剂，所述溶剂优选地是水。

本发明提供了本发明的抗除草剂的植物的非转基因和转基因种子。这样的种子包括，例如，包含具有ATCC专利保藏号5625的植物的除草剂耐受性特征的非转基因小麦种子，和包含编码IMI蛋白的本发明多核苷酸分子的转基因种子。

关于种子处理，使用除草剂，优选地选自下列AHAS抑制性除草剂的除草剂，或使用包含AHAS抑制性除草剂的制剂，来处理本发明的抗除草剂的植物的种子，所述AHAS抑制性除草剂是例如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸(imazamethabenz)、咪草啶酸、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚、嘧草硫醚及其混合物。

术语“种子处理”包括本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌种(seed dressing)、种子包衣(seed coating)、种子涂粉(seed dusting)、浸种(seed soaking)和种子丸粒化(seedpelleting)。

根据本发明的一个变化形式，本发明的进一步目的是处理土壤的方法，其通过施用作为组合物/制剂的包含AHAS抑制性除草剂的颗粒制剂(例如任选地具有一种或多种固体或液体的、农业上可接受的载体和/或任选地具有一种或多种农业上可接受的表面活性剂的颗粒制剂)来进行，特别是施用到条播机中。有利地，在例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床中使用该方法。

本发明还包括用含有至少一种AHAS抑制性除草剂的种子处理制剂包被的或包含所述种子处理制剂的种子，所述AHAS抑制性除草剂选自酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、绿磺隆、醚磺隆、环丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、吡氯磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、烟嘧磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、三氟啶磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆、咪草酸、咪草啶酸、甲灭草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、氯酯磺草胺、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺、五氟磺草胺、双草醚、嘧草醚、丙苯磺隆、氟酮磺隆、嘧啶肟草醚、环酯草醚和嘧草硫醚。

术语“种子”包括所有种类的种子和植物繁殖体，其包括但不限于真正的种子、插条、吸根、球茎、鳞茎、果实、块茎、谷粒、扦插条(cuttings)、伐条(cut shoot)等，和在优选的实施方案中表示真正的种子。

术语“用...包被和/或包含”一般表示，活性成分在施用时绝大部分存在于繁殖产品的表面上，尽管依赖于施用方法，或多或少的成分可能渗透入繁殖产品中。当(重新)种植所述繁殖产品时，其可能吸收活性成分。

在植物播种前和植物出苗前，通过对种子进行喷洒或撒粉，使用AHAS抑制性除草剂或使用包含AHAS抑制性除草剂的制剂来施行种子处理应用。

在种子的处理中，通过用有效量的AHAS抑制性除草剂或包含AHAS抑制性除草剂的制剂处理种子来施用相应的制剂。此处，施用率通常是0.1g-10kg a.i./100kg种子(或a.i.的混合物，或制剂)，优选地1g-5kg/100kg种子，特别地1g-2.5kg/100kg种子。对于特定的作物例如莴苣，施用率可更高。

本发明提供了用于防治不希望的植被或控制杂草的方法，所述方法包括在播种前和/或在催芽后将本发明的抗性植物的种子与AHAS抑制性除草剂接触。所述方法还可包括在田间的土壤中或在温室中的盆栽介质中播种种子。所述方法特别地可用于在紧邻种子的附近防治不希望的植被或控制杂草。

“控制不希望的植被”可理解为表示，杀死杂草和/或延缓或抑制杂草的正常生长。杂草，在广义上理解为表示在不希望其生长的位置处生长的所有植物。

本发明的杂草包括，例如，双子叶和单子叶的杂草。双子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、刺酸模属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛茛属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括，但不限于下列属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、蟋蟀草属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高梁属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。

此外，本发明的杂草可包括，例如，生长在不希望的位置处的作物植物。例如，如果在大豆植物的田中不想要玉米植物，那么可以将在主要包含大豆植物的田中的自生自长的玉米植物当作杂草。

此处所用的冠词“a”和“an”是指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)的语法对象。举例来说，“要素(element)”表示一种或多种要素。

如此处所用的，单词“包含”或“包括”，将理解为表示包括所述的要素、整数或步骤或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。

以举例说明的方式而不是以限定的方式提供下列实施例。

实施例1

耐受性小麦品系的诱变和选择

将1,500粒Shiloh品种种子的样品各置于1,000ml烧杯中，并用去离子水覆盖至高过种子水平至少1英寸。然后将烧杯在4℃下置于冰箱中15-20小时。从冰箱中取出种子样品，并通过将烧杯置于室温下而在大约3小时的期间内使之升温至室温。在一些情况下，通过向烧杯中加入去离子水来加速升温过程。

从种子中将去离子水倒出，将叠氮化钠溶液注入烧杯至高过种子水平至少1英寸。如下来制备叠氮化钠溶液：向1,500ml去离子水中加入27.218g KH₂PO₄，用浓H₃PO₄使溶液达到pH 3，并用去离子水使终溶液达到2L体积。在即将使用之前，加入0.2604g NaN₃，并将所述溶液保持在暗处。在向种子中加入叠氮化钠溶液后，将烧杯在黑暗区域中于室温下温育2小时，偶尔进行搅拌。

倾倒出叠氮化钠处理溶液，并用去离子水漂洗种子样品两次。然后用去离子水覆盖种子样品至高过种子水平至少1英寸，并在室温下浸泡1小时，偶尔搅拌。倾倒出去离子水，并将种子铺展在纸巾上进行干燥。将种子种植在Berthoud，Colorado附近的田中的6个5英尺×40英尺的地块中。收获大约15磅的M2种子，并将大约466,000粒种子种植在Platteville，Colorado附近。用1×(40g ai ha^-1(咪草啶酸))或2×(80g ai ha^-1(咪草啶酸))对所述田进行喷雾施用。

鉴定耐受所述除草剂的植物，并移植入1加仑的盆中，并在45℉下进行春化处理4周。2×率的区域中进行14个单一植物选择。对于耐受性M2植物解除春化作用，在Berthoud，Colorado温室中进行出芽，和将M3植物种植在Berthoud，Colorado附近的大约4英寸×5英寸的地块中。当植物处于三叶期时，用80g ai ha^-1(咪草啶酸)对所述地块进行喷雾，并如表1中所示对14个后代的结果进行分级。

表1-M3 Shiloh植物对于80g ai ha^-1(咪草啶酸)的耐受性

完全良好的MR-R	中等的MR-MS	丢弃-敏感的
			Shiloh-08	Shiloh-01Shiloh-14	Shiloh-03Shiloh-04Shiloh-05Shiloh-06Shiloh-07Shiloh-09Shiloh-10Shiloh-11Shiloh-12Shiloh-13

将Shiloh-08的12粒种子种植在Berthoud，Colorado温室中，并在三叶期时用40g ai ha^-1咪草啶酸进行筛选，所述结果确证了可遗传的纯合反应。

进行Shiloh-8与已知的Als1品系的两个测交实验。两个实验都显示在F2群体中关于耐受性无遗传分离，这暗示着关于除草剂耐受性来说Shiloh-8是Als1的等位基因。所述结果显示在表2和3中。

表2

测交

杂交日期

收获F2’s的日期

筛选出的#F2’s

F2 Room

FS4？

iShiloh-8/iGDN

99-00年冬天

00年夏天

168

15-40g

是

全部R

表3

EXP 2001-2冬天总的强存活者剔除的或死亡或濒死的 DGP+测交 #F2’s 矮小的生长点棕色叶鞘
	iShiloh-8/imi GDN 167 140 27 0 0iShiloh-8 8 7 1 0 0Shiloh 7 0 0 0 7imi GDN 2 1 1 0 0

实施例2

Shiloh-8小麦品系的分子表征

随后的分子表征揭示出，Shiloh-08品系在Als1基因的位置142处具有新的腺嘌呤至鸟嘌呤碱基对的置换。该突变的Als1多核苷酸编码突变的AHAS多肽，所述多肽在相应于野生型AHAS多肽的位置96上具有丙氨酸至苏氨酸的置换，并且赋予所述植物对于咪唑啉酮类除草剂的抗性。该Shiloh-8品系在Als2或Als3基因中不具有突变。

实施例3

Shiloh-8品系的咪唑啉酮类耐受性性状的表征

然后在田间条件下评价农艺学且有关的咪唑啉酮类除草剂(咪草啶酸)耐受性。表4概括了产量和农艺学评价，其比较了Shiloh-8和野生型Shiloh植物。这些试验是采用不完全随机化区组三次重复设计进行的典型的谷类评价实验。收获时，地块为1.54m×4.62m。表5概括了Shiloh-8和标准的耐受性对照9804之间的多个田间咪唑啉酮类除草剂(咪草啶酸)耐受性比较。这些地块在单行1m至更大的1.54m×4.62m的地块的范围内变化。

表4

植物 5 (lbs/bu) 兼性 Heading 4/12/01 高度土壤小麦壳针细菌褐斑条锈Loc 测试重量的 ZAD0 病毒孢条纹病病产量 (1-9) KS (Septoriatritici)
	Shiloh 67.6 58.9 6 108 52 36.3 1 5 6 4 3Shiloh-8 61.5 59.1 6 109 52 34.8 1 4 5 5 1平均 64.5 59.0 6 108 52 35.6 1 5 6 4 2CV 6.8 1＝兼性的(Facultative)LSD(.10) 7.4 9＝Non-venaized30项试验

表5

¹在田间施用，移植入温室直至结束并进行分级

²春天施用，施用后的那天夜间温度下降至19℉

本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请在此引用作为参考，就如同具体地和单独地指明每一个单个的出版物或专利申请在此引用作为参考一样。

尽管已通过举例说明和用于使能够理解得清楚的目的的实施例在一定程度上详述了上述发明，但很显然的是，可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修饰。

Claims

1.小麦植物细胞，其包含至少一种选自下列的Imi核酸：

(a)编码在结构域C中包含突变的IMI蛋白的Shiloh栽培种Imi1核酸，所述突变导致与野生型AHAS蛋白相比在所述IMI蛋白中产生丙氨酸至苏氨酸的置换，

(b)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh栽培种Imi1核酸序列，和

(c)编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的Shiloh栽培种Imi1核酸；

其中所述Imi核酸赋予所述植物相比野生型小麦植物而言增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并且其中所述小麦植物细胞不是植物品种。

2.小麦植物细胞，其包含Shiloh-8品系的植物的细胞的除草剂耐受性特征，所述品系的种子的代表性样品已经以美国典型培养物保藏中心(ATCC)专利保藏指定编号PTA-5625进行了保藏，其中所述小麦植物细胞不是植物品种。

3.黑小麦植物细胞，其包含至少一种选自下列的Imi核酸：

(b)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh栽培种Imi1核酸序列，和

其中所述Imi核酸赋予所述植物相比野生型黑小麦植物而言增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并且其中所述黑小麦植物细胞不是植物品种。

4.黑小麦植物细胞，其包含Shiloh-8品系的植物的细胞的除草剂耐受性特征，所述品系的种子的代表性样品已经以美国典型培养物保藏中心(ATCC)专利保藏指定编号PTA-5625进行了保藏，其中所述黑小麦植物细胞不是植物品种。

5.包含选自下列的多核苷酸序列的分离的Imi核酸：

(a)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh-8Imi1多核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO：2中所示的多肽的Shiloh栽培种Imi1多核苷酸序列；

(c)编码在结构域C中包含突变的IMI蛋白的Shiloh栽培种Imi1核酸，所述突变导致与野生型AHAS蛋白相比在所述IMI蛋白中产生丙氨酸至苏氨酸的置换；和

(d)与(a)、(b)或(c)中任一项互补的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列的互补序列编码在相应于野生型AHAS多肽的位置96上具有丙氨酸至苏氨酸的置换的IMI蛋白。

6.包含与权利要求5的Imi核酸有效地连接的启动子的表达盒。

7.权利要求6的表达盒，其中所述启动子能够在细菌、真菌细胞、动物细胞或植物细胞中驱动基因表达。

8.用权利要求6或7的表达盒转化的非人宿主细胞。

9.权利要求8的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌、真菌细胞、动物细胞和植物细胞。

10.包含目的基因和选择标记基因的转化载体，所述选择标记基因包含与权利要求5的Imi核酸有效地连接的启动子，其中所述启动子在宿主细胞中驱动表达。

11.权利要求10的转化载体，其中所述宿主细胞选自细菌、真菌细胞、动物细胞和植物细胞。

12.在其基因组中包含稳定地整合的多核苷酸分子的转化的植物细胞，所述多核苷酸分子包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的Imi核酸，其中所述转化的植物细胞不是植物品种，并且其中所述Imi核酸包含选自下列的多核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh-8 Imi1多核苷酸序列；

(d)与(a)、(b)或(c)中任一项互补的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列的互补序列编码在相应于野生型AHAS多肽的位置96上具有丙氨酸至苏氨酸的置换的IMI蛋白；

其中，所述Imi核酸赋予所述植物细胞相比未转化的植物细胞而言增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性。

13.控制在植物附近的杂草的方法，所述方法包括向所述杂草和所述植物施用有效量的咪唑啉酮类除草剂，其中与野生型植物相比，所述植物具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，并且其中所述植物包含至少一种选自下列的Imi核酸：

(b)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh栽培种Imi1核酸序列，和

(c)编码SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的Shiloh栽培种Imi1核酸。

14.控制在植物附近的杂草的方法，所述方法包括向所述杂草和所述植物施用有效量的咪唑啉酮类除草剂，其中与野生型植物相比，所述植物具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，其中所述植物是小麦或黑小麦植物，并且其中所述植物包含Shiloh-8品系的植物的除草剂耐受性特征，所述品系的代表性样品已经以专利保藏指定编号PTA-5625保藏在ATCC。

15.产生转化的植物的方法，所述转化的植物具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性，所述方法包括：

(a)用包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的Imi核酸的多核苷酸分子转化植物细胞；和

(b)从所述植物细胞再生出转基因植物，所述转基因植物与野生型植物相比具有增加的对于咪唑啉酮类除草剂的耐受性；

其中，所述Imi核酸选自：

(i)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh-8 Imi1多核苷酸序列；

(ii)编码SEQ ID NO：2中所示的多肽的Shiloh栽培种Imi1多核苷酸序列；和

(iii)编码在结构域C中包含突变的IMI蛋白的Shiloh栽培种Imi1核酸，所述突变导致与野生型AHAS蛋白相比在所述IMI蛋白中产生丙氨酸至苏氨酸的置换。

16.权利要求15的方法，其中所述启动子选自组成型启动子和组织偏爱型启动子。

17.权利要求15的方法，其中所述多核苷酸分子还包含有效地连接的叶绿体靶向序列。

18.权利要求15的方法，其中相对于未转化的植物，所述转化的植物的AHAS活性增加。

19.权利要求15的方法，其中所述除草剂是咪唑啉酮类除草剂。

20.权利要求15的方法，其中所述植物细胞在转化步骤之前具有对于至少一种除草剂的抗性。

21.权利要求15的方法，其中所述植物细胞在转化步骤之前包含至少一种Imi核酸。

22.增加植物中AHAS活性的方法，所述方法包括用包含与在植物细胞中驱动表达的启动子有效地连接的Imi核酸的多核苷酸分子转化植物细胞，并从所述转化的植物细胞再生出转化的植物，其中所述Imi核酸包含选自下列的多核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh-8 Imi1多核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO：2中所示的多肽的Shiloh栽培种Imi1多核苷酸序列；和

(c)编码在结构域C中包含突变的IMI蛋白的Shiloh栽培种Imi1核酸，所述突变导致与野生型AHAS蛋白相比在所述IMI蛋白中产生丙氨酸至苏氨酸的置换；

其中，当与未转化的植物相比较时，在所述转化的植物或其至少一部分中AHAS活性增加。

23.用于选择出转化的植物细胞的方法，其包括下列步骤：

用植物转化载体转化植物细胞，

将所述转化的植物细胞暴露于至少一种处于抑制未转化的植物细胞生长的浓度上的除草剂，和

通过其在所述除草剂存在的情况下生长的能力来鉴定所述转化的植物细胞；

其中，所述植物转化载体包含选择标记基因，所述选择标记基因包含在植物细胞中驱动表达的启动子和有效地连接的Imi核酸，其中所述Imi核酸包含选自下列的多核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh-8 Imi1多核苷酸序列；

(c)编码在结构域C中包含突变的IMI蛋白的Shiloh栽培种Imi1核酸，所述突变导致与野生型AHAS蛋白相比在所述IMI蛋白中产生丙氨酸至苏氨酸的置换。

24.权利要求23的方法，其中所述植物转化载体还包含至少一个目的基因。

25.权利要求23或24的方法，其还包括从所述转化的植物细胞再生出转化的植物的步骤。

26.控制在转化的植物附近的杂草的方法，所述方法包括向所述杂草和向所述转化的植物施用有效量的咪唑啉酮类除草剂，其中与未转化的植物相比，所述转化的植物具有增加的对于所述除草剂的抗性，并且所述转化的植物在其基因组中包含至少一个表达盒，所述表达盒包含与在植物细胞中驱动基因表达的启动子有效地连接的Imi核酸，其中所述Imi核酸包含选自下列的多核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO：1中所示的Shiloh-8 Imi1多核苷酸序列；

27.产生抗除草剂的植物的方法，所述方法包括将抗除草剂的第一植物和不抗所述除草剂的第二植物杂交，其中所述第一植物包含权利要求1-4中任一项的植物细胞。

28.权利要求27的方法，其还包括选择出抗除草剂的后代植物。

29.用于增加植物的除草剂抗性的方法，所述方法包括将第一植物和第二植物杂交，其中所述第一植物包含权利要求1-4中任一项的植物细胞。

30.权利要求29的方法，其还包括选择出后代植物，当与所述第二植物的除草剂抗性相比较时，所述后代植物包含增加的除草剂抗性。

31.防治不希望的植被的方法，其包括在播种前和/或在催芽后，将包含权利要求1-4中任一项的植物细胞的植物的种子与AHAS抑制性除草剂接触。